TEC-44 DETERMINACIÓN MEDIANTE TÉCNICAS DE HPLC, CG Y EM DE LOS PRODUCTOS DE OXIDACION DE LAS AGLUCONAS DE LA OLEUROPEINA Y LIGUSTRÓSIDO DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN F. GUTIÉRREZ ROSALES, J.J. RÍOS Y Mª J. GIL Instituto de la Grasa (CSIC). Unidad de Caracterización y Calidad de Alimentos FORO DE LA TECNOLOGÍA OLEÍCOLA Y LA CALIDAD RESUMEN Se han determinado en los aceites sometidos a oxidación mediante HPLC- CG –SM los productos de oxidación del ácido elenólico y de la formas aldehídica y dialdehídica de las agluconas de la oleuropeina y ligustrósido , estructuras poco conocidas, pudiendo ser de interés su determinación por ser un posible factor para controlar el estado de frescura de un aceite de oliva virgen y marcador del tiempo de vida útil. Durante la oxidación de los aceites hay una pérdida significativa de sus polifenoles y un aumento de los productos de oxidación. INTRODUCCIÓN Las agluconas secoiridoides son una clase de compuestos biológicos presentes en el aceite de oliva virgen, genéticamente correlacionados con la oleuropeina y el ligustrósido (1). Los biofenoles del aceite de oliva virgen son un grupo de biomoleculas minoritarias que juegan importantes actividades biológicas. En el aceite de oliva virgen están presentes en las formas simples y esterificadas, en cantidades diferentes, con un perfil constante para cualquier variedad, y desaparecen durante el proceso de refinación (2,3,4). La presencia de estructuras fenólicas y ortodifenólicas (tirosol e hidroxitirosol) proporcionan una acción antioxidante natural secuestradores de radicales libres; la oleuropeina e hidroxitirosol se han mostrado con una capacidad antioxidante igual o superior que la vitamina C, vitamina E y BHT (5). El hidroxitirosol presenta un alto grado de actividad antioxidante en la oxidación del linoleato de metilo (6,7) La bioactividad de los compuestos biofenólicos, particularmente en relación a la estabilidad oxidativa y características sensoriales han sido ya estudiados (8,9). MATERIAL Y MÉTODOS Aceites. Se han elegido tres aceites de oliva vírgenes de las variedades Picual, Arbequina y Picudo, los cuales se han oxidado en Rancimat a 100ºC y flujo de 10L/h durante un tiempo de 0 h , 4h, 8h, 24, 48h, 72h y 96 h, teniendo por tanto un total 21 muestras para realizar el estudio y ver el comportamiento durante la oxidación. Extracción de compuestos fenólicos. Los extractos fenólicos de los aceites se obtienen siguiendo el trabajo descrito (10). Se pesan (2.5 ± 0.001g) de aceite al que se añade 0.5 mL de solución estándar de p-hidroxifenil- acético (0.12 mg /mL). Se evapora el disolvente en evaporador rotatorio a 40ºC bajo vacio y el residuo de aceite es disuelto en 6mL de hexano que se pasa con vacío por una columna de fase diol previamente acondicionada con 6ml de metanol y 6ml de hexano. Después del paso de la muestra se lava con 6ml de hexano y 4mL hexano/ acetato de etilo (85:15, v/v) que se descartan. Finalmente se eluye la columna con 10 mL de metanol, y el eluato recogido, se evapora a sequedad bajo vacio en un evaporador rotatorio a temperatura ambiente. El residuo se redisuelve en metanol/ agua (1:1 v/v) . Una alicuota de 20µL de solución incolora se inyecta en el cromatógrafo líquido.

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Análisis HPLC preparativo. El aislamiento de los productos individuales de oxidación de las formas aldehídicas y dialdehídicas de las agluconas de la oleuropeina y ligustrósido se lleva a cabo por una serie de cinco inyecciones sucesivas de los extractos fenólicos en el sistema HPLC que se describe posteriormente. Cuatro fracciones se recogen manualmente, se concentran a sequedad y se derivatizan para su análisis CG-EM Análisis CG-EM. Los experimentos se realizan utilizando un cromatógrafo Trace 2000 acoplado a un detector de masas Polaris Q, del tipo Ion Trap. La columna usada fue una capilar de sílice fundida. de 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm de espesor de fase, marca Zebron ZB- 5ms El programa de temperatura fue: inicial a 150º C durante 3 min y rampa de 3 ºC/min hasta 295º C donde se mantiene durante 18 min. Temperatura del inyector 300º C . El gas portador fue He a 1 mL/min a flujo constante. Las condiciones de EM fueron: fuente y transfer line a 200ºC y 290 ºC respectivamente. El instrumento se calibro en modo EI y/o SIM a 70eV de energia electronica y 250µA. de corriente de emision, Las muestras se analizaron como TMS éteres. Para ello, los extractos fenólicos se evaporaron a sequedad y se derivatizan en frio con 100 µL una mezcla de HMDS/DMCS en piridina. Análisis HPLC- APcI-EM Los extractos fenolicos se analizaron por HPLC-EM en un sistema Beckman Gold (Beckman, Inc., USA ) formado por una bomba modelo 126 y Diode Array model 168 en serie con una Interfase ApcI en linea con un espectrometro de sector magnético modelo MAT95´s (Finnigan Mat, Bremen, Germany ). La columna utilizada fue una Lichrospher 100RP-18 de 4.0 mmm d.i. x 250 mm y 5 µm de tamaño de partícula. La elución se hizo con : agua: acido acetico (99.9:0.1 v/v)(solvente A) y metanol:acetonitrilo: ácido acético (50:50:0.1 v/v) (solvente B). El gradiente utilizado fue : desde 95% (A) : 5% (B) to 45% (A) : 55% (B) en 45 min, y luego hasta 100% (B) en 10 min; 100% (B) se mantiene durante 10 min. Las longitudes de onda fueron 240 and 280 nm simultáneamente. A la salida de la columna un 25 % del flujo fue introducido en la interfase ApcI .Las condiciones de trabajo de la interfase fueron: capilar 200ºC y lentes, skimmer y octapolo a optima respuesta para patron de gramicidina. La tension de la corona de descarga se situó a 3.5 Kv como gas de barrido se utilizó nitrogeno a 150 Kpa. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En las figuras 1 y 2 pueden verse los cromatogramas de un extracto de polifenoles de un aceite oliva virgen y el mismo depues de ser sometido a oxidacion durante 48 horas Figura 1

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Figura 2

En la siguiente tabla se listan los compuestos identificados

Pico Compuesto TR PM (TMSiO)

1 Ácido cinámico 6.92 220 2 Tirosol 7.65 138 3 Acetato de tirosol 8.81 180 4 p-hidroxifenil Acético (IS) 9.47 296 5 Ácido Homovanillico 11.37 168 6 Hidroxitirosol 13.06 370 7 Äcido o-cumárico 14.54 308 8 Acetato de hidroxitirosol 14.66 340 9 Forma dialdehídica del ácido élenólico 15.42 314 10 Acido dihidroxibenzoico 16.64 370 11 Producto de oxidación de la forma dialdehidica del ácido

elenólico 19.52 402

12 Forma dialdehídica de la decarboximetil aglucona del ligustrósido

35.28 376

13 Forma dialdehídica de la decarboximetil aglucona de la oleuropeina

39.46 464

14 Producto de oxidación de la forma dialdehídica de la decarboximetlil aglucona del ligustrósido

39.86 464

15 Forma aldehídica de la aglucona del ligustrósido 41.93 434 16 Producto de oxidación de la forma dialdehídica de la

decarboximetlil aglucona de la oleuropeína 43.55 552

17 Producto de oxidación de la forma aldehídica de la decarboximetlil aglucona del ligustrósido

44.41 522

18 Forma aldehídica de la aglucona de la oleuropeína 45.54 522 19 Producto de oxidación de la forma aldehídica de la

decarboximetlil aglucona de la oleuropeína 47.45 610

20 Pinoresinol 52.95 502 21 Acetoxipinoresinol 53.55 560

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La determinacion de los productos de oxidacion se hizo por aislamiento de los mismos a partir del analisis por HPLC de una muestra oxidada, (figura 3)

Figura 3

Los picos marcados como 2, 4, 5 y 7 fueron simultáneamente analizados por HPLC-APcI-EM y aislados por cinco inyecciones sucesivas, recogidos individualmente, derivatizados como TMS éteres y analizados por GC-MS Los espectros de masas de estos picos obtenidos por HPLC-APcI-MS se muestran a continuación :

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Y en la figura 4, a modo comparativo, se muestran los cromatogramas GC-EM de la zona entre 30 y 70 min de un muestra de aceite de oliva virgen original (A), la misma muestra oxidada parcialmente ( B) y los picos mencionados anteriormente, ( C,D,E y F). El pico D, por su dificultad de aislamiento, aparece contaminado con la forma no oxidada

Figura 4

Evolución de los productos de oxidacion de las formas aldehidicas y dialdehidicas de las agluconas del ligustrosido y la oleuropeina . En las figuras 5, 6 y 7 se recogen las evoluciones de estos compuestos en las tres muestras estudiadas

SO62/04 PICUAL

0

10000000

20000000

30000000

40000000

50000000

60000000

0 4 8 24 48 72 96

Horas de Oxidación

FAO-Oxidado

FDAO-Oxidado

FAL-Oxidado

FDAL-Oxidado

Figura 5

5

SO42/04 PICUAL-PICUDA

0

20000000

40000000

60000000

80000000

100000000

120000000

140000000

160000000

180000000

0 4 8 24 48 72 96

Horas de Oxidación

FAO-Oxidado

FDAO-Oxidado

FAL-Oxidado

FDAL-Oxidado

Figura 6

SO43/04 ARBEQUINA

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

0 4 8 24 48 72 96

Horas de Oxidación

FAO-Oxidado

FDAO-Oxidado

FAL-Oxidado

FDAL-Oxidado

Figura 7

Puede observarse que en las tres variedades estudiadas los valores más altos de las formas oxidadas corresponden a las agluconas del ligustrósido pudiendo justificarse esto por ser menos estable la molécula de tirosol que la de hidroxitirosol . El menor crecimiento de estas formas oxidadas a las 8 horas de oxidación en la muestra de la variedad Picual – Picudo, así como su desplazamiento del máximo de estos compuestos hasta las 72 horas, pensamos puede deberse a su mayor estabilidad inicial (120 horas frente a 80 h y 70h de las variedades Picual y Arbequina respectivamente). La explicación que encontramos de momento a la pérdida de estos compuestos en el periodo estudiado es que se formen otros productos que no sean recuperables con el método de extracción utilizado. El seguimiento de estos productos de oxidación puede ser una herramienta de utilidad en el futuro. BIBLIOGRAFÍA 1. P. Gariboldi, G. Jommi, L Verotta. “ Secoiridoids from Olea Europaea” Phytochemistry (1986) 25865-869 2. N. Uccella. “ Olive biophenols : biomolecular characterization, distribution and phytoalexin histochemical

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Tecnology , Vol 11 (2001) 357-363

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