Chapter 7. DNA 정제

- 3가지 DNA 준비 필요 : total cell DNA, plasmid DNA, phage DNA

1. Total cell DNA 준비

- Bacterial DNA 추출1. Cell harvest2. Cell lysis3. DNA purification4. DNA concentration

Chapter 7. DNA 정제

1) 세포추출물 제조

- 세포막 및 세포벽 제거 위한 약품처리

- 균종에 따라 다름

- lysozyme : peptidoglycan 제거

- EDTA : 세포외피 전체구조 유지에 필요한

Mg+2 제거, nuclease inhibition

- SDS : lipid 제거 -> 세포막 파괴 야기

원심분리로 상등액 세포추출물 회수

Chapter 7. DNA 정제

2) 세포추출물에서 DNA 정제

- 세포추출물 내에 DNA, RNA, protein 포함

- 단백질 제거 : phenol, phenol+chloroform 혼합물 첨가 -> 단백질 응축 -> 제거

- 단백질농도 높을 때 : proetase, 처리 후 페놀 처리

- mRNA : 페놀처리로 제거

- 다른 RNA : ribonuclease 처리

Chapter 7. DNA 정제

3) DNA 농축

- ethanol precipitation : 염 존재하에 무수에탄올 처리 (-20oC) -> 고분자핵산 침전

- 유리막대를 이용한 DNA 섬유 회수

4) DNA 농도 측정

- UV abs @ 260nm -> A260 1.0 = 50µg/ml

- A260/A280 = 1.8 인 경우 pure DNA

-> 1.8 이하이면 단백질, 페놀 오염

Chapter 7. DNA 정제

5) 박테리아 이외의 총세포 DNA 정제

- 세포벽, 세포 내용물의 차이에 따라 별도의 처리 필요

- 식물세포 : lysozyme 불필요 -> 액체질소동결 후 막

자사발

- 동물세포 세포벽 없음 -> 세제만 이용

- 식물세포

-> CRAB(cetyltrimethylammonium bromide) 처리법

- 핵산과 불용성 복합체 형성

- 원심분리로 복합체 회수

- 1M NaCl 용액에 녹여 DNA 정제

-> Guanidium thiocyanate 처리

- 핵산을 제외한 모든 생화학물질 변성, 용해

- silica 입자에 DNA 고정 후 회수

Chapter 7. DNA 정제

☞ 이온교환수지에 의한 DNA 정제

- cation exchange column 이용

Chapter 7. DNA 정제

2. Plasmid DNA 정제

- Ethanol 침전에 의한 DNA 농축까지는 동일- 염색체 DNA로부터 plasmid DNA 분리 필요

1) 크기에 따른 분리

- 원심분리에 의해 세포단편과 함께 큰 사이즈

DNA 제거

- 세포막에 부착된 염색체의 경우 용이

- 조절된 용해에 의한 세포 파괴

-> 전체 DNA 파손 방지

-> sucrose 존재 하에 EDTA, lysozyme 처리

-> Triton X-100 처리 (비이온성 세제)

-> SDS(이온성세제)의 경우 염색체 파손

원심분리로 plasmid solution 얻음(일부 염색체DNA 포함 가능성)

Chapter 7. DNA 정제

2) 구조(conformation)차이에 따른 분리

- supercoiled vs unsupercoiled 구조 차이 유지

- DNA 정제 과정 중 염색체 DNA는 일부 파손

- plasmid의 supercoiling 상태 유지 필수

☞ alkaline denaturation- unsupercoiled DNA : 좁은 pH 범위에서 변성됨- supercoiled DNA : 안정- pH 12.0 이상에서 변성 후 산 첨가에 의해

재집합- 대부분의 단백질, RNA 함께 제거- 페놀, ribonuclease 처리 불필요

Chapter 7. DNA 정제

☞ Ethidium bromide-CsCl 밀도기울기 이용

- 고속 원심분리에 의한 CsCl 밀도기울기 형성

- 밀도기울기 내 특정의 위치에 거대분자 띠 형성

- DNA 부력밀도 : 1.7g/cm3

- 단백질 : low , RNA : high

Chapter 7. DNA 정제

☞ EtBr 처리 시

- DNA 분자 인접한 염기쌍 사이에 삽입 -> 선형 DNA의 경우 부력밀도를 크게 낮춤

- 선형 vs 원형 DNA -> EtBr-CsCl 기울기에서 별도의 위치에 띠 형성

- 튜브에 UV 조사하여 위치 확인

- 순수 plasmid 얻기에 효과적

- 결합된 EtBr은 부탄올로 추출, CsCl은 dialysis로 제거

Chapter 7. DNA 정제

3) Plasmid multiplication

- multicopy plasmid(20 copy 이상) -> 단백질 합성 없이 복제 가능

- 일정 세포농도에서 단백질 합성 억제제(chloramphenicol 등) 첨가 후 12시간 배양

- 세포분열 없이 plasmid 복제

3. Phage DNA 정제

- 감염된 세균 배양액의 세포외 배지에서 파지입자 회수

- Capsid 제거에 의해 phage DNA 추출

- 문제점 : 낮은 titre(배양액 1ml 당 파지입자 수)

- Λ phage 의 경우 lysogenic : 세포외 phage 입자수가 적음

Chapter 7. DNA 정제

1) 높은 λ phage 입자를 얻기 위한 배양

- cl 유전자(phage를 integrated 상태로 유지시킴)의

온도민감성 돌연변이(clts) 개발

- 30oC : 정상 용원성, 42oC : clts 기능정지 -> 용균성

- 30oC에서 배양 후 42oC로 변환

- 다량의 파지입자 생산

Chapter 7. DNA 정제

2) 비용원성 λ phage 정제

- 대부분의 λ phage 유래 벡터에는 cl 유전자 삭제

용원성 없음

- 세포 감염단계의 배양액상태가 중요

(세포성장속도와 감염속도의 균형유지)

- 세포의 지속적 성장 및 감염계속

- 궁극적으로 모든 세포 감염 및 용해

Chapter 7. DNA 정제

3) 감염된 배양액에서 phage 수집

- 원심분리로 phage 현탁액 제조

- PEP(polyethyleneglycol) 첨가 후 원심분리

(PEP : 염 존재하에 물 흡수하는 긴사슬고분자)

4) Λ phage 입자에서 DNA 정제

- PEP 침전물 중 불순물 잔존(세포찌꺼기, 세포 DNA 등)

- CsCl density-gradient centfg 이용 phage 입자만 분리

- phage 입자의 단백질 제거

- 이하 동일한 DNA 정제과정 이용

Chapter 7. DNA 정제

5) M13 DNA 정제

- 별도의 처리없이 1012 titre 얻을 수 있음

- replicated form : plasmid 정제방법 이용 쉽게 정제

- 세포 용해가 없으므로 phage 현탁액의 오염 안됨

- 별도의 CsCl 이용단계 불필요