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Chapter 16

RNA polymerase II:

regulation

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16.1 Regulatory promoter and enhancer

Figure 16.1

박테리아 gene regulation을 볼 때 진핵 세포의 regulatory element는 transcription initiation

site의 바로 윗부분에 위치 할 것으로 간주됨. 이를 조사하기 위하여 해당 부위의 일부

DNA를 제거하면 필수 부위가 제거 되어 문제가 생기기도 하지만 flanking DNA 서열의

간격을 변화 시켜 문제가 생기기도 한다. 이들 중 어느 것이 문제인가를 알기 어렵다.

Linker-scanning mutagenesis; 위의 문제를 해결하기 위하여 관심 있는 지역의 짧은

DNA 분절을 동일한 크기의 random sequence를 갖는 DNA linker로 교체한 후 조사함.

SV 40 thymidine gene의 regulatory element를 조사

하기 위하여 전사 개시 부위의 upstream 지역을

linker DNA (노란색)로 대치함. 대치 후 Xeponous

oocyte내로 injection 한 후 thymidine gene이

mRNA를 만드는가를 조사함.

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Thymidine kinase promoter elements identified by linker scanning

Figure 16.2

SV 40 thymidine gene의 조절 부위를 조사

linker DNA로 교체 한 후 푸른색은 mRNA

의 발현에 차이가 없는 것이고 붉은 색은

mRNA의 발현이 줄어든 것을 표시 함.

Regulatory promoter;

TATA box; core promoter의 일부

CCAAT box와 GC box; 개시 부위로부터 50-200bp upstream에 위치하며 regulatory

promoter 혹은 proximal promoter라고 한다.

그러나 CCAAT box는 일부 유전자에서는 존재하지 않으며 일부 유전자에서는 존재하는

위치가 다양하다.

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Enhancers SV 40의 전사 연구로부터 TATA box를 포함하는 core promoter 부위와 6개의 GC box를

포함하는 regulatory promoter 부위를 발견함. 또한 regulatory promoter 바로 위에 두개의

동일한 72bp 지역을 발견. 하나를 제거하면 초기 전사의 소량의 감소가 있으나 두개 모두

제거되면 100배가 감소된다. 이 부위를 enhancer라고 하며 두 가지 특징을 지님.

1) enhancer는 몇 천bp upstream이나 down stream에 위치하여 있더라도 올바른 전사

개시 위치에서 전사가 일어나게 한다.

2) enhancer는 어느 방향으로 위치하던 전사를 촉진 시킨다.

근래에 많은 종류의 다른 enhancer가 발견

되었고 크기는 50bp에서 1.5 kbp이며

regulatory promoter 처럼 module cluster

를 갖고 있다. 실제로 CCAAT나 GC

box를 갖고 있는 것도 있다. 세포는

enhancer나 regulatory protein 내의

module에 결합하는 transcription activator

protein이 있으며 결합에 의하여 전사가

극대화 된다. repressor protein에 대한

regulatory site가 존재하나 우리는

activation을 주로 배운다

UAS (upstream activating sequence): 효모에서 발견되는 단일 regulatory region이며

전사 개시 부위로 부터 수백 bp내에 존재한다. forward나 reverse orientation으로 작용하나

전사개시 부위보다 downstream에 있을 경우는 작동하지 않는다.

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16.2 Transcription Activator proteins 진핵세포에서는 전사를 위하여 transcription activator protein을 필요로 한다.

이들은 최소한 두 개의 영역으로 되었으며 DNA-binding domain과 activation domain을

포함한다. (그림 참조)

DNA-binding domain은 유전자의 regulatory promoter나 enhancer의 특정 서열에 결합

한다. DNA binding domain은 몇가지의 folding pattern을 갖고 있으며 앞으로 folding

pattern에 대하여 공부할 예정임.

Activation domain은 유전자로 다른 transcription machinery의 구성분을 불려 드리며

이들과 전사를 촉진하기 위하여 다양한 interact를 한다.

다른 부가적인 구조를 갖고 있으며 nuclear localization signal, nuclear export signal이

있어 핵과 세포질간의 이동을 가능하게 하며 dimerization domain은 동일하거나 다른

activator protein과 homodimer 혹은 heterodimer를 이루게 한다. 또한 ligand binding

domain이 있어 steroid hormone 같은 작은 물질이나 ligand와 결합을 하여 결합 물질에

대하여 반응을 하게함. dimerization과 ligand binding domain에 대하여 다음에 자세히

배운다.

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Figure 16.6

DNA looping occurs between regions bound to activator proteins

초기에는 regulatory promoter와 enhancer는 완전히 다른 형태의 조절 부위로 생각

하였으나 동일한 서열이 양쪽 모두에서 발견되는 등 두 개의 구분이 모호해졌다. 또한 동일

한 activator protein이 양쪽에 결합 하기도 한다. 그림처럼 DNA looping에 의하여 두 개의

activator protein이 가까워져서 이들의 activation domain이 협동적으로 작용하여 유전자로

transcription machinery를 불러드린다.

유전자의 활성은 이들의 activation domain이 얼마나 협동적으로 작용하여 유전자에

transcription machinery를 불러드리느냐에 달려있다.

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transcription activator protein의 분리 및 분석

DNA affinity chromatography를 이용하여 transcription activator

protein을 분리함.

transcription activator protein이 결합하는 tandem repeat sequence

motif를 갖는 DNA fragment를 합성하여 bead에 결합시킴.

transcription activator protein을 포함하는 핵 추출물과 sonicate된

calf thymus DNA를 반응 시킨 후 column을 통과 시키면 무작위로

DNA에 결합하는 단백질 (thymus DNA에 결합)과 결합 하지 않는

단백질은 column을 통과하고 activator protein만 bead에 결합한다.

high salted buffer를 이용하여 결합 한 activator protein을 elution

시키고 분석을 한다.

Transfection assay; transcription activator protein

유전자를 clone 한 후 cell based assay를 이용하여 능력을

측정함.

한 plasmid는 activator protein gene을 갖고 다른 것은

reporter 유전자와 activator protein의 결합 부위를 갖는다.

이들을 host cell로 transfection 시킨 후 reporter gene의

mRNA가 발현하는가를 조사함.

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16.3 DNA-binding domains with helix-turn-helix

structure transcription activator protein은 DNA-binding domain의 구조에 따라 구분을 하며 유사한

구조를 갖는 단백질은 유사한 기능을 한다.

helix-turn-helix motif는 이미 E. coli의 lac repressor나 cAMP receptor protein (CRP)에

존재하며 진핵 세포에서는 초파리의 homeotic (HOM) 유전자로 알려진 8개의 발달 유전자

연구 시 발견되었다. HOM 유전자는 초파리의 anterior-posterior 축을

따라서 세포들이 각각 다른 지역에 위치하게끔 한다.

HOM 유전자는 염색체 3의 두개의 적은 구역에 위치

하며 Antennapedia complex에 위치한 유전자는

머리와 가슴 상부를 조절하고 bithorax complex에

위치한 유전자는 가슴 하부와 배 부위를 조절한다.

염색체 상의 유전자들의 순서는 embryo의 anterior와

posterior axis에 따른 순서와 동일하다.

HOM 유전자에 돌연변이가 일어나면 대개 lethal이고

Antennapedia 유전자에 돌연변이가 일어나면 그림

처럼 antenna가 위치 할 부위에 다리가 생기기도

한다.

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Vertebrate도 Hox 유전자로 알려진 homeotic

유전자를 갖고 있다. Mammalian 세포는 38개의 hox

유전자를 갖고 있으며 HoxA, HoxB, HoxC, HoxD로

알려진 4 영역에 존재한다.

각각의 영역은 길이가 100kb이며 다른 염색체에

존재한다. (그림참조)

중간 그림은 bilateral animal의 조상을 가정함.

Homeotic genes specify transcription activator proteins.

초파리의 homeotic 유전자는 180bp (60개의 아미노산을 암호화) 길이의 helix-turn-helix

영역이 있는 것을 발견하고 homeobox 라 명명함. 이 box는 효모, 식물, 척추동물 등에 모두

존재함.

1. homeobox 단백질은 regulatory promoter와 enhancer에 sequence-specific manner에

의하여 결합함.

2. homeobox 단백질은 activator protein이나 repressor protein으로 작용.

3. 조절부위에 이들이 결합하는 것은 in vivo나 invitro나 동일함.

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Homeobox proteins have activation and DNA binding domains

homeobox protein은 두 영역으로

되어있으며 N-terminal은 activation

domain이고 C-terminal은 60개의

아미노산으로 되어 homeodomain

(DNA-binding domain)이다.

homeodomain 과 DNA의 구조; 3개의 helix로 되었으며

helix1과 2는 short loop로 연결되고 helix 2와 3는 turn에

의하여 연결되어 helix-turn-helix구조를 이루어 DNA와

sequence specific contact를 한다. helix3은 recognition

helix로 5’-ATTA-3’ (5’-TAAT-3’)를 갖는 DNA 분절의

major groove에 맞게 되어 있다.

N-terminal arm은 minor groove에 결합하여 DNA가

단백질에 고정되게 한다.

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Pou proteins have a homebox and a POU domain

POU transcription activator protein은 histone, immunoglobulin, growth factor등의 발현을

조절하며 두 종류의 helix-turn-helix motif를 갖고 있다. Octanucleotide sequence (ATGC

AAAT)에 결합하기 때문에 Oct-1, Oct-2 transcription activator protein이라고 부른다.

그림은 Oct-1 transcription factor를 나타내며 DNA에 결합하는 푸른색지역과 activation

domain (핑크)을 볼 수 있다. POU 지역은 75아미노산의 POU-specific sub domain (POUS)

과 60 아미노산의 POU homeodomain (POUH)이 있으며 linker 지역이 존재하여 이들이

연결되어 POU region을 만든다.

Oct-1 POU region이 DNA에 결합하는 모양은 교과서 그림 16.15를 참조 할 것.

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16.4 DNA binding domains with zinc fingers 많은 transcription activator protein은 zinc ion에 의하여 안정화되는 DNA 결합 부위를

갖고 있다. 5S RNA 합성을 조절하는 TFIIIA transcription factor에서 발견을 함.

그림 16.16; TFIIIA에 존재하는 9개의 계속되는 zinc finger sequence motif. N-terminal 쪽에

한 쌍의 cysteine이 있고 C-terminal 쪽에 한 쌍의 histidine이 존재하며 이들이 상호 작용

하여 zinc와 결합을 한다. 이 sequence motif를 zinc finger라고 하며 DNA를 잡는데 도움이

된다. 이곳에서 배운 zinc finger를 Cys2His2 zinc finger 혹은 classical zinc finger라함.

Figure 16.16

푸른색; histidine, 노란색; cysteine

왼쪽은 α-helix, 왼쪽은 β-strand모양을 나타냄.

α-helix의 His-19, His-23과 β-strand의 Cys-3

Cys-6과 zinc ion에 결합.

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어떻게 zinc finger protein이 DNA와 결합하는가?

zinc finger protein은 DNA와 반복적인 접촉을 한다.

mouse transcription activator protein인 Zif268은

3개의 C2H2 zinc finger motif를 갖고 있으며 서로

짧은 linker로 연결되어있다. 3개의 zinc finger는

DNA에 있는 인접한 3-bp sub-site에 결합하고 zinc

finger 지역이 DNA helix의 한 turn을 둘러싼다.

그림; mouse transcription activator protein Zif268과

DNA complex.

그림; Cys2His2 zinc finger motif와 Zif268 finger

sequence.

각 zinc finger의 α-helix는 major groove에 적합하며

helix 시작 부위로 부터 -1,2,3,6 위치에 있는 잔기가

major groove에 있는 base에 특별한 접촉을 한다.

short linker region이 인접한 zinc finger를 연결하는데

TGEKP라는 consensus sequence가 있다.

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Nuclear receptor superfamily에는 다른 종류의 zinc finger motif가 존재한다. Nuclear

receptor는 higher organism에서 특정 유전자의 발현을 높임으로써 외부나 내부의 화학적

신호에 반응을 한다. Nuclear receptor는 steroid hormone, thyroid hormone, vitamin D,

retinoic acid등에 결합하는 핵 내 단백질로 발견이 됨.

receptor-ligand complex는 regulatory promoter와 enhancer등에 결합하여 activator protein

으로 작용함.

thyroid receptor는 핵 내에 존재하며 free receptor form과 receptor-ligand complex form

모두 DNA에 결합한다. 그러나 free form은 유전자의 발현을 억제하고 complex form은

발현을 촉진한다 Nuclear receptor의 일반적인 구조;

AF-1; poorly conserved activation domain

DBD; highly conserved DNA-binding domain

LBD; conserved ligand binding domain

AF-2; second activation domain

glucocorticoid receptor;

DNA 결합 부위에 두개의

Cys4 finger motif가 존재.

한 zinc는 DNA와 결합하는

recognition helix를 안정화.

다른 zinc는 receptor가

dimer를 만들게 하는 부위를

안정화 시킴.

receptor가 DNA 결합하는 glucocorticoid response element (GRX)

두 개의 palindromic half site가 3개의 염기를 두고 분리됨

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Glucocorticoid receptor binding domain bound to DNA

Steroid receptor (Glucocorticoid receptor 혹은 estrogen

receptor등) 는 homodimer로 DNA에 결합.즉 두 개의 DNA

binding 부위가 DNA에 결합한다.

두 개의 DNA binding domain이 head-to-head로 연결 되어 대칭

구조를 이룬다. dimerization loop는 두번째 zinc finger 내의 Cys

내에 존재한다. 이들은 homodimer의 안정화에 기여한다.

(앞장 그림 참조)

homodimer에 존재하는 두개의 DNA-binding

domain은 DNA의 같은 방향의 major

groove에 결합한다. 첫번째 zinc finger의 α-

helix는 recognition helix로 DNA에 직접 결합

하고 두번째 α-helix의 zinc finger는

recognition helix가 제자리에 있게끔 도와

준다.

homodimer가 DNA에 결합하는 서열을

hormone response element라고 하며 3bp

spacer에 의하여 떨어져 있는 inverted 6bp

repeat로 된 불완전한 palindrome이다.

5’-AGAACA-3’과 5’-AGGTCA-3’등이다.

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Heterodimer를 이루는 nuclear receptor protein;

9-cis-retinoic acid의 receptor인 retinoid X receptor (RXR)와 dimerization을 이루는 것에는

thyroid receptor protein (TR), vitamin D receptor (VDR), the retinoic acid receptor (RAR)

peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)등이 있다.

RXR의 DNA binding domain은 hormone response element 존재 시 해당하는

heterodimeric partner와 결합을 하여 full length receptor로 작용을 한다.

hormone response element는 AGGTCA라는 서열이 direct repeat (DRs)에 의하여 분리

되고 이 지역의 염기의 수에 따라서 결합의 specificity가 결정된다. (그림참조)

즉 RXR-VDR response element의 spacer에 1bp를 첨가하면 RXR-TR response element로

바뀐다.

우측그림; RXR이 heterodimer를 만들어 DNA와 결합하는 모형

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The ligand binding domain of nuclear receptors

Figure 16.28

ligand binding domain은 hormone binding

site를 포함한다. ligand binding domain은

ligand가 결합하거나 antagonist가 결합하면

형태의 변화를 야기.

그림 16.28; (a) ligand가 없는 경우의 retinoid

X receptor (RXR) ligand binding domain.

(b) ligand가 결합한 경우 구조가 바뀌어

ligand binding pocket (LBP)에 있는 ligand를

에워싼다.

(c) antagonist가 결합 한 경우도 구조가 변화.

그림 16.29; Hormone antagonist

Estradiol; estrogen receptor에 작용하는 정상 estrogen

Tamoxifen, Raloxifene; antagonist

Tamoxifen은 estrogen의 대체물로 작용. estrogen은 유방의 정상

세포나 변화된 세포의 proliferation을 일으켜서 유방암을 야기 한다.

그러므로 유방암 환자에게 estrogen 대신에 tamoxifen을 사용하면

estrogen이 야기 시키는 cell profilation을 막아 암을 예방 할 수 있다.

그러나 다른 부작용도 있어 오히려 uterine cancer을 야기 시키기도 함.

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The Gal4, a yeast transcription activator protein belong to the Cys6 zinc

family. Gal4는 Zn2C6 binuclear cluster를 이루며 두 개의 zinc ion이 6개의 cysteine과 결합을 한다.

Gal4는 효모에서 galactose metabolism에 사용되는 유전자를 조절하는 transcription

activator protein 이다.

그림; Gal4 protein의

아미노산 잔기 1-40

(붉은색)은 Zn2C6

binuclear cluster를

만들어 DNA와 결합.

잔기 51-64 (푸른색)는

weak dimerization을

만듬. 잔기 41-50

(노란색)은 linker를

이룬다.

Domain swapping experiment;

(a) Gal4 trancsription activator protein은 Gal4 site에 결합

(b) Ppr1 activator protein은 Ppr1 DNA site에 결합

(c) Ppr1 zinc cluster, Gal4 linker, Gal4 dimerization을

포함하는 chimera 1은 Gal4 site에 결합

(d) Ppr1 zinc cluster, Ppr1 linker, Gal4 dimerization 을

포함하는 chimera 2는 Ppr1 site에 결합.

결론; linker 지역이 binding specificity를 결정함.

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16.5 DNA binding domain with basic region

leucine zippers 여태까지 배운것은 globular structure (공 모양)의 DNA-binding domain을 갖는 activator

protein에 관한 것이고 이제는 fibrous DNA-binding domain인 basic region leucine zipper

(bzip) protein을 갖는 activator protein에 대하여 배운다.

그림; 효모의 general control of nitrogen metabolism을 조절하는 activator protein (Gcn4)의

leucine zipper의 구조. leucine은 ball과 stick으로 표시. leucine은 side to side 접촉을 한다.

우측 그림; α-helix는 한 turn당 3.6 residue가 있고 그림은 two helical turn을 나타내는 7개의

아미노산을 나타내며 two turn (7번째 위치)당 하나의 leucine이 존재함을 보여줌.

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그러면 어떻게 Gcn4 dimer가 DNA와 interact하는가를 살펴보자.

leucine zipper motif 바로 옆에

basic (염기성) 아미노산이 존재

하며 DNA recognition을 위하여

필요하다. basic amino acid 서열은

leucine zipper과 함께 bzip DNA

binding domain을 만든다.또한

중간에 activation domain이 존재

한다.

Gcn4 DNA-binding domain과 DNA 분절;

basic 아미노산 (226-249)은 보라색으로 표시되고

leucine zipper 지역(250-281)은 blue로 표시됨.

leucine side chain은 노란색으로 표시

DNA 서열; 각각의 polypeptide chain은 helical 구조를

이루며 quasi (유사) palindrome (붉은색)의 끝에 존재하는

major groove의 half-site에 결합을 함.

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c-Jun and c-Fos functional domains

Ap-1 단백질은 cellular proliferation을 조절

하는 activator protein의 모임이며 이곳에서

oncogene인 c-Fos와 c-June에 대하여 배운다.

이들은 그림처럼 bzip transcription activator

protein으로 작용을 한다.

c-June은 homodimer로 결합을 하고 또한 c-June•c-Fos heterodimer로 결합을 하여 작용

한다. 그러나 c-Fos는 그림에서 보듯이 charge repulsion이 e와 g에 위치한 negatively

charged side chain간에 일어나 homodimer를 형성 하지 못한다.

교과서 그림 16.40은 June-Fos heterodimer가 Ap1 recognition element base sequence

(TGAGTCA)에 결합하는 것을 보여줌.

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16.6 DNA binding domains with helix-loop-helix

structure 일부 transcription activator protein은 helix-loop-helix (HLH) motif를 갖고 있다.

MyoD (myogenesis 즉 근육 세포를 분화 시키는데 작용하는 transcription regulator)가

만드는 complex에서 HLH motif가 존재 하며 cognate DNA에 결합한다.

HLH motif는 dimerization site로 작용하며 두개의

subunit가 모여 4개의 helix bundle을 만든다.

그림에서 loop는 보라색으로 표시되며 길이가 5-

24 residue가 된다.

초록색은 N-terminal 쪽에 위치하며 basic

recognition sequence를 의미하고 DNA의 major

groove에 결합한다.

MyoD와 같은 성질을 갖는 것을 bHLH activator

protein이라고 하며 DNA recognition element

서열이 CANNTG인 곳에 결합한다.

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bHLHzip proteins have both HLH and leucine zipper motifs

많은 transcription regulator는 HLH motif의

c-terminal 쪽에 leucine zipper site도 있다.

이들을 bHLH zip protein이라고 하며

일부는 정상 세포를 암세포로 전환시킨다.

그림에서 basic recognition helix는 푸른색

HLH는 회색. leucine zipper (Zip)는 노란색

Myc protein은 homodimer를 만들지

못하고 특정한 상황하에 Max와

결합하여 활성이 있는 Myc•Max

transcription regulator를 만든다. 이들은

세포의 성장과 발달에 영향을 미치며

Max는 Mad와 결합 하기도 한다.

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16.7 Activation domain

• activation by recruitment

– activation domain interacts with one or more components of the transcriptional machinery and stabilizes its binding to the template DNA

• activation by conformational change

– activation domain induces a conformational change in the transcriptional machinery to stimulate RNA polymerase II to initiate transcription

Mechanisms for transcriptional activation by activator proteins

다양한 transcription activator protein의 DNA-binding domain에 관하여 그 동안 배웠으며

이제 activation domain에 대하여 배울 것이나 많은 것이 알려지지 않았다.즉 공통적인

구조 등이 밝혀 지지 않았기 때문이다.

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Gal4 has DNA binding and activation domains Gal4 regulator protein을 이용한 activation domain 연구.

그간은 Zn2C6 binuclear cluster 부위만 배웠으나 그림처럼

activating domain I (148-196, weak activating region)과

activating domain II (768-881, strong activating region)에

대하여 배운다.

배지에 glucose가 없고 galactose가 첨가되면 GALI (galacto

kinase) 유전자가 발현 되어야한다. GALI 유전자의 upstream

지역을 보면 118bp의 UASGAl 내에 각 17bp인 4개의 Gal4

binding site가 있으며 하나의 Mig1 site가 있다.

Mig1은 multicopy inhibitor of

GAL gene으로 C2H2 zinc

finger를 DNA binding

domain에 갖고 있다.

galactose가 있건 없건 Gal4는 UAS에 결합

하나galactose가 없으면 Gal80 단백질이

결합하여 activating region이 다른 전사

구성분과 작용을 하지 못하게 한다. 그러나

galactose가 있으면 Gal3이 Gal80에 결합

하여 Gal80이 제거되어 activating region이

다른 구성분과 작용하여 유전자를 turn on

할 수있다.

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The GAL gene switch model for GAL activation and repression

galactose가 첨가되면 Gal3는 galactose와 ATP와 결합

하여 Gal3•galactose•ATP complex를 만든다.

이때 Gal80 monomer와 dimer는 핵과 세포질내를

이동 할 수 있다. Gal3•galactose•ATP complex는

세포질에서 Gal80 monomer에 결합하여 Gal80 dimer가

monomer로 전환되게 한다.이로 인하여 activating region

II가 자유로워 지고 RNA polymerase transcription

machinery와 작용을 하여 전사가 일어나게 한다.

glucose가 없으면 Snf1 kinase (sucrose non-fermenting

kinase)가 Mig1을 인산화 시켜서 Mig1 site에 결합하지

못한다. 그러나 glucose가 존재시는 Snf1이 비활성화되어

Mig1을 인산화 시키지 못한다. 이때 Mig1은 site에 결합

하여GAL1의 전사를 막는다.

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Gal4 activation domain이 어떻게 작용하는가?

Gal4의 activation domain의 일부를 제거하거나 다른 단백질과 fusion을 시켜서 조사한다.

정상적인 Gal4는 전사를 촉진

앞부분의 아미노산 100개만을

갖은것은 UAS에 결합은 해도

activating domain이 없어 전사가

안됨

아미노산 100-881개 만을 갖는

것은 UAS에 결합을 못해 전사가

안됨

Gal4 activating domain과 LexA

DNA-binding domain을 fusion

시키면 LexA site에 결합한 후

Gal4의 activating domain에

의하여 전사가 개시됨.

마지막 실험을 domain swap라고 하며 그 결과 transcription activator protein은

activation domain과 DNA-binding domain 모두가 필요하다는 것이 밝혀짐

28

The DNA-binding and activation domains can be on separate polypeptides Gal4 activating region의 일부 (아미노산 851-

881)를 dimerization region에 직접 연결하여

약화된 Gal4를 만들면 약간의 전사가 발생함.

약화된 Gal4에 야생형 Gal80이 만들어져 결합

하면 예상대로 전사가 거의 일어나지 않는다.

Gal80에 bacterial peptide (activating region으로

알려진 peptide)를 넣어 변형시킨 후 약화된

Gal4와 결합하면 강한 전사가 일어남.이는

DNA-binding domain의 polypeptide가

activating region의 polypeptide와 non-covalent

interaction을 통하여 기능이 있는 transcriptional

activator protein으로 작용한다는 것을 의미함.

Herpes simplex virus에서 VP16은 감염 초기에 유전자를 발현시키는 factor로 작용. 그러나

VP16 자신은 DNA-binding domain이 없어 유전자에 직접 결합하지 못한다. Oct1은 ATGC

AAAT에 결합하여 약한 전사를 야기. Oct1은 TAATGARAT에도 결합하나 이곳에 결합 후

형태 변화가 일어나고 VP16이 결합하면 강한 전사가 일어난다.

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The yeast two-hybrid system detects protein-protein interactions

바로 앞에서 DNA-binding domain과 activation domain이

다른 peptide에 있어도 작용한다는 원리를 이용하여 protein-

protein interaction을 조사하는 것이 two-hybrid system이다.

하나의 plasmid는 protein X 유전자가 DNA binding domain에

fusion 되어 있고 다른 plasmid는 다른 protein 유전자인 Y1

혹은 Y2등이 activation domain과 fusion 되어 있다.

(상) 단백질 X와 Y1이 상호 작용을 한다면 DBD가 DNA에

결합하고 AD가 작용을 하여 reporter gene의 전사가 일어

난다.

(하) X와 Y2가 상호 작용하지 않으면 AD가 작동을 하지 않아

전사가 일어나지 않는다.

실제 실험에서 protein-protein interaction을 보기 위하여

많이 사용되고 bait를 이용하여 prey를 찾는다.

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Squelching occurs when activator

protein compete for target proteins

16.8 Mediator transcription activator protein은 많은 경우 basal transcription machinery인 TBP나 TAF,

TFIIB등에 직접 접촉을 하나 이는 활성화 된 전사를 위하여 충분치 않다. 이때 전혀 새로운

protein complex인 mediator가 필요함.

Squelching; 한 종류의 transcription activator protein의 농도가 높으면 다른 activator가

유전자의 전사를 촉진하는 것을 막는다. 이들은 activator간에 어떠한 limiting target에

대하여 경쟁을 하기 때문이다. limiting factor는 TBP나 RNA polymerase등이 아니라

mediator라는 물질임.

target protein (blue)이 transcription activator A

(light green)에 결합하여 전사가 일어남.

transcription activator B에 target protein이 결합

하여 A에 결합 할 target protein이 거의 없음.

activator간에 경쟁이 생겨 squelching이 일어나

전사가 거의 일어나지 않는다.

31

yeast mediator

two-hybrid experiment에 의하여 밝혀짐

Head와 middle, tail로 나뉘어짐

붉은 색의 Cdk는 거의 모든 mediator에 존재함.

Head 부위는 RNA polymerase II의 CTD인 Rpb1

subunit와 관련을 맺어 RNA polymerase II의

활성에 영향을 준다. 이부위가 없는 세포는 죽음.

Middle domain은 Med 9/10을 포함하며 CTD

지역과 관계를 맺으나 activator protein이 결합 한

후에 regulatory signal을 전달하는데 역할을 한다.

Tail domain은 Gcn4와 같은 gene-specific

transcription activator protein으로부터의 signal을

감지.

Mediator는 general RNA polymerase II

transcription machinery와 gene-specific

activators (ACT) 간에 다리 역할을 한다.

Head와 middle가 polymerase II와 결합하고

tail은 ACT와 결합한다.

32

16.9 Chromatin modification and remodeling 염색체는 nucleosome이라는 기본적인 단위로 구성되어있다. (6장 참조)

염색체 내에는 두 종류의 chromatin이 interspersed 되어 있으며 강하게 packing된 hetero-

chromatin과 보다 open된 euchromatin이다. (아래 표를 참조)

Heterochromatin에는 모든 세포에 존재하는 말단소체나 동원체 같은 부위를 constitutive

heterochromatin이라고 하며 단지 inactive X 염색체처럼 특정세포에만 존재하는 것을

facultative heterochromatin이라고 한다.

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1. ATP-dependent chromatin-remodeling factors alter histone-DNA or

histone-histone interactions so DNA becomes more accessible to the

transcriptional machinery

2. Enzymes modify the amino terminal tails of histones by covalent

modifications to alter their affinity for DNA

예를 들어 histone acetylase가 acetyl CoA로 부터 acetyl group을 histone의

lysine side chain으로 옮겨서 DNA에 대한 affinity를 감소시킨다.

Tight 한 chromatin 구조는 transcription machinery가 DNA에 작용하기 위해서는 “loosened”

되어야 하며 chromatin 구조를 풀기 위해서는 두 가지 기작을 이용한다.

ATP-dependent remodeling complex (a)

(b)

(c)

(d)

(e)

Swi/Snf multisubunit protein complex는 naked DNA와

nucleosome에 강하게 결합하며 ATP hydrolysis에서

나오는 에너지를 이용하여 chromatin을 remodeling한다.

(a) Dnase I cleavage pattern을 변형 시킴

(b) transcription factor (푸른색)가 접근 하게 함.

(c) restriction endonuclease 접근을 변화 시킴.

화살표는 접근 가능 지역. asterisk는 불가능 지역

(d) histone octamer의 translational position을 변화 시킴.

(e) histone octamer를 한 DNA 분자로부터 다른 분자로

이전함.

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Histone modifications influence transcriptional activity

• acetylation

– histone acetyltransferases (HATs)

– occurs on specific Lys residues in N-terminal tails

– enhances transcription by destabilizing nucleosomes

• deacetylation

– by histone deacetylases (HDACs)

– stabilizes compact chromatin structure

– tends to lower transcription

• methylation

– on specific Lys and Arg

residues

• phosphorylation

– on specific Ser residues

• ubiquitination

– on specific Lys residues

Histone modifications on the

nucleosome core particle

35

Histone modification influences

chromatin structure

histone N-terminal의 modification에

의하여 chromatin의 구조가 바뀜을

보여준다. 더 많은 연구가 필요함.

HATs and remodeling complexes can act

in different orders

histone acetyl transferase (HAT) complex의

regulator (a)와 SWI/SNF 같은 ATP-dependent

remodeling complex (b)가 각각 다른 순서로 작용

하고 전사를 위하여 경쟁을 함을 보여준다.

그림에서는 gene activation에 도달하는 세가지

방법을 보여주었으나 general transcription

factor가 먼저 promoter 지역에 가서 붙고 다음에

HAT나 remodeling이 일어나기도 한다고 생각됨.