CellomicsTM ArrayScan R System オペレーションマニュアル … · - 1 - 簡易マニュアル CONFIDENTIAL CellomicsTM ArrayScan R VTI System オペレーションマニュアル

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簡易マニュアル CONFIDENTIAL

CellomicsTM ArrayScan○R VTI System

オペレーションマニュアル

（VTI6.x – ApoTome）Ver2.3.0

サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社

ラボプロダクツ事業本部

セルラーイメージング

〒221-0022 横浜市神奈川区守屋町 3-9 C 棟２F

Tel: 045-453-9220

Fax: 045-453-9222

[email protected]

URL: www.cellomics.jp

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目次ページ

１．本体の電源を入れる・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・５

２． ArrayScan を立ち上げる・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・６

３． Application に応じた Protocol を作成する・・・・・・・・・・・・・７

４． Protocol Interactive View で Algorithm を決定・・・・・・・・・・・１０

５． Scan をはじめる・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１６

６． Data Viewer・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１８

７． Graph Display Option・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２０

８． Cell Detail Window を見る・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２０

９． Field Detail Window を見る・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２１

１０． Data Export・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２２

１１．シャットダウン・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２２

１２． ApoTome の使用法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２３

１２． Disk－based Scan・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２４

１３．解析がおわったら・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３０

１４．解析全体の流れ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３０

１５． Protocol Manager の使用方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・３１

１６． PC の構成・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３２

１７． View の Path 変更及びデータバックアップ・・・・・・・・・・・・３３

付録１）Target Activation BioApplication 解説・・・・・・・・・・３４

付録２）Population 解析・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３７

付録３）Reference Well の設定・・・・・・・・・・・・・・・・・３８

付録４）オプション対物レンズの交換方法・・・・・・・・・・・・３９

付録５）新たなプレートフォームファクタの入力方法・・・・・・・・・４０

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マークは低実施する項目です。

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１．本体の電源を入れる

（１）本体の電源を入れる

（２） PC の電源を入れる

ユーザーネーム「Administrator」、パスワード「」でログインする

＊PC、本体、モニタの電源を入れる順番は順不同で構わない。

本体電源

前面下を押すことによりドア開き、右手に光源が

ある。光源の電源は通常 ON。

＊本体と電源が連動しているので、数時間使用し

ない場合は光源の電源のみ OFF にするのが望まし

い。

一度 ON した場合、5 分以上は OFF にしない。

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２．ArrayScan Software を立ち上げる

（１） User name「cell」、Password「cell」でログイン

（2 ）ArrayScan Instrument Appli.の Toolbar で「Create Protocol」へアクセス

Cellomics ArrayScan Instrument 解析用ソフト(イメージ取込み＆数値化)

vHCS View 解析データ閲覧用ソフト

Create Protocol Window

Scan Plate

Create Protocol

Protocol Interactive

Plate Type Selection l ist Protocol Select ion l ist

Scan Area

Start ing Field

Disk Based Scan

Store Image

Display Mode

Start Scan

Pause Scan

Stop Scan

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３．Application に応じた Protocol を作成する

（１）Protocol を選ぶ（Protocol Manager が立ち上がる）

また､それぞれ対物レンズ別に異なる Protocolが存在するため､使用する対物レンズに合わせて選択する

（２） Default の Protocol を「Save as…」で保存しなおす Protocol Manager→Protocol もしくは『Create Protocol Window』→File→Save AssayProtocol as で保存しなおす。

必ずチェックをはずす!!

*参考）X10 には開口度の異なるレンズがある

（0.3NA と 0.45NA）。この使い分けは、用いる

プレートに依存する。ガラスプレートや Thin プ

レートは高開口度のレンズを用いる方がよい。

Protocol Manager

右側の BioApplication を選ぶと、Default のProtocol と今までに作成された Protocol がすべて表示される『_Cellomics_･･･』で始まる Protocol がDefault で『Read Only』になっている。

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（３）Protocol の適化を行う

① 対物レンズの選択目的の細胞によってレンズの拡大率を変更できる＊レンズの種類によって使用できるプレートが異なります

② １well あたりの Autofocus の頻度１well をスキャンするときの Focusing の頻度 exp. ０・・・Well を移動した初のみ１・・・視野を移動するたび３・・・3 視野に一回

③ Scan Limit：スキャンを行う条件を設定（何を律速にするか） Max Fields for Well：１well あたりの高視野数 Min objects for Well：１well あたりで同定する低細胞数 Max Sparse Fields for Well：１well あたりでのまばらな視野

．．．．．．の高数

Min objects for Field：１視野あたりで同定する低細胞数 Max Sparse Well for Plate：１plate あたりでのまばらな

．．．．Well．．．．

の高数

➃ AssayChannel 数および Assayparameter の設定

Assay の線よく数を Channel No として選ぶ

Auto Foucus を行う Ch を選ぶ（通常核の Ch）

➄ Channel の設定：各染色を Channel として設定 Label ：任意に変更可 Dye ：フィルターの設定 Z Offset ：フォーカス Ch からのオフセット値 Exposure Type ： Exposure を Auto 又は Fix に設定 Apply Illumination Correction ： Illumination 設定（Illumination Wizard で設定必要）

ArrayScan○R HCS VT I Reader に標準で搭載されているフィルターセット

Fil ter Set Type Omega Fi l ter Set Names Spectral Ranges Quad XF93 Hoechst FITC TRITC Cy5 Triple XF53 Hoechst FITC Texas Red Dual XF100 Hoechst FITC (GFP) Single XF110 Cy5 (sensit ive) Single XF32 TRITC (sensit ive)

Scan の条件

Object 同定設定

各 CH の設定 ①

②

③

➃ ○5

Autofocus の回数

Well Limit

Field Limit Plate Limit

＊⑥、⑦、⑧、➈は次の

InteractiveView Windowでも変えられます。

⑥

⑦

⑧

Object Lens の選択

➈

➉

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（OP）各機能を設定する

① Auto Exposure Option の設定

Auto Exposure をする Well と視野の設定

② ImageDisplay の設定

③ Assay Parameters の設定

適切にイメージを数値化するために Protocol を Optimize する( 終的な決定は Protocol

Interactive View で決定)。

（バイオアプリケーション毎に設定がことなるので、詳細は各マニュアルを参照）

Algorithm の色設定

擬似カラーでの色設定

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４．Protocol Interactive View で Assay Parameter 決定

（１） Interactive View に切り替える

機器が自動的にイニシャライズを行う。イニシャライズ後に InteractiveView の LoadPlate

をクリックしプレートをセットする

（RetractPlate でプレートが中に入る）

（２）プレートの種類を選ぶ

メーカー → 形式

A1 Well

バーコード

プレートの向きを間違えない!!

!! イニシャライズ中はステージが本体の左部分まで出てきますので、プレートや蓋などは絶対に置かないでください｡

重要です！！

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（３）画像を実際に取得して露光時間を決める

（１）Image を取得

Well を選択し、Ch１を選択して「Aquire Image」をクリック

（２）「Autofocus」をクリック（Ch１でフォーカスをあわせるため）

（３）Exposure の時間を調整（または Channel

Parameter の「AutoExpose」をクリック）

（４）Ch２を選択し「Aquire Image 」をクリックし、

（Aquire Image Set をクリックすると全 ch イメージ取得）

（５）Exposure の時間を調整（以下全 ch で Exposure time を設定）

Well を変える場合（１）から（５）を繰り返す

ステージの設定、画像の撮影

チャンネル設定と Dye の選択

（CreateProtocol と同じ）

Object の選択のパラメータ Object 同定、アルゴリズム決定

（Identify Object ボタン）

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（６）幾つかの Well で Exposure Time を確認し適切な値をセットする

Auto Expose を行うとき

Auto Expose option の各値を設定する Auto ExposureをするWellと視野の設定 Peak targetとTolerance等を設定

（４）画像解析を画像取得と同時に行う場合は、Algorithm の調整及び細胞の Selection を行う。

＊画像取得のみを行う場合は不要

（１）画像を取得した状態で「Identify Object」をクリック

（２）上図のように細胞が囲まれる。Object がきちんと同定していない場合は Object

Identification の Threshold パラメータを調節して Object を同定する－0.995～+0.995 で合わせる

(ただし、用いる Applicationによって Method が変わるので Manual を参照。) 数字が小さいほどゆるくなる

-0.995 -0.700

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（３）「Run Algorithm」をクリック

測定に用いられる Object は青くセグメント(select object)され、棄却された Object はオレンジ色

にセグメント（Reject object）される。

（４）再度「Identify Object」を行い、Reject したい細胞をクリックし、赤に反転させて値を確

認し「Object Selection Parameter」の値を変える

例

Selection 無し面積が 30-150pixel の細胞のみ解析

（４）「Run Algorithm」をクリック

（５）（１）Identify Object→（３）Object Selection Parameter→（４）Run Algorithm を

繰り返し、Object Selection を決定する

（６）Edit assay Parameter をクリックし Assay Parameter Window で各パラメーターの調整を

行う。調整と（４）Run Algorithm を繰り返し、Assay Parameter を決定する

注意：Assay Parameter は選択されたバイオアプリケーション毎に異なります。

反転させた細胞の情報が表示される

（面積、円形度、扁平度、平均蛍光強

度、総蛍光強度）

この範囲内の細胞のみ解析を行う

（解析を行いたい細胞の範囲を反転さ

せた細胞情報を元に調整する

青色は解析される細胞

オレンジは解析からはず

された細胞

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（OP1）画像を全部表示する

（OP2）Composite Image 及び Object の色調変更

Merge 画像や Object の色を変更することが出来ます｡

『Create Protcol』での色調変更と同様に各 Channel について行えます。直接『RunAlgorithm』をすると画面に反映されます｡ ①OverayImage スイッチ－Algorithm を附した画像と白黒画像（Raw 画像との切り替え） ②CompositeImage スイッチ－擬似カラー画像 ③WellFeatures－画像中の平均データ（Application により異なる） ④FieldFeatures－画像中の平均データ（Application により異なる） ⑤CellFeatures－画像中の同定した各細胞のデータ（Application により異なる）

（OP3）Z Offset を各 Channel ごとに設定

但し、Focus Channel はここで Z Offset をかけることは出来ません｡

Focus Channel で OffSet をかけるには､『Autofocus Option』で設定します｡

Focus Adjustment を必要に応じて変更

Less をクリックすると画

像がすべて表示されます｡ Identify Objects ボタンが

画像の下に移動します｡

① ② ③ ④ ⑤

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（OP4）ReferenceWell の設定

NegativeControl もしくは PositiveControl ウェルをあらかじめ設定することにより、設定

したウェルを基準に Respomder％をデータとして表示することが可能になります｡

緑色に設定されているウェルを選択 ↓ None をクリックして解除 ↓ 再度設定したいウェルを選択 ↓ Known をクリック

Starting Field を選択

Number of Field を選択

（OP5）PopUp Window の表示

Overay Image や CompositeImage または RawImage をポップアップさせ、保存することが

出来ます｡

画像をクリックすることにより、PopUpWindow が出ます｡

表示させている画像を保存

RawImage 又は OverlayImage を

Channel 分すべて保存

WellFeature を画像と共に表示

CellFeature を画像と共に表示

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５．Scan をはじめる

（１） Toolbar の「Scan Plate Window」に切り替える

注：設定された Protocol が未保存の場合、Protocol の Save を促します

（２）Plate ID/PlateName を記入

＊ Plate Name は PlateID と同じにするか､複数のユーザが使用する場合は、ユーザ特有名を

入れると Viewer での検索が容易。

(OP1) ScanArea を選ぶ

Shift キーで列、行選択 Control キーで Single Well 選択

＊Scan 方向の例 Scan する方向を選択

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(OP2)Start Field を選ぶ

Scan を始める Field を Drop down list から選ぶ

X5 対物レンズ X10 対物レンズ X20 対物レンズ

＊但し､四隅の視野はプレートタイプに

より、1 隅が欠けて撮影される場合があ

る｡

（３）Scan Start

Start Bottom をクリックして Scan をスタート Start Bottom

X40 対物レンズ

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６．Data Viewer

（１） Scan WindowTool Bar 右上端の Data Viewer Icon をクリック

またはデスクトップの Data Viewer アイコン

以下の Caution Wizard が出ことがあるが、そのまま OK をおす。

*この Caution は Store Server に接続した場合、出なくなる｡

Standalone の場合、そのまま OK でログイン

Store Server 接続の場合は

User Name: cell

Password: cell でログイン

（２）Data Viewer ToolBar のアイコン Multi – Plates Find Plate Well Detail View Plate – SpreadSheet – Graph Export

Plate Refresh Image Only Plate – SpreadSheet – Graph Delete Plate Multi – Feature

（３）Plate ID を選択して Well Detail Vieｗをクリックもしくは選択した PlateID を

ダブルクリック

View を立ち上げたまま Scan を実行すると Scan した Data が

更新されていないので、 Refresh（双眼光マークの

Find の右隣）ボタンをクリック

見たい Plate ID がない場合、Find Plate を

クリック

Viewer で表示させる Feature を Filtration す

ることが出来る。

Feature Type Filters：接頭語

AND Show Only ：含まれる語

AND Omit：含まれない語

AND Channel：表示させる Channel

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右スペースに表示したい Output Feature を

を用いて移動させる（＞＞は左にあるも

のをすべて、＞は選択したもののみ）

（４）ScanData を立ち上げる

ToolBar

Plate 単位列単位 Area

Multi-Feature View

1Plate の Feature をマルチに表示

Multi-Plate View

複数の Plate を表示

＊Plot on One Graph により一つのグラフにプロットできる

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７．GraphDisplay の Option

８．CellDetail Window を見る（１） ToolBar で Area もしくは列単位の Icon をクリックし、Cell Data を見たい Well もしくは

Area を選択し、右クリックで Cell Detail Data を選ぶ

Well Data 同様表示したい Output Featureを選択する

(OP1) ArrayScan Instrument Software へ Load Plate ID の右クリックで Disk Based Scan Window 及び Interactive View Window へ Loadすることが出来る。『Load Disk base Scan…』では ScanWindow へ、『Load Interactive…』では InteractiveView へ Load される

やが出ても OK で進む

GraphTool バーからのカスタマイズもしくは右クリックによるカスタマイズ

Well を右クリックもしくはダブルクリックで CellDetail を選ぶ。

＊ ImagesOnly によって画像のみを表示することもできる＊ FileMenu の SpreadSheet から Transfer to Excel により Excel へ Data を

Export できる

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９．Field Detail Window を見る＊一部の Application のみ（１） ToolBar で Area もしくは列単位の Icon をクリックし、Well Data を見たい Well もしくは

Area を選択し、右クリックで Well Detail Data を選ぶ

＊FileMenu の SpreadSheet から Transfer to Excel により Excel へ Data を Export できる＊Cell-Detail Asaay と Well-Detail Assay の Application があるので注意。

（２）Cell-Detail Asaay、Well-Detail Assay いずれもそれぞれ Spreadsheet、Graph 及び Image は右ク

リックで Export 及び Copy を行うことが出来る

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１０．Data Export （１） Data Viewer Main Window で Export したい PlateID を選ぶ（２） File Menu もしくは右クリックで「Export」を選ぶ

（３）「Export Destination」で保存先を指定通常は C:ドライブ→Program File→Cellomics→vHCS View→Export に設定されています。直接 USB メモリもしくは Drive[E]を選択すると良い。（４）｢Exported Image Type｣で保存形式を選択

Cellomics DIB：再び Viewer に Import することがある場合、又は Disk Based Scanをすることがある場合。

TIFF、BMP、PSD：他のソフトウェアで画像を見る場合。（５）Export Bottom を押す（６）CD-R、HDD にコピーする（７）export を確認したら、Viewer Main Window の File Menu から Delete する

１１．シャットダウン

HCSVeiw ソフトウェア、Cellomics ArrayScan ソフトウェアを終了させ、本体電源を切る

順番は順不同でかまわない。

＊基本的に Store Server を導入している場合は基本的に Store Server はシャットダウンしない

＊一度本体電源を落とした後に再投入すると、光源ランプが冷却されるまで測定ができない（約５分）

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１２．ApoTome を使用して解析する

（１）Hardware 上での ApoTome のセット

ApoTome を使用するときは必ず押しておくこと。Hardware 上で自動 On,Off は行われない。

ApoTome を使用しないときは必ず OFF にしておくこと。

１） Software 上での ApoTome のセット

『Create Protocol』での Channel ごとの ApoTome 設定

前面パネル下部を押す

前面パネル開く

ApoTome 押す（ON）引く（OFF）

Hardware 上での ApoTome セット状況

Channel ごとの ApoTome ON/OFF 切替及びセクショニング厚

ApoTome 利用可能で ON セット

ApoTome 利用可能で ON セットだが、現在設定の Protocol は ApoTome設定されていない

ApoTome 利用可能で OFF

ApoTome 利用可能で OFF、しかも現在設定の Protocol でも ApoTome 設定無し

ApoTome 使用不可

Hardware 上での ApoTome セット状況アイコン

セクショニング厚参考例―変更不可

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２）『Interactive Window』での Channel ごとの ApoTome 設定

Comments Apot- ome? Objective (NA)

Focus Depth*

Field Width

"Standard" Resolution**

Standard on ArrayScan Y 10x (0.45)

Plan Apochromat 5.2µ 1048µ 2.05 µ/pix

Optional Y 20x (0.75) Plan Apochromat 1.9µ 524µ 1.02 µ/pix

Optional Y 40x (0.75) Plan Neo Fluar 1.9µ 262µ 0.51 µ/pix

Standard on ArrayScan n 5x (0 .25)

Fluar 16.8µ 2097µ 4.10 µ/pix

Standard on ArrayScan n 10x (0.3)

Plan Neo Fluar 11.7µ 1048µ 2.05 µ/pix

Standard on ArrayScan n 20x (0.4)

LD Achroplan 6.6µ 524µ 1.02 µ/pix

Optional n 40x (0.5) LD A-Plan 4.2µ 262µ 0.51 µ/pix

* Depth of f ield has a perceptual factor (Zeiss values for these lenses are 25% those of Cellomics ' values listed here).

** "Standard" Acquisition Mode (2x2 binning) on the VTI yields 512x512 pixel images. Resolution is [field width in µ] / [field width in pixels]. Field width in µ = (6.45µ/pixel) x (1024 pixels) / [(objective magnification) x (0.63)].

Channel ごとの ApoTome ON/OFF 切替及びセクショニング厚－Create Protocol と同じ

Channel ごとの z-offset の設定 Autofocus 設定 Channel は Offset 使用不可それ以外の Channelについて 0.05micron 単位で設定可能

＊ Expose Time は ApoTome 無しの場合と異なるため、事前に確認すること。＊ ApoTome を使用しない場合、Hardware 上で ApoTome を解除（OFF）にしておく

こと。（操作ごとに ApoTomeON の Wizard が表示されるため）

注意点

ApoTome 使用可能対物レンズ及び Microplate

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Cellomics' top recommendations for thin-bottom plates compatible with higher NA objectives and the Apotome :

384-well plastic plate: 353962, BD Biosciences Discovery Labware 384-well Black/Clear Assay Plates, BD Optilux™, BD Falcon™ Black with Clear Bottom 384-well Microtest™ Plate

96-well plastic plate: 165305, 96 MicroWell™ Optical Bottom Plates (Nunclon™Δ).

96-well glass plate: Whatman # 7706-2370 Glass Bottom Microplates; Tissue Culture Treated; No Skirt for Microscope.

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１３．Disk－Based Scan ですでにスキャンしたデータをもとに再解析する

Disk－Based Scan ではスキャンした画像を元に、プロトコールもしくはパラメータを変えて

再度解析だけしなおすことが出来ます

（１） Interactive View Window で Disk－based Scan ボタンを押す

（または本体の電源は OFF のまま ArrayScan Instrument Software を立ち上げる）

本体 OFF のまま ArrayScan Instrument Software を立ち上げると左記の Wizardが出ます｡

（２） Disk Base Scan のときに画像を保存する必要が無いときは、Store Image ボタンを押して解

除する。数値データのみが保存されます｡

（３） Create Protocol Window で Protocol の設定を行う。このとき、Dye の設定や Exposure の設

定は不要。Channel 数、Scan Limit のみ設定。

（４） Interactive View Window で画像を呼び出す。

「Acquire Image Set」をクリックしてスキャンしたい Plate の見たい Well の画像を選ぶ。

初の Wizard で『Local Store Database (Store Database)』を選ぶ。その後 Wizard に従っ

て行う。

＊ (Store Server が接続されている場合は『Store Database』を選ぶ)

・Local Store Database (Store Database)― PC もしくは Store の Database に

保存されているデータの呼出

・In a Directory or CD ROM― USB HDD や CD、DVD のデータの呼出

・Test Images― Channel ごとに異なるロケーションのデータの呼出

（５） Wizard に従って呼び出したいデータを選択する。

PlateID、Protocol、作成日などで検索＞Next

呼出したいデータを選択＞Acquire Images Set

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（６）呼出したいウェル・視野を選ぶ

*View の CellDetail などから右クリックで Load した場合、この画面が直接表示される。

①『Current Plate』に呼出したデータの Unique ID が表示さ

れる

②呼出したデータにはどのウェルに何視野づつ画像が保存さ

れているかが表示

③そのウェルで保存されている視野番号が選択できる

（７） Parameter を変えて Scan View Window に移行、Plate ID を入力

（８）スタートしてスキャンしたい Plate ID を選ぶ

再び Scan したいデータを選ぶ

（９）再び Wizard が出てくるので Wizard にしたがってスキャンしたいプレートを選ぶ。

（１０）後に Scan Area を選択＞Next＞StartScan。

画像データの形式及び名前

ArrayScan は Plate ID に関わらず、Scan ごとに特有の Unique Plate Name をつけます｡

その名前は View の Main Window 左下に表示されます｡

各画像データはこの Unique Plate ID ですべて管理されています｡

Image File 名（DIB ファイル）ARRAYSCAN_VTI_011023140002_A01f00d0.DIB

ARRAYSCAN_VTI_011023140002_A01f00d1.DIB

（１） A01 のウェルの f00(一番目の視野)の d0(一番目の色素 Ch1)と d1(2 番目の色素 Ch2)

①

② ③

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１４．解析全体の流れ

本体、PC の電源入れる

プレートをセット

メニューバーの左上のボタンの順に設定していく。

① Protocol を作る

② 実際に画像を見てパラメーター設定

(１) Aquire Image

(２) Autofocus

(３) １Ch の Auto Exposure

(４) Aquire ImageSet

(５) ２Ch の Auto Exposure

(６) Identify Object (1Ch)

(７) Change Threshold

(８) Change object selection & Run Algorism

(９) Change Assay Parameter & Run Algorism

(１０) Run Algorism

③ スキャンのスタート

Viewer を立ち上げる

PlateID を選ぶ

SpreadSheet 上で Area を選んで右クリック

CellDetail を見る

Export する

本体、PC の電源を切る

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１５．Protocol Manager の使用方法

選択した Protocol を開く

選択した Protocol を別名で保存

選択した Protocol を削除

Protocol Manager の表示を Refresh

Protocol 情報の表示項目

Protocol Manager の表示形式

削除した Protocol の表示

Log In User で作成した Protocol のみ表示

Version の合わない Protocol の表示

Protocol の印刷（プリンターを設定されている場合に限る）

選択した Protocol の履歴を表示

2 つの選択した Protocol を比較表示

Hard Disk から選択した Protocol を Bulk で Import

Hard Disk へ選択した Protocol を Bulk で Export

古い Version の Protocol を Version5.5 に Upgrade

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例）

Protocol 情報の表示項目

Protocol 情報を表示させたい項目、順序を

選択することが可能｡

Protocol Manager の表示形式

右側の Assay Protocol の分類表示を指定可能。

優先分類を上段、次の優先分類項目を中段、次の項目を下段で選択。

と同じ機能。複数の Log In Name で解析を行っている場合、

現在の Log In Name によって作成された Protocol のみを表示

させることが可能。

と同じ機能で、削除した Protocol の表示/非表示を選択。

削除するとごみ箱マークの Protocol になる。一度削除された

Protocol を復活させるためには､右クッリクで『Property』を選び、

『Protocol can be edited』

にチェックを切り替える。

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選択した Protocol の履歴を表示

上書きしてしまった Protocol の以前のパラメータ等を表示することが出来る。

ごみ箱マークの表示させたい Protocol を選択して

『View』を押すと、Internet Exploler 上ですべてのパ

ラメータを表示できる。

『Open』を選択すると、ArrayScan

Software に表示される。これを別名

で保存すれば、過去の上書きされた

Protocol を復活させることができる。

『Differnece』ボタンで選択した 2 つの

Protocol の違いを表示することが出来る。

『Ctrl』で同時に２つの Protocol を選択。

2 つの選択した Protocol を比較表示

選択した 2 つの Protocol 上でのパラメータの違いを Internet Explorer で表示可能。

『Ctrl』キーで 2 つの Protocol を同時に選ぶ( 大 2)

ボタンをおす。

異なっているパラメータのみ表示される。

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１６．PC の構成

ArrayScan 本体附属のコントロール PC のドライブ構成は以下のとおりです｡

C ドライブ－Program がインストール

D ドライブ－CellData フォルダの中にデータ

D ドライブ＞CellData フォルダの中にスキャンごとの Unique Name のフォルダが作成されます｡

それぞれのフォルダに画像ファイル、数値データファイル（｡MDB）が存在します｡

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1７．vHCS:View Path の変更の仕方及び ArrayScanVTI HCS System データバックアップ（１）．View の Path 変更

① DataViewer を立ち上げる

② Options→vHCS™:View Setup を選ぶ

Default では CellData フォルダになっています｡

Plate Data 及び ImageData の Path を設定する

③ PlateDatabase の①をクリックして Unique Name フォルダを選択

④ 同様に LocalImage の②を選択して Unique Name フォルダを選択

⑤ OK を押す

⑥ 必要であれば Report ファイルと Export ファイルの Path も設定（通常は C:Drive→Program

Files→Cellomics→VHCS View→Reports もしくは Export に設定）

（2）．USB HDD へデータをバックアップ

１． USB HDD にコピーする

① USB HDD に適当なフォルダ（CellData フォルダが望ましい）を作成する。

② 必要な Unique Name フォルダをそのままコピーする

２． ClientPC の View で HDD の Data を見る

① DataViewer を立ち上げる

② Path を HDD の作成したフォルダ（CellData）に設定

① ②

① ②

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付録１） Target Activation V3 BioApplication

Target Activation BioApplication の概要

Hoechst33342 による核染色をはじめ、６Ch まで設定でき、核を中心とした領域の蛍光強度及び、ある

一定以上の蛍光強度を持つ細胞の Population を Output することが出来る。

１） Create Protocol Window での Protocol 作成

Protocol の Pulldown より『TargetActivation.Cell』>『_Cellomics_ TargetActivation_10x_0.3NA_3CH_ｐ5.5』を File > Save Protocol As…で名前を付けて保存する。こ

のとき、Save As Read Only のチェックを必ずはずす。 ① Scan Limit の設定 ② Assay 条件の設定（ほぼ Default のまま）

但し、核とターゲットのみの場合は『No.ofChannel』を２に設定する。 ③ Channel Specific Parameter の設定

用いる色素にあわせて Channel 毎に『Dye』の設定を行う ④ Image Display Options の設定

２） Interactive Window で細胞同定、パラメーターの設定

① Acquire Image→Autofocus→（Autoexpose）→Acquire Image Set ですべての画像を取得 ② Identify Objects→Run Algorithm を行う。Object Odentification の Threshold で調整。

１Ch IsodataThreshold －0.999～＋9.999 数字が大きくなればなるほどきつい条件２Ch なし

①

② ③

④

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③ AssayParameter の調整

EventDenifinition：Event1-3 を設定する条件

Advanced Parameter 以外 UseReferenceWells： ReferenceWellTool を用いる場合（１）用いない場合（０） Object TypeCh1 : 明視野での解析を行う時は（１）通常の蛍光画像のときは（０） BackgroundCorrectionCh1： Ch1 のバックグラウンド推測を設定するパラメータ。0 のときは行わない。 ObjectSmoothFactor；イメージの画像にスムージング（画像の均一化）を行う。半径を入力。 ObjectSegmentation：隣接している核同士を別々に認識させるためのパラメータ 0 以上の時は形態学的、0 以下のときは Intensity の差によってわける。 RejectBorderObjectionCh1：イメージに外接する Object を棄却するときは（１）しないときは（０）

BackgroundCorrectionChN： ChN のバックグラウンド推測を設定するパラメータ。0 のときは行わない。 MaskModifierChN： ChN において蛍光強度を測定する領域を設定（核領域を中心に領域の大（＋）小

（－））

Advanced Parameter MinRefObjectCountPerField： ReferenceWell を用いたときの神経細胞の小値/視野（2－4095） UseMicrometers：長さと面積を pixel で表示するか（0）μｍで表示するか（１） ######LevelLow(High)ChN： ChN のパラメータ#####において Responder として認識させる低（高）値。

末尾に CC がつくパラメータは Reference Well を使用したときに使用 (付録２、

３ population 解析参照)

④ Object Selection Parameter の設定 Ch1 ObjectArea：同定した領域の面積

ObjectShapeP2A：円周／（面積*４π）（1.0 に近ければ近いほど真円） ObjectLWR：長径と短径の比（1.0 に近ければ近いほど真円） ObjectAvgIntenCh1：１単位面積あたりの平均蛍光強度 ObjectTotalInten Ch1：核領域の総蛍光強度

Ch2-6 AvgIntenChN：１単位面積あたりの平均蛍光強度

TotalInten ChN：核領域の総蛍光強度

３） Well Feature Parameter ：（Units ） Description

ValidObjectCount : (Objects) The number of objects in the well ( those that are and are not rejected by Channel 1

selection parameters).

SelectedObjectCount : (Objects) The number of selected objects in the well after select ion parameters are appl ied.

%SelectedObjectCount : (%) The percent of selected objects vs. total number of objects in the well .

Val idFieldCount : (Number) The number of f ields in which objects were identi f ied.

ObjectPerFieldCount : (Number) Average number of objects counted per f ield.

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MEAN_ObjectArea : (Pixels or ⎧m2 ) The mean ObjectArea for al l objects in the wel l.

SD_ObjectArea : (Number ) The standard deviation of ObjectArea for al l selected objects in the well .

MEAN_ObjectShapeP2A : (Number) The mean ObjectShapeP2A for al l objects in the well .

SD_ObjectShapeP2A : The standard deviat ion of ObjectShapeP2A for al l selected objects in the well .

MEAN_ObjectShapeLWR : (Number) The mean ObjectShapeLWR for al l objects in the well .

SD_ObjectShapeLWR : The standard deviation of ObjectShapeLWR for al l selected objects in the well .

MEAN_AvgIntenChn : Intensity The mean AvgInten in Chn for al l objects in the wel l.

(n = Channels 1-6)

SD_AvgIntenChn: Intensity The standard deviation of AvglInten in Chn for al l objects in the well .

(n = Channels 1-6)

%RespondersChn : (%) The percentage of objects with their AvgInten in Chn outside the intensity range set by

the user with

(n = Channels 1-6) AvgIntenLevelLowChn and AvgIntenLevelHighChn or the intensity range set

automatical ly by Reference Wells with AvgIntenLevelLowChn_CC and

AvgIntenLevelHighChn_CC

MEAN_IntenVariationChn : (Number ) The mean IntenVariation in Chn for al l objects in the wel l .

(n = Channels 1-6)

SD_IntenVariationChn: Intensity The standard deviation of IntenVariat ion in Chn for al l objects in the well

(n= channerls 1-6)

４） Cell Feature

Parameter : (Units) Description

CellNumber : (Number) A unique object ID number assigned to each object within the well . ObjectArea Pixels or

⎧m2 The area of the object in the Channel 1 mask.

ObjectShapeP2A : (Number) A measure of roundness of the object defined by the Channel 1 mask. Ratio of the

perimeter squared to the area t imes 4 .

ObjectShapeLWR : (Number) The length to width ratio (the aspect ratio, akin to a measure of elongation) of the

object defined by the

Channel 1 mask.

AvgIntenChn : Intensity The average intensity under the Channel n mask. Intensity The average intensity under

the Channel n mask.

(n = Channels 1-6)

AvgIntenStatusChn : (Number) Status for average intensity of pixels under the Channel n mask (0: not a

responder; 1: responder >

the AvgIntenLevelHigh; 2: responder < the AvgIntenLevelLow)

TotalIntenChn : Intensity The total intensity under the Channel n mask.

(n = channels 1-6)

IntenVariationChn : Intensity The standard deviation of the intensity of the pixels under the Channel n mask. This is

a measure of texture of the object.

(n = Channels 1-6)

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付録２）Population 解析（Responder 解析） BioApplication によって、Population 解析できる Output Feature は異なるが、TargetActivation の

例をとって解析する。

任意に各 Output Feature について Low と

High の数値を入力すると、Low と High の

間の Range 以外（斜線の部分）の細胞数を

相対値で各ウェルについて数値化この任意の数値を自動で設定するのが、

ReferenceWell 機能です。

Assay Parameter を開くと Parameter の後半に『・・・HighChN』もしくは『・・・LowChN』と

表示されているものがある｡これらについて Population 解析をすることが出来る。各 Channel に対して『AvgIntensity』と『TotalIntensity』について Responder 解析を行うことが出来る。このとき一番上部の『Reference Wells』が『0』になっていることを確認。

これらのPopulationのデータは『% FeatureRespondersCh N』として表示される。

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付録３）Population 解析（Responder 解析）―Reference Well 機能を用いて自動で設定 Population 解析の『Low』と『High』の値を自動的に設定する機能。Scan を始める前に、設定した Reference Well を解析し、Mean を出す｡ReferenceWell の画像は保存されない。

Assay Parameter の一番上部の『Reference Well』を『１』に切り替える。『・・・LevelHighChN_CC』もしくは『・・・LevelLowChN_CC』の Parameterで設定。 Reference Well として設定したウェルの値から算出。

RefFeatureLevelLowChN = Mean –

(FeatureLevelLowChN_CC ⋅ SD)

RefFeatureLevelHighChN = Mean +

(FeatureLevelHighChN_CC ⋅ SD)

Reference Well の平均値±（CC＊SD）。

ReferenceWell の設定方法

Tool＞Change Reference Well を立ち上げる。

(ア) Well を選んで Known を押す。

(イ) 解析開始視野を設定

③ 解析視野数を設定

設定した開始視野と視野数は Scan Window の右

上『Comment』欄に書き込んでおく｡

1 .00

MEAN_Averag

+CC＊SD -CC＊SD

①

② ③

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付録４) オプション対物レンズの交換方法

標準搭載対物レンズ：5x、10x（0.3NA）、10x（0.5NA）、20x（0.4NA）

オプション対物レンズ：20x(0.75NA)、40x（0.5NA）、40x（0.75NA）

オプションの対物レンズを使用する場合は、10x(0.45NA)をはずしてオプション対物レンズを搭載

する｡オプションの対物レンズは 2 種類を同時に搭載することは出来ない｡

Start メニュー＞Program＞Cellomics Folder＞Objective Change Wizard をたちあげる。

ArrayScan 本体のステージ上にプレートが無いこ

とを確認

＞Next

Calibration を始める＞Next

Calibration 後、対物レンズのタレット上に

10x(0.5NA)が正位置にきている。

この 10x(0.5NA)をはずす｡

＞Next

搭載するオプション対物レンズを選ぶ。

＞Next

対物レンズをタレットに装着。きっちりと締める。

＞Next

『Successful!』がでたら、＞Close

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付録５) プレートフォームファクターの入力方法

デフォルトで登録されていないプレートを使用するときは、Calibration Verification tool を用いて新たに

プレートフォームファクターを入力する必要があります。

フォームファクター入力には入力したいプレートに核等を染色された細胞が必要になります。また、プレー

トメーカより、正確なプレート形状情報を用意する必要があります。

実施方法を間違えると目に重大な損傷を与える操作があるので、初めてこの操作を行うときは十分注意して実

施してください。

（１）ソフトウェアを立ち上げます

Program Files > Cellomics > Customer Tools >Calibration

Verification Tool.

（２）Next をクリックします

（３）Form Factor Calibration/Verification を選択し、Next をク

リックします。

（４）測定する対物レンズと染色された蛍光が読み取れるフィルタ

ーを指定します。

＊通常 10x のレンズと Hoechst のフィルター

Next をクリックします

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（５）形状の近いプレートを選択し、ファクターをコピーします

「Make a copy of selected form factor for use as a template for a new form Factor」の欄にチェックを

入れ、Next をクリックします。

（６）各項目を入力します。

新たに製品群を作成したい場合は Manufacturing に新たに

名前をタイプします（過去の製品群に入れるときはプルダ

ウンから選択）

Form Factor Name ：プレート名

Well Shape ：ウェル形状

Row：横列数

Cols：縦列数

Well Pitch X：ウェル間の距離（G）

Well Pitch Y：ウェル間の距離（H）

Well Width：ウェルの横幅（I）

Well Hight：ウェルの縦幅（J）

Physical Width ：プレートの横幅（B）

Physical Height ：プレートの高さ（C）

Physical Length ：プレートの縦幅（A）

各値はプレートメーカがHP上などで公開している正確な値

を入力してください

Nextをクリック

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（７）基準とするウェル位置を指定

＊細胞等が染色されている必要があります。

Nextをクリック

（８）Yesをクリックしてプレートをセットします。

＊ステージが開きます

Nextをクリック

（９）（７）で選んだウェルの位置が測定位置になるよう

にのツールを使ってプレートの位置を合わせる。

ステージカバーをあけて目視しながら調整しますが、そ

の際、 □の位置にチェックが入ったままカーソルをク

リックすると励起光が光り、目に損傷を与える恐れがあ

ります。

絶対に □ にチェックが入った状態で目視しながら調

整は行わないでください。

（１０）目標のウェルのほぼ中央に対物レンズの中心が

来るように調整ができたら、中央の視野のチェックボッ

クス（）にチェックを入れのツールでフォーカス

をあわせます。

必ずステージカバーは閉じてください

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（１１）ウェルの上下左右を正確に設定するため、すべて

ののチェックボックスにチェックを入れ、再度の

ツールを用いてステージを調整します。

＊右図のようにウェルの端がそれぞれの視野に均一に現

れるようにセットします。

調整が終了したらNextをクリックします。

（１２）フォーカスの微小な調整をします。

調整が終了したらNextをクリックします。

（１３）Insert New Form Factorボタンをクリックして

Form Factorを更新します。

Finishをクリックしてソフトウェアを終了します。

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CellomicsTM ArrayScan R System オペレーションマニュアル … · - 1 - 簡易マニュアル CONFIDENTIAL CellomicsTM ArrayScan R VTI System オペレーションマニュアル