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diagnostica molecolare unifi
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ANALISI POLIMORFISMI DNA
Analisi di linkage -> esclusione di geni
Fenotipi di pazienti con osteogenesi imperfetta (OI)
AR(poco comune)
AD
Deformita` da lieve a moderata.
Variab. ritardo nella crescita; cifoscoliosi.
In alc.casi
+(50%)
Bian-che
+IV
ADDeform. progress. delle ossa lunghe; deform. moder. alla nascita; statura bassa; marcata cifoscoliosi
Rara+Blu alla nasci-ta
++III
AD
AR(rara)
Letale nel periodo perinatale; costole piegate; deformita` marcate nelle ossa lunghe; platispondilia (vertebre appiattite)
--Blu+++II
ADStatura normale; niente o poche deformita`; tendenza a contusioni; ipermobilita` delle giunture.
+(50%)
RaraBlu+I
Eredita`Altre caratt. clinichePerd. udito
Dent. imperf.
Sclere
FrattureTipo
Dip. Area Critica Medico Chirurgica,Firenze
OSTEOGENESIS IMPERFECTA
Dip. Area Critica Medico Chirurgica,Firenze
Dip. Area Critica Medico Chirurgica,Firenze
I
II
III
IV
1 2
5 63 4
5 6
1 2
1 2
1 2
3 4
3 4
-/- -/+
-/--/- -/- -/-
-/-
-/+-/+
-/+ -/+-/+ -/+ -/+
-/+ -/+ -/++/+
Affected by OI
ProbandDip. Area Critica Medico Chirurgica,Firenze
Famiglia con Osteogenesi Imperfetta tipo IV dominante
RFLP: COL1A2/EcoRI
Famiglia A
Famiglia con Osteogenesi Imperfetta tipo IV dominante
Famiglia B
OI tipo I, dominante
1 RFLP: COL1A2/EcoRI2 VNTR: COL1A2/(ACT)n3 RFLP: COL1A1/EcoRI4 VNTR: COL1A1/(GCC)n
15/18 17/18
I
1234
8/10-/++/+15/18
1 2 3
1 2
8/10-/+-/+15/17
9/10+/+-/-18/19
I
1234
8/9-/+-/+15/18
8/9-/+-/-17/18
Dip. Area Critica Medico Chirurgica,Firenze
Dip. Area Critica Medico Chirurgica,Firenze
BETHLEM MYOPATHY
1996
By linkage analysis: association between Bethlem myopathy and a) COL6A1-COL6A2 on chromosome 21q 22.3 (Jobsis et al.,) b) COL6A3 on cromosome 2q37 (Speer et al.,)
Detection of the two first mutations in COL6A1 and COL6A2 in three unrelated Dutch families (Jobsis et al.,)
Detection of the first mutations in COL6A3 in a French-Canadian family (Pan et al.,)
1998
Dip. Area Critica Medico Chirurgica,Firenze
BETHLEM MYOPATHY
Autosomal dominant inherited disease producing a mild neuromuscular disorder characterized by:
Proximal skeletal muscle weakness and wasting
Multiple joint contractures (neck, elbows, ankles and the interphalangeal finger joints)
It has a slow, progressive benign course although some of the patients end up on a wheel chair after the age of 50
Age of onset: from prenatal period to adulthood
Dip. Area Critica Medico Chirurgica,Firenze
Dept. of Internal Medicine, Tor Vergata University, ROME-ITALY
Bethlem miopathy
Dip. Area Critica Medico Chirurgica,Firenze
RNA and DNA analysis in Bethlem myopathy
Skin biopsyFibroblast cells cultureRNA extractionRT-PCR
Heteroduplex analysisDirect sequencing
Blood withdrawal
Segregation analysisPCR amplification of single exons
Genomic DNA extraction
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Immunofluorescence of fibroblasts of a Bethlem patient
Cont
rol
B
D C
A
Patien
t
Type I collagen Type VI collagen
Dip. Area Critica Medico Chirurgica,Firenze
Northern
Immunoprecipitation
Northern and immunoprecipitation analysis
Dip. Area Critica Medico Chirurgica,Firenze
C P C P C P C P
Cell Medium
1 2 3 4 5 6 7 8
2( I )
1( I )
1( VI )
C P
3( VI )
1( VI ) 2( VI )
A B
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Protein analysis
BETHLEM FAMILY BG:COL6A3 and COL6A2 gene exclusion
I
III
IV
II
A3P1
A2P1 A2P1
1 2
3 4 5
6 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18
13/18
T/C 3/4
18/18
C/C 1/3
13/18
T/C 3/4
13/18
C/C 4/3
14/17
C/C 1/2
7
8/14
C/C 2/5
13/18
C/C 4/1
13/18
C/C 4/1
8/14
C/C 2/2
18/18
T/C 3/1
13/17
C/C
4/1
13/14
C/C
4/1 13/14
C/C
1/2
13/14
C/C
5/1
14/18
C/C
2/4
14/18
C/C
4/2
affected
A3P1 A2P1 A2P1
A3P1 A2P1 A2P1
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Chromatograms from DHPLC analysis
A - control B Ins 2 bp C SNS
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SITO DONATORE IN 5'
SITO ACCETTORE IN 3'Centro Marfan,Firenze
Genomic DNA cDNA
COL6A1 IVS3+1 G->A mutation activates a donor splice site inside Exon3 causing the deletion of 66 nts (in frame deletion)
3 4
GGG/gtgagt
a
CAA/gtactt (cryptic donor site)
AG/gt agt C A
g a
Canonical site in mammals
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COL6A1 mutations
7 6 8 8 6
Genomic DNA cDNA
gt ac (2)(1)
14 13 15 15 13 gt ac (1)(6)
3 4 g
a (4)
-66 14 6
Ser
X
GlyArg
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MUTAZIONI DI SPLICING
Mutazioni di tipo quantitativo
50% 50%
Centro Marfan,Firenze
GT/AG
Perdita di un esone interoRitenzione di un introne
10%-50% 50%
Mutazione negli altri nucleotididei siti donatori o accettori
Attivazione di siti criptici esonici o intronici
Totale Parziale
COL6A1 cDNA mutations
14 13 15
Genomic DNA
12 11 10 9 8 IVS 8 IVS 14
15 14 13 Normal cDNA 12 11 10 9 8
15 8 MutatedcDNA 252nts in frame deletion
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Collagensstructure, function, and biosynthesis
Centro Marfan,Firenze
Mutaz. in un allele
2(I) 1(I)
saranno presenti nel
50% 75%
Eterotrimerialterati
Centro Marfan,Firenze
Espressione diversa delle mutazioni in base alla struttura della molecola o alla sovrastruttura finale
Collagen VI mutations in Bethlem Myopathy
N1 C1 C2 C
1
2
N10 N9 N8 N7 N6 N5 N4 N3 N2 N1 C1 C2 C3 C5 C
3 C4
G1679E G2056R
G271S(2)
IVS3, +1GA, pdelEx3
G305V IVS11, -1GA, PTC IVS14, +1GA, delEx14 (1+5)
IVS14, +2TC, delEx14
N1 C1 C2 C
S348X
G275R
IVS7, +1GA, delEx7 (2)
IVS7, +2AG, delEx7 K122R
G341D
D621N
G341V
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Ullrich Scleroatonic Muscular Dystrophy
Recessive congenital muscular distrophy (CMD) affecting connective tissue and muscle
Proximal joint contractures
Hyperextensibility of distal joints resembling Ehlers Danlos syndrome
Consanguineity among unaffected parents
Normal intelligence
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COL6A2 Exon 18
28nts del
A Japanese patient with Ullrich scleroatonic muscular dystrophy
Dip. Area Critica Medico Chirurgica,Firenze
Type VI collagen in the muscle of an Ullrich patient
Co P Dip. Area Critica Medico Chirurgica,Firenze
A
B
C
D
E
F
Family B
Fath
er
Mot
her
Aff
ecte
d so
n
Dip. Area Critica Medico Chirurgica,Firenze
Type VI Collageninteractions
N10 N9 N8 N7 N6 N5 N4 N3 N2
N1
N1
C1 C2TH
C1 C2TH C4C3 C5
C
C
C
1(VI)
2(VI)
3(VI)
NG2
?
Perlecan/BM
BG
Undulin
Decorin
Fibronectin
ColIV
ColIMAGPwWF
Hyaluronic Acid; Heparin)Dip. Area Critica Medico Chirurgica,Firenze
Type VI Collageninteractions
N10 N9 N8 N7 N6 N5 N4 N3 N2
N1
N1
C1 C2TH
C1 C2TH C4C3 C5
C
C
C
1(VI)
2(VI)
3(VI)
NG2
?
Perlecan/BM
BG
Undulin
Decorin
Fibronectin
ColIV
ColIMAGPwWF
Hyaluronic Acid; Heparin)Dip. Area Critica Medico Chirurgica,Firenze