KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dikenal juga dengan istilah High Performance Liquid Chromatography (HPLC). KCKT merupakan perangkat peralatan yang penting dalam perkembangan dunia analisis bahan baku maupun bahan pencemar. Fungsi utama KCKT pada dasarnya adalah kemampuannya dalam memisahkan berbagai komponen penyusun dalam suatu sampel. Kinerja tinggi dari kromatografi awalnya ditentukan oleh ketinggian tekanannya, namun perkembangan teknologi telah menghasilkan produk kromatografi cair berkinerja tinggi dengan tekanan yang tidak terlalu tinggi.

KCKT merupakan teknik pemisahan yang masih menjadi idola di dunia analisis saat ini. KCKT digunakan secara luas dalam pemisahan dan pemurnian berbagai sampel dalam berbagai bidang seperti farmasi, lingkungan, industri makanan dan minuman, industri polimer dan berbagai bahan baku. KCKT lebih banyak digunakan untuk keperluan identifikasi (analisis kualitatif), kecuali jika KCKT ini dihubungkan dengan sebuah spektrometri massa (Mass Spectrometer (MS)), maka penggunaannya akan lebih memungkinkan dalam analisis kuantitatif.

Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:1. Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologis 2. Analisis ketidakmurnian (impurities) 3. Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil) 4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion 5. Isolasi dan pemurnian senyawa 6. Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip 7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements) Komponen KCKT

Komponen utama dalam KCKT adalah juga komponen dalam kromatografi lainnya yaitu wadah/kemasan fase gerak, fase gerak, pompa KCKT, kolom, fase diam, detektor, dan perangkat komponen pendukung lainnya.

Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak dalam KCKT harus terbuat dari bahan yang bersih dan inert. Wadah ini dapat menampung sekurang-kurangnya 1-2 liter fase gerak, dan terlebih dahulu harus dibebasgaskan. Kehadiran gas dalam wadah fase gerak ini akan menimbulkan gelembung gas pada pompa dan detektor yang akan sangat mengacaukan hasil analisis.

Fase Gerak

Fase gerak dalam KCKT harus berupa pelarut, buffer, ataupun reagen dengan tingkat kemurnian yang sangat tinggi, yaitu suatu cairan yang berderajat KCKT (HPLC grade). Adanya pengotor dalam fase gerak akan menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi. Partikel-partikel kecil yang terdapat dalam fase gerak yang kurang murni dapat mengakibatkan kekosongan kolom KCKT.

Fase gerak atau dikenal juga dengan istilah eluen umumnya merupakan campuran pelarut yang berperan dalam daya elusi dan resolusi analisis. Daya elusi dan resolusi KCKT ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat-sifat komponen dalam sampel.

Secara umum ada 2 tipe fase gerak:1. Fase gerak/eluen isokratik, yaitu eluen dengan komposisi pelarut yang tidak berubah selama percobaan kromatografi 2. Fase gerak/eluen gradien, yaitu fase gerak dengan komposisi pelarut yang berubah selama masa kromatografi Ada begitu banyak pilihan fase gerak yang dapat kita gunakan (pelarut/larutan) serta kemungkinan gradiennya akan menghasilkan kesempatan untuk mengoptimalkan pemisahan-pemisahan campuran kompleks dari segi resolusi maupun waktu. Secara normal elusi isokratik akan lebih mudah dikerjakan daripada elusi gradien.

Seringkali campuran pelarut merupakan fase gerak yang lebih baik daripada cairan murni, namun pekerjaan optimasi berbagai komposisi pelarut untuk fase gerak secara coba-coba tentu tidak mudah dilakukan.

Berdasarkan kepolaran fase gerak dibandingkan fase diamnya, fase gerak dibedakan menjadi:1. Fase normal, yaitu fase diam lebih polar dari fase gerak. Kemampuan elusinya akan meningkat seiring peningkatan polaritas fase gerak. 2. Fase terbalik, yaitu bila fase diam kurang polar dibanding fase geraknya. Kemampuan elusi akan menurun seiring peningkatan kepolaran fase geraknya. Deret eluotrofik yang merupakan deretan nama-nama pelarut yang disusun berdasarkan kepolarannya, akan sangat membantu kita dalam pemilihan fase gerak.

Dalam KCKT dengan fase terbalik, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran larutan buffer-metabol atau campuran air-asetonitril. Sedangkan dalam fase normal sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut terklorinasi atau menggunakan pelarut jenis-jenis alkohol.

Pompa

Pompa KCKT harus terbuat dari bahan yag inert terhadap fase gerak. Bahan pompa dapat terbuat dari: gelas, baja tahan karat, teflon maupun batu nilam.

Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan hingga 5000 psi dan mamp mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 3 ml/menit. Untuk keperluan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan hingga 20 ml/menit. Ada 2 tipe pompa:1. Pompa dengan tekanan konstan 2. Pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Pompa tipe ini lebih umum digunakan.

Kolom

Ada 2 jenis kolom pada KCKT, yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Untuk mengetahui perbedaan kolom konvensional dan kolom mikrobor klik disini.

Dalam beberapa hal kolom mikrobor lebih menguntungkan, diantaranya:1. Kolom mikrobor mengkonsumsi fase gerak hanya 80% dari konsumsi kolom konvensional. Hal ini disebabkan karena kolom mikrobor mempunyai kecepatan alir yang lebih lambat (10-100 ul/menit) 2. Aliran fase gerak pada mikrobor yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal untuk digabungkan dengan spektrometer massa 3. Sensitivitas kolom mikrobor lebih tinggi karena pelarut yang lebih pekat, sehingga cocok digunakan dalam analisis sampel berskala kecil, seperti sampel klinis. Perbedaan kolom konvensional dan mikrobor dapat anda lihat disini.

Fase Diam

Kebanyakn fase diam berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzena.

Daftar fase diam dapat dilihat disini.

Detektor

Detektor KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu detektor yang bersifat universal, yaitu detektor yang dapat mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif. Contoh detektor yang bersifat universal adalah detektor indeks bias dan spektrometri massa. Dan jenis detektor lainnya adalah detektor spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, fluoresensi dan elektrokimia.

Detektor yang ideal akan mempunyai karakteristik berikut:1. Mempunyai respon terhadap analit yang cepat dan reproduksible 2. Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi analit pada kadar yang sangat kecil 3. Stabil dalam pengoperasiannya 4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. Untuk kolom konvensional 8 ul atau lebih kecil dan 1 ul atau lebih kecil pada kolom mikrobar. 5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi analit pada kisaran yang luas 6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak Detektor merupakan bagian integral dari peralatan analitik kromatografi cair ini. Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya didasarkan pada persyaratan sensitivitas, jenis senyawa yang ada dalam sampel, dan faktor-faktor lain seperti biaya. Detektor yang paling umum didasarkan pada indeks bias dari eluat kolom, karena hampir semua zat terlarut akan menghasilkan larutan dengan indeks bias yang berbeda dengan indeks bias pelarut murni. Detektor ini mampu menginderai perbedaan tersebut dan menghasilkan sinyal-sinyal listrik yang proporsional yang kemudian diperkuat dan direkam untuk menghasilkan kromatogram. Batasan utamanya adalah sensitivitas; batasan pendeteksian akan bervariasi sesuai dengan keadaan, yang umumnya sekitar satu mikrogram zat terlarut.

Detektor SpektrofotometriDeteksi spektrofotometri umumnya hanya dalam daerah ultraviolet. Idealnya, spektrofometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik.

Detektor fluorometriMerupakan detektor yang didasarkan atas fluoresens.

Detektor elektrokimiaLazimnya, larutan efluen dari dalam kolom memasuki sebuah sel dimana larutan tersebut mengalir diatas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada satu harga, dimana komponen-komponen sampel mengalami reaksi transfer elektron.

Perangkat Pendukung Lainnya

Perangkat pendukung lain yang digunakan dalam KCKT dapat berupa komputer, integrator dan rekorder.Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)High Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang lebih dikenal dibandingkan dengan kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT) merupakan teknik analisis pemisahan sekaligus penentuan kualitatif maupun kuantitatif yang banyak digunakan pada senyawa-senyawa yang mempunyai titik didih tinggi yang tidak dapat dilakukan dengan analisis secara kromatografi gas.Prinsip pemisahannya sama dengan prinsip kromatografi pada umumnya yaitu berdasarkan pada perbedaan sifat dalam distribusi kesetimbangan (K) dari 2 komponen yang berbeda fasanya (fasa diam dan fasa gerak). HPLC terdiri dari fasa diam dengan permukaan aktifnya yang berupa padatan, resin penukar ion, atau polimer berpori yang ditempatkan pada kolom serta dialiri fase gerak cair dengan aliran yang diatur oleh suatu pompa. Analisis dengan HPLC dilakukan pada temperatur rendah serta dengan adanya kompetisi 2 fase (gerak dan diam). Migrasi dari molekul komponen akan sebanding dengan koefisien distribusinya, maka komponen dengan distribusi tinggi pada fase diam akan bergerak lebih perlahan didalam kolom sehingga dapat terpisah dari komponen yang distribusinya rendah.Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Jumlah peak pada kromatogram menyatakan jumlah komponen, sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.Teknik dalam HPLC :a. Sebagai fase mobil/fase gerak berbentuk cairan.b. Sebagai fase stasioner/fase diam, dapat berbentuk padatan atau cairan.Secara sistematik diagram alat HPLC dapat digambarkan sebagai berikut:

Keunggulan HPLC diantaranya adalah:a. Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi karena HPLC dilakukan pada suhu kamar.b. Dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa anorganik.c. Dapat menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik didihnya sangat tinggi seperti polimer.Jenis-jenis kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC) yaitu :a. Kromatografi adsorbsiKromatografi adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yang bersifat agak polar. Partikel-partikel silika atau alumina biasanya digunakan sebagai adsorben. Jenis kromatografi ini menggunakan fasa gerak non polar seperti heksana dan disebut jugakromatografi fasa normal.b. Kromatografi partisiKromatografi partisi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa non polar. Jenis kromatografi ini disebut dengan kromatografi fasa terbalik karena fasa geraknya lebih polar daripada fasa diam. Salah satu kendala kromatografi ini adalah keterbatasan selektivitas sebagai ketidakcampuran kedua fasa. Karena keterbatasan ini maka kromatografi partisi tidak digunakan lagi sebagai teknik analisis rutin.c. Kromatografi fasa terikatKromatografi fasa terikat merupakan teknik HPLC yang paling penting dan paling banyak digunakan saat ini. Dalam hal penerapann kromatografi fasa terikat dan kromatografi partisi memiliki persamaan. Akan tetapi, sorben fasa terbalik terdiri dari partikel silika yang dimodifikasi secara kimia dengan rantai alkil sebaliknya, fasa diam pada kromatografi partisi terdiri dari partikel yang dilapisi secara fisik dengan zat cair non polar.Keuntungan kromatografi fasa terikat, yaitu :1) Merupakan fasa yang stabil2) Kepolaran fasa gerak dapat diubah selama proses pemisahan berlangsung bila kepolaran solut-solut bervariasi.3) Kolom mempunyai umur panjang.4) Memiliki keterulangan waktu retensi yang baik.5) Lebih ekonomis.d. Kromatogarfi penukar ionKromatografi penukar ion merupakan teknik pemisahan campuran ion-ion atau molekul-molekul yang dapat diionkan. Ion-ion bersaing dengan ion-ion fase gerak untuk memperebutkan tempat berikatan dengan fasa diam. Dasar pemisahan kromatografi ini berasal dari perbedaan afinitas senyawa bermuatan terhadap permukaan penukar ion.e. Kromatografi ekslusi ukuranUkuran molekul merupakan kriteria utama dalam pemisahan dengan kromatografi ekslusi ukuran. Pemisahan terjadi karena solut-solut berdifusi masuk dan keluar pori-pori paking kolom. Molekul-molekul yang lebih besar dari diameter pori-pori akan melewati kolom secara cepat dan dikenal dengan istilah volume terekslusi begitu pula sebaliknya. Teknik ini berguna untuk mengkarakterisasi distribusi berat molekul polimer, pemurnian cuplikan biologis dan pemisahan senyawa-senyawa dengan berat molekul 2000 atau lebih.Di bawah ini beberapa komponen-komponen KCKT secara umum, antara lain :a. Eluen (pelarut)Tempat pelarut biasanya menggunakan suatu botol yang tahan terhadap pelarut-pelarut organik dan larutan yang digunakan untuk KCKT haruslah terbebas dari partikel-partikel dari gas/udara. Hal ini dikarenakan:1) Adanya partikel dalam larutan bisa terbawa masuk ke dalam pompa, hal ini dapat mengakibatkan tersumbatnya aliran pelarut tersebut.2) Udara yang masuk ke dalam pompa dapat mengganggu kestabilan pemompaan dan jumlah volume tetap yang dipakai akan terganggu.3) Selain itu pada kolom dan detektor akan mengalami gangguan.Adapun ciri-ciri yang harus dimiliki oleh fase gerak pada KCKT, yaitu :1) Kemurnian tinggi (high purity), yaitu cairan eluen yang tidak terkontaminasi.2) Kestabilan tinggi, yaitu eluen yang tidak bereaksi dengan sampel atau zat yang berfungsi sebagai fase diam.3) Kekentalan rendah, yaitu kerapatan eluen sekecil mungkin.4) Dapat melarutkan sampel, tidak mengubah kolom dan sifat kolom serta cocok dengan detektor.b. Sistem PemompaanPeralatan yang digunakan sebagai pompa dalam sistem KCKT memiliki beberapa persyaratan :1) Menghasilkan tekanan hingga 6000 psi2) Keluaran yang bebas denyut3) Kecepatan alir dalam kisaran 0, 1 10 ml/menit4) Pengaturan kecepatan alir dengan keterulangan setara dengan 0,5 % atau lebih baik5) Tahan terhadap korosi.Tiga jenis pompa yang sering digunakan dalam sistem KCKT yaitu :1) Pompa Bolak-balik (reciprocating pump)Jenis pompa yang paling banyak digunakan. Kelebihan pompa jenis ini adalah volume internalnya kecil sekitar 35 400 l, tekanan hingga 10.000 psi, kemampuan untuk adaptasi menggunakan elusi gradien, aliran yang konstan sehingga terbebas dari tekanan balik kolom dan akibat dari kekentalan solven.2) Pompa Sistem Penggantian (displacement pump)Sistem penggantian menggunakan sebuah wadah besar seperti syringe dengan sebuah penekan yang digerakan oleh motor. Menghasilkan aliran yang bebas tekanan balik, tidak dipengaruhi kekentalan dan bebas denyut. Kekurangan pompa jenis ini adalah kapasitas pompa terbatas hanya 250 ml dan cukup sulit saat solven harus mengalami penggantian.3) Pompa Tekanan Udara (pneumatic pump)Bentuk paling sederhana sebuah pompa pneumatik merupakan wadah yang ditekan oleh gas bertekanan tinggi. Harga relatif murah dan bebas denyut merupakan kelebihan jenis pompa ini. Kekurangannya terletak pada kapasitas terbatas, tekanan keluaran terbatas hanya sekitar 2000 psi, dipengaruhi oleh tekanan balik dan kekentalan solven dan tidak dapat digunakan untuk sistem elusi gradien.c. Injeksi sampelSistem injeksi sampel merupakan keterbatasan dari sistem kromatografi cair. Masalah ini dapat menyebabkan pelebaran puncak sebagai akibat kolom yang kelebihan kapasitas. Sebagai akibatnya, volume injeksi harus dibatasi hingga kisaran maksimum 500 l.Proses injeksi pada awalnya menggunakan syringe melalui sebuah katup elastomer. Syringeyang digunakan memiliki kemampuan melawan tekanan 1500 psi. Aliran dihentikan sementara saat injeksi dan dikembalikan setelah sampel masuk ke aliran fasa gerak.Metode pemasukkan sampel yang paling umum digunakan adalah dengan menggunakansampling loop. Seringkali disatukan dalam sistem KCKT dengan kapasitas beragam 0,5 hingga 500 l (Skoog et al., 1998)d. Kolom KCKTKolom KCKT secara umum dibuat dari bahan tabung stainless steel, walaupun untuk tekanan di bawah 600 psi kolom kaca dapat digunakan. Kolom untuk analisis KCKT memiliki ukuran panjang kolom berkisar dari 10 30 cm berbentuk lurus dan jika diperlukan dapat disambung dengan kolom yang lain. Diameter dalam kolom 4 10 mm dengan ukuran partikel 5 10 m. Kolom dari jenis ini mempunyai 40.000 hingga 60.000 lempeng/meternya.Saat ini, pabrik pembuat kolom telah merancang dan memproduksi kolom dengan kecepatan dan kinerja tinggi. Beberapa kolom hanya memiliki panjang 1 hingga 4,6 cm dengan ukuran partikel 3 5 m. Beberapa jenis kolom memiliki jumlah lempeng hingga 100.000 hanya dengan panjang 3 sampai 7,5 cm dengan kelebihan pada kecepatan dan sedikitnya solven yang diperlukan dalam pemisahan. Jumlah solven minimum menjadi pertimbangan penting karena mahalnya solven dengan tingkatan kromatografi (chromatography grade).Dua jenis kolom digunakan dalam kromatografi cair yaitu jenis pellicular dan partikel berpori (porous particle). Jenis pellicular terdiri dari partikel dengan bentuk bola, tidak berpori berbahan dasar gelas atau polimer dengan diameter 30 hingga 40 m. Lapisan tipis berpori silika, alumina, divinil benzen sintetis polystirena atau resin penukar ion dilapiskan pada permukaannya.Jenis kolom dengan partikel berpori berisi partikel berpori dengan diameter partikel 3 10m terbuat dari silika, alumina, resin sintetis divinil benzen polystirena atau resin penukar kation yang kemudian dilapisi lapisan tipis film berbahan organik sehingga berikatan secara kimia atau fisika terhadap permukaannya. (Skoog et al., 1998)e. DetektorDetektor ideal pada sistem KCKT mempunyai persyaratan :1) Memiliki sensitifitas yang memadai. Kisaran umum sensitifitas berkisar dari 10-8 hingga 10-15gram zat terlarut per pembacaan2) Stabil dan memiliki keterulangan yang baik3) Respon yang linear terhadap kenaikan konsentrasi4) Waktu respon yang singkat5) Kemudahan pada penggunaan6) Memiliki volume internal yang kecil untuk mengurangi pelebaran puncakBeberapa jenis detektor yang digunakan pada sistem KCKT :1) Detektor Absorban (UV-Vis)Pada detektor absorban, aliran akan mengalir melalui detektor dari kolom kromatografi. Untuk meminimalkan pelebaran puncak, detektor dirancang dalam volume yang sekecil mungkin. Ukuran volume dibatasi 1 10 l dengan panjang sel 2 10 mm. Umumnya sel detektor mampu menahan tekanan hingga 600 psi sehingga peralatan pengurang tekanan diperlukan sebelum aliran memasuki detektor.2) Detektor FluorescensDetektor fluorescens yang digunakan sama halnya dengan detektor pada spektrofluoro-fotometer. Detektor paling sederhana menggunakan lampu merkuri sebagai sumber cahaya dan filter untuk mengisolasi panjang gelombang emisi radiasi. Lampu Xenon digunakan pada instrumen yang lebih baik dengan gratting sebagai monokromatornya.3) Detektor Refraktif IndeksDetektor jenis ini bekerja dengan mengukur nilai indeks bias yang senyawa yang melalui sel. Sel akan mengukur indeks bias solven fasa gerak sebagai blanko dan sampel secara bersamaan untuk mendapatkan nilai indeks bias relatif.4) Detektor ElektrokimiaDetektor dengan mendasarkan kerjanya pada pengukuran arus listrik. Perubahan arus akan dideteksi terhadap waktu dan ditampakkan dalam bentuk kromatogram. Contoh penggunaan detektor adalah pada penetapan senyawa tiol dan disulfida.5) Detektor Spektra MassaSejumlah fraksi kecil cairan dari kolom dimasukkan ke dalam spektrometer massa pada kecepatan alir 10 50 l per menit atau menggunakan termospray. Analat akan diionisasikan, dipisahkan pada analisator, dibaca oleh detektor dan menghasilkan spektrum massa.KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

MAKALAH KROMATOGRAFI

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

PENDAHULUAN

Kromatografi merupakan pemisahan fisiko kimiawi. Pemisahan ini dapat terjadi kalau interaksinya berulang. Kita dapat mengetahuinya dengan kuantitas ulangan yang dinyatakan dengan teori plate (terjadi pada setiap lempeng, banyaknya lempeng dinyatakan dengan N).N = Makin banyak N, pemisahan akan mengalami peningkatan dengan kesetimbangan interaksi. Makin banyak N terjadi pelebaran puncak, karena : Senyawa tersebut berjalan ke bawah mengalami difusi kalau dibawa fase gerak.Persamaan Van Deemter :H =Dasar yang digunakan dalam pemisahan adalah :1. Pemisahan secara fisiko - kimiawi yang melibatkan interaksi antar fase gerak, fase diam, dan sampel.2. Fase diam dan fase gerak yang digunakan.

Solute

fase gerak fase diam

Kalau fase geraknya gas :Solute

fase gerak fase diam

Interaksi yang terjadi pada kromatografi, yaitu :1. Adsorbsi, dengan melihat perbedaan stereochemistry2. Partisi, dengan melihat kelarutan3. Afinitas, dengan melihat BM4. Ion Exchange, berdasrkan perbedaan muatanKROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. KCKT paling sering digunakan untuk : menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam- asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis; menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi.Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu :1. Low pressure (tekanan rendah)2. High pressure (tekanan tinggi 76 bar biasanya memakai satuan kpa/kilo paskal).Pada HPLC terdapat oven untuk pemanas karena pada partikel kecil, cairan ditekan terjadi gesekan maka digunakan pendingin dan tekanan tinggi (cairan ditekan menggunakan pompa kemudian didorong, jika ditarik cairan masuk). Tekanan harus 76 bar, antara fase diam dan fase gerak terjadi gesekan sehingga temperatur meningkat maka harus diturunkan (dengan pendingin liebig/ ion exchange) karena ikatannya bisa lepas dan bisa juga terjadi bleeding.Temperatur pada HPLC digunakan untuk menjaga temperatur dalam kolom konstan sehingga KD tetap.

A. Prinsip kerjaKerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam.

B. Instrumentasi1. PompaPompa pendesakan tetap dapat dibedakan menjadi pompa torak dan pompa semprit. Pompa torak menghasilkan aliran yang berdenyut jadi memerlukan peredam denyut atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis alas detektor yang stabil jika detektor peka terhadap aliran. Pompa semprit menghasilkan aliran yang tak berdenyut, tetapi tandonnya terbatas.

2. InjektorCuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada dua ragam utama aliran henti dan pelarut mengalir. Ada 3 macam system injector, yaitu :a. stop flow : aliran dihentikan, injeksi dilakukan padakinerja atmosfir, system tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak diperngaruhi.b. Septum : septum yang digunakan pada kckt sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injector ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injector) dapat menyebabkan penyumbatan.c. Loop valve : tipe injector ini umumnya digunakan unutk menginjeksi volume lebih besar dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunkan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi load, sampel diisi ke dalam loop pada kinerja atmosfir, bila valve difungsikan, maka sampel akan masuk dalam kolom.

3. KolomKolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi kolom analitik dan kolom preparatif.

4. DetektorDetektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam eluen kolom dan mengukur jumlahnya. Detektor yang baik sangat peka, tidak banyak berderau, rentang tanggapan liniernya lebar dan menanggapi semua jenis senyawa. Jenis-jenis detektor :- UV / Vis- Retraktif indeks (RI) Detector- konduktifitas detector- Elektrokimia Detector- PDA- ELSD- MS Detector

5. Fase gerakFase gerak memiliki syarat-syarat :- murni, tanpa cemaran- tidak bereaksi dengan kemasan- sesuai dengan detektor- dapat melarutkan cuplikan- mempunyai viskositas rendah- memungkinkan memperoleh dengan mudah cuplikan jika diperlukan- harganya wajar

Gambar Instrumentasi :

C. Macam Macam OptimasiTujuan Optimasi : Memisahkan sampai baseline dengan waktu seminimal mungkin. Rs yang bagus 1,5.1. Optimasi Efisiensi KolomAdalah jumlah keterulangan interaksi. Efisiensi kolom dapat diukur N, yaitu kemampuan memberikan small bath. N akan maximal bila H minimal.Efisiensi kolom dapat dilakukan dengan Van Deemter equation :N = L / HETPN = 5,54 ( tR / W)2N dapat diperoleh dari hasil kromatogram dengan menginjeksikan suatu senyawasehingga mendapatkan puncak. Cara meminimalkan HETP :1. difusi eddy ( A )o supaya cairan tidak kemana-mana perlu memperkecil partikelo kerapatannya diperbesar2. difusi longitudinal (B)o memperkecil diameter partikel, kerapatan diperkecilo u dipercepat, u = kecepatan alir fase gerako temperatur kolom diturunkan untuk mengatasi difusi laminer3. non equilibrium mass transfer ( C )terjadi karena fase gerak ditambah terus sebelum terjadi keseimbangano partikel diperkecil, luas area makin besaro ketebalan fase diam cair makin tipiso kerapatan diperbesar, u diperlambat supaya terjadi kesetimbangano temperatur dinaikkan

2. Optimasi SelektivitasUntuk menentukan kemampuan kolom memisahkan. Tergantung dari sifat-sifat senyawa dan memilih berbagai interaksi yang ada dalam kolom.- adsorpsiperbedaan pada stereokimia ( orto : lebih cepat dilepaskan ke fase gerak sedangkan para : paling lama dilepaskan 2 tangan terikat)- partisiperbedaan pada kelarutan senyawa-senyawa yang akan dipisahkan- ion exchangepada muatan senyawa-senyawa

3. Optimasi KapasitasK = ns / nmns = jumlah molekul dalam fase diamnm = jumlah molekul dalam fase gerakdengan mengubah komposisi fase gerak kelarutan dalam fase gerak senyawatersebut akan berbeda.

D. Jenis-jenis KCKTDilihat dari jenis fase diam dan fase gerak, KCKT (kolomnya) dibedakan menjadi:a. Kromatografi fase normalKromatografi dengan kolom konvensional dimanaFase diam : normal (bersifat polar), misalnya Silika gelFase gerak : bersifat non polarb. Kromatografi fase terbalikFase diam : sifatnya non polar, misalnya Silika gel direaksikan dengan klorosilanFase gerak : bersifat polarKeuntungan kromatografi fase terbalik : Senyawa yang polar akan lebih baik pemisahannya Senyawa ionic dapat dipisahkan Air dapat digunakan sebagi pelarut

E. Keuntungan dan Kerugiana. Keuntungan

Cepat : Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai

Selektif : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.

Peka : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT.

Kolom dapat dipakai lagi : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan.

Ideal untuk molekul besar dan ion : zat zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat zat tersebut.

Mudah memperoleh kembali sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.

b. Kerugian Mahal Sampel yang digunakan jumlahnya sedikit Perlu tenaga ahli untuk mengoperasikanKromatografi Cair Kinerja TinggiKata Kunci: fase gerak, Kromatografi CairDitulis oleh Adam Wiryawan pada 29-03-2011Tujuan :Untuk mengenalkan teknik high performance liquid cromatography, termasuk operasional dasar instrumen dan mempelajari pengaruh pengaturan sejumlah parameter.PendahuluanHPLC adalah metode kromatografi yang menggunakan fase gerak cair dan fase diam padat / bahan pendukung untuk melakukan pemisahan suatu jenis molekul. Terdapat dua variasi utama yaitu, HPLC yang terdiri dari eluen polar dan fase diam non-polar atau eluen non-polar dan fase diam polar. Keduanya diklasifikasikan sebagai metode reversed-phase dan normal-phase. Metode reversed-phase yang akan dipakai dalam eksperimen ini menggunakan kolom octadecylsilane (ODS) dan partisi absorptif (dapat menyerap) utnuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran.Syarat pemilihan utama setelah memilih metode HPLC yang sesuai adalah menentukan sistem pelarut untuk analisa. Kriteria pemilihan melibatkan waktu analisa, (tR atau k), efisiensi keseluruhan (jumlah plate, N atau n), atau mungkin resolusi (Rs). Percepatan aliran eluen akan memainkan peranan dalam parameter ini, akan tetapi pemilihan yang bijaksana atau optimisasi komposisi pelarut akan diperlukan.Polaritas pelarut adalah dasar yang berguna untuk menentukan bagaiman nilai k dapat diubah, dan tentunya akan mengubah waktu analisa. Untuk menggunakn parameter ini, maka sangatlah penting untuk mengukur polaritas pelarut dan hubungkan dengan k. Dapat dilihat seperti dibawah ini :Indeks Polaritas dari Pelarut Terpilih

Indeks polaritasdari campuran dua pelarut akan diberikan sebagai :Pab = aPa + bPbdimana = fraksi volume tiap pelarut.Sebuah aturan yang berguna bahwa untuk setiap perubahan polaritas dua unit terdapat perkiraan 10 kali lipat perubahan dalam rasio partisi (faktor kapasitas) k

Darihubungan ini dapat terlihat bahwa k=64 dalam 30/70 MeOH/pelarut air, kemudian komposisi pelarut yang mana akan memberikan nilai k =5 dalam 73/27 MeOH/aiirProsedurA.Operasional Kromatografi CairCatatan : Jangan pernah membiarkan pompa beroperasi tanpa filter pelarut terendam dalam pelarutPilih panjang gelombang UV-sinar tampak dan nyalakan detektor untuk standby. Setelah 1 menit nyalakan detektor ke posisi ON. Pengaturan 0,04AUFS akan cukup.Jika pompa belum dinyalakan, pertama pilih solvent line yang diperlukan (solvent select dial) dan keluarkan solvent line dengan gambar sekitar 20 mL pelarut keluar melalui flush outlet (berada dibawah solvent select dial). Lakukan ini dengan menggunakan syringe, masukkan dalam outlet, buka katup dan keluarkan solvent. Tutup katup kembali.Pada saat pelarut telah terpilih dengan tepat, turn on pompa dan secara perlahan naikkan laju aliran pada level yang diinginkan. Tunggu sekitar 15-20 detik antara tiap kenaikkan dalam pengaturan aliran. Bila aliran telah di-set, tunggu paling tidak 15 menit agar kolom menyesuaikan dengan pelarut yang baru sebelum menginjeksikan sampel.Bila aliran pelarut diubah pada saat running, misal dari 0,8 ke 1,2 mL/menit, lakukan pengaturan ke aliran yang baru dengan perlahan dan tunggu 5-10 menit hingga stabil.Jika aliran pelarut harus dihentikan, kurangi thumbwheel setting dengan perlahan ke angka nol, dan switch off pompa. Pada saat ini, pelarut dapat diubah ke pilihan selanjutnya.Melakukan Injeksi : Semua volume injeksi yang akan dilakukan adalah 10L. Bilas syringe beberapa kali dengan pelarut dan sampel sebelum mengambil 10L aliquot. Pastikan tidak terdapat gelembung udara dalam tabung syringe yang mungkin masuk. Putar katup injeksi ke load, putar retaining arm kebawah untuk melepas plug stopper dan cabut plug. Masukkan jarum syringe ke dalam injection loop dan injeksikan larutan. Kembalikan plug, putar retaining arm untuk mengencangkan plug, dan selesaikan injeksi dengan cara memutar katup ke posisi inject. Pencatat (recorder) akan start secara otomatis.Pengaturan recorder : Menggunakan Shimadzu recorder. Atur speed pada 5, dan attenuation pada 3.Shut-down procedure : Pada saat kromatogram terakhir telah terekam kolom sebaiknya dikembalikan ke kondisi yang sesuai untuk storing, yang mana ini berarti kolom harus disiram dengan 50/50 MeOH/air pada 1 mL/menit selama sekitar 20-30 menit dan kemudian laju aliran dikembalikan ke nol. Maka ganti dengan pelarut ini dengan mengguankan prosedur sebelumnya dan lakukan seperi diatas.B.Studi KromatografiDua sampel yang akan dianalisa ;SAMPEL 1:Uracil dan acenaphtheneSAMPEL 2:Naphtalene, phenanthrene dan anthraceneUracil umumnya dipakai untuk menunjukkan kekosongan volume atau waktu untuk puncak yang tidak tertahan (to), dan akan mengelusi layak dengan cepat. Hal ini akan membantu dalam perhitungan nilai k. Phenanthrene dan anthracene elute sebagai sepasang puncak yang berdekatan, sehingga akan berguna jika kita akan memperkirakan resolving power dari suatu kolom. Berikut eksperimen yang akan dilaksanakan :Tetapkan aliran dari 60/40 acetonitrile/air pada 0,8 mL/menit1. Injeksikan 10 L air. Catat water dip2. Injeksikan 10 L acetonitrile. Catat respon yang terjadi3. Injeksikan 10 L sampel 1 Naikkan laju aliran ke 1,2 mL/menit4. Injeksikan 10 L sampel 1 Naikkan laju aliran ke 1,6 mL/menit5. Injeksikan 10 L sampel 16. Injeksikan 10 L sampel 2 Ubah pelarut ke 75/25 acetonitrile/air dan laju aliran ke 1,6 mL/menit. Biarkan kolom untuk menyeimbangkan.(Catatan : Periksa dengan asisten lab sehubungan dengan perubahan pelarut)7. Injeksikan 10 L sampel 18. Injeksikan 10 L sampel 2Bila semua prosedur di atas telah diselesaikan, lakukan prosedur shutdown.Perhitungan dan Pertanyaan1. Untuk setiap kromatogram sampel 1, hitung k, total plates (n, N), tinggi plate (h,H) dan tinggi reduced plate.2. Untuksetiap kromatogram sampel 2, hitung nilai k, dan resolusi (Rs) dari pasangan puncak yang berdekatan.3. Hitung asimetri puncak dari acenaphthene dalam satu kromatogram (ditentukan dengan mengambil rasio jarak dari peak maximum, atau mode, ke trailing edge puncak, jarak dari peak mode ke leading edge puncak, pada 10% tinggi puncak) Ini mungkin akn berguna untuk penyimpanan kemampuan dari recording inegrator sehingga puncak dapat dinalisa kembali pada chart speed yang lebih cepat untuk pengukuran akurat dari jarak yang terlibat. ( Acuan pada diagram di bawah).4. Beri komentar pada pengamatan dari solvents dip.5. Beri komentar tentang bagaimana k bervariasi dengan laju aliran dan komposisi pelarut. Apakah k bervariasi sesuai dengan yang Anda harapkan ?6. Beri komentar tentang bagaimanaefisiensi bervariasi dengan laju aliran.7. Beri komentar tentang bagaimana Rs bervariasi dengan komposisi pelarut, dan nyatakan bagaimana Rs mungkin bervariasi dengan laju aliran.8. Bandingkan dengan teliti hasil yang diperoleh dalam eksperimen 5 dan 7, berkenaan dengan area puncak dan tinggi puncak dari uracil dan acenaphthene. Jelaskan pengamatan Anda. Aplikasikan alasan Anda pada perbandingan hasil dalam eksperimen 6 dan 8.9. Apakah Anda percaya bahwa uracil merupakan bahan terlarut(solute) efektif untuk estimasi ?

kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC) PEMBAHASAN

2.1 PENGERTIAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (HPLC)HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat. HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.

http://www.idonbiu.com/2009/10/mengenal-kromatografi-cair-kinerja.html

2.2 JENIS HPLCPemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi AdsorbsiPrinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi fase terikatKebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ionKCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ionKromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi UkuranKromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi AfinitasDalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.http://lansida.blogspot.com/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html

2.3 PRINSIP DASAR HPLCPrinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut : Dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solut-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.

2.4 INSTRUMENTASI KROMATOGRAFI CAIRAN KINERJA TINGGI

Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi, yaitu:

A. Fasa Gerak Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Berbeda dengan kromatografi gas, HPLC mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak, dibandingkan dengan fasa gerak untuk kromatografi gas. Dalam kromatografi gas, fasa gerak hanya sebagai pembawa solute melewati kolom menuju detektor. Sebaliknya dalam HPLC,fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solute-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.

PERSYARATAN FASA GERAK HPLC Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan berikut:Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan di analisis.Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat menganggu interpretasi kromatogram.Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.Zat cair tidak kental. Sesuai dengan detektor.

JENIS FASA GERAKFasa gerak untuk kromatografi partisi, adsorpsi, dan penukar ion bersifat interaktif dalam arti fasa gerak berinteraksi dengan komponen-komponen cuplikan. Akibatnya, waktu retensi sangat dipengaruhi oleh jenis pelarut. Sebaliknya fasa gerak untuk kromatografi eksklusi bersifat non interaktif. Oleh karena itu, waktu retensi dengan kromatografi ini tidak bergantung pada komposisi fasa gerak.B. PompaPompa dalam HPLC dapat dianalogikan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan :1. Menghasilkan tekanan sampai 600 psi2. Keluaran bebas pulsa3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit4. Bahan tahan korosi Dikenal tiga jenis pompa yang masing-masing memiliki kenutungan dan kekurangannya yaitu pompa reciprocating, displacement dan pneumatic.

Pompa reciprocatingJenis pompa ini sekarang banyak dipakai. Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa batang gelas dan berkontak langsung dengan pelarut.Pompa displacementPompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung tekanan baik kolom dan viskositas pelarut. Selain itu, keluaran pompa ini bebas pulsa. Akan tetapi pompa ini keterbatasan kapasitas pelarut (250 mL) dan tidak mudah untuk melakukan pergantian pelarut.Pompa pneumaticDalam pompa ini pelarut di dorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunyai keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (