CURSOS EM BIOLOGIA, BIOQUÍMICA, BIOTECNOLOGIA, E ...w3.ualg.pt/~jvarela/bioinformatica/T9-T10-2018-2019.pdf · CURSOS EM BIOLOGIA, BIOQUÍMICA, BIOTECNOLOGIA, E ENGENHARIA BIOLÓGICA

C U R S O S E M B I O L O G I A , B I O Q U Í M I C A , B I O T E C N O L O G I A , E E N G E N H A R I A

B I O L Ó G I C A

Bioinformática

João [email protected]

Aulas T9-T10

Esquema de anotação Annothaton

1. ORFs? Coordenadas? Quadro de leitura? Cadeia + ou -? (SMS ORF Finder)

2. Existem proteínas homólogas? (BLASTp, BLASTx)3. Existem domínios funcionais? Onde? (InterProScan)4. Qual o tamanho / massa molecular da proteína codificada

pela ORF em aa / kDa?5. A que organismo ou táxon pertencerá a sequência

metagenómica? (BLAST Taxonomy Report)6. Relações filogenéticas (MSA; Prof. Rita Castilho)7. Conclusões e Análise de Resultados (PONTO PRINCIPAL DA

AVALIAÇÃO)

Massa Molecular (Molecular Weight)

� 1 Da = 1 unidade de massa atómica = 1/12 massa de um átomo de C ≈ massa de um átomo de H

� 1 mole de H tem uma massa de 1 g� Logo: 1 Da => 1 g mol-1

� A massa molecular de uma macromolécula depende do nº de unidades que a forma

� Mw Proteína = somatório da Mw dos resíduos de aa� Mw DNA = somatório da Mw dos resíduos de nucleótidos� Annothaton: anotar Mw - apenas se a ORF estiver

completa!

A ORF está completa quando:

� Identificámos o seu codão STOP (a 3’)� Identificámos o seu codão START (a 5’)� O alinhamento múltiplo (MSA = multisequence

alignment) com sequências homólogas não revela a falta de qualquer sequência

Determinação do codão START por MSA

GOS_12345 MSAHNTMALAGHAHHHAIKLYVVFABD_P0001 MSAHYTMALVGHAHKHAIKLYVIFABP_P0002 MSAHYTMALVGHAHHHAIKLYVVFA

Exemplo 1 Conclusão

A ORF está completana sua extremidade 5’

GOS_12345 MALAGHAHHHAIKLYVVFABD_P0001 MSAHYTMALVGHAHKHAIKLYVIFABP_P0002 MSAHYTMALVGHAHHHAIKLYVVFA


A ORF está incompletana sua extremidade 5’

GOS_12345 MSAHNTMALAGHAHHHAIKLYVVFABD_P0001 MALVGHAHKHAIKLYVIFABP_P0002 MALVGHAHHHAIKLYVVFA


A ORF começa no2º codão START

Alinhamentos de sequências múltiplas (MSA)Para que servem?

� Determinar qual o verdadeiro codão START por comparação com sequências homólogas e corrigir a extremidade 5’ dada pela “greedyapproach”

� Procurar sequências adicionais� Montar sequências genómicas� Montar ESTs� Pontos de partida para análises filogenéticas

Alinhamentos de sequências múltiplas (MSA)Pesquisa de sequências adicionais

5’-ACTGATTAGCAACTAAGGACATAAAACTGCTTAGCCAT-3’5’-ACTGATTACCATACATTGACTTAACTGACTAATCTTAT-3’5’-ACTGATTAGCATCCAAGGACATAAAACTGCTATGTTAT-3’

ACTGATTASCAWMYAWKGACWTAAMWSWSYWWWSYYATConsensoprimer, sonda

(sequência comum usada para detectarfamílias de genes [homólogos] por hibridação)

Alinhamentos de sequências múltiplas (MSA)Montagem de sequências genómicas

5’-AGCTATTACAGGAACTTGCACATGGGCTTAGCTAGCAAATTTAGC-3’ seq123_67seq123_24 5’-CTTGCACATGGGCTTAGCTAGCAAATTTAGCTAGCT-3’

seq123_89 5’-CAAATTTAGCTAGCTTGCCATTA-3’

seq123_67 + seq123_24 + seq123_89 = contig

ESTs (Expressed Sequence Tags)

Expressed Sequence Tags(fragmentos de sequências de cDNA

de RNAs transcritos de um dado tecido ou células)

RNA1RNA2RNA3RNA4...RNAn

cDNA1cDNA2cDNA3cDNA4...cDNAn

Célula

Extracção de RNA,

Síntese decDNA

Sequenciação

EST1-1

EST1-2cDNA15’

5’

Alinhamentos de sequências múltiplas (MSA)Montagem de ESTs para a dedução de sequências completas de RNA transcrito numa célula / tecido

http://cseweb.ucsd.edu/groups/bioinformatics/ESTs/index.html

Detecção de splicing alternativo





metagenómica? (BLAST Taxonomy Report)6. Relações filogenéticas 7. Conclusões e Análise de Resultados (PONTO PRINCIPAL DA

AVALIAÇÃO)

BLAST Taxonomy Reports

Lineage Report

A importância do Organism Report

Valor EScore

Critérios de decisão de taxonomia da fontebiológica de sequências metagenómicas

� Escolher o táxon que tenha valores E e scores com diferenças significativas com os restantes taxa

� Caso haja apenas taxa com valores E e scores muitopróximos (não significativos) essa sequência não édiagnosticante para esse táxon; por isso escolher um táxon mais abrangente





metagenómica? (BLAST Taxonomy Report)6. Relações filogenéticas 7. Conclusões e Análise de Resultados (PONTO PRINCIPAL DA

AVALIAÇÃO)

Taxonomia e Ontologia Molecular

� Taxonomia (Annotathon)� Ontologia Génica (GO)� Conclusões (Annotathon)

Taxonomia

� Uma das funções das anotações (meta)genómicas é a definição do táxon da fonte de material genético

Tipos de Classificações

� Classificação hierárquica (de Lineu)� Classificação cladística

Classificação Hierárquica de Sistemas Biológicos

� Domínio� Superreino, Reino, Subreino� Superfilo, Filo (≈ divisão), Subfilo� (Superclasse,) Classe, Subclasse� Superordem, Ordem, Subordem (, Infraordem)� (Superfamília, Epifamília,) Família, Subfamília (, Tribo,

Subtribo, Infratribo)� Género, Subgénero� Espécie, Subespécie� Estirpe (≈ variedade)

Clades

Clades – ramos monofiléticos de uma árvore filogenética

Monofilia, Parafilia e Polifilia

� Grupo monofilético – grupo taxonómico que provém de um ancestral comum cujos descendentes se encontram incluídos neste grupo (≈ grupo holofilético)

� Grupo parafilético – grupo taxonómico que provém de um ascendente comum cujos descendentes se encontram parcialmente incluídos neste grupo

� Grupo polifilético – grupo taxonómico que provém de mais que um ascendente

Monofilia, Parafilia e Polifilia

Clades

NCBI Taxonomy Database

� Cada táxon tem um nº de identificação - NCBI numerical identifier ou Taxonomy ID

Filogenia

� http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/

� Pesquisa por táxon ou identificador numérico

� Colocar o identificador numérico no campo Taxonomy para o táxon menos abrangente ao qual a sequênciadeverá pertencer com uma elevada probabilidade (analisarvalores E do BLAST e o nó imediatamente superior do ramo à qualpertence a sequência em estudo das árvores filogenéticas obtidas)

� Raramente se consegue identificar até à espécie a fontebiológica de sequências metagenómicas

Determinação da fonte biológica de uma sequência metagenómica

� Os resultados do Taxonomy Report do BLAST não são indicadores suficientes para a fonte biológica de uma sequência metagenómica

� Nem sempre os melhores resultados do BLAST correspondem ao táxon indicado pela análise filogenética

� Os resultados do BLAST e da análise filogenética devem ser congruentes e significativos para a atribuição da fonte biológica ser credível

Determinação da fonte biológica de uma sequência metagenómica

� Os resultados do Taxonomy Report do BLAST não são indicadores suficientes para a fonte biológica de uma sequência metagenómica

� Nem sempre os melhores resultados do BLAST correspondem ao táxon indicado pela análise filogenética

� Os resultados do BLAST e da análise filogenética devem ser congruentes e significativos para a atribuição da fonte biológica ser credível

Fonte biológica de uma sequência metagenómica

� A fonte biológica de uma sequência metagenómica corresponde ao táxon que terá maior probabilidade de ser o dador da sequência nucleotídica em estudo

� A classificação taxonómica da fonte biológica nem sempre pode ser realizado até à espécie

� A classificação taxonómica da fonte biológica deve corresponder ao táxon menos abrangente do qual se tenha fortes indicações através da análise filogenética e da análise dos resultados do BLAST

Critérios de atribuição taxonómica

� Se o melhor resultado ter uma identidade > 98% e valores E claramente diferente do 2º melhor resultado que aponte para um táxon diferente do 1º, muito provavelmente esse será o táxon da fonte biológica

Function [species] Identity E valueGlycerol 3-P dehydrogenase [species x] 99 % 0.0Glycerol 3-P dehydrogenase [species y] 74% 1o-74

Glycerol 3-P dehydrogenase [species z] 65% 1o-46

Function [species] Identity E valueGlycerol 3-P dehydrogenase [species x] 99 % 1o-106

Glycerol 3-P dehydrogenase [species y] 98% 1o-105

Glycerol 3-P dehydrogenase [species z] 94% 1o-103

✔

?

Critérios de atribuição taxonómica

� Se o melhor resultado ter uma identidade << 98% e valor E claramente diferente do 2º melhor resultado que aponte para um táxon diferente do 1º, a espécie x poderá ser aparentada com a da fonte biológica ou poderemos a estar lidar com sequências parálogas à nossa sequência (query)

Function [species] Identity E valueGlycerol 3-P dehydrogenase [species x] 75 % 10-86

Glycerol 3-P dehydrogenase [species y] 55% 1o-74

Glycerol 3-P dehydrogenase [species z] 25% 1o-46?

Filogenia e taxonomia molecular

� A análise filogenética serve para apoiar ou não conclusões tiradas com resultados do BLAST em relação à atribuição da fonte biológica mais provável da sequência query

� A análise filogenética dá-nos também informação sobre as relações evolutivas entre sequências

� A análise filogenética é uma ferramenta essencial em taxonomia molecular (atribuição de classificação taxonómica de um ou mais organismos dadores de DNA por métodos moleculares)

Filogenia

� A análise filogenética serve para apoiar ou não conclusões tiradas com resultados do BLAST em relação à atribuição da fonte biológica mais provável da sequência query

� A análise filogenética dá-nos também informação sobre as relações evolutivas entre sequências

� A análise filogenética é uma ferramenta essencial em taxonomia molecular (atribuição de classificação taxonómica de um ou mais organismos dadores de DNA por métodos moleculares)

Exemplo: Filogenia dos Primatas

15-30

Seres Humanos

Gorilas

Chimpanzés

Bonobos

Orangotangos

MYA0

Via morfologia

MYA

Seres Humanos

ChimpanzésBonobos

Gorilas

Orangotangos

014

Via mtDNA, genes nucleares e hibridizaçãode moléculas de DNA

Fonte: Swofford (2003)

Exemplo: Filogenia e a Ciência Forense

Controlo 2Controlo 3

Controlo 9

Controlo 35

Controlo 3

Não

NãoFonte: Ou et al.(1992) and Page & Holmes (1998), redesenhado porCaro-Beth Stewart

Sim:A fonte provável de contaminação será o dentista para estes pacientes

Paciente D

Paciente F

DENTISTAPaciente CPaciente APaciente G

Paciente BPaciente EPaciente A

DENTISTA

Árvore filogenética de sequências genómicas do HIV

Filogenia melhora a atribuição de função

Eisen et al. (1998)

Passos da análise filogenética

� Seleção da ORF a estudar

� Identificação de sequências homólogas

� Alinhamento múltiplo (MSA) da sequência query com sequências homólogas

� Construção de árvores filogenéticas

� Inferência funcional das sequências utilizadas

� Inferência filogenética das sequências utilizadas

Adaptado de Eisen et al. (1998)

Sequências parálogas vs. ortólogas

Eisen et al. (1998)

Árvore A:Indica a existência de sequências parálogas

Árvore B:Indica apenas a existência de sequências ortólogas

Semelhança vs. Homologia

� Sequências muitos semelhantes entre si são geralmente homólogas (i.e., têm um ancestral comum) e têm a mesma função

� Sequências semelhantes podem ter a mesma função, mas não ser homólogas se a semelhança resultar de evolução convergente

� Árvores filogenéticas podem indicar a presença de sequências parálogas caso haja sequências da mesma espécie com scores e valores E significativamente diferentes

Adaptado de Eisen et al. (1998)

Termos associados a árvores filogenéticas

A

E

B

C

D

ramos oulinhagens

nós internos ouancestrais hipotéticos

raiz

nós terminais ou nós “foliares” (leaf nodes) ou taxa ou OTUs


(OTUs = OperationalTaxonomical Units)

Termos associados a árvores filogenéticas

A

B

C

D

E

Árvore binária com elevada resolução

A

B

C

D

E

politomia "hard"

A

B

C

D

E

Árvore não bináriacom resolução

parcial

politomia "soft"

Árvore estrelada comresolução nula

(árvore colapsada)


A importância de enraizar uma árvore


Para enraizar uma árvorementalmente, imagine quepuxa um fio com 4 pontas pelaraiz, até que as extremidades(os taxa) fiquem no lado opostoao da raiz.

A

C

Raiz D

A B C D

Root

Notar que na árvore enraizada, o táxonA não está mais relacionado com otaxon B que com os taxa C ou D.

árvore enraizada

árvore não enraizada

Slide por Caro-Beth Stewart

BPara inferir relações evolutivas é necessário determinar a raiz da árvore

Número de árvores não enraizadas possíveis

Taxa Nu3 14 35 156 1057 9458 103959 135,13510 2,027,02511 34,459,42512 654,729,07513 13,749,310,57514 316,234,143,22515 7,905,853,580,625

1 3

421

3 4

2

1 3

4 2Nu=(2n-5) . (2n-7) . (...) . 3 . 1=(2n-5)!/[2n-3 . (n-3)!]

Adaptado de Swofford (2003)

Número de árvores enraizadas possíveis

Taxa Nr3 34 155 1056 9457 103958 135,1359 2,027,02510 34,459,42511 654,729,07512 13,749,310,57513 316,234,143,22514 7,905,853,580,62515 2,134,580,4667,6875

Nr=(2n-3) . (2n-5) . (...) . 3 . 1=(2n-3)!/[2n-2 . (n-2)!]Adaptado de Swofford (2003)

1 3 1 2 1 3

4 2 3 1

2 4 3 4 4 2

4 2 3 1 2 4 3 1

4 2 1 3 4 2 3 1

Árvores com a mesma topologia


B

A

C

D

C

D

ABBC

DA

B

A CD

Árvore enraizada

A D

C B

D

C

ABBD

CASlide por Caro-Beth Stewart

Como enraizar uma árvore


Por definição de “outgroup”:Definido por um táxon ou taxa exterior aogrupo em estudo (“ingroup”), mas requerum conhecimento taxonómico prévio (usadono Annotathon). Pode ser também umafamília molecular (não usado noAnnotathon).

Por ponto de meia-distância (midpoint):A raiz é o ponto de meia-distância entre ostaxa mais distintos da árvore e édeterminado pelo tamanho dos ramos.Porém, assume que a evolução molecular éigual para todos os ramos (i.e., assume aexistência de um ”relógio molecular”).

Adaptado de um slide por Caro-Beth Stewart

Existem duas maneiras:

A

B

C

D

10

2

3

5

2

outgroup

d (A,D) = 10 + 3 + 5 = 18Midpoint = 18 / 2 = 9

Métodos de inferência filogenética: caracteres

Fonte: Swofford (2003) Adaptado de um slide por Caro-Beth Stewart

Métodos de caracteres: Alinhamento de caracteres, nucleótidos ou aminoácidos, para construir uma árvore e inferir filogenia:

Taxa CaracteresSpecies A ATGGCTATTCTTATAGTACGSpecies B ATCGCTAGTCTTATATTACASpecies C TTCACTAGACCTGTGGTCCASpecies D TTGACCAGACCTGTGGTCCGSpecies E TTGACCAGTTCTCTAGTTCG

Métodos de inferência filogenética: distância


Métodos de distância: Transforma as dissemelhanças entre sequências em distâncias, sendo utilizada a respetiva matriz para calcular a árvore.

A B C D ESpecies A ---- 0.20 0.50 0.45 0.40Species B 0.23 ---- 0.40 0.55 0.50Species C 0.87 0.59 ---- 0.15 0.40Species D 0.73 1.12 0.17 ---- 0.25Species E 0.59 0.89 0.61 0.31 ----

Distância não corrigida(= % de diferença entre sequências)

Parâmetro de distância Kimura 2(estimativa corrigida da verdadeira distância de substituições de caracteres (nt. ou aa.) entre taxa.

Semelhança vs. Relação Evolutiva


Semelhança e relação evolutiva são conceitos diferentes, apesar da segunda ser inferida através da primeira.Semelhança: parecença (observação) Relação evolutiva: há uma relação genética (um facto histórico)

Dois taxa podem ser semelhantes, mas não terem uma relação evolutiva próxima. Como?

Taxon A

Taxon C

Taxon D

11

1

3

5

C tem maior semelhança com A (d = 3) que com B (d = 7), masC e B são mais próximos em termos evolutivos (i.e., C e Bpartilham um ancestral comum mais recente do que com A).

Taxon B6

Tipos de semelhanças: Simplesiomorfia e Sinapomorfia


A semelhança observada entre dois taxa pode ser devido a:

Relação evolutiva:com caracteres ancestrais partilhados: simplesiomorfiacom caracteres ancestrais derivados: sinapomorfia

caracterancestral

caracterderivado

CCGG

Cplesiomorfia

apomorfia

Tipos de semelhanças: homoplasia


Homoplasia: Evolução independente do mesmo caracter

Relação evolutiva convergente:Eventos evolutivos convergentes entre taxa relacionados (ou não) evolutivamente:através de eventos paralelos:

CGG C

CGG C

Eventos paralelos em diferentes ramos da árvore

Tipos de semelhanças: homoplasia

Homoplasia: Evolução independente do mesmo caracter

Relação evolutiva convergente:Eventos evolutivos convergentes entre taxa relacionados (ou não) evolutivamente:através de eventos de reversão:

CCGG

CGCCG

CCCCG

C

ReversãoMutação

Mutações e reversões podem esconder a verdadeira história evolutiva. Por isso, é necessário cuidado com interpretações de árvores. Em métodos de distância, semelhança = relação evolutiva caso as distâncias forem baseadas em matrizes / árvores “ultramétricas”.

Distâncias / matrizes / Árvores Ultramétricas

� Satisfazem a hipótese do “relógio molecular”

� Todas as distâncias desde a raiz até aos nós foliares são iguais

� O tamanho dos ramos é proporcional ao tempo evolutivo

Isto é verdade para a maioria das árvores?

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