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病毒工具在神经科学中的应用
最后的前沿
10亿个神经元
“三磅的宇宙”
先天与后天
发育与退行
中国版=美国版+欧洲版
病毒工具在神经科学中的应用
1• Labeling
2• Modification (※Cas9)
3• Physiology
4 • Neural circuit
体外感染 推荐
定位注射 可用
整体注射 不推荐
体外感染 可用
定位注射 可用
整体注射 不推荐
体外感染 可用
定位注射 推荐
整体注射 推荐
Adenovirus Lentivirus AAV
直径范围 60-90nm 90-110nm 20-30nm
复制类型 自主 无 无
免疫原性 高 中 低
基因容量* 5~6k 4k 2.5k
整合机制 非整合 随机整合 定向低频整合
细胞感染 类型广泛 类型广泛 血清型决定
持续时间 短 长 长
滴度范围 1011~12PFU/ml 108~9TU/ml 1012~13vg/ml
细胞感染 可用 推荐 根据血清型区分
稳转株制备 可用 推荐 可用
定位注射 可用 可用 推荐
整体注射 可用 不推荐 推荐
基因容量是在考虑常用启动子及必要表达原件基础上计算的
慢病毒、腺病毒和腺相关病毒的基本性质和应用
脑区标记
定位注射
长期：AAV/Lentivirus
瞬时：AdV
环路标记
非跨突触
顺行：AAV
逆行：CAV2
跨突触
顺行：HSV/AAV(with Cre-
LoxP)
逆行：PrV/AAV(w
ith Cre-loxP)
细胞标记
分裂细胞
Retrovirus
分化细胞
特异性启动子
Cre-loxP
结构标记
定位肽 融合蛋白
载体类型 体外应用 所覆盖脑区
腺病毒 原代细胞，细胞系 CNS各种细胞
慢病毒 原代细胞，细胞系 CNS各种细胞
AAV2/1,AAV2/2 原代细胞，细胞系 CNS，神经元
AAV2/5 较少使用 DRG感染，CNS，外周，神经元
AAV2/6 较少使用 CNS，外周，神经元
AAV2/8 较少使用 CNS，脊髓灰质，神经元
AAV2/9 较少使用 CNS，脊髓，各种细胞
AAV DJ 体外感染细胞系 CNS
CAV2 - CNS 外周神经元
PrV 感染神经元 CNS 外周神经元
神经系统标记
Syn promoter drive gene expression in hippocampus
Luo et. al, Nat Med 2014
CBG promoter drive GFP gene
expression and H1 promoter
produce shRNA in Cortex
Cao et al. Nat Med, 2014
CMV promoter driving gene expression
Guo J, et al. Mol Neurobiol. 2015
A mesoscale connectome of the mouse brain
Oh, et. al. Nature 2014
顺行工具
逆行工具
AAV6介导的逆行标记
Sebastian et al. Gene Ther 2013
CAV2介导的逆行标记
Szelechowskin et al. JOVE 2013
跨突触标记工具
A WGA-cre activation of Flx-EGFP
indicates connection between striatum and mPFC
Xu et. al Science. 2013 March 15; 339(6125)
分裂期细胞标记：逆转录病毒
Retrovirus mediated EF1a promoter drived EGFP expression in mouse SVZ
areas
Ma et al. Sci. Rep.2015
分化细胞标记：特异性启动子
特异性启动子
启动子名称 应用方向 表达强度与特性
Nestin, Mash1 神经干细胞 测试中
Syn, PrP 成熟神经元 中丰度
CaMKIIα 锥体神经元 高丰度
GAD67(Gad1), VGAT 中间神经元 中丰度
hGFAP, mGFAP, Cst3, Cx30 星形胶质细胞 中丰度
CX3CR1 小胶质细胞 测试中
NG2, Pdgfra 少突胶质细胞 测试中
TRE 时间特异性启动/关闭 高丰度
Syn promoter drive gene expression in
hippocampus
Luo et. al, Nat Med 2014
CaMKII promoter drive gene MPF
Liu et al. Science, 2014
hGFAP promoter drive gene MPF
Liu & Miao et al. JNS, 2015
Cre: Couse recombination
LoxP: the original Lox site derived from bacteriophage P1
通过重组实现时间或细胞特异性表达
优点：1. 实现对特定种类细胞的基因操作
(启动子)；2. 特定时间操作
(ER+tamoxifen/ttA+TRE)
缺点：1. 转基因小鼠难获取；2. 交配小鼠耗时间；3. 很难达到区域特异性
Conditional Knockout by Cre-loxP (Transgenic mice)
Virus-dependent knockout
优点：1. 实现对特定种类细胞的基因操作（启动子）；2. 特定时间操作；3. 病毒的获取相对容易；4. 病毒注射容易；5. 可以精准地实现区域特异性（立体定位注射
等）
Conditional Knockout by Cre-loxP
Cre-loxP工具病毒
载体名称 特异性表达
pAOV-CMV-Globin-Cre 广泛表达
pAOV-CMV-Cre 广泛表达
pAOV-CAG-EGFP-T2A-Cre 广泛表达
pAOV-CMV-bGlobin-EGFP-Cre 广泛表达
pAOV-CaMKIIα-GFP-2A-Cre 特异性表达
pAOV-GFAP-GFP-Cre 特异性表达
pAOV-Syn-Cre-2A-GFP 特异性表达
pAOV-EF1A-DIO-EGFP Cre依赖表达启动
pAOV-EF1A-DIO-mCherry Cre依赖表达启动
EF1A promoter drive gene MPF
Liu et al. Science, 2014
细胞结构标记
Mito-DsRed by lentiviral
infection
Zhang et al, Autophagy,2015
Actin-EGFP labeling spines
Fischer et al, Nature, 2000
•同源重组
•外源表达
•基因组编辑
•同源重组
•敲减+外源表达
•敲除+外源表达
•基因组编辑
• RNAi• 同源重组
• 基因组编辑
基因敲除 基因敲减
基因表达基因突变
病毒载体设计原理和基本流程
•腺病毒•慢病毒
• AAV
•慢病毒•腺病毒
瞬转细胞
稳转细胞
瞬转组织
稳转组织
基因表达病毒载体设计
pLenti-CMV-LncRNA
7729 bp
Ampicillin
LncRNA
HIV-1 5 LTR
HIV-1 psi pack
RRE
cPPT
WPRE
truncHIV-1 3 LTR
CMV promoter
AmpR promoter
pBR322 origin
复制子、复制起点
原核筛选抗性包装容量
（Pack Capacity）
真核表达框（Open Read Frame, ORF）
Capacity = ORF+ WPRE+RRE + LTR
（ITR）
启动子名称 来源 用途 应用举例
CMV 病毒启动子 基因表达 神经系统肿瘤
EF1a、UbiC 组织来源 基因表达 神经元，神经干细胞
CAG、CBG 嵌合型启动子 基因表达 神经元
H1/U6 III型启动子 shRNA或microRNA表达 神经组织
Syn 组织来源 基因表达 成熟神经元
CaMKIIα 组织来源 基因表达 锥体神经元
GAD67 组织来源 基因表达 中间神经元
hGFAP 组织来源 基因表达 星形胶质细胞
启动子选择
标记基因 激发波长 发射波长 片段/分子量
EGFP/GFP/YFP 488nm 507nm 0.6kb/26kd
RFP 563nm 582nm 0.6kb/26kd
mCherry 587nm 610nm 0.6kb/26kd
tdTomato 554nm 681nm 1.4kb/55kd
抗生素 筛选浓度 药效持续 筛选时间
Puromycin 1-10 µg/ml 2-3d 3-10d
G418 102-103µg/ml 2-3d 3-10d
Gentamicin 0.5-50µg/ml 2-3d 3-10d
标签基因 序列 用途
3xFlag (DYKDDDDK)3 免疫组化、免疫荧光、WB
His (His)6 亲和层析、免疫组化、WB
HA YPYDVPDYA 免疫组化、免疫荧光、WB
Myc EQKLISEEDL 亲和层析、免疫荧光、WB
表达载体设计要素——标记基因
融合表达 vs. 非融合表达
• 目的基因与标记基因融合表达标记基因影响导肽或信号肽的作用
目的基因的转录效率影响标记基因表达
• 目的基因与标记基因独立表达 2A：多肽水平切割，会在5’多肽上留有AA残基
IRES：mRNA水平分隔，分隔效率较低
Fusion Expression isolated by 2A
序列确认 序列筛选
载体构建 效率验证
RNAi实验流程
AAV2/8 mediated H1 promoter produce
PKMλ shRNA in CA1
Ren et al., EMBO J 2012
Lentiviral H1 promoter produce PKMξshRNA in hippocampus
Cheng et al., JBR 2015
基因组编辑技术Genome editing
• ZFN(锌指蛋白酶技术) 2002
• TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶) 2009
• CRIPSR/Cas9 2011
什么是CRISPR/Cas
提供了一种方便、高效的基因组编辑技术
1. 基因敲除 Knock out(精确修改/随机修改)
2. 基因突变(精确修改)
Cas 蛋白: spCas9, saCas9, Cpf1
gRNA: 不同的Cas蛋白对应不同的gRNA
基因组编辑技术原理
Non-Homologous End-Joining (NHEJ)
非同源重组末端连接Homologous Recombination(HR)
同源重组
Double-Strand Break(DSB)
双链断裂
spCas9
Cas9种类 载体种类 Cas9/Cas9+gRNA gRNA
spCas9野生型
腺病毒pAdeno-U6-sgRNA-CMV-3Flag-spCas9 已整合
pAdeno-CMV-mCherry-T2A-3Flag-spCas9 pAdeno-U6-gRNA-CMV-EGFP
慢病毒pLenti-U6-gRNA-CMV-Puro-P2A-3Flag-spCas9 已整合
pLenti-CMV-Puro-P2A-3Flag-spCas9 pLenti-U6-gRNA-CMV-EGFP
腺相关病毒 pAAV-miCMV-spCas9 pAAV-U6-gRNA-CMV-EGFP
其它(体外转录) pcDNA3.1(+)-3Flag-spCas9 Dev-T7-gRNA
spCas9突变型腺病毒
pAdeno-U6-sgRNA-CMV-3Flag-spCas9n 已整合
pAdeno-CMV-mCherry-T2A-3Flag-spCas9n pAdeno-U6-gRNA-CMV-EGFP
慢病毒 pLenti-CMV-Puro-P2A-3Flag-spCas9n pLenti-U6-gRNA-CMV-EGFP
第一步:确定实验目的,选择sgRNA位置
• Knock out
• Transcriptional regulation
• Point mutation
• N/C-term tagging
Cas载体设计与验证
第二步:了解目的基因的转录本及基因组序列
http://genome.cse.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway
IL6
Entrez Gene: 3569
启动子区
第一外显子区
第一内含子区
第二外显子区
第二内含子区
第三外显子区
第三步:gRNA设计
http://www.e-crisp.org/E-CRISP/ http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html
Cas9载体构建与活性验证
转染目的物种细胞（如293，3T3等）
转染后提取细胞基因组DNA，进行扩增
如出现“套峰”现象，再进一步进行验证
T7E1切割验证
“套峰”
Cel1实验原理示意图
T7E1切割验证
T7E1 Assay
Cas9质粒活性检测实例
PCR产物~500bp
预测切割产物~340bp
预测切割产物~160bp
Control Cas9
Cas9实验案例
Step 1.表达启动Step 2. 启动编辑
Optogenetic= Optic（光）+ Genetics （遗传学）
"Method of the Year" - Nature Methods 2010
“Breakthroughs of the Decade - Science 2010
Karl D
eisseroth
(20
11) N
ature M
ethod
s
Optogenetics
Dr. Karl Deisseroth
Karl Deisseroth (2011) Nature Methods
Advantages over Electrical Stimulation
Schematic diagram of Optogenetic techniques
直接表达 依赖性表达
DREADD: Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs
DREADD Receptor Drug Effect
Gq-DREADD hM3Dqclozapine-N-oxide (CNO)
叠氮平-N-氧化物
激活（增强神经元的兴奋性）
Gi-DREADD hM4Di 抑制（抑制神经递质的释放）
Gs-DREADD Gs-D cAMP增加，神经递质释放增加
CNO: high affinity, highly bioavailable, inert molecule
Chemogenetics
Rogan and Roth, Pharmacol Rev 2011 Jun;63(2):291-315
DREADD
Schematic diagram of DREADD techniques
直接表达
依赖性表达
Calcium Indicator
In-vivo two photon calcium imaging in motor cortex of a
mouse free to rest or run on a treadmillCultured neuron and neural stem cell imaging
Calcium Imaging
GCaMP 6f f= fast 光强较弱，更快淬灭GCaMP 6s s=slow 光强最强，更晚淬灭GCaMP 6m m=medium 光强和淬灭都是中等
Tsai-Wen Chen et al, (2013) nature, doi:10.1038/nature12354
GCaMP6 – in vivo study
calcium indicator工具病毒
载体名称 应用特点
pAOV-CMV-GCaMP6(f) 广泛表达
pAOV-CMV-GCaMP6(s) 广泛表达
pAOV-CMV-GCaMP6(m) 广泛表达
pAOV-CMV-GCaMP5(g) 广泛表达
pAOV-Syn-GCaMP5(g) 组织特异性表达
pAOV-Syn-GCaMP6(f) 组织特异性表达
pAOV-Syn-GCaMP6(s) 组织特异性表达
pAOV-EF1a-Dio-GCaMP5(g) Cre依赖表达
pAOV-EF1a-Dio-GCaMP6(f) Cre依赖表达
pAOV-EF1a-Dio-GCaMP6(s) Cre依赖表达
情感和记忆的神经环路基础
核心问题：
（一）情感和记忆的结构环路与功能环路间的相互关系；
（二）情感和记忆神经环路相互作用和调控机制；
（三）遗传和应激等环境因素对神经环路可塑性的作用及其调控机制。
近年研究进展
2013, Science：
植入记忆不再是科幻2014，Nature：
光遗传，让坏记忆变美好
2015-2016，Science&Nature：
光遗传，找回“丢失”的记忆
Xu Liu，Steve Ramirez，Susumu Tonegawa，Nature(2012) and Science(2013)
h
i
Steve Ramirez， Xu Liu， Susumu Tonegawa，Nature(2014)
c d
Susumu Tonegawa，Science(2015)
E
情感和记忆的神经环路基础——利用光遗传及环路示踪
通过干预“延迟期间”小鼠大脑内侧前额叶（mPFC）的
电活动影响了记忆任务的学习正确率，阐明了该脑区在记忆学习过程中放电模式变化的规律。
学习记忆
Laterodorsal tegmentum interneuron subtypes
oppositely regulate olfactory cue-induced innate
fear
Nature Neuroscience(2015)
气味诱导小鼠恐惧， PV阳性的GABA神经元就像一个恐惧开关。
a
d
背外侧被盖区逆向追踪至缰核。
先天恐惧的神经环路机制
情感影响学习记忆的神经环路机制
Nature Communications(2016)
情感和记忆障碍——分子机制
基于外侧缰核的抑郁模型 Science(2013)
抑郁症
D
Stress and other aversive emotional
stimuli activate LHb neurons and
increase the βCaMKII level, which
can induce more GluR1 to insert into
the synapse and more spontaneous
spiking output. The hyper-activated
LHb can further inhibit the VTA and
DR (Dorsal Raphe), and then lead to
the core symptoms of depression.
胶质细胞释放生长因子促进干细胞分化为多巴胺能神经元
用光遗传技术激活神经胶质细胞可促进神经干细胞向多巴胺能神经元分化并显著改善帕金森氏疾病动物受损脑功能。
帕金森
Nature Communications(2014)
突触可塑性
树突棘修剪的竞争模型。Cell (2015)
代表性论文
人类只有攻克一个又一个前沿才能创造更灿烂的文明，才能让自身屹立于茫茫宇宙之中。面对人类科学“最后的前沿”，让我们像第一次飞入太空的宇航员加加林那样，豪情万丈地说：“让我们出发！”
——仇子龙研究员 蒲慕明院士
一流科研服务供应商
技术研发
技术转化技术推广
公司核心使命
AAV产业化工艺技术研发 组织特异性启动子及表达载体研发 罕见疾病的基因诊断技术研发 Cas9基因组编辑技术及载体研发
临床应用级别AAV生产 特异性启动子介导的靶向基因治疗 罕见疾病的基因诊断试剂盒 Cas9基因组编辑技术应用于基因治疗
基因表达、RNAi、基因组编辑技术 病毒载体构建、包装和纯化技术 启动子、microRNA和lncRNA调控活性检测技术 细胞功能学及动物实验
