CONTAJE DE

RETICULOCITOS

INTRODUCCION

Los reticulocitos son eritrocitos inmaduros que contienen, como su nombre lo indica, un retículo o red cromatínica formada por restos de ARN (Ribosomas) mitocondrias y otros órganos celulares.

Tienen un tamaño de 7 a 10 um de diámetro. Permanecen en médula ósea unos 2 o 3 días y después salen a sangre periférica, donde terminan el proceso de maduración en unas 24 horas.Su cantidad en sangre periférica es un reflejo de la actividad eritropoyética medular.

METODICA

Fundamento:

Podemos observar los reticulocitos al microscopio óptico mediante la tinción con colorantes vitales, azul de metileno nuevo o azul de cresil brillante. Estos colorantes dan lugar a la precipitación de los restos de ARN, y se observan como filamentos de color azul intenso en el interior de la célula.Según el grado de maduración que posea el reticulocito presentará un modelo de retículo distinto, de ovillo denso en el caso de los más inmaduros o de gránulos escasos para los más maduros. Se pueden clasificar en cuatro grupos distintos tal como se observa en la figura.

Grado I

Célula joven

Grado II Grado III Grado IV

MATERIAL NECESARIO

• Microscopio óptico• Tubos de hemólisis• Pipetas pasteur• Portas• Baño maría• Sistema de filtración

REACTIVOS

• Azul de cresil brillante en polvo• Solución salina al 0.9%• Citrato sódico al 3%• Agua destilada• Aceite de inmersión

MUESTRA

Sangre anticolagulada con EDTA

Debido a que los reticulocitos también maduran in vitro, es aconsejable que la sangre utilizada se haya extraído recientemente, como máximo 6 horas antes de su análisis.

TECNICA

1. Preparación del colorante: Mezclamos 80 ml de solución salina y 20 ml de citrato sódico al 3%.Pesamo 1 g de azul de cresil brillante y lo disolvemos en la mezcla anterior.Filtramos antes de usarlo.

2. Tinción de los reticulocitos:Es una tinción supravital, es decir, se hace mientras las células aún están vivas.Para ello echamos 3 gotas de la solución colorante en un tubo de hemólisis y otras 3 gotas de sangre total previamente homogenizada.Mezclamos suavemente y tapamos con papel parafilm. Introducimos en el baño maría a 37º C durante 5 minutos.Pasado este tiempo volvemos a homogenizar y tomamos una gota de la suspensión para depositarla en un porta.Realizamos una extensión y dejamos secar al aire.

Lectura de Resultados

Con una gota de aceite de inmersión observamos la extensión con el objetivo de 100x.Los hematíes se habrá teñido de color verde amarillento y los reticulocitos se diferencian porque presentan en su interior unos hilos finos de color azul.Se deben contar 2000 hematíes en total, y el cálculo del porcentaje de reticulocitos es el siguiente:

Nº de reticulocitos contadosNº de hematíes contados

Para descartar errores en la técnica debemos realizar dos extensiones y hacer el recuento en ambas, de manera que la diferencia entre ellas sea igual o menor a 5 reticulocitos.

El resultado final es la media de los 2 porcentajes obtenidos.

% reticulocitos =% reticulocitos = x 100x 100

INTERPRETACION CLINICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

En adultos y niños los valores normales están entre 0.5 y 2%.

Se produce reticulopenia o disminu´ción en la cifra de los reticulocitos, en casos de aplasia medular, anemia ferropénica, anemia megaloblástica y anemias que cursan con dificultad en la eritropeyesis.

Por el contrario, hay reticulocitos en anemias hemolíticas y post-hemorrágicas, donde se aumenta el nivel de producción de hematíes para contrarrestar su pérdida.

La cantidad de reticulocitos expresada en tanto por ciento es un valor relativo referido a una cifra normal de hematíes. Por ello, cuando existe una anemia con disminución en la cantidad de hematíes se compensa con un aumento en el número de reticulocitos y debemos corregir su valor en tanto por ciento para poder considerarlo real.

La corrección se hace en base al valor hematocrito (Hto) del paciente y se calcula de la siguiente forma:

% reticulocitos corregido% reticulocitos corregido = % reticulocitos x = % reticulocitos x Hto. PacienteHto. Paciente

Hto. normalHto. normal

Si existe una anemia muy intensa, aparece en sangre periférica un número de reticulocitos mayor del que correspondería por regeneración eritroblástica.Esto se debe a que el estímulo eritropoyético compensador va acompañado de un periodo de maduración intramedular más corto y una etapa de maduración en sangre periférica más largas.

Esto se conoce como “desviación reticulocitaria” y se observa en el frotis por la aparición de hematíes grandes con un color azulado (macrocitos policromáticos). Para evitar pensar que hay una capacidad regenerativa medular intensa se debe hace una segunda corrección del % de reticulocitos en función de los días que tarda en madurar el reticulocito en sangre periférica, y a esto se le llama índice de producción reticulocitaria (IPR). Se obtiene con la siguiente fórmula:

IPR =IPR = % reticulocitos corregido .% reticulocitos corregido .

Días de maduración en sangre periféricaDías de maduración en sangre periférica

Los días que tarda en madurar el reticulocito está reflejados en la tabla, cuyos valores se han obtenido experimentalmente:

Hematocrito del Hematocrito del paciente paciente

(%)(%)

Tiempo de Tiempo de maduraciónmaduración

(días)(días)

4545 11

3535 1’51’5

2525 22

1515 2’52’5

El IPR nos da un valor numérico de la estimulación hematopoyética El IPR nos da un valor numérico de la estimulación hematopoyética por encima de la actividad de la línea base normal.por encima de la actividad de la línea base normal.

Un IPR mayor de 3 nos indica un aumento de la actividad Un IPR mayor de 3 nos indica un aumento de la actividad eritropoyética medular, mientras que un IPR menor de 2 indica una eritropoyética medular, mientras que un IPR menor de 2 indica una escasa actividad eritropoyética.escasa actividad eritropoyética.

TablaTabla

HOJA DE TRABAJO

1. ¿Qué son los reticulocitos?

2. ¿Qué tipo de tinción estamos utilizando?

3. ¿Por qué hacemos la corrección del porcentaje de reticulocitos?

4. ¿Qué nos expresa el IPR?

Resultado obtenidosResultado obtenidos

Observe al microscopio óptico la tinción de reticulocitos y Observe al microscopio óptico la tinción de reticulocitos y dibuje las células observadas.dibuje las células observadas.

Indique en qué grado de maduración se encuentran.Indique en qué grado de maduración se encuentran.

Cuente 2.000 hematíes y haga el cálculo del porcentaje de Cuente 2.000 hematíes y haga el cálculo del porcentaje de reticulocitos.reticulocitos.

Realice el hematocrito y calcule el porcentaje de reticulocitos Realice el hematocrito y calcule el porcentaje de reticulocitos corregido.corregido.

HemoglobinaHemoglobina

• Una molécula de Hemoglobina consta de 2 pares de cadenas polipeptídicas (unión de aminoácidos) (globina) y 4 grupos prostéicos HEM que contienen cada uno un átomo de Fe en estado ferroso.

•Las cadenas peptídicas que son iguales 2 a 2 adoptan una posición helicoidal; lo que da a la molécula de Hemoglobina una estructura esteroide.

• En el ser humano se pueden encontrar las siguientes Hemoglobina normales:

HEMOGLOBINA A: • consta de 2 cadenas α y 2 cadenas β . En un

adulto normal corresponde a más del 95% del total.

HEMOGLOBINA A2:• consta de 2 cadenas α y 2 δ (delta). En un

adulto sano está en proporción menor al 3%.

HEMOGLOBINA F ó fetal: • consta de 2 cadenas α y 2 γ (gamma). Es la

Hemoglobina principal en el feto desde el 4º mes de embarazo hasta aproximadamente los 6 meses de edad. La HB F tiene mayor afinidad por el O2 por lo que capta el de la Hemoglobina madre.

HEMOGLOBINA Gower: • existen 2 tipos de esta Hemoglobina en el

embrión. Desaparece casi por completo en el tercer mes de embarazo y empieza a aparecer la HB F.

• La principal función de la hemoglobina es el transporte del O2 de los pulmones donde la tensión es elevada hacia los tejidos donde es baja.

• A una tensión de O2 de 100mmHg en los capilares pulmonares del 98% de hemoglobina se combina con el O2.

• En los tejidos donde la tensión de O2 puede descender hasta 20 mmHg el O2 se disocia fácilmente de la hemoglobina; en este caso menos de un 30% del O2 puede permanecer combinado con la hemoglobina.

• Si la Hb esta cargada de O2, se llama oxihemoglobina (Hb-O2) y si esta libre de él, se denomina desoxihemogloina o Hb reducida (Hb-red)

• La Hb-O2, pedomina en la sangre arterial y la Hb-red en la sangre venosa

• Cada molécula de Hb puede transportar hasta un máximo de 4 moléculas de oxigeno (Hb saturada)

• La sangre se diluye en líquido de Drabkin (ferricianuro potásico + cianuro potásico), el cual hemoliza los hematíes y convierte la Hb en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina).

• La solución que se produce se lee por medio de un espectrofotómetro o fotocolorímetro.

• Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad de hemoglobina que contenga la sangre.

Dosaje de Hemoglobina

Interpretacion clinica de resultados

• Se habla de valores de referencia ya que existen diferencias notables entre zonas geográficas y grupos étnicos donde exisen ciertas anemias carenciales que afectan a un número elevado de la población.

• En hombres : 14 – 18 g/dl• En mujeres : 11 – 16 g/dl• En miños : 10 – 14 g/dl

ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINAS

La electroforesis es una técnica analítica que sirve para separar las moléculas en función de su carga eléctrica neta.

Cuando se aplica una corriente eléctrica a un medio electrolítico que contiene moléculas cargadas, las moléculas cargadas negativamente

(aniones) se desplazan hacia el electrodo positivo (ánodo), y las cargadas positivamente (cationes) se desplazan hacia el electrodo negativo (cátodo).

Las proteínas son moléculas anfóteras, es decir, pueden estar cargadas positiva o negativamente o no estarlo, según el pH del medio en le que se

encuentran. Así pues, cuando el pH del medio que circunda las proteínas es neutro, éstas se comportan como partículas no cargadas. Sin embargo, si el pH del medio

que las rodea es ácido, las proteínas adquieren una carga eléctrica neta positiva. Y por el contrario, cuando el pH es básico (o alcalino), las proteínas

se cargan negativamente.

Fundamento • La carga eléctrica global de las hemoglobinas es la resultante de la suma de las

cargas de los aminoácidos que constituyen las cadenas polipeptidicas de su globina. • En la electroforesis de hemoglobinas, el hemolizado se deposita sobre un soporte

empapado en un líquido alcalino y se aplica una corriente eléctrica que lo atraviesa. • Como las cadenas polipeptídicas de la globina en medio básico adquieren una carga

eléctrica • La carga eléctrica global de las hemoglobinas es la resultante de la suma de las

cargas de los aminoácidos que constituyen las cadenas polipeptídicas de su globina.• En la electroforesis de hemoglobinas, el hemolizado se deposita sobre un soporte

empapado en un líquido alcalino y se aplica una corriente eléctrica que lo atraviesa.• Como las cadenas polipeptídicas de la globina en medio básico adquieren una carga

eléctrica neta negativa, las hemoglobinas se van desplazando progre sivamente hacia el ánodo (migración).

• Pero en la sangre hay varios tipos de hemoglobinas y cada una de ellas adquiere la carga eléctrica de una forma más o menos intensa. Así pues, las más electro negativas avanzan más rápidamente hacia el ánodo y las menos electro negativas lo hacen más lentamente.

• Al cabo de un cierto tiempo, las moléculas de Hb idénticas se agrupan entre sí y adoptan el aspecto de bandas.

• Cada banda está constituida por un tipo diferente de Hb y se separa del resto debido a su distinta carga eléctrica neta y, por consiguiente, a su diferente capacidad de migración.

Material necesario • Una gradilla • Tubos de centrífuga • Una centrífuga • Un espectrofotómetro • Cubetas de espectrofotómetro • Un vidrio de reloj • Pinzas • Papel de filtro • Una placa de vidrio de unos 18 x 18 cm. • Una estufa • Un reloj

Una fuente de alimentación: consiste en un generador de corriente eléctrica con el que se puede regular el voltaje (en voltios) y la intensidad (en miliamperios) que se aplica.

Una cubeta: es el recipiente donde se lleva a cabo la electroforesis.Consta de dos cavidades separadas entre sí en las que se localizan los electrodos.Está conectada a la fuente de alimentación mediante dos cables diferentes: uno para el polo negativo, que es de color negro, y otro para el polo positivo, que es de color rojo.

Un puente: en él se sitúan las tiras soporte para que estén horizontales y con sus extremos en contacto con el tampón.Aunque puede ser de varios tamaños, en esta práctica se recomienda el uso de un puente de 8,5 cm de ancho.Se complementa con unas pinzas especiales que sirven para fijar las tiras a su estructura.·

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Aparato de electroforesis

Medio de soporte: es el medio físico en el cual migran las proteínas.

Hay dos tipos principales: los que permiten la separación molecular en base a su carga eléctrica neta y los que hacen

posible la separación en base a la carga y al tamaño molecular.Dentro del primer tipo se incluye el acetato de celulosa (Cellogel de los laboratorios ATOM), que es el soporte

recomendado en esta práctica. Éste se proporciona en forma de tiras (por ejemplo, de 2,5 x 17 cm) que deben conservarse en

una solución de metanol al 30%.

. Un fotodensitómetro.

Un aplicador: se utiliza para depositar la muestra sobre las

tiras soporte

Reactivos• Suero fisiológico (solución de cloruro sódico al 0,9%). • Agua destilada o desionizada.• Cloroformo o triclordmetano (CI3CH).• Tampón: es el líquido que ioniza las proteínas.

En esta práctica se utiliza un tampón TRIS-GLlCOCOLA, cuya composición es la siguiente:

• Tris-Hidroximetilaminometano : 7,05 g.• Glicocola : 11,3• Agua destilada : c.s.p. 1000 mI.

• . Colorante: se emplea para poner de manifiesto las bandas que se han formado tras migración electroforética

Aunque las bandas pueden teñirse con varias sustancias, en esta práctica se recomienda el uso del rojo Ponceau, cuya composición es la siguiente:

• Rojo Ponceau 0,5 g.• Ácido tricloroacético al 5% 100 mI.

•Decolorante: elimina el exceso de colorante que tiñe las tiras. Su composición depende del colorante empleado.Si se utiliza como colorante el rojo Ponceau, el decolorante es una solución acuosa de ácido acético al 5 %.

•· Deshidratante: alcohol metílico (metanol).•· Solución transparentadora: se prepara mezclando,

extemporáneamente, una solución A y otra B, a una proporción de 9 partes de A con una parte de B.La composición de las dos soluciones transparentadoras es la siguiente:

Solución A:

Metanol..........................870 mlCiclohexa nona ...................... 30 ml

Solución B:

Acido acético ........................ 100 ml

Muestra Hemolizado preparado de la siguiente manera:

• 1 ° Anticoagular la sangre problema.• 2° Centrifugar la sangre anticoagulada a 3.000 tpm,

durante 5 minutos. • 3° Retirar el plasma.• 4° Resuspender los hematíes con 4-S mi de suero

fisiológico.• 5º Centrifugar la suspensión de hematíes a 3.000

rpm durante 5 minutos. • 6° Retirar el sobrenadante

•7° Repetir el lavado de los hematíes 3 veces más hasta obtener un concentrado de hematíes lavados.•8° Hemolizar los hematíes, añadiendo, a 1 volumen de éstos, 1,5 volúmenes de agua destilada y O,S volúmenes de cloroformo.•9° Agitar fuertemente la mezcla anterior.10° Centrifugar la mezcla a 3.000 rpm durante 20 minutos •11° Retirar el hemolizado (el sobrenadante).•12° Determinar la concentración de Hb que está presente en el hemolizado, mediante un método habitual (por ejemplo, el de la cianmetahemoglobina).•13° Diluir el hemolizado con agua destilada hasta lograr que tenga una concen tración de Hb de 5g/100 ml.

Para ello hay. que tener en cuenta la concentración inicial de la Hb en el hemolizado, que previamente se ha determinado.

Técnica

• 1 ° Sumergir las tiras en tampón durante 10 minutos como mínimo.• 2° Absorber el exceso Re tampón de las tiras, situándolas entre dos hojas de

papel de filtro.• 3° Montadas tiras sobre el puente, de forma que queden dispuestas con su cara

absorbente (mate) hacia arriba. Para estar seguros de esto, la esquina cortada de las tiras siempre debe estar cercana al analista y hacia su lado derecho.

• 4° Verter en el interior de la cubeta la cantidad de tampón suficiente para que los electrodos queden cubiertos.

• 5° Introducir el puente con las tiras en el interior de la cubeta, de forma que los extremos de éstas queden sumergidos en el tampón.

• 6° Depositar un poco de la dilución del hemolizado en el interior de un vidrio de reloj y tocarla, suavemente, con el extremo ranurado del aplicador para cargarlo con ella.

• 7° Situar la dilución del hemolizado, mediante el aplicador previamente car gado, sobre el extremo catódico de cada una de las tiras y, aproximada mente, a 1,5 cm de su borde libre.

Se considera extremo catódico de la tira al extremo de ésta que está más cercano al cátodo. Este electrodo suele corresponderse con la entrada negra de la cubeta.

•8° Conectar la cubeta al alimentador, usando un cable negro para la entrada de la cubeta y la salida del alimentador de color negro, y otro rojo para la salida de la cubeta y la entrada del alimentador de color rojo.De esta manera se hace atravesar la corriente eléctrica desde el extremo catódico de las tiras hasta su extremo anódico.

•9° Encender la fuente de alimentación y aplicar sobre las tiras una corriente eléctrica de 200 voltios, durante 90 minutos.

•10° Transcurrido ese tiempo, apagar el alimentador y desconectarlo de la cubeta.

•11° Sumergir las tiras, con su cara absorbente hacia abajo, en el colorante ele guido durante unos 10 minutos.

•12° Decolorar las tiras, mediante baños sucesivos de las mismas en el decolorante apropiado, hasta que se vean claramente las bandas de hemoglobina y el fondo sea blanco.

Lectura de resultados Para la lectura de las bandas presentes en las tiras, se suele proceder al

transparentado de las mismas. Esto se realiza de la siguiente manera:

• 1 ° Deshidratar las tiras, sumergiéndolas en metanol durante 1 minuto.• 2° Sumergir las tiras en una mezcla de soluciones transparentadoras

preparada recientemente.• 3º Este baño de las tiras en la mezcla transparentadora se efectúa bajo

agitación y durante 1 o 2 minutos.Extender las tiras sobre una placa de vidrio, de forma que su cara absorbente quede en contacto con el cristal y procurando que no se formen burbujas de aire al hacerlo.

• Si a pesar de ello se forman burbujas, se ha de intentar eliminarlas utilizan do un tubo como un rodillo.

• 4° Calentar la placa en una estufa, a una temperatura de 60-70 °C, hasta que la transparencia de las tiras sea completa.

• 5° Dejar enfriar la placa, a temperatura ambiente, durante unos minutos.• 6° Desprender las tiras de la placa.

Los resultados de la prueba pueden apreciarse visual mente o

fotodensitométricamente

• La observación visual de las tiras transparentadas permite detectar la presencia de bandas anómalas o de engrosamientos de las bandas normales.

• La lectura fotodensitométrica de las bandas comienza con un barrido de la tira con un haz de luz a 520 nm (si se usa como colorante el rojo Ponceau), seguido de una medición de la absorbancia de cada banda, a esa longitud de onda, que es registrada gráficamente en forma de curvas.

• El fotodensímetro también evalúa el área que corresponde a cada curva y proporciona el porcentaje que representa cada una de ellas con respecto al total de las áreas. Como las áreas son directamente proporcionales a la absorbancia producida, y ésta lo es a su vez a la cantidad de Hb presente en las bandas, estos porcentajes expresan la cantidad de cada tipo de Hb que hay en la sangre problema con respecto a la cantidad total de hemoglobinas que hay en ella.

Interpretación clínica de los resultados obtenidos

• La electroforesis de hemoglobinas permite detectar anomalías hemoglobínicas cuantitativas o cualitativas.

• Las anomalías cuantitativas de la hemoglobina se deben al aumento y/o a la disminución de un tipo normal de Hb con respecto al resto. Esto sucede, por ejemplo, en la B talasemia.

• Las anomalías cualitativas de la hemoglobina (hemoglobinosis) se deben a pequeños cambios en la secuencia de aminoácidos que componen las cadenas de globina de algunas moléculas de Hb. Estos cambios modifican la carga eléc trica de estas moléculas de Hb y determinan una variación en su capacidad de migración. Las hemoglobinosis se detectan, por tanto, en la electroforesis, debido a la aparición de bandas de hemoglobinas anómalas. Este es el caso de la anemia falciforme y el de la hemoglobinosis.