免疫毒性法規概論 - cde.org.t · 免疫毒性法規概論張為元1 前言 2005 年9 月公告ICH S8 是規範人用藥品的免疫毒性法規，以臨床前試驗研究評估臨床免疫毒性的風險。ICH

RegMed 2014 Vol. 47 1

免疫毒性法規概論張為元1

前言

2005 年 9 月公告 ICH S8 是規範人用藥品的免疫毒性法規，以臨床前試驗研

究評估臨床免疫毒性的風險。ICH S8 不僅提供臨床前試驗方法來辨別具潛在免

疫毒性的化合物，更為免疫毒性測試所做之證據權重 (weight-of-evidence)決策的

方法制定參考規範。本概論將就歐盟 EMA、美國 FDA、日本 MHLW/PMDA，

以及 ICH 法規，對免疫毒性的歷史演變、法源重點比較、功能性免疫 T 細胞依

賴性抗體反應 (T-cell Dependent Antibody Response, TDAR)試驗的應用，以及第

一線、第二線試驗執行時機等進行探討。

歷史演變

本法規的歷史演變始於 1980 年，當時歐、美、日等國在國際會議上相繼發

表重要的免疫毒性測試和風險評估，尤其是美國環境保護局 (US Environmental

Protection Agency, EPA)和國家毒理中心 (National Toxicology Program)。

從發展年表 (表 1)可看出早在 80 年代，歐洲已對化學品提出免疫毒理學前

瞻性評估，近年來免疫毒性法規的發展，在於人用藥品之免疫毒性評估，且特別

注重對第一線與後續試驗的執行策略與時機。

表 1. 免疫毒理學的法規科學發展

年代/機構關鍵文件/獻主要特色

1982, EPA Guideline for the immunotox

evaluation of pesticides

新農藥依第一線和第二線進行免

疫毒理學評估。

1983, EC Official Journal no. L332/11 新藥、特別強調免疫系統的組織

病理學評估。

1987, RIVM Vos and van Loveren, 1987 1. 基於 OECD 407 進行第一線免

疫毒性分層測試。

2. 分析第二線測試結果，並定義

免疫毒性作用。

1988, EPA Proposal for 1st draft revision of

1982 guideline

新農藥

1. 一線應於重複劑量 (>30 天)毒

1 財團法人醫藥品查驗中心諮詢輔導中心


性測試中進行評估。

2. 承上，若有陽性或無法解釋的

免疫毒性將執行第二線測試。

1988-1994,

NTP

Luster et al., 1988; Luster et al.,

1992; Luster et al.; 1994

50 種測試物質，以 Inter-laboratory,

repeat dose, in mice 執行確效。

Tier I: 一般毒性、病理和功能性

終點。

Tier II: 進一步確定免疫毒性。

1995, OECD Revised Guideline 407 重複劑量毒性指南，包括修正後

在病理學的研究。

1996, EPA Bio-chemicals test guidelines

OPPTS 880.3550

更新對農藥在免疫毒性檢測的準

則，須涵蓋病理組織學和功能性

終點。

Tier I: 一般毒性、病理和體液免

疫。可能執行先天免疫測試(NK

assay)。

Tier II: 進一步確定免疫毒性。

1998, EPA Health effects test guidelines

OPPTS 870.7800

1999, FDA Guidance for Industry and IND

reviews.

IND 對免疫毒性的要求。

EPA: Environmental Protection Agency; EC: Council of the European Communities; RIVM: National

Institute of Public Health and Environmental Protection; NTP: National Toxicology Program; OECD:

Organisation for Economic Development and Cooperation

藥業法規進展

標準的人用藥物開發程序，應納入藥物對免疫系統的潛在副作用與不良反應

的評估。在已開發的各種免疫毒性法規指導文件中，歐盟 EMA 在 2000 年，美

國FDA在2002年分別公佈免疫毒性法規指導文件。兩份免疫毒性法規指導文件，

皆著眼於新小分子藥物，以及已上市但用於不同適應症或有仿單變更的藥物，除

此之外，也包含於臨床試驗中及核准上市後發現有免疫毒性臨床徵候的藥物，但

不適用生技衍生藥物及其他生物性產品。

關於評估新小分子藥物的潛在免疫毒性還有很多爭論。最多辯論集中在美國

FDA 和歐盟專利藥品委員會對最佳的免疫毒性風險評估方法兩者間的細微差別。

最終在 ICH 努力協調下，於 2005 年 9 月公告 ICH S8 (步驟 4 草案)，協和了歐、

美、日監管機構觀點。下表為比較四份免疫毒性法規指導文件的差別 (表 2)。


表 2. 免疫毒性法規指導文件比較表

ICH S8 CDER CPMP MHLW

法規指

引名稱

S8 Step 4

immunotoxicity

studies for

human

pharmaceuticals

Immuno-toxicology

evaluation of

investigational new

drugs

Note for guidance

on repeated-dose

toxicity.

CPMP/SWP/1042/

99

guidance on

immunotoxicity

studies (draft)

時間 2005 2002 2000 2000

具體指

引

是是否，包括在重複

劑量毒性指導內

是

指引範

圍

免疫抑制免疫抑制、免疫

原性、過敏、自

身免疫排斥

免疫抑制/增強免疫抑制

需篩選

研究

是，從 STS 在

兩物種初篩潛

在的免疫毒性

是，包括已執

行、所有的重複

劑量毒性試驗

是。

1. 篩選需包括至

少一種重複劑量

毒性試驗，且持

續時間應為 28

天。

2. 大鼠或小鼠為

首選物種。

是。

初篩包括:

1. 免疫毒性相

關的 STS 結果。

2. Tier I

immunotoxicity

index.

免疫毒

性參數

篩選試

驗

血液、淋巴器

官重、免疫系

統組織病理

學、血清球蛋

白、感染、腫

瘤 (包在 STS

中)

血液、淋巴器官

重、免疫系統組

織病理學、血清

球蛋白、感染、

腫瘤

血液、淋巴器官

重、免疫系統組

織病理學、骨髓

細胞結構、淋巴

細胞亞群分佈，

及細胞活性 (若

後 2 項測試不適

用，以 TDAR 替

換)

臨床表現、體

重、血液、白血

球結構、A/G、

器官重、組織病

理學、淋巴細

胞、抗體量、NK

活性

其他因

素

評估潛

在免疫

毒性以

及附加

藥物的藥理特

性、與已知免

疫調節劑的結

構相似度、預

期的病人族

群、藥品的體

患者族群、預期

藥物分類效應

（包括 SAR）、藥

動、臨床資料。

若用於愛滋病的

藥，則需功能性

無說明無說明


試驗內分佈、臨床

資訊。

的研究。

額外或

附加試

驗

TDAR、IPT、

NK、HRS、Macrophage/neu

trophil

function、DTH

TDAR、NK、

CTL、DTH、BM

function、serum

complement

IPT、NK、DTH、

Lymphocyte

proliferation test、

HRS、TDAR、Macrophage

function

TDAR、IPT、

NK、HRS、CTL、

DTH、

Macrophage/neutr

ophil function、

immunoglobulin

、IHC、BM

function、serum

complement、Lymphocyte

proliferation

test、cytokines、

auto-Ab、Ab

level、urine

protein、serum

protein fraction、immediate-type

hypersensitivity

前者的

實施時

機 (與

IND 相

關)

若需要，額外

的免疫毒性試

驗應在臨床三

期試驗前完

成、或更早，

視結果或病人

群而定。

無說明無說明 Tier I 與重複劑

量毒性試驗同

時或更早、也在

臨床試驗之前

進行。

Tier II 按結果在

適當時間進行。

STS: standard toxicological studies; HRS: Host resistance studies; TDAR: T-cell Dependent Antibody

Response; IPT: Immunophenotyping; NK: Natural killer activity assay; CTL: Cytotoxic T cell activity;

DTH: delayed-type hypersensitivity; IHC: immunohistochemistry

新藥開發共同精神

目前所有規範小分子新藥的法規指導文件，皆建議先根據常規的毒性試驗

(standard toxicological studies, STS)和研究結果，進行免疫毒性的第一線篩選，這

是第一個共通處，當 STS 的觀察結果有異常時，則須執行額外 (Additional)或追

加 (Follow-up)研究。此時，須考量進行的額外免疫毒性試驗，可區分成幾個領

域，各國法規單位管理略有不同，可參考表 2 的說明。

第二個共同點，為常規毒性試驗所需的篩選常數的規範，其檢測項目需包括

(但不限於)血液學，以及淋巴器官重量及組織學變化。第三個重點在於檢測免疫


毒性的功能性試驗。在 ICH 區域國家中，目前只有歐盟在常規篩選中要求功能

性試驗，即淋巴細胞亞群的分佈 (phenotyping 法)與殺手細胞 (natural killer, NK)

的活性；若情況特殊，可以 TDAR 試驗取代前兩者。但美國 FDA 與 ICH S8 的

要求較相似，雖不列為常規檢驗，必要時採個案處理 (case-by-case)的原則，以

保持法規上的靈活度。日本 MHLW/PMDA 採取分級評價策略，當在重複劑量毒

性試驗中發現免疫毒性時，才會要求執行功能性的免疫檢測，如殺手細胞活性試

驗等…。

與前述相較，台灣對小分子新藥的免疫毒性試驗要求，較傾向於 ICH S8 與

US FDA 的規範，以個案處理的原則輔導廠商設計適合新藥的功能性試驗，以深

入探討個案藥品對免疫系統的不同影響，所以並沒有將功能性試驗列入常規性毒

性試驗檢測，或要求一致性的附加試驗，更不會強制規定檢測項目。目前台灣大

部分業界與學界，對免疫毒性 Tier I 與需併入重複劑量毒性試驗…等常規毒性試

驗所需的常數，較為熟悉。因此，以下將就 Tier II 功能性試驗在藥物臨床前毒理

學研究中的應用，以及執行免疫毒性試驗的時機，作深入分析。

免疫 TDAR 在臨床前毒理學的應用

TDAR 試驗是檢測藥物潛在免疫毒性較理想的功能性試驗，特別是評估體液

免疫功能，此外，也可做為藥理 proof-of-concept 試驗。本試驗優勢為可合併於

臨床前的重複劑量毒性試驗檢測免疫功能的改變，可提供資訊，對候選藥物的免

疫調節和免疫毒性特點進行早期預測。

同時，不單是藥物，從 EPA 評估農藥免疫毒性的流程圖可看出 (圖 1)。雖

證據權重 (WoE)策略非本文討論之議題，然 EPA 看重 WoE 策略和 TDAR 評估；

TDAR 試驗在毒理研究之執行面與評估上皆佔重要地位。


圖 1：2009 年 EPA 評估免疫毒性的流程圖(見參考文獻 5)

TDAR 原理與檢測方法

TDAR 原理為通過人為引入外來抗原，一般常用抗原有綿羊紅血球細胞

(Sheep Red Blood Cell, SRBC)或者鑰孔蟲血氰蛋白 (Keyhole Limpet Hemocyanin,

KLH)，進入未經免疫的機體後，誘發初次免疫反應，又稱預先致敏，後經巨噬

細胞活化 Th 細胞，再由活化的 Th 細胞輔助 B 細胞產生抗體，遂反映藥物或化

合物對免疫系統整體的影響。

TDAR試驗之檢測方法有三種: 以 SRBC為免疫原，以空斑形成细胞 (Plague

Forming Cells, PFC)方法檢測 SRBC 特異性抗體反應 (SRBC-PFC TDAR) ; 以

SRBC 為免疫原，以 ELISA 方法檢測 SRBC 特異性抗體反應 (SRBC-ELISA T

DAR) ; 以 KLH 為免疫原，以 ELISA 方法檢測循環血液中 KLH 特異性抗體反應

(KLH-ELISA TDAR)。相較於 ELISA，目前較少使用 PFC 法測量抗體，主要因

PFC 法試驗週期長、干擾因素多、結果變異大、抗原標準化較困難，且只能當天

採集樣本等局限性。另外，PFC 法最大的限制源自於物種，目前僅有囓齒類的小

鼠有充分資料獲得驗證。


ICH S8 認為 TDAR 優點之一是可以在試驗期間連續性收集樣本 (圖 2)，以

得到抗體生成 vs.時間的曲線圖。另外，因反應動力學有高度的動物間變異性，

可以連續的在不同時間點由同一隻動物收集血液進行分析，顯得十分重要。最後，

試驗結果應以濃度或效價、而非吸光值來表示。

圖 2: 傳統 TDAR 反應，可連續於不同時間點收集血液樣本作檢測

非人靈長類(Non-Human Primate , NHP)在免疫毒性試驗的角色

ICH S8 與 FDA 法規皆認為選擇相關物種，是藥物臨床前免疫毒理學 TDAR

試驗最關鍵的因素。如果一種藥物在非人靈長類(Non-Human Primate , NHP)上表

現藥效活性或者毒性特徵，則需要採用非人靈長類進行免疫毒性試驗，而不是採

用囓齒類動物。美國毒理協會 Dr. A. Aulbach (DVM, DACVP) 於今年初在學會發

表的演說中，提到 30 篇回顧性分析研究，觀察到幾個使用 NHP 作試驗的共通性:

1. 無性別差異；

2. 沒有因國家產地不同造成的差異；

3. 最常用的抗原為 KLH (87%)，Tetanus Toxoid, TT (34%)，SRBC (12%)；

4. 動物間有大幅度的 inter/intra 變異；

5. 若≤4 隻/組確定有大幅差異 (但兩種性別可加大分析檢定力)；

6. 當大鼠造成反應程度和時機有差異時。


換言之，非人靈長類有超越嚙齒類的優勢。廠商除需瞭解本身產品性質外，

也需瞭解非人靈長類” translatability”與”model” 的應用，例如，當藥品的標靶不

與嚙齒類相關時，或是與人類相關之免疫疾病等…。

目前常用於臨床前安全性研究藥品的 model 有食蟹猴 cynomolgus macaques

和獼猴 rhesus macaques 兩種，以雄與雌兩性別、每組 6 隻，並設立陽性

cyclophosphamide 對照組，若為 100 天的試驗周期，則在第 21 天與第 71 天以

KLH 誘發 (圖 3)。再者，本方法雖有多項優點，也被許多法規單位推薦使用，

仍有其限制，主要挑戰有三: 一為固有的物種間變異性，二為動物與動物之間的

變異性 (inter-animal variability)，最後是預先存在的抗體 (pre-existing Ab)，所以

不能將 TDAR 試驗做為單獨、唯一的免疫毒性試驗。動物個體間差異性，可通

過結合雄與雌性之兩性組別，因著樣本數增加，間接提高統計上的檢定力，至於

預先存在的抗體，則可藉預篩而減少對試驗藥物誘發 anti-drug 抗體的影響。

圖 3: NHP 中抗 KLH 的 IgM 與 IgG 反應

其他免疫毒性試驗

就致敏性而言，不同於 TDAR 試驗，自然殺手 (Natural Killer, NK)細胞活性

分析法無需預先致敏，即有迅速溶腫瘤細胞的作用，應用於免疫表現型

(Immunophenotyping)分析法證實白血球亞型 (leukocyte subsets)數量有變化時，

或 STS 試驗證實病毒感染率增加時，或反應為其他因素所造成時執行。

免疫表現型分析法，通常使用流式細胞儀計數分析或免疫組化法分析。本法

的優點是當觀察到免疫毒性徵候時，可做 STS 試驗的組織回溯性分析；且能一

次檢驗多種抗原；另外，更可搭配他種免疫功能試驗一同執行(如: STS、TDAR

試驗)。惟應用本法之前，應注意並檢查樣本的新鮮度、保存和細胞的數量，如

果細胞不足或受損過多，將無法進行有效的評估。


而巨噬細胞/嗜中性球功能分析法 (macrophage/neutrophil functional assays)

中的巨噬細胞是 NK 細胞的激活劑，且對 B 細胞的激活、增殖、和分化具有調

節作用。本法的優點如前述，可合併他種免疫功能試驗，待取得細胞後，進行離

體功能分析。本法若在活體動物執行，也可作為評估化合物對網狀內皮細胞吞噬

放射性或螢光標定物的影響。

分析特性和確效

一般而言，上述免疫毒性試驗應是廣泛使用，且已證明其敏感度和專一性，

意即普遍為法規單位接受。然在某些情況下，仍有使用尚未經確效和/或尚未被

廣泛使用的新分析方法的情形。為了確保適當的測定效能和實驗室準確性，應監

測、確認一些標準技術參數，包括測定內部及組間的分析精準度、技術人員對技

術人員間的精準度、最低定量濃度、定量線性區間和測試樣本的安定性等…。除

此之外，也應建立敏感度分析，以及定期測試陽性對照組。因此，法規單位一般

會要求說明科學/基礎機轉，且加入適當的陽性對照組，或方法確效，但通常不

要求遵循優良實驗室操作規範(Good laboratory practice, GLP)執行。

免疫毒性測試時機與臨床研究的關係

依照 ICH S8 流程圖 (圖 4)，可從額外的免疫毒性試驗所得的結果，評估免

疫毒性的測試時機與風險，如果:

1. 當額外的試驗結果顯示，沒有測到免疫毒性風險的可能，就不要求進一步的

測試；

2. 當證實可能有免疫毒性風險，但無法提供足夠資料，做合理的風險效益判斷，

此時，進一步的測試可能有助於提供充分資訊，以判斷風險效益；

3. 如果整體風險效益分析認為免疫毒性的風險是可接受的，或可列入風險管理

計畫中(參閱 ICH E2E 準則)，則不需進一步的動物測試。


圖 4：評估免疫毒性的流程圖 (見參考文獻 1)

若按證據權重顯示需執行額外的免疫毒性試驗，則該研究應在用藥於大量病

人之前完成，通常是臨床第三期；如果時機適當，臨床試驗中可同時加入免疫系

統參數/指標的監測；如果目標族群是免疫功能不全，即 HIV 病人，必須進行免

疫抑制研究，如: TDAR，且需在藥物開發早期時就著手。

若擬開發的藥物為抗發炎藥或免疫調節藥物，亦可於研發早期，即早於 STS

試驗之前，並以嚙齒類 TDAR 或體外 TDAR 執行試驗，可做為篩選候選藥物的

Go-No Go 決策點。早期評估的優勢，在於檢測一系列化合物，找出影響免疫細

胞潛能卻不改變免疫功能的候選藥物。

除了特殊的給藥途徑，像是局部或吸入給藥，和老人、小孩、孕婦等特殊族

群，一般來說，台灣的法規單位不要求常規免疫毒性評估，建議在 STS 試驗中

一併觀察。

結語隨著新藥研發的增加，具免疫調節功能的新藥在具生育力人群、兒童和青少

年相關疾病治療中的應用也不斷增加，使得這類藥物的免疫毒性越來越受重視。

本文從歷史演變、法源比較、功能性 TDAR 試驗的應用、以及第一線、第二線

試驗執行時機、檢測終點幾方面，對非臨床免疫毒性研究進行綜述。因免疫反應

十分複雜，當動物免疫毒性反應結果外推到人體時，不可避免地會涉及到受試物


在動物和人體內毒性反應之間的差異，如：物種、劑量、代謝途徑等…；或在人

體中出現的特異體質反應，在動物試驗並不呈現毒性反應，造成動物毒性試驗的

結果不一定完全再現於人體臨床試驗。因此，評估免疫毒性風險時，首先必須假

設人最為敏感，毒性試驗中動物的毒性反應將會在臨床試驗中出現，緊接著，找

出最合適的物種與檢測方法(或終點)，並進行深入的作用機制或產品本質的研究，

這些步驟將有助於判斷動物和人體免疫毒性的相關性與風險。

任何進一步的試驗應取決於：1）可能的適應症，2）是否為可預期、或可耐

受的免疫毒性，以及 3）後續測試結果真會改變臨床開發計劃嗎？

免疫毒理學領域發展迅速，新方法（如基因體學，蛋白組體學，轉基因動物）

不斷出現，並以有用的終點評估產品安全性，特別是對全身過敏，自身免疫，以

及光過敏等免疫不良反應，因此，當廠商與學界於 STS 試驗或臨床試驗發現免

疫毒性時，於規劃額外試驗前，建議可與本中心討論後續試驗的適當性與可行

性。

參考文獻：

1. ICH. Guidance for industry. S8 immunotoxicity studies for human

pharmaceuticals. Brussels:ICH, 2005:1-13.

2. Luster, M.I., Portier, C., et al. Risk assessment in immunotoxicology. I

Sensitivity and predictability of immune tests. Fundam. Appl. Toxicol.

1992,18:200-10.

3. OECD. OECD 407 guidelines for the testing of chemicals. Repeated dose 28-day

oral toxicity study in rodents. Paris: OECD, 2008:1-13.

4. US EPA. Biochemicals test guidelines. OPPTS 880.3550 immunotoxicity.

Washington:USEPA, 1996:1-12.

5. US EPA. Health effects test guidelines OPPTS 870.7800 immunotoxicity.

Washington:USEPA, 1998:1-11.

6. CDER (Center for Drug Evaluation and Research). Immunotoxicology

evaluation of investigational new drugs. US Department of Health and Human

Services, Food and Drug, 2002.

7. Administration.CPMP- Committee on Proprietary Medicinal Products. Note for

guidance on repeated-dose toxicity. 2000. CPMP/SWP/1042/99.

8. Japan Ministry of Health, Labour and Welfare. Guidance on the immunotoxicity

study. Tokyo:Japan MHLW, 2004:1-6.

9. Boverhof D.R., Ladics G., et al. Approaches and considerations for the


assessment of immunotoxicity for environmental chemicals: a workshop

summary. Regul Toxicol Pharmacol. 2014;68:96-107.

10. Herzyk D.J., Holsapple M. Immunotoxicity evaluation by immune function tests:

focus on the T-dependent antibody response (TDAR). J Immunotoxicol.

2007;4:143-7.

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