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RECUENTO CELULAR MANUAL YAUTOMATIZADO
LIC. TM Ronald Luis Len Soto
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Los recuentos celulares son una serie deprocedimientos que tiene
por objeto
determinar el numero de cada uno de lostipos celulares
Todos los recuentos constan de 3 fases Dilucin de sangre Computo
del numero de clulas Calculo del numero de clulas en 1mm3
desangre
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Recuento Manual
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RECUENTO LEUCOCITARIO
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La sangre anticoagulada se deposita enun lquido que permite
evidenciar los
leucocitos, mantenindolos visibles,mientras que los eritrocitos
sonhemolizados.
El recuento del nmero de leucocitos oglbulos blancos se expresa
por mm3
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Equipos Microscopio.
Hemocitmetro(Cmara deNeubauer).
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Pipeta de glbulos blancos (De Thoma)
Pipeta Automtica
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SOLUCIN DE TURK
Reactivos cido actico glacial 2,0 mL
Solucin acuosa de violeta de genciana al 1%1,0 mL
Agua destilada c.s.p. 100 mL Procedimiento
Mezclar los reactivos y guardar en frascombar en lugar
fresco.
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Cmara de Neubauer
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Consiste en una placa gruesa de cristal enforma de porta, cuya
porcin central estdividida
en tres bandas perpendiculares al ejelongitudinal de la
cmara.
De ellas, las dos laterales se hallan
sobreelevadas 01 mm con respecto a lacentral, y en esta ltima
hay grabado unretculo cuadrangular.
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La banda central puede estar, a su vez,subdividida en dos
semibandas idnticas y
separadas por un surco paralelo al ejelongitudinal de la
banda.
En cada una de estas dos semibandas hay
grabado un retculo idntico.
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Cada cuadrculamide 3 mm de
lado y se divide en9 cuadrados
grandes.
Cada uno de loscuales mide 1mm2 de
superficie, que sesubdivide a su
vez en 16cuadrados
medianos. Elcuadrado grandecentral se divide
en25 cuadrados
pequeos y cada
uno de ellos en 16cuadraditos. Cadacuadrado pequeomide 0,2 mm
delado (0,04 mm2de superficie), y
cada
cuadradito mide0,05 mm de lado
3 mm
1mm2
1 2 3 4
5 6 7 8
9 10 11 12
13 14 15 16
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Procedimiento
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Aspirar la sangre con la pipeta de glbulosblancos hasta la marca
de 0,5 y a limpiar lapunta con papel absorbente.
Introducir la pipeta en el tubo que contengasolucin de Turk y
absorber hasta la marca de11 (no debe haber burbujas).
Tapar ambos extremos y proceder a mezclar
manualmente. Monte la laminilla de vidrio en la cmara para
recuento que debe estar limpia y seca. Agitar la pipeta y
descartar las cuatro primeras
gotas para luego colocar una gota pequea deesta solucin en la
cmara. Deje reposar por espacio de 3 minutos para
que las clulas se sedimenten.
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Cuando se usa la pipeta automtica, setoma 20 mL (0,02 mL) de
sangre totalanticoagulada y se diluye en un tubo quecontenga 380 mL
de solucin de Turk
(aqu tenemos una dilucin 1:20). Enfocar con objetivo de 10x y
contar en 4
cuadrados grandes angulares
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RECUENTO DE GLBULOS ROJOS
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Equipos y reactivos Microscopio.
Hemocitmetro (cmara de Neubauer). Pipeta de glbulos rojos (De
Thoma) o pipetaautomtica (de 0-100 mL).
Diluyente de glbulos rojos: Cloruro de Sodio al 0,9% Diluyente
de Hayem
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SOLUCIN DE HAYEM
Reactivos Bicloruro de mercurio 0,5 g
Sulfato de sodio 5,0 g Cloruro de sodio 1,0 g Agua destilada 200
mL
Procedimiento Se mezclan todos los reactivos y se guarda
enfrasco de vidrio en lugar fresco.
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procedimiento
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Llenar la pipeta de glbulos rojos con sangrehasta la marca de
0,5 para realizar unadilucin de 1/200, y si se carga hasta 1,
la
dilucin ser 1/100. Limpiar la punta congasa o papel absorbente.
Introducir la pipeta en el tubo o frasquito
conteniendo diluyente (Hayem) y llenar de
lquido de dilucin hasta la marca de 101. Mesclar bien Agitar
bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas
del tallo, luego colocar una gota pequeacerca de un extremo de
la cmara para quepor capilaridad se llene exactamente.
Hacer el recuento con objetivo de 40x
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Se puede realizar con la pipetaautomtica, se toma 20 ul (0,02mL)
de
sangre total con 4 mL de solucin deHayem (aqu se tiene una
dilucin de1:200).
Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar
la cmaracon la misma pipeta usando un nuevo tip.
Dejar en reposo por 3 minutos.
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Recuento de Plaquetas
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Se realiza
En un microscopio de contraste de fases
Un microscopio convencional.
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Recuento en Cmara
Materiales Hemocitmetro o cmara de Neubauer.
Solucin de procana (Anexo A). Pipetas automticas de 100 a 1000
mL y 0 a100 mL.
Cmara hmeda.
Tubos de plstico de 12 x 75. Microscopio convencional.
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Mtodo
Mezclar bien la muestra de sangre obtenidacon EDTA.
Hacer una dilucin de 20 uL de sangre totalcon 380 uL de solucin
de procana en untubo de plstico de 12 x 75 (dilucin 1/20).
Dejar en reposo por 15 minutos en unagradilla.
De esta dilucin, llenar en cmara deNeubauer.
Dejar en reposo por 15 minutos en cmarahmeda.
Enfocar con objetivo de 40x y contar lasplaquetas en el retculo
central de 1 mm2cuadrado.
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Resultados Valores de referencia150 000 - 450 000
plaquetas/mm3
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Recuento en Lmina
Se cuentan 10 campos con objetivo de100x y se multiplica por
1000 que es la
Valores de referencia
150 000 - 450 000 plaquetas/mm3
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Recuento Automatizado
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La automatizacin proporciona mayorexactitud y precisin que los
mtodosmanuales.
Resultados en menos Tiempo Muchos mas parmetros que los
habituales Menor volumen de sangre Mayor rendimiento
Diagnstico y Tratamiento ms oportunode la enfermedad.
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Principios Generales delEquipamiento
Utilizan sobre todo dos principios bsicos:
La Impedancia Electrnica, o la Resistenciaa la Corriente
Continua (CC) de Bajo Voltaje
Radiofrecuencia RF, o corrienteelectromagntica de alto
voltaje
La Dispersin ptica
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La Impedancia Electrnica, o laResistencia a la Corriente
Continua(CC) de Bajo Voltaje
Desarrollada por Wallace Coulter 1950 Metodologa utilizada con
mayor
frecuencia Se basa en la deteccin y la medicin de
cambios en la resistencia elctrica
producida por las clulas cuandoatraviesan una apertura
pequea.
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Las clulas suspendidas en un diluyenteconductor de la
electricidad, como solucinfisiolgica, se arrastran a travs de
unaapertura (orificio) en un tubo de vidrio.
En la cmara de recuento, o ensamblaje deltransductor, se aplica
la corriente elctrica debaja frecuencia entre un electrodo
externo
(suspendido en la dilucin celular) y unointerno (alojado dentro
del tubo de apertura).La resistencia elctrica entre los
doselectrodos, o la impedancia en la corriente, seproduce a medida
que las clulas atraviesanla apertura, que tiene sensores y
producepulsos de voltaje medibles
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El nmero de pulsos es proporcional alnmero de clulas
contadas.
El tamao del pulso de voltaje esdirectamente proporcional al
tamao de laclula
Los datos se trazan en un grfico dedistribucin de frecuencia, o
histogramade distribucin de tamao
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Factores que Afectan la Medicin
El Tamao de la Apertura: La Acumulacin de protenas
Recuentos celulares ms bajos con volmenescelulares con
elevaciones falsas.
El pasaje coincidente de ms de una clula volmenes celulares
aumentados falsos y recuentos
celulares disminuidos falsos.
La orientacin de la clula en el centro de laapertura y la
capacidad de deformacin delos eritrocitos
La recirculacin de las clulas hacia atrs Recuentos celulares con
elevaciones falsas
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Rad iofrecuencia RF, o co rr iente
Elec tromagntica de alto vo ltaje
La impedancia de CC de bajo voltaje puedeutilizarse junto con la
resistencia de RF, o
corriente electromagntica de alto voltaje El volumen total de la
clula es proporcionalal cambio en la corriente continua, ladensidad
interna celular (volumen nuclear,etc.) es proporcional al tamao del
pulso o el
cambio en la seal de RF. La conductividad, medida por esta
sonda
electromagntica de alta frecuencia, seatena por la relacin
ncleo-citoplasma, la
densidad nuclear y la granulacincitoplasmtica.
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Por lo Tanto
El uso de varios mtodos en un equipodado para la determinacin de
por lo
menos dos propiedades celulares permitela separacin diferencial
de los leucocitosen cinco componentes (neutrfilos,linfocitos,
monocitos, eosinfilos ybasfilos)
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Dispersin Optica
En los sistemas de dispersin ptica(citmetros de flujo) una masa
de muestra(centrada en forma hidrodinmica) se dirigepor un canal de
cuarzo que genera un flujocelular (de a una por vez), sobre el
queimpacta la luz tambin centrada.
La fuente suele ser de luz halgena, detungsteno, o laser de
helio y nen.
Esto permite la deteccin de interferenciaen el haz de luz y
posibilita sucuantificacin, de modo tal de dar valoresque
caracterizarn a cada tipo celular. Estesistema de dispersin ptica
permiteidentifica leucocitos, plaquetas y eritrocitos.
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Por lo Tanto
A medida que las clulas circulan por laregin sensora, la luz
impacta sobre
ellas y se interrumpe el flujo lumnicounidireccional. La luz se
dispersa en todas direcciones
con ngulos de desvo relativos a lascaractersticas (densidad y
tamao) delcuerpo golpeado.
Se generan a su vez procesos de
absorcin, difraccin y de dispersinlumnica
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Principales Instrumentospara el Recuento de
Clulas
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Son Fabricados
Abbott Laboratories ABX Diagnostics Bayer Diagnostics Beckman
Coulter, Inc Sysmex Corporation.
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Componentes
Los analizadores hemticos tienenalgunos componentes bsicos
comunes,
como los sistemas: Hidrulicos Neumticos Elctricos
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Componentes
Sistema Hidrulico La unidad de aspiracin
Los dispensadores Los diluyentes Las cmaras de mezclado Los baos
de apertura
El flujo de clulas o ambos Un hemoglobinmetro.
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Componentes
El sistema Neumtico Se incluye el sistema de vaco y las
presiones
requeridas para que operen las vlvulas ytransporten la muestra a
travs del sistemahidrulico
El sistema elctrico
controla las secuencias operacionales delsistema total e incluye
analizadoreselectrnicos y circuitos computarizados para
elprocesamiento de los datos generados
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El Grado de Automatizacin. Depende de cmo se manejen las
muestras
Los equipos varan desde Los Analizadores "paso a
paso"SemiAutomatizado
Los Sistemas fciles de usar con capacidad de
"carga frontend Totalmente Automatizado
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SemiAutomatizado
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Totalmente Automatizado
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Las funciones de la computadora tambinvaran Los software pueden
incluir
Inicio y Apagado Automticos Autocontroles internos de diagnstico
Cierto grado de mantenimiento Control de calidad (QC), con revisin
automtica de
datos del QC Clculos Grficos Promedios Dinmicos Almacenamiento
de Archivos del QC Almacenamiento y Recuperacin de datos del
Paciente Sealizacin de los valores de Emergencia o Crticos Sistema
de informacin del laboratorio o del hospital
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Equipos CoulterBeckman Coulter, lnc
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La Serie ONIX Anlisis completo de eritrocitos, plaquetas
yleucocitos con recuento diferencial de trescomponentes
MAXM y STKS RCS con recuento diferencial de cincocomponentes y
anlisis de Reticulocitos
GEN-S System Anlisis de Reticulocitos en lnea Automatizado por
completo. Realizar recuento de CD4 y CD8
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Los Recuentos de Eritrocitos y Leucocitos,y la determinacin de
Hemoglobina (HGB)
se miden en forma directa El VCM es un promedio tomado de
los
datos de distribucin de tamao. El Hto, la HbCM, la CHbCM, EL RDW
se
calculan
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Recuento de Hemates y Plaquetas Por la Impedancia Elctrica
Las partculas entre 2 y 20 fL se cuentancomo plaquetas Las
partculas de ms de 36 fL, comoEritrocitos
Determinacin de la concentracinde la Hemoglobina
Despus de que se completan los ciclos de
recuento, la dilucin de leucocitos pasa alhemoglobinmetro para
la determinacin de laconcentracin de la hemoglobina
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Recuento de Leucocitos
Basado en su Impedancia En Tres Componentes En Linfocitos Clulas
Mononucleares Granulocitos
Entre 35 y 90 fLLinfocitos " Entre 90 y 160 fLMononucleares"
(monocitos, blastos, granulocitosinmaduros y linfocitos
atpicos)
Entre 160 y 450 fL Los Granulocitosmaduros "
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Recuento Diferencial deLeucocitos
Usa Tecnologa VCS La CC de bajafrecuencia
Sonda electromagnticade alta frecuencia
Luz lsermonocromtico
En cada muestra se
analizan ms de 8.000leucocitos
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VOLUME:La CC de bajafrecuencia mide
el tamao
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CONDUCTIVITY:sondaelectromagntic
a de altafrecuencia midela conductividad,un indicador
delcontenidointerno
celular
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SCATTER:Cada clulatambin seanalizacon luz lsermonocromtic
o que revelainformacinsobre lasuperficiecelular comosu
estructura,forma yreflectividad
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Equipamiento SysmexSysmex Corporation, antes TOA Medical
Electronics, Co.,Ltd ahora ROCHE
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El KX-21 pequeo y El K-4500 Proporcionan anlisis completos de
eritrocitos,plaquetas y leucocitos con recuento diferencial detres
componentes
El SF-3000 ms grande y el SE-9000 Realizan un recuento
diferencial de cinco
componentes
Los sistemas ms nuevos que proporcionanadems un recuento de
Reticulocitos
El Sysmex XE-2100 Tiene citometra de flujo fluorescente agregada
para
aumentar la capacidad de anlisis celular delequipo. permite el
recuento directo
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Los Recuentos de Leucocitos Eritrocitos
La Determinacin de Hemoglobina (Hb) El Hematocrito (Hto) Las
Plaquetas (PL)
Se calculan de forma directa
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Recuento de Leucocitos, Eritrocitos yPlaquetas
Mtodo de Impedancia (deteccin de CC) parael recuento y la
determinacin del tamaocelular
Usando umbrales de Discriminacin
El hematocrito es entonces la altura delpulso acumulativa del
eritrocito y seconsidera un volumen verdadero delporcentaje
relativo de Eritrocitos
La hemoglobina se convierte aMetahemoglobina q se convertirse en
unamolcula hemicromtica y se mide comoabsor - bancia a 555 nm.
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En el microprocesador se calculan lossiguientes ndices, que
utilizan
parmetros medidos en forma directa oderivados: VCM HbCM
CHbCM RDW-SD RDW-CV VPM
Plaquetocrito (Pto).
U ili d d i l
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Utiliza cuatro cmaras de deteccin lascmaras DIFF, IMl, Ea y BASO
paraRecuento diferencial de cincocomponentes
Los Leucocitos se analizan con mtodo dedeteccin CC y RF
La cmara DIFF permite separar losleucocitos en Linfocitos,
Monocitos yGranulocitos
En la cmara IMI establecer "informacinsobre (leucocitos)
inmaduros a partir de
los Granulocitos En las cmaras Ea y Baso se analizan y
cuentan los Eosinofilos y Basofilo Por Diferencia se calcula los
Neutrofilos
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Equipamiento CELL-
DYNAbbott Laboratories
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El CELLDYN 1700 ms pequeo
Proporciona anlisis completo de eritrocitos,plaquetas y
leucocito s con recuento diferencialde los tres componentes;
Los CELL-DYN ms grandes 3500R y
3700 Realizan un HC con recuento diferencial decinco componentes
y anlisis de reticulocitos
El CELL-DYN 4000 ms nuevo Proporciona un anlisis de
reticulocitosautomatizado por completo
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Usa la Impedancia para el Recuentocelular
Usa tres canales de medicinindependientes para determinar
elhemograma y el recuento diferencial
Tiene un canal de impedancia adicionalpara determinar para
control interno delrecuento ptico de leucocitos primario
Se consideran que los valores de
leucocitos, eritrocitos, hemoglobina yplaquetas se miden en
forma directa.
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El VCM es obtenido de los datos dedistribucin de su tamao.
La Hemoglobina se mide en formadirecta mediante el mtodo
decianhemoglobina
El Hto, la HbCM y la CHbCM se calculan. La RDW, equivalente al
coeficiente de
variacin, es un valor relativo, derivadodel histograma
Otros ndices son el VPM y Pto
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Los recuentos leucocitario y diferencialderivan del canal ptico
que utiliza la
separacin por dispersin polarizada conmltiples ngulos
(M.A.P.S.S.)
Se utilizan varias combinaciones de estascuatro mediciones para
diferenciar ycuantificar las cinco subpoblacionesleucocitarias
principales: neutrfilos,
linfocitos, monocitos, eosinfilos ybasfilos
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Equipamiento Bayer
(Siemmens)Bayer Corporation
ADVIA 120
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ADVIA 120 Los leucocitos, los eritrocitos, la hemoglobina ylas
plaquetas se miden en forma directa.
La HB se determina con el mtodo decianmetahemoglobina
El mtodo para Eritrocitos y PL utiliza
mediciones de dispersin de la luz porcitometra de flujo
Utilizan cuatro canales de medicin
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Utilizan cuatro canales de medicinindependientes para determinar
el
hemograma y el recuento diferencial: Canal para eritrocitos y PL
Canal para Hemoglobina Canal para Peroxidasa (PEROX)
Canal para Lobularidad de Basfilos (BASO)para recuento
Leuocitario y datos diferenciales.
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Angulobajo [2 a3], secorrelacionacon elvolumen
celularo e!tamao,
Angulo alto[5 a 15] secorrelaciona
con lacomplejidadinterna
El VCM y el VPM son la media del
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yhistograma del volumen eritrocitario y elhistograma de las
plaquetas
El Hematocrito, la HbCM y la CHbCM secomputan en forma matemtica
a partir delos valores de eritrosis-tos, hemoglobina yVCM.
La RDW se calcula como el CV delhistograma de volumen
eritrocitario La amplitud de distribucin de hemoglobina
(HbDW), se calcula como la desviacinestrtdar del histograma de
concentracin dela Hb eritrocitaria.
Los analizadores hemticos de Bayer
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ydeterminan el recuento leucocitario total y
diferencial de seis componentes(neutrfilos, linfocitos,
monocitos,eosinfilos, basfilos y clulas nocoloreadas grandespor
citoqumica y
citometra de flujo ptica, utilizando loscanales PEROX y BASO
Canal de Peroxidasa (PEROX) En el canal PEROX, los eritrocitos
se lisan y losleucocitos se tien por su actividad deperoxidasa
(PX)
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Los Neutrfilos y los eosinfilos contienen
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Los Neutrfilos y los eosinfilos contienenla mxima cantidad de PX
y un cmulo a
la derecha del citograma Los Monocitos adquieren una
coloracin
dbil y por consiguiente el cmulo seobserva en la regin media del
citograma.
Los linfocitos, los basfilos y los LVC (queabarca los linfocitos
atpicos y los blastos)no contienen PX y aparecen en laizquierda del
citograma
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Canal de Lobularidad de Basfilos
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(BASO)
En el canal BASO las clulas se tratan con unre activo, Los
basfilos tienen una resistenciaparticular a la lisis, mientras que
los eritrocitosy las plaquetas se lisan y otros leucocitos
(nobasfilos) se despojan de su citoplasma
Por diferencia se calculan el porcentajetotal de leucocitos
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Recuento Automatizado
de Reticulocitos
El recuento de Reticulocitos fue el ltimo
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de los procedimientos manuales de conteo
celular en automatizarse La imprecisin y la inexactitud del
recuento manual de Reticulocitos se debena numerosos factores,
como: Variabilidad de la coloracin Errores de distribucin en el
porta objeto Errores estadsticos de muestreo Errores surgidos entre
los observadores
Los analizadores automatizados de
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Reticulocitos pueden contar hasta 32.000
eritrocitos comparado con las 1.000clulas del mtodo manual
habitual. Equipos
Becton Dickinson FACS
Culter EPICS Sysmex R-3S00, R-SOO y SE-9S00/9000+RAM-1
Sistemas CELL-DYN 3500R, 3700 Y 4000
Coulter GEN-S, STKS Sistemas MAXM Sistemas Bayer ADVIA 120
Technicon H-3 RTC y RTX.
Todos estos analizadores evalan los
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Reticulocitos basados en la dispersin
ptica o la fluorescencia despus de tratarlos eritrocitos con
colorantes fluorescenteso la coloracin del cido nucleico parateir
el RNA residual en los reticulocitos.
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Se Sintetizan los mtodos para la determinacin diferencial delos
leucocitos en los mismos cuatro analizadores
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Utilidad Clnica de losEquipos Automatizados
en
Hematologa
Mejoraron La disponibilidad, la exactitud yl tilid d l i d l H l
t
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la utilidad clnica del Hg y el recuentoleucocitario
diferencial.
Nuevos parmetros hematolgicos La RDW CHb eritrocitaria VPM
Recuento leucocitario diferencia Mayor Rendimiento en el
Laboratorio Alerta de Hemates nucleados y plaquetasAgregadas
Alarmas sobre patologas Leucocitaria eEritrocitaria
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Limitaciones Debidas a
la Muestra
Incluye la presencia de factores como
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Crioaglutininas VCM aumentado (con frecuencia mayor que 130
fL) Recuentos de Eritrocitos notablement disminuidos CHbCM
aumentada (con frecuencia mayor que 40gldL).
Ictericia Lipemia Afectan las mediciones de la Hb y los
ndicesrelacionados
Tiempo de procesamiento
Aumento de la fragilidad de los leucocitos Aumento del tamao
celular Posible lisis Eritrocitaria Alteracin de las plaquetas
Anticoagulante usado y cantidad
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Limitaciones del Equipo
Incapacidad de un instrumento paradistinguir las clulas de otras
partculas o
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distinguir las clulas de otras partculas ofragmentos de clulas
del mismo tamao de
manera confiable Por ejemplo Pueden contarse los fragmentos
celulares
como plaquetas Los esquistocitos o eritrocitos pequeospueden
interferir en el recuento de las
plaquetas Los cmulos de plaquetas ms grandes
pueden contarse como leucocitos Los Micromegacariocitos pueden
contarsecomo eritrocitos nucleados o leucocitos
Los Eritrocitos que contienen alguna variantede hemoglobina como
S o C a menudo son
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CALIBRACION
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Puede lograrse con el uso apropiado de
mtodos de referencia, materiales dereferencia, calibradores
preparados enforma comercial o cualquier combinacinde ellos
La calibracin debe realizarse en elmomento de la instalacin
inicial y debeverificarse al menos cada 6 meses
Pueden requerirse calibraciones peridicas
despus de reparaciones importantes delequipo que requieren
alineacin ptica o'reemplazo de partes
