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Determinación de de la constante de Acidez del
2,6-Diclorofenol Indofenol, por electroforesis
capilar, voltamperometría cíclica y
espectrofotometría UV/Vis
INFORME DE PROYECTO TERMINAL
ALUMNO: RUSLÁN ÁLVAREZ DIDUK
LICENCIATURA EN QUÍMICA
MATRÍCULA: 203213175
ASESORA: DRA. MARÍA TERESA RAMÍREZ SILVA
Agradecimientos
Quiero agradecer a mi asesora y mejor amiga María Teresa Ramírez Silva por haberme motivado a la investigación y a la culminación de mi carrera, por hacer de mi una mejor persona cada día, por toda la paciencia que ha tenido conmigo, por los consejos. Por estar siempre cuando la necesito, por esos momentos batallando a última hora para obtener resultados, por ser una madre para mi, en fin, “Por salvarme la vida”. A mi padre Raúl Álvarez que aunque el no lo crea siempre me ha inspirado para lograr mis metas, me ha apoyado toda la vida y lo sigue haciendo, porque nunca se equivoca cuando me da un consejo, ha sido toda la vida el ejemplo a seguir … porque es el mejor padre del mundo. A mi madre Natalia Diduk que aunque esté lejos siempre procuró lo mejor para mi, que hizo que caer en la mediocridad no fuera una opción para su hijo, era un 10 o no era nada. A Annia Galano otra mamá que tengo que me soporta todas mis malcriadeces y tonterías, por las horas estudiando matemáticas, por estar siempre ahí para ayudarme académicamente o darme un consejo para la vida. A Montserrat Origel por ser esa persona especial que hizo que mi vida diera un giro de 180 grados. Porque hizo que me convirtiera en parte de lo que soy ahora, porque compartió conmigo muchos de los mejores momentos de mi vida, por ser esa mujer incondicional que da todo sin esperar nada a cambio, porque me conoce y me entiende, por esa hermosa sonrisa que me inspira, por amarme… A todos ustedes, no se si algún día pueda compensar todo lo que han hecho por mi, solo digo gracias por estar en mi vida ya sea porque le tocaba como mamá y papá o porque nos encontramos en algún momento del camino y lo más importante porque seguimos juntos compartiendo esto maravilloso que es la vida. Y a todas las personas que de alguna manera u otra compartieron conmigo a lo largo de la carrera momentos buenos, malos opiniones, consejos, fiestas, etc. A la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa, al área de Química Analítica, que me dio la bienvenida como uno más de los suyos desde el primer día
A México porque cambió enteramente mi vida y me acogió con los brazos abiertos y me dio la oportunidad de vivir en este hermoso país. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por el apoyo financiero otorgado a través del proyecto 82932
Determinación de de la constante de Acidez del 2,6-Diclorofenol Indofenol, por
electroforesis capilar, voltamperometría cíclica y espectrofotometría UV/Vis y análisis
de la cinética de descomposición de la molécula.
Resumen
Se realiza la determinación de constantes de acidez de 2,6-Diclorofenol Indofenol por tres
métodos diferentes, obteniendo información relacionada con la estabilidad de la molécula
por diferentes métodos como son HPLC, electroforesis capilar y Resonancia Magnética
Nuclear.
Introducción
Desde 1937 el 2,6-Diclorofenol Indofenol (DCPI) ha sido utilizado para la determinación
de ácido ascórbico [1] . La importancia de este reactivo se ha ido incrementando a la fecha
ya que se han encontrado diversas aplicaciones para la determinación de antioxidantes en
vino[2], especies reducidas en cerveza [3] y determinaciones de diferentes especies
biológicas entre las cuales se encuentra el NADH (nicotinamida adenin dinucleótido) [4].
Diversos autores han calculado el valor de la constante de acidez, por diferentes métodos,
Narayanaswamy y col. [5] consideran que la determinación depende de si la especie
química está inmovilizada o está en solución. Estos autores encontraron que inmovilizada
el valor de pKa es 7.01 y en solución de 5.7. Por otra parte, Florou y col. [6] presentan una
constante de 5.2 para la DCPI (ox) inmovilizada. En resumen, existen valores de pKa
reportados hasta con una unidad de diferencia. Debido a esta discrepancia y a la
importancia de las aplicaciones de esta especie química, en este trabajo se calcula la
constante de acidez de la molécula, por diferentes métodos y se analiza el comportamiento
químico de la DPCI en medio ácido.
Condiciones Experimentales
Preparación de muestras.
El 2,6-diclorofenol indofenol se preparó a partir del reactivo analítico Fluka. El NaCl,
NaOH y HCl fueron grado analítico marca Merck, se preparó el amortiguador Britton
Robinson (acetatos, boratos y fosfatos) para fijar los diferentes valores de pH, en todos los
casos se utilizó agua desionizada tipo 1(18.2 MΩ) libre de materia orgánica, obtenida de
US Filter Pure-LAB-PLUS UV.
Equipos.
Para el estudio electroquímico se utilizó un potenciostato galvanostato Autolab
(PGSTAT12), con un electrodo de trabajo de pasta de carbón, (EPC), un contraelectrodo de
platino y un electrodo de referencia de Ag/AgCl.
Para el estudio espectrofotométrico se utilizó el UV/vis Lambda 20 Perkin Elmer se
utilizaron celdas de cuarzo con una longitud de paso óptico de un centímetro.
Para la obtención de los cromatogramas se utiliza un Cromatógrafo de líquidos de alta
resolución Spectra System SCM 1000 Thermo Separation Products con un detector de
arreglo de diodos con una columna Phenomenex, 100 x 4.60 mm, 3µm ODS (3), la fase
móvil fue 80% Metanol grado HPLC Fluka y 20 % de agua desionizada, Para medir el pH
se utilizó un Potenciómetro Mettler Toledo MPC227 y un electrodo de vidrio combinado
Mettler Toledo Para el estudio de electroforesis capilar se preparó una solución 0.001 M de
DCPI. Se utilizó buffer de fosfatos, 50 mM, para cubrir todo el intervalo posible de valores
de pH, desde2 hasta 11, aproximadamente. La técnica utilizada fue CZE (electroforesis
capilar de zona), los experimentos se realizaron a 25ºC en un equipo P/ACE MDQ de
Beckman con detector de arreglo de diodos. La inyección de la muestra se hizo de forma
hidrodinámica a 1.0 psi/10 segundos, para cada valor de pH se hicieron dos repeticiones; se
aplicó un voltaje de 20 kV, con polaridad invertida para valores pH< 4. Se utilizó acetona
como marcador del flujo electroosmótico. El capilar usado tiene 50 µm de diámetro interno
con una longitud total de 50.2 cm y una longitud efectiva de 40 cm.
Resultados y Discusión
En la figura 1 se muestra la estructura del 2,6-diclorofenol indofenol, como puede
observarse tiene un grupo OH, que podría asociarse a un protón ácido, también el N que
está unido a los dos anillos puede protonarse y presentar una constante de acidez, A partir
de estas consideraciones se realizan estudios del comportamiento espectrofotométrico de la
molécula a diferentes valores de pH para determinar las constantes de acidez asociadas a
ésta.
Figura 1.Estructura del 2,6-Diclorofenol Indofenol
Espectrofotometría
En la figura 2 se muestra la familia de espectros de absorción obtenidos de una solución de
DCPI 4.45 x 10-5M en un intervalo de pH de 1.5 a 11.7, los espectros obtenidos presentan
los máximos de absorción en las siguientes longitudes de onda 600, 520, 310 y 270 nm,
como se puede observar en la figura a valores de pH ácido se encuentra el máximo en 510
nm y se observa una coloración roja, al incrementar el valor de pH desaparece esta banda
dando lugar a otra a 602 nm y un cambio de coloración de la solución a azul.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
240 340 440 540 640 740
A
λλλλ/nm
11.7
1.5
pH
Figura 2. Espectros de absorción de una solución de DCPI 4.45 x10-5M a diferentes
valores de pH.
Con la finalidad de observar el intervalo de pH en cual se encuentra la constante de
acidez de la DCPI en la solución se sigue el cambio de absorbancia en función del pH para
la λ de 602 nm asociado al color azul que presenta la molécula cuando se encuentra a
valores de pH básico, en la figura 3 se puede observar que le punto de inflexión se
encuentra en un pH de 577 y al realizar el cálculo de la Absorbancia total a 602nm se otiene
un buen ajuste de los valores de absorbancia para cada uno de los pH este comportamiento
muestra que a estas condiciones solamente se tendría un valor de pKa asociado a la DCPI.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0 2 4 6 8 10 12 14
602
Ajuste pKa 5.77
A
pH
Figura 3. El cambio de absorbancia en función del pH a una longitud de onda de 602nm
Para realizar el cálculo de la constante con mayor precisión se alimentan al
programa computacional SQUAD las absorbancias obtenidas a los diferentes valores de pH
para varias longitudes de onda. El valor que se obtiene con este programa es de
5.7579±0.0019.
Con los datos obtenidos por el programa se SQUAD se obtiene el diagrama de
distribución de especies químicas de la DCPI mostrado en la figura 4
0
0.5
1
0 5 10
fra
cció
n
pH
HDPCI DPCI
Figura 4. Diagrama de distribución de especies química de DPCI
En la figura 5 se presentan los coeficientes de absortividad molar de las especies
químicas HDCPI y DCPI a las diferentes longitudes de onda de trabajo, con los errores
asociados a cada uno de ellos, como puede observarse los errores son menores al 1%, con
estos valores, así como las fracciones de especies a cada valor de pH y las concentraciones
de trabajo se pueden reproducir los espectros de absorción a diferentes valores de pH y
compararlos con los obtenidos experimentalmente en la figura 6 se observa que los
espectros simulados reproducen perfectamente los resultados experimentales. Por lo que
consideramos con esta información que solo se puede obtener un valor de pKa.
0.00E+00
2.00E+03
4.00E+03
6.00E+03
8.00E+03
1.00E+04
1.20E+04
1.40E+04
1.60E+04
1.80E+04
2.00E+04
250 350 450 550 650 750
HDCPI
DCPI
ε/cm
-1M
-1
λ/nm
Figura 5. Coeficientes de absortividad dados por SQUAD para las especies químicas de
DCPI
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
250 350 450 550 650 750
2.01
5.69
6.24
6.62
10.37
2.01
5.69
6.24
6.62
10.37Ab
sorb
anc
ia
λ/nm
pH
Figura 6. Espectros de absorción simulados (línea continua) y experimentales
(marcadores) a diferentes valores de pH
Para validar el valor obtenido de pKa se realiza la determinación con otros
métodos.
Estudio Electroquímico
En la figura 7 se muestra el comportamiento electroquímico del DCPI a una concentración
de 4.14 x 10-5M . El estudio se inició en el potencial de corriente nula obtenido para cada
valor de pH y se inicia el barrido de potencial hacia valores de potenciales más negativos,
después se invierte el potencial de barrido y se puede observar que los voltamperogramas
obtenidos para la DCPI en todos los casos presenta un pico de reducción, y al invertir el
barrido de potencial un pico de oxidación, y conforme el valor de pH es más ácido ambos
potenciales se desplazan hacia valores positivos, además de que la diferencia de potencial
entre los picos se hace menor. A valores de pH básicos se puede observar en la oxidación la
presencia de un hombro después del pico de oxidación que podría estar asociado con la
adsorción de la molécula en la superficie del electrodo, en el caso de los valores de pH
ácido se puede observar en algunos casos otros picos de reducción. Considerando lo
anterior se decidió realizar un gráfico del cambio del potencial del pico de reducción en
función del pH para observar solo la reducción de la DCPI.
-7.50E-06
-5.50E-06
-3.50E-06
-1.50E-06
5.00E-07
2.50E-06
4.50E-06
6.50E-06
-150 -50 50 150 250 350 450
I/A
E/mV
1.5271.7832.2012.4392.633.1473.5313.7613.9854.2984.6494.9945.2555.465.6925.9386.246.4476.827.0487.2917.6697.961
pH
Figura 7. Voltamperogramas cíclicos del DCPI 4.14 x 10-5 M a diferentes valores de pH
en NaCl =0.1M
A partir de los potenciales del pico de reducción se traza la gráfica de Epc=f(pH) donde se
aprecian los cambios asociados a los valores de pKa de la molécula (figura 8), a diferencia
de los métodos anteriores, aquí se observan dos cambios de pendiente asociados a la DCPI
oxidada, el que se ve en 5.8 se asocia a la constante de acidez y el otro cambio a pH más
ácido con los resultados presentados hasta este momento no puede ser asignado a algún
proceso fisicoquímico. Además se presenta otro cambio de pendiente en un valor de pH de
4.5 que podría asociarse a un proceso químico de la DCPI reducida.
-400
-200
0
200
400
0 5 10 15
pH
E/m
V
Figura 8. Potencial del pico de reducción del DCPI en función del pH
Los resultados obtenidos por esta técnica confirman el valor de constante de acidez
en 5.8 aproximadamente, pero da información adicional sobre la especie reducida, la cual
puede presentar también un valor de constante de equilibrio probablemente de acidez a un
valor de 4.5, el cambio de pendiente en el valor de pH 3, puede ser asociado a la
protonación del grupo N de la molécula, sin embargo, pueden ocurrir otros fenómenos que
den este cambio de pendiente ya que se observa un cambio de coloración que indica una
pérdida de la especie ácida, este comportamiento químico no se estudia en este trabajo.
Para analizar las cargas que tienen las especies químicas que se tienen a los
diferentes valores de pH se realiza un estudio por electroforesis capilar de zona.
Electroforesis Capilar
Se utiliza la técnica CZE, con acetona como marcador del flujo electroosmótico. En la
figura 9 se muestra un electroferograma obtenido a pH 6.94, con la señal de la DPCI y la
acetona. Realizando los ajustes estadísticos de las curvas de movilidad electroforética como
función de pH (figura 10) y con ayuda del programa SQUAD, a temperatura de 25oC y
fuerza iónica de 0.05M, se obtuvo pKa1 = 5.819 ± 0.022. Aquí se observa que cuando la
especie predominante es el anión, a valores altos de pH, la movilidad es prácticamente
constante. Cuando se acerca el pH al primer valor de pKa, esta empieza a cambiar debido a
que ya no predomina una sola especie sino que se tiene un promedio entre ambas que afecta
la movilidad efectiva hasta hacerse prácticamente constante a un valor de 0 lo que nos
indica que la especie que se tiene a valores de pH menor a 5.8 es una especie neutra, lo que
confirma que la desprotonación se lleva a cabo en el grupo OH y dando una especie
aniónica y que a el grupo N no se encuentra protonado
Figura 9. Electroferograma obtenido de una solución de DCPI 1 x 10-3M a pH 6.94,
utilizando acetona como marcador del flujo electrosmótico
-2.50E-08
-2.00E-08
-1.50E-08
-1.00E-08
-5.00E-09
0.00E+00
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00
pH
u eff (m
2/V
s)
Ueff(exp) Ueff(sim)
Figura 10. Movilidad efectiva (ueff) como función del pH
CONCLUSIONES
Con los resultados anteriores se puede concluir que el pKa del DCPI es 5.7579±0.0019, fue
calculado por tres métodos diferentes dando resultados similares.
Referencias
1. M. H . Menaker, N. B. Guerrant, Ind. Eng. Chem. Anal. 10 (1938) 25.
2. X. Durliat, M. Comtat; Anal. Chim. Acta 545 (2005) 173
3. R.M. Sobiech, R. Neumann, D. Wabner, Electroanalysis 10 (1998) 969
4. A. B. Florou, M. I. Prodromidis, M. I. Karayannis, S. M. Tzouwara-Karayanni,
Electroanalysis 10 (1998) 1261.
5. R. Narayanaswamy, F. Sevilla III, Anal. Chim. Acta 189 (1986) 365.
6. A. B. Florou, M. I. Prodromidis, M. I. Karayannis, S. M. Tzouwara-Karayanni,
Electroanalysis 12 (2000) 361.