Diferencijalna i citokemijska analiza krvnih stanica zelene žabe … · 2018-04-17 · Kod embrija sisavaca hematopoeza počinje u žumanjčanoj vreći (gdje se stvaraju eritrociti

Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Iva Kleiner

Diferencijalna i citokemijska analiza krvnih stanica

zelene žabe (Pelophylax ridibundus, Pallas, 1771)

Diplomski rad

Zagreb, 2013. godina

Ovaj diplomski rad, izrađen u Zavodu za animalnu fiziologiju Prirodoslovno-matematičkog

fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, pod vodstvom doc. dr. sc. Domagoja Đikića, predan je na

ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi

stjecanja zvanja magistra molekularne biologije.

Zahvale

Puno hvala tehničarki Mariji Potočić i stručnoj suradnici dr. sc. Anici Horvat-Knežević na

stručno odrađenoj pripremi uzorka i spremnosti da mi uvijek uskoče u pomoć.

Hvala mentoru doc. dr. sc Domagoju Đikiću što mi je pružio potpuno samostalnost i

odgovornost tijekom izrade ovog rada. Smatram to odličnom pripremom za pravi posao.

Hvala cijeloj ekipi Zavoda za animalnu fiziologiju na njihovom pozitivnom stavu! Bilo mi je

zadovoljstvo radit s vama!

Hvala Duji na ustupljenom magistarskom radu koji je pomogao tamo gdje je literatura nije.

Također, hvala kolegici Mateji Jarak na pomoći kod izrade i bojanja uzorka. Bez nje bio ovo

bilo mnogo dugotrajnije i upola manje zabavno.

Za kraj, hvala obitelji i prijateljima na potpori i velika hvala Toniju za pomoć oko obrade

slika.

Hvala vam što ste uz mene!

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Diplomski rad

Diferencijalna i citokemijska analiza krvnih stanica zelene žabe (Pelophylax ridibundus, Pallas, 1771)

Iva Kleiner

Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb

U ovom radu koristila se puna krv zelene žabe Pelophylax ridibundus. Izračunala se brojnost eritrocita, leukocita te vrijednost hematokrita. Morfološka i kvantitativna analiza krvnih stanica provedena je bojanjem May-Grünwald Giemsom. Diferencijalnim citokemijskim tehnikama napravljena je citološka karakterizacija različitih tipova leukocita. Glikokonjugati i polisaharidi dokazani su tehnikama alcian blue (AB) i periodic acid Schiff (PAS). Stanični lipidi dokazani su tehnikom sudan black B (SBB). Enzimatsko-citokemijskim tehnikama dokazala se aktivnost alfa-naftil acetat esteraza (ANAE), alfa-naftil butirat esteraza (ANBE) te alkalne fosfataze (ALP). Brojnost i udio leukocita, hematokrit i morfologija stanica slični su ostalim žabama, dok je brojnost eritrocita veća. Bojanje ABom imaju jezgre svih stanica, citoplazma limfocita, monocita, dio neutrofila, trombocita i neke granule eozinofila. PASom se boje limfociti, granule eozinofila, neki monociti, neutrofili i trombociti. SBBom se boje leukociti, trombociti, slabije nezreli i zreli eritrociti. Aktivnost ANAE pokazuju monociti i neki limfociti. Aktivnost ANBE imaju monociti, neki trombociti i limfociti. ALP nije dala pozitivne rezultate.

(63 stranica, 44 slika, 9 tablica, 58 literaturna navoda, jezik izvornika: hrvatski) Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici. Ključne riječi: boja, eritrocit, hematologija, leukocit, trombocit, vodozemac Voditelj: Dr. sc. Domagoj Đikić, doc. Ocjenitelji: Dr. sc. Domagoj Đikić, doc.

Dr. sc. Gordana Lacković Venturin, prof. Dr. sc. Renata Šoštarić, doc.

Zamjena: Dr. sc. Davor Zanella, doc. Rad prihvaćen: 23.2.2013.

BASIC DOCUMENTATION CARD

University of Zagreb Faculty of Science Department of Biology Graduation Thesis

Differential and Cytochemical Analysis of Blood Cells in Green Frogs (Pelophylax

ridibundus, Pallas, 1771

Iva Kleiner

Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Croatia

This thesis presents results attained from peripheral blood of the frog Pelophylax ridibundus. It contains hematocrit values, erythrocytes and leukocytes counts. The May-Grünwald Giemsa stain was used in morphological and quantitative blood cell analysis. Cytological characterization of leukocytes types used differential cytochemical stains. The alcian blue (AB) dye and the periodic acid Schiff method (PAS) stained glycoconjugates and polysaccharides. The sudan black B (SBB) dye stained cell lipids. Activities of alpha-naphthyl acetate esterase (ANAE), alpha-naphthyl butyrate esterase (ANBE) and alkaline phosphatase (ALP) were proved using enzyme-cytochemical reactions. Leukocyte count and percentage, hematocrit and cell morphology are similar to other frogs, unlike erythrocyte counts which are greater. AB stained nuclei of all cells, cytoplasm of lymphocytes, monocytes, some neutrophils, thrombocytes and some eosinophil granules. PAS stained lymphocytes, eosinophil granules, some monocytes, neutrophils and thrombocytes. All leukocytes, thrombocytes, young and mature erythrocytes stained with SBB. Monocytes and lymphocytes have active ANAE. Monocytes, some lymphocytes and thrombocytes have active ANBE. ALP activity was not recorded.

(63 pages, 44 figures, 9 tables, 58 references, original in: Croatian) Thesis deposited in the Central Biological Library Key words: amphibian, dye, erythrocyte, leukocyte, hematology, stain, thrombocyte Supervisor: Dr. Domagoj Đikić, Asst. Prof. Reviewers: Dr. sc. Domagoj Đikić, doc.

Dr. sc. Gordana Lacković Venturin, prof. Dr. sc. Renata Šoštarić, doc.

Replacement: Dr. sc. Davor Zanella, doc. Thesis accepted: February 23rd, 2013.

POPIS KRATICA:

AB alcijansko modrilo, engl. alcian blue

ACP kisela fofataza, engl. acid phosphatase

ALP alkalna fosfataza, engl. alkaline phosphatase

ANAE alfa-naftil acetat esteraza, engl. α-naphthyl acetate esterase

ANA alfa-naftil acetat

ANBE alfa-naftil butirat esteraza, engl. α-naphthyl butyrate esterase

ANBE alfa-naftil butirat

CFU-E stanice koje formiraju eritrocite, engl. colony-forming unit-erythrocyte

CFU-GM stanice koje formiraju granulocite i monocite, engl. colony-forming unit-

granulocytes,monocytes

CFU-M stanice koje formiraju megakariocite, engl. colony-forming unit-megakaryocytes

dH2O destilirana voda

DKS diferencijalna krvna slika

EG etilen glikol

EGME etilen glikol monometil eter

GAG glikozaminoglikani, engl. glycosaminoglycans

GalNAc N- acetilgalaktozamin

GlcNAc N-acetilglukozamin

MGG May-Grünwald Giemsa

NFR engl. nuclear fast red

N-H Natt- Herrick

NK stanice ubojice, engl. natural killer cells

NSE nespecifična esteraza, engl. non-specific esterase

PAS metoda Schiffove baze i perjodne kiseline, engl. periodic acid Schiff

SBB sudansko crnilo, engl. sudan black B

SADRŽAJ: 1. UVOD ................................................................................................................................................. 1

1.1. Izgled, građa, uloga i razvoj pojedinih krvnih stanica u kralježnjaka .......................................... 1

1.1.1. Eritrociti................................................................................................................................. 3

1.1.2. Trombociti ............................................................................................................................. 5

1.1.3. Leukociti ................................................................................................................................ 7

1.2. Citokemijske tehnike .................................................................................................................. 14

1.3. Citokemijske karakteristike krvnih stanica u kralježnjaka ......................................................... 25

2. CILJ ISTRAŽIVANJA...................................................................................................................... 26

3. MATERIJALI I METODE ............................................................................................................... 27

3.1. Uzorci ......................................................................................................................................... 27

3.2. Određivanje ukupnog broja eritrocita i leukocita ....................................................................... 27

3.3. Određivanje vrijednosti hematokrita .......................................................................................... 28

3.4. Bojanja May-Grünwald Giemsom (MGG) ................................................................................ 28

3.4.1. Morfološke karakteristike krvnih stanica ............................................................................ 28

3.4.2. Računalna obrada podataka ................................................................................................. 28

3.5. Citokemijske analize .................................................................................................................. 28

3.5.1. Alcijansko modrilo (AB) ..................................................................................................... 29

3.5.2. Alfa-naftil acetat esteraza (ANAE) ..................................................................................... 30

3.5.3. Alfa-naftil butirat esteraza (ANBE) .................................................................................... 31

3.5.4. Alkalna fosfataza (ALP) ...................................................................................................... 32

3.5.5. Metoda Schiffove baze i perjodne kiseline (PAS)............................................................... 33

3.5.6. PAS i AB kombinacija ........................................................................................................ 34

3.5.7. Sudansko crnilo B (SBB) .................................................................................................... 34

3.5.8. Morfološke karakteristike krvnih stanica ............................................................................ 35

4. REZULTATI ..................................................................................................................................... 36

4.1. Određivanje ukupnog broja eritrocita i leukocita ....................................................................... 36

4.2. Određivanje vrijednosti hematokrita .......................................................................................... 36

4.3. Diferencijalna analiza pomoću bojanja May-Grünwald Giemsom ............................................ 36

4.3.1 Eritrociti................................................................................................................................ 36

4.3.2. Trombociti ........................................................................................................................... 37

4.3.3. Agranulociti, limfociti ......................................................................................................... 38

4.3.4. Granulociti, neutrofili .......................................................................................................... 38

4.3.5. Granulociti, eozinofili.......................................................................................................... 38

4.3.6. Agranulociti, monociti ......................................................................................................... 38

4.3.7. Granulociti, bazofili ............................................................................................................. 39

4.4. Citokemijske analize .................................................................................................................. 41

4.4.1. Alcijansko modrilo (AB) ..................................................................................................... 41

4.4.2. Alfa-naftil acetat esteraza (ANAE) ..................................................................................... 42

4.4.3. Alfa-naftil butirat esteraza (ANBE) .................................................................................... 43

4.4.4 Alkalna fosfataza (ALP) ....................................................................................................... 43

4.4.5. Metoda Schiffove baze i perjodne kiseline (PAS)............................................................... 43

4.4.6. PAS i AB kombinacija ........................................................................................................ 44

4.4.7. Sudansko crnilo B (SBB) .................................................................................................... 44

4.5. Atipične i neklasificirane stanice................................................................................................ 45

4.5.1. "Raspadnute jezgre". ........................................................................................................... 45

4.5.2. Neobične stanice .................................................................................................................. 46

4.5.4. Azurofili i heterofili ............................................................................................................. 47

4.5.5. Morfološke neobičnosti krvnih stanica ............................................................................... 47

5. RASPRAVA ...................................................................................................................................... 49

6. ZAKLJUČAK ................................................................................................................................... 58

7. LITERATURA .................................................................................................................................. 59

UVOD

1

1. UVOD

Vrlo je malo objavljenih radova o hematologiji vodozemaca. Vrsta koja je najviše

korištena u istraživanjima hematologije vodozemaca je tropska žaba panđašica Xenopus laevis

koja je standardizirana kao laboratorijska životinja i česti je model u laboratorijskom radu i

fiziološkim istraživanjima.

Krvne stanice vodozemaca dijele neke sličnosti (poglavito morfološke) sa ostalim

kralježnjacima, ali u nekim pogledima (npr. hematopoeza u ličinačkim stadijima) sličnije su

nižim kralježnjacima (Claver i Quaglia 2009).

U najčešće rutinske analize krvi spada niz pretraga u kojima se mjeri brojnost leukocita,

eritrocita i trombocita, diferencijalna krvna slika (DKS), koncentracija hemoglobina,

vrijednost hematokrita te indeksi eritrocita (Desai 2006; Dugdale 2011). DKS određuje

relativni broj, odnosno udio svakog tipa leukocita u perifernoj krvi (Dugdale 2011; Piršljin i

Milinković Tur 2009).

U ovom je radu izmjerena brojnost eritrocita i leukocita, dobivena je vrijednost

hematokrita i napravljen je DKS. Također su napravljene citokemijske analize za

karakterizaciju pojedinih tipova i podtipova krvnih stanica zelene žabe Pelophylax

ridibundus.

Podaci o diferencijalnoj citokemijskoj analizi krvnih stanica P. ridibundus ne postoje u

dostupnoj literaturi. Kako ova vrsta, uz još nekoliko drugih vrsta iz roda Pelophylax,

predstavlja eksperimentalnu životinju u različitim fiziološkim, genetičkim i evolucijsko

specijacijskim istraživanjima (Feidantsis i sur. 2012; Fominykh i Liapkov 2011; Marracci i

sur. 2011; Usmanova i sur. 2010), ovaj rad predstavlja temeljno istraživanje sa svrhom

utvrđivanja referentnih podataka o citokemijskim karakteristikama stanica krvi.

1.1. Izgled, građa, uloga i razvoj pojedinih krvnih stanica u kralježnjaka

Kod embrija sisavaca hematopoeza počinje u žumanjčanoj vreći (gdje se stvaraju

eritrociti sa jezgrama), nastavlja se u jetri, zatim u slezeni i limfnim čvorovima i konačno u

koštanoj srži. Sve krvne stanice nastaju iz pluripotentnih hematopoetskih matičnih stanica.

Prilikom njihovih diobi jedna stanica kćer ostaje pluripotentna dok druga ide dalje u

intermedijarnu fazu gdje postaje usmjerena za određenu staničnu liniju. Postoji više različitih

usmjerenih matična stanica (Slika 1.), colony-forming unit-erythrocyte (CFU-E) stanice koje

formiraju eritrocite, colony-forming unit-granulocytes, monocytes (CFU-GM) stanice koje

UVOD

2

stvaraju granulocite i monocite i colony-forming unit-megakaryocytes (CFU-M) stanice iz

kojih nastaju megakariociti (Guyton i Hall 2006).

Kod embrija ptica glavno mjesto hematopoeze također je žumanjčana vreća u kojoj

nastaju samo eritrociti i trombociti. Nakon izlijeganja sve se krvne stanice proizvode u

koštanoj srži. Kod gmazova mjesto hematopoeze je isto kao i u ptica osim što njihova jetra i

slezena sudjeluju u hematopoezi u ranijim razvojnim fazama, slično procesu embrionalne

hematopoeze u sisavaca (Claver i Quaglia 2009).

U embrionalnom razvoju vodozemaca hematopoeza se događa u tkivu analognom

žumančanoj vreći viših kralježnjaka, dok je u ličinačkim stadijima (primjerice stadij

punoglavaca u Anura ili ličinačkom stadiju u Urodela) bubreg centar hematopoeze. Općenito,

kod odraslih žaba koštana srž nema značajnu hematopoetsku ulogu (Claver i Quaglia 2009).

Kod Xenopus laevis glavni organi hematopoeze su jetra, bedrena kost i slezena (Hadji-Azimi i

sur. 1987).

Kako ribe nemaju koštanu srž i limfne čvorove morale su razviti jedinstvene

hemtopoetske organe. Čak se i u embrionalnoj hematopoezi razlikuju od ostalih kralježnjaka.

U većini odraslih koštunjača prozonefros (anteriorni bubreg) glavni je hematopoetski organ.

Neke koštunjače koriste slezenu i srce za hematopoezu, a zabilježeno je da se pojedini tipovi

stanica mogu dijeliti i u cirkulaciji (Claver i Quaglia 2009).

UVOD

3

Slika 1. Pojednostavljeni prikaz hematopoeze kod ljudi. Različite krvne stanice nastaju iz pluripotentne

hematopoetske matične stanice. CFU-E (colony forming unit- erythrocytes), CFU-GM (colony forming unit-

granulocytes, monocytes), CFU-M (colony forming unit- megakaryocytes). Obrađeno iz Guyton i Hall

(2006).

1.1.1. Eritrociti

Zreli eritrociti (crvena krvna zrnca) sisavaca (Slika 2.a) nemaju jezgru ni organele čime

gube sposobnost sinteze proteina i nukleinskih kiselina. Veličina im varira između 6 do 9 μm

te izgledaju kao biokonkavni diskovi (Guyton i Hall 2006; Weiss i Wardrop 2010). Deve su

jedina skupina sisavaca koje imaju eliptičan oblik eritrocita. Kod ostalih kralježnjaka eritrociti

su ovalnog ili elipsoidnog oblika sa centralno pozicioniranom jezgrom. Citoplazma je svijetlo

roze boje. Kod ptica (Slika 2.b) čini tanki, bijeli obrub oko jezgre (Arserim i Mermer 2008;

Claver i Quaglia 2009; Weiss i Wardrop 2010). Gmazovi imaju okruglaste jezgre (Slika 2.c)

za razliku od ovalnih kod ptica i vodozemca. Najveće eritrocite imaju upravo vodozemci

(Slika 2.d). Kod salamandera Amphiuma tridactylum iznose 70 x 40 μm što ih čini najvećim

eritrocitima u životinjskom svijetu (Claver i Quaglia 2009). Duljina eritrocita X. laevis varira

od 17 do 19 μm, a širina 9 do 12 μm. Duljina jezgre kreće se od 5 do 9 μm, a širina 4 do 5 μm

UVOD

4

(Hadji-Azimi i sur. 1987). Prosječan broj eritrocita ljudi je oko 5 000 000/ml krvi (Guyton i

Hall 2006), a kod X. laevis taj broj iznosi oko 75 000/ ml krvi (Hadji-Azimi i sur. 1987).

Zahvaljujući hemoglobinu, eritrociti vežu, prenose i predaju kisik tkivima, odnosno

uzimaju ugljični dioksid iz njih. Hemoglobin je proteinski kompleks, tetramer sastavljen od

dva αβ dimera. α i β su globinski lanci od kojih svaki nosi hem skupinu (Nelson i Cox 2008).

Hemoglobin se počinje sintetizirati u rastućim eritrocitima, tj. eritroidnim prekursorskim

stanicama.

Prosječni život zrelog eritrocita čovjeka je 120 dana (Guyton i Hall 2006), kod gmazova

600 do 800 dana, a kod vodozemaca 700-1400 dana (Claver i Quaglia 2009).

Kod ljudi nastanak eritrocita počinje iz CFU-E stanica (Slika 3.). Pod određenim

uvjetima prelaze u proeritroblaste, a u idućem koraku postaju bazofilni eritrociti sa vrlo malo

hemoglobina. Kako stanice mijenjaju oblik (polikromatofilni, ortokromatofilni eritrociti) tako

sintetiziraju sve više hemoglobina, jezgra je sve manja i u fazi retikulocita dolazi do

reapsorpcije endoplazmatskog retikuluma i jezgre (koja se može izbaciti izvan stanice).

Retikulociti se sa ostacima mitohondrija i Golgijevog aparata protiskuju kroz koštanu srž u

krvne kapilare procesom dijapedeze. U iduća dva dana sav bazofilni materijal nestane iz

retikulocita i oni postanu zreli eritrociti (Guyton i Hall 2006). X. laevis ima dosta sličan

proces (Slika 4.). Diferencijacija eritrocita se događa na periferiji jetre prilikom čega dolazi do

kondenzacije i smanjenja jezgre, dok veličina stanice ostaje gotovo ista. Iz matične stanice

razvija se proeritroblast, okrugla stanica sa velikim udjelom jezgre. Daljnjom diferencijacijom

nastaju eritroblast I i II gdje dolazi do izduljivanja stanice, povećanja količine hemoglobina te

kondenzacije jezgre. Nezrele eritrocite I i II karakterizira povećanje obujma citoplazme i

dodatno kondenziranje i smanjenje jezgre koja poprimi okrugli oblik. U tom stadiju

citoplazma ima jednolično obojenje zbog visoke količine hemoglobina. Konačno, zreli

eritrocit ovalnog je oblika sa ovalnom, centralno smještenom jezgrom (Hadji-Azimi i sur,

1987). Zanimljivo kako eritrociti gmazova mogu nastati transformacijom trombocita (Pendl

2006).

Membrana eritrocita ima tipični asimetrični fosfolipidni dvosloj u kojem se nalaze

glikolipidi, kolesterol, proteini i glikokonjuganti (Alberts i sur. 1994; Nelson i Cox 2008).

Jedan od bitnih membranskih glikoproteina je glikoforin. Bogat je negativno nabijenom

sijalinskom kiselinom dajući eritrocitu ukupni površinski negativni naboj (Weiss i Wardrop

2010).

Najčešćih poremećaji u broju eritrocita su anemije, poput aplastične i hemolitičke, te

eritrocitoze, odnosno policitemije (Guyton i Hall 2006; Weiss i Wardop 2010). Kod ljudi,

UVOD

5

ptica i gmazova zabilježeno je nekoliko morfoloških poremećaja poput anizocitoze (eritrociti

različitih veličina), poikilocitoze (različiti oblik), hiperkromije (prejaka obojanost) i prisutnost

normoblasta tj. eritroblasta u ljudi, odnosno eritrocita bez jezgre kod gmazova (Pendl 2006;

Piršljin i Milinković Tur 2009).

Slika 2. Eritrocit čovjeka (a), ptice (b), gmaza (c), vodozemca (d) i ribe (e). Proporcije nisu nužno realne.

Preutezo iz Claver i Quaglia (2009) i Reece (2012).

Slika 3.. Nastanak eritrocita u ljudi. Preuzeto iz Guyton i Hall (2006).

Slika 4. Eritropoeza X. laevis. Proeritroblast (a), eritroblast I (b), eritroblast II (c), nezreli eritrocit I (d),

nezreli eritrocit II (e) i zreli eritrocti (f). Obrađeno iz Hadji-Azimi i sur. (1987).

1.1.2. Trombociti

Trombociti ili krvne pločice u sisavaca (Slika 5.) izgledaju kao mali diskovi promjera 1

do 4 μm (Guyton i Hall 2006). Kod ptica, gmazova, vodozemaca i riba najčešće su okrugli ili

ovalni sa okruglom ili izduženom jezgrom. Velika je morfološka sličnost između nezrelih

trombocita i malih limfocita u gmazova i vodozemaca (Claver i Quaglia 2009). Kod ruskih

UVOD

6

kornjača čak su pronađeni pravokutni trombociti (Knotková i sur. 2002) dok je za ribe česti

vretenasti oblik (Claver i Quaglia 2009; Shigdar i sur. 2007). Zreli trombociti X. laevis su

izduženog, ovalnog oblika različith dimenzija. Citoplazma je svijetlo plave boje, oko

centralno smještene izdužene, tamno ljubičaste jezgre. Kod manjih, izuženih trombocita

jezgra je vrlo kondenzirana, za razliku od većih i okruglijih. Njihova se duljina kod kreće od 7

do 16 μm, a širina 3 do 5 μm. Prosječni broj trombocita X. laevis je oko 19 000/ ml krvi

(Hadji-Azimi i sur. 1987), a čovjeka 225 000 000/ ml krvi (Guyton i Hall 2006).

Kod svih kralježnjaka trombociti imaju glavnu ulogu u aktivaciji mehanizma

zgrušavanja krvi (Claver i Quaglia 2009; Guyton i Hall 2006). Kod ptica i riba sposobni su

fagocitirati i u ovih skupina možda sudjeluju u nespecifičnoj imunosti, iako među

komparativnim hematolozima nikada nije postignuto usaglašavanje mišljenja o ovoj temi

(Claver i Quaglia 2009).

Kod sisavaca trombociti nastaju fragmentacijom iz megakariocita koji se sintetiziraju u

koštanoj srži (Guyton i Hall 2006; Weiss i Wardrop 2010). Nastanak trombocita X. laevis

događa se na periferiji jetri (Slika 6.). Umjesto megakariocita postoji protromboblast, velika

jezgrena stanica nepravilnog oblika koja sazrijevanjem smanjuje obujam citoplazme i jezgre.

U idućem stadiju, stadiju tromboblasta, počinje kondenzacija kromatina. Sazrijevanjem u

nezreli trombocit jezgra je potpuno kondenzirana, trombocit ima vrlo malo citoplazme i

poprima ovalni oblik. Konačno, zreli trombocit ima sposobnost rasta i dijeljenja i često se

nalazi u nakupinama s drugim trombocitima (Hadji-Azimi i sur. 1987).

Najčešći poremećaji u broju trombocita sisavaca su trombocitopenija, smanjeni broj

trombocita, i trombocitoza, povećani broj trombocita. Neki poremećaji grušanja krvi (npr.

Von Willebrandova bolest) nastaju zbog abnormalnih trombocita (Weiss i Wardop 2010).

Slika 5. Ljudski trombocit (a), ptičji (b), trombocit gmazova - desni je aktiviran (c), vodozemca (d) i ribe-

skroz desni je aktiviran (e). Proporcije nisu nužno realne. Preutezo iz Claver i Quaglia (2009) i Reece

(2012).

UVOD

7

Slika 6. Trombopoeza X. laevis. Protromboblast (a), tromboblast (b), nezreli trombocit i zreli eritorcit (c) i

nakupina zrelih trombocita (d). Preuzeto iz Hadji-Azimi i sur. (1987).

1.1.3. Leukociti

Leukociti ili bijela krvna zrnca krvne su stanice sa jezgrom, što je potvrđeno kod svih

istraživanih kralježnjaka od riba sve do sisavaca. Glavni su u obrani organizma. Kod sisavaca

postoji pet tipova leukocita: neutrofili, eozinofili, bazofili, monociti i limfociti. Prema

morfološkim svojstvima dijele se na granulocite i agranulocite. Granulociti u svojoj

citoplazmi sadrže specifično obojena zrnca (granule), a prema boji zrnaca razlikuju se

neturofili, eozinofili i bazofili. Mogu imati segmentiranu ili nesegmentiranu jezgru.

Agranulociti nemaju citoplazmatska zrnca i dijele se na limfocite i monocite (Guyton i Hall

2006; Weiss i Wardrop 2010).

Prosječan broj ukupnih leukocita kod ljudi je oko 7000/ ml krvi. Najzastupljeniji su

neutrofili (62 %) i limfociti (30 %) dok monocita (2,3 %), eozinofila (2,3 %) i bazofila (0,4

%) ima najmanje (Guyton i Hall 2006). Kod X. laevis prosječn broj leukocita je 5000/ ml krvi

(Hadji-Azimi i sur. 1987). Limfociti i neutrofili su također najčešći (30 % i 27 %), dok su

eozinofili (1,2 %) i monociti (1,6 %) najrjeđi tipovi. Zanimljivo je kako bazofili čine oko 40

% ukupnih leukocita X. laevis (Hadji-Azimi i sur. 1987). Pojedini tipovi leukociti gmazova

teže se klasificiraju zbog jakih morfoloških varijacija među vrstama (Knotková i sur. 2002).

Prosječan život granulocita čovjeka nakon ispuštanja iz koštane srži u krv je 4-8 sati te 4

do 5 dana u ciljnom tkivu. Prilikom jakih infekcija granulociti žive još kraće. Monociti u krvi

mogu izdržati 10 do 20 sati, a čim uđu u tkivo narastu u makrofage koji mogu živjeti nekoliko

mjeseci (Guyton i Hall 2006). Kod sisavaca granulociti, monociti i manji dio limfocita

proizvode se i čuvaju u koštanoj srži dok se plazma stanice i većina limfocita proizvodi i čuva

u limfogenim tkivima- limfnim čvorovima, slezeni, timusu i mandulama. Po potrebi se

UVOD

8

leukociti ispuštaju u cirkulaciju i prenose u različite dijelove tijela omogućavajući trenutnu

reakciju na infekcije i upale (Guyton i Hall 2006).

Leukociti nastaju iz usmjerenih matičnih stanica (CFU-GM i limfoidne matične stanice)

koje tvore mijelocitne i limfocitne loze. Mijelocitna loza (Slika 7.) počinje mijeloblastom sa

karakterističnim primarnim, azurofilnim granulama. Neutrofili, eozinofili i bazofili sazrijevaju

slično, počevši iz promijelocita kojeg karateriziraju sekundarne bazofilne granule i smanjeni

broj primarnih. Daljnjim sazrijevanjem nastaje usmjereni mijelocit. To je ujedno i zadnja

stanica sposobna za diobu. Prije formiranja zrelih eozinofila i neutrofila, u prijelaznom obliku

zvanom metamijelocit dolazi do kondenzacije i segmentacije jezgre. Monociti nastaju

postepenom diferencijacijom iz CFU-GM stanica u monoblaste, promonocite i konačno

monocite (Venkat 2010; Weiss i Wardrop 2010). Većina granulopoeze X. laevis događa se u

slezeni, a manji dio u jetri. Stadiji i loze su gotovo identični kao u sisavaca (Hadji-Azimi i sur.

1987).

Limfopoeza X. laevis događa se u timusu, gdje se limfocitne populacije zovu timociti, i

u slezeni, gdje se limfocitne populacije zovu limfociti slezene. Limfoidna loza počinje

protimocitom (u timusu), odnosno limfoblastom (u slezeni) koji se postepeno diferencira u

timocite I, II, III i IV, odnosno limfocite I, II, III i IV. Prilikom toga dolazi do značajnog

smanjenja stanice od početnih 13 μm do 6 μm. Kod sisavaca iz limfoidne loze (Slika 8.)

nastaju različiti podtipovi limfocita: B i T stanice, plazma stanice i tzv. stanice ubojice, NK

stanice (engl. natural killer). B limfociti i plazma stanice X. laevis nastaju u slezeni, T

limfociti u timusu, a NK stanice u oba organa (Hadji-Azimi i sur. 1987). Kod ljudi T limfociti

također nastaju u timusu, ali B limfociti sazrijevaju u koštanoj srži. Plazma stanice nastaju iz

aktiviranih B limfocita (Guyton i Hall 2006; Weiss i Wardrop 2010).

Najčešći poremećaji broja leukocita su leukopenije, smanjeni broj leukocita, i

leukemije, povećani broj (Guyton i Hall 2006).

UVOD

9

Slika 7. Shematski prikaz nastanka leukocita iz mijelocitne loze kod ljudi. Preuzeto iz Guyton i Hall

(2006).

Slika 8. Pojednostavljeni shematski prikaz nastanka različitih limfocita. Preuzeto iz Venkat (2010).

Bazofili (Slika 9.) svih kralježnjaka okrugle su stanice sa centralno ili periferno

smještenom jezgrom (Claver i Quaglia 2009; Piršljin i Milinković Tur 2009; Shigdar i sur.

UVOD

10

2007). U citoplazmi se nalaze granule tamno plave do crne boje koje obično ne prekrivaju

jezgru. Sisavci, za razliku od vodozemaca, imaju segmentiranu jezgru bazofila (Piršljin i

Milinković Tur 2009). Kod sisavaca imaju promjer 10 do15 μm i najrjeđe su stanice (Lester i

sur. 2005). U X. laevis dosta su česti leukociti, a promjer im se kreće od 7 do 16 μm (Hadji-

Azimi i sur. 1987). U krvi kornjače također ih ima više nego kod sisavaca, nekada čine 50%

do 60% ukupnih leukocita (Claver i Quaglia 2009, Knotková i sur. 2002). Kod riba imaju

varijabilan izgled, ima ih jako malo i nisu prisutni u svim vrstama (Claver i Quaglia 2009).

Mogu imati segmentiranu jezgru (Shigdar i sur. 2007).

Bazofili ispuštaju u krv heparin, koji sprečava zgrušavanje, te sudjeluju u alergijskim

reakcijama prilikom kojih ispuštaju velike količine histamina, serotonina, anafilaktičkih tvari,

bradikinina i lizosomnih enzima (Guyton i Hall 2006). Žive oko 3 do 10 dana (Reece 2012).

Slika 9. Bazofil čovjeka (a), ptice (b), gmaza (c), vodozemca (d) i ribe (e). Proporcije nisu nužno realne.


Eozinofili (Slika 10.) kralježnjaka okruglog su oblika sa blijedo plavom citoplazmom

bogata granulama crvene boje i ljubičastom jezgrom. Sisavci obično imaju dva segmenta

jezgre (Lester i sur. 2005). Ljudski eozinofili imaju promjer od 10 do 15 μm (Piršljin i

Milinković Tur 2009). Citoplazmatske granule okrugle su kod ptica i gmazova, a kod

vodozemca i riba također mogu biti izdužene. Gmazovi i ribe jedini imaju samo okrugle,

nesegmentirane jezgre (Claver i Quaglia 2009). Promjer eozinofila kod X. laevis iznosi od 13

do 17 μm (Hadji-Azimi i sur. 1987).

Granule su vrste modificiranih lizosoma koji sadržavaju razne enzime (npr. hidrolitičke)

i larvacidne polipeptide (Guyton i Hall, 2006). Eozinofili su slabi fagociti koji sudjeluju u

upalnim procesima uzrokovanim parazitima i alergijama. Fagocitiraju i uništavaju parazite te

smanjuju upalne procese (Guyton i Hall 2006). Žive oko 3 mjeseca (Reece 2012).

UVOD

11

Slika 10. Eozinofil čovjeka (a), ptice (b), gmaza (c), vodozemca (d) i ribe (e). Proporcije nisu nužno realne.


Limfociti (Slika 11.) su jedni od najčešćih tipova leukocita kralježnjaka. Kod sisavaca

okruglog su oblika sa velikom okruglom jezgrom smještenom periferno. Citoplazma se vidi

kao mali svijetlo plavi prsten. Razlikuju se veliki, promjera 12-15 μm i mali, promjera 10 μm

(Weiss i Wardrop 2010). Limfociti ptica imaju gotovo isti izgled kao kod sisavaca, jedino što

mogu biti nepravilnog oblika. Gmazovi, vodozemci i ribe također imaju slični izgled limfocita

kao sisavci (Claver i Quaglia 2009). Mali limfociti X. laevis promjera su od 5 do 8 μm, a

veliki 10 do 11 μm (Hadji-Azimi i sur. 1987). U riba također spadaju u najčešću vrstu

leukocita (Shigdar i sur. 2007).

T i B limfociti, plazma i NK stanica teško se mogu morfološki razlikovati. NK stanice

dio su urođenog imunološkog odgovora i izgledaju kao veliki granulirani limfociti. T limfociti

(prezentiraju antigene), B limfociti i plazma stanice (proizvode antitijela) dio su stečenog

imunološkog odgovora (Guyton i Hall 2006; Weiss i Wardrop 2010). Ljudski B limfociti žive

4-5 tjedna. T limfociti mogu živjeti od jednog dana do više mjeseci ovisno o njihovoj

aktivnosti (Reece 2012).

Slika 11. Limfocit čovjeka (a), mali i veliki limfociti kod ptice (b), mali limfocit gmaza (c), mali limfocit

vodozemca (d) i limfocit ribe (e). Proporcije nisu nužno realne. Preuzeto iz Claver i Quaglia (2009) i Reece

(2012).

Monociti (Slika 12.) kralježnjaka najveće su krvne stanice, okruglog oblika. Imaju

ljubičastu nesegmentiranu ekscentrično smještenu jezgru, koja zna poprimiti nepravilni,

zaobljeni oblik. Citoplazma im je sivkasto plava, a kromatinska struktura im je rjeđa nego kod

limfocita (Claver i Quaglia 2009; Guyton i Hall 2006; Lester i sur. 2005). Kod ljudi promjer

UVOD

12

im varira od 16 do 22,5 μm (Piršljin i Milinković Tur 2009). Promjer kod X. laevis kreće se

od 11,5 do 15 μm (Hadji-Azimi i sur. 1987).

Za razliku od neutrofila monociti nemaju veliku sposobnost obrane od patogena te

moraju sazreti u makrofage što se događa u tkivima. Kod X. laevis diferencijacija se događa u

jetri (Hadji-Azimi i sur. 1987). Fagocitoza ovisi o više faktora, strukturi tvari, zaštitnim

proteinima (koji nedostaju mrtvim stanicama) i antitijelima (koja se vežu na membrane

patogena označavajući ih metom za fagocitozu). Makrofagi su sposobni fagocitirati stotinjak

bakterija tijekom svog života i probavljati velike čestice poput eritrocita što ih čini jačim od

neutrofila. Zanimljivo je kako i monociti i neutrofili imaju baktericidne agense u slučaju da

probavljanje lizosomima nije efikasno (Guyton i Hall 2006).

Slika 12. Monocit čovjeka (a), ptice (b), gmaza (c), vodozemca (d) i ribe (e). Proporcije nisu nužno realne.


Morfologija neutrofila slična je kod svih kralježnjaka (Slika 13.). Ljudski neutrofili, čiji

promjer stanice varira od 10 do 15 μm, imaju fino granuliranu citoplazmu. Jezgra može biti u

komadu ili segmentirana, što je češće kod zrelijih neutrofila gdje se broj segmenta jezgri kreće

od tri od pet, s tim da spojnica među segmentima mora biti manja od 1/3 najdebljeg dijela

(Piršljin i Milinković Tur 2009). Neki autori smatraju kako ptice, gmazovi i ribe nemaju

neutrofile, nego samo heterofile (Claver i Quaglia 2009). Promjer neutrofila X. laevis kreće se

od 11 do 19 μm. Zbog bazofilnih i acidofilnih citoplazmatskih granula poprimaju blijedo rozu

boju dok su im segmenti jezgre tamno ljubičasti. Jedni su od rijetkih leukocita koje nastaju u

koštanoj srži (Hadji-Azimi i sur. 1987).

Uloga neutrofila je napad i uništavanje invadirajućih organizama, poput bakterija i

virusa te uklanjanje nekrotičnog tkiva. Čim uđu u tkiva su sposobni fagocitirati 3 do 20

bakterija prije nego što se inaktiviraju i odumru (Guyton i Hall 2006).

UVOD

13

Slika 13. Neutrofil čovjeka (a) i vodozemca (b). Proporcije nisu nužno realne. Preutezo iz Claver i Quaglia

(2009) i Reece (2012).

Heterofili (Slika 14.) vrsta su leukocita prisutnih kod većine kralježnjaka. Sliče

eozinfilima s glavnom razlikom u obliku citoplazmatskih granula izuženog oblika (Claver i

Quaglia 2009; Knotková i sur. 2002). Kod ptica najčešća su vrsta leukocita. Citoplazma im je

bezbojna sa acidofilnim okruglastim granulama. Kod gmazova izgled heterofila varira ovisno

o vrsti, ali većina ima okruglu jezgru. Heterofili vodozemca imaju segmentiranu jezgru i

nekad ih je teško razlučiti od neutrofila i eozinofila. Kod riba imaju varijabilnu morfologiju

granula i jezgre (Claver i Quaglia 2009). U sisavaca su pronađeni kod zečeva i zamorčića gdje

im je promjer 10 do 15 μm (Lester i sur. 2005; Weiss i Wardrop 2010).

Heterofili imaju sličnu ulogu kao neutrofili sisavaca.

Slika 14. Heterofil ptice (a), gmaza (b), vodozemca (c) i ribe (d). Proporcije nisu nužno realne. Preutezo iz

Claver i Quaglia (2009) i Reece (2012).

Azurofili (Slika 15.) su pronađeni kod gmazova i vodozemaca. Morfološki sliče

monocitima, ali sadržavaju azurofilne granule. Neki autori smatraju da potječu iz iste linije

kao monociti (Knotková i sur. 2002) dok ih drugi smatraju vrstom neutrofila ili monocita

(Claver i Quaglia 2009).

Imaju fagocitoznu ulogu.

UVOD

14

Slika 15. Azurofil gmaza (a) i vodozemca (b) Proporcije nisu nužno realne. Preutezo iz Claver i Quaglia

(2009) i Reece (2012).

1.2. Citokemijske tehnike

Za karakterizaciju pojedinih tipova leukocita koriste se posebne boje kojima se

vizualiziraju određene stanične komponente poput lipida, ugljikohidrata i proteina.

Boje imaju dvije funkcionalne skupine, kromofor (nekad zvan i kromogen) za bojanje i

auksokrom za vezanje sa supstratom i pojačanje intenziteta boje. Auksokromi mogu biti

ionizirajuće skupine, mogu se vezati kovalentno sa supstratom ili raditi koordinirane veze.

Mogu biti lužnati zbog amino grupa ili kiseli zbog karboksilnih grupa i fenola (Kiernan

2008). Boju koju vidimo nastaje prolaskom bijelog svjetla koz objekt koji apsorbira određene

valne duljine, nakon čega iz objekta proizlazi boja komplementarna apsorbiranoj. Naime,

bijelo svjetlo nastaje miješanjem komplementarnih boja, a oduzimanjem (apsorbiranjem)

jedne boje (npr. žute), vidimo drugu (plavu). Smatra se kako boja organskih bojila nastaje na

temelju energetskih razlika između elektron donora i elektron akceptora. Obično kromofori

imaju azo, karbonilnu i nitro skupinu te su akceptori, a auksokromi, sa amino i hidroksi

grupom, donori elektrona (Christie 2001). Batokromtski pomak je promjena spektra molekule

prema dužim valnim duljnama, prema crvenom dijelu spektra. Neke grupe jače utječu na

pomak od drugih: aromati sa NH skupinom jače utječu nego NH2 skupina koja je jača od OH

skupine. Suprotna pojava, promjena prema kraćim apsorbiranim valnim duljinama, zove se

hipsokromatski pomak (Christie 2001).

Postoji više interakcija između boja i tkiva. Van der Waalsove sile javljaju se kod

aromatskih boja (azo boje), vodikove veze najviše su prisutne kod boja za vezivna tkiva, a

Coulombove interakcije javljaju se kod kiselih i lužnatih boja. Kovalentne interakcije postoje

kod enizmskih reakcija esteraza te metode Schiffove baze i perjodne kiseline (engl. periodic

acid Schiff, PAS), a hidrofobne veze kod nepolarnih boja (Bancroft i Gamble 2008).

Na selektivnost boja utječe nekoliko faktora: naboj, veličina i polarnost. Kationske

(lužnate boje) pozitivnog su naboja koje interagiraju sa anionskim (negativno nabijenim)

biopolimerima (npr. nukleinskim kiselinama i glikozaminoglikanima). Velike boje (poput

UVOD

15

alcian bluea) sporo difundiraju kroz tkiva i stanice te će lakše prodrijeti u rahle strukture,

naspram kompaktnog kromatina. Za bojanje nepolarnih, hidrofobnih, odnosno lipofilnih

struktura koriste se ne-ionske boje (Kumar i Kiernan 2010).

Postoje dva načina klasificiranja boja- prema namjeni ili prema kemijskoj strukturi.

Prema namjeni razlikujemo lužnate (kationske, pozitivno nabijene) boje koje uz pomoć tzv.

mordanta (pomoćna tvar, najčešće metalni ion, koja učvršćuje vezu molekule boje i tkiva te

pojačava intenzitet boje) vizualiziraju proteine, kisele (anionske, negativno nabijene) boje

koje sadržavaju sulfatne i karboksilne auksokrome, a služe bojanju citoplazmatske i

izvanstanične proteinske strukture te direktne boje, poput azo boja, koje ne trebaju mordant.

Prema kromoforima razlikujemo azo i dušične (engl. azotic) boje, ftalocijanine, karbonilne,

ksantenske, triarilmetane (trifenilmetane) i tiazinske boje te mnoge druge (Kiernan 2008).

1. Azo boje najčešće su korištene komercijalne boje čiji je kromofor azo -N=N-

skupina. Apsorbiraju pri nižim valnim duljima stoga ih ima najviše u žutim, crvenim i

narančastima bojama. Mogu biti hidrofilne poput indikatora metil oranža ili hidrofobne poput

Oil red Oa i različitih sudanskih bojila (Christie 2001).

Za nespecifično dokazivanje nekristaliziranih staničnih lipida koristi se lizokrom

sudansko crnilo B (engl. sudan black B, SBB) (Bayliss High 1981). Lizokromom se smatraju

boje topive u mastima (Stains Files 2012c). Zbog svoje kemijske strukture ne mogu ionizirati,

nego tvore hidrofobne veze otapajući se u mastima. Sudan black B (SBB, Slika 16.) spada u

diazo boje zbog dva azo kromofora (Christie 2001; Kumar i Kiernan 2010). Već se prije znalo

kako je ova tehnika osjetljiva na metode fiksacije te, ovisno o njima, može prikazivati samo

membranske fosfolipide ili lipidne kapljice (Baker 1956).

Slika 16. Sudan black B, azo boja zbog karakterističnih N=N veza. Preuzeto sa www.sigmaaldrich.com

Kompleksni glikokonjugati i polisaharidi mogu se dokazati tehnikama alcian blue i

periodic acid Schiff (PAS).

UVOD

16

2. Alcijansko modrilo (Alcian blue 8 GX, Ingrain Blue 1) se sastoji od kromofora

ftalocijanina (četiri izoindolska prstena spojenih dušikovim atomima) koordinirano vezanog

sa atomom bakra (Slika 17.) te četiri izotiouronska bočna lanca koji mu daju masivnost i

pozitivni naboj čineći ga lužnatom (kationskom) bojom (Christie 2001). Apsorbira svjetlost u

žuto-narančastom dijelu spektra, a reflektira valne duljine koje mi percipiramo kao zelene ili

plave. Topiv je u vodi i polarnim otapalima. Specifično boji heteropolisaharide poput

glikozaminoglikana u hrskavicama, mukopolisaharida na stanicama i sijaliniziranog

glikokaliksa intenzivnom plavom bojom. Glikozaminoglikani (GAG) sastoje su od

ponavljajućih disaharida od kojih je jedan N-acetilglukozamin (GlcNAc) ili N-

acetilgalaktozamin (GalNAc), a drugi uronska kiselina ili iduronska kiselina (Slika 18.) koja

polimeru može dati negativan naboj. Mucini spadaju u glikoproteine (vrsta glikokonjuganta),

oligosaharide kovalentno vezane za proteinsku srž. Mogu se izlučivati ili ostati na membrani

kao dio glikokaliksa. Sadržavaju veliki broj O-vezanih oligosaharidnih lanca povezanih za

protein glikozidnom vezom preko njegove -OH skupine serina ili treonina (Nelson i Cox

2008). Ovisno o sastavu oligosaharida mogu biti neutralni do blago kiseli. Neutralni mucini,

obično prisutni na površinskim i probavnim epitelnim stanicama, imaju visok udio neutralnih

šećera poput manoze i galaktoze. Blago kiseli mucini sadržavaju sijalinske kiseline koje su

monosaharidi od 9 C atoma sa karboksilnom grupom na prvom C atomu. Naziv "sijalinska

kiselina" obično se odnosi na N-acetilneuraminsku kiselinu (Bancroft i Gamble 2008).

Ovisno o pH alcijansko modrilo (AB) radi ionske veze se različitim grupama šećera. U

kiselinama dolazi do ionizacije amino grupa boje. Tkiva sadržavaju anione poput fosfata

nukleinskih kiselina, sulfata ugljikohidrata te karboksilata ugljikohidrata i proteina. Procesom

ionske zamjene pozitivno nabijeni alcian blue (AB) istiskuje male katione (poput H+) iz tkiva

(Kiernan 2008). U rasponima od pH 0,2 do pH 1 AB boji sulfatne polisharide. Pri pH 2,5 do 3

osim njih boji i fosfate DNA i RNA. Od pH 4 do 5 boji sve nabrojano te karboksilne grupe

ugljikohidrata (prisutne na sijalinskim i uronskim kiselinama) i kiselijih proteina. Iznad pH 5

može bojati neutralne proteine, ali pri pH 5,6 postaje nestabilan te se često dodaje magnezijev

klorid kao stabilizator (Green i Pastewka 1974; Kiernan 2008). Iako alcian blue pri

optimalnim uvjetima (pH, prisutnim ionima soli, temperaturi i vremenu reakcije) preferentno

boji glikozaminoglikane, nekad zna bojati nukleinske kiseline. Smatra se da je to zbog

interakcija negativnog naboja fosfatne okosnice i pozitivih bočnih lanaca alciana blue. Zbog

veličine molekule AB teško prodire do jezgrinog kompaktnog kromatina, ali proces je znatno

lakši ukoliko je DNA denaturirana (Kumar i Kiernan 2010).

UVOD

17

Često se kombinira sa metodom Schiffove baze i perjodne kiseline (PAS) upravo zato

što nema odbojavanja (engl. destaining) te ne mijenja boju ovisno o svojoj koncentraciji ili

dodatku drugih supstrata, što je svojstvo ortokromatskih boja (Bancroft i Gamble 2008).

Slika 17. Alcian blue 8GX kationska (lužnata) boja. Kloridni ioni prikazani kao protuioni. Na

ftalocijaninskoj jegri vide se četiri bočna lanca (R). Preuzeto sa www.sigmaaldrich.com

Slika 18. Lijevo N-acetilglukozamin (GlcNAc; GalNAc ima obrnuti položaj OH i H skupine na C-4

atomu), desno iduronska kiselina. Preuzeto iz Nelson i Cox (2008).

3. U skupinu trifenilmetana (triarilmetana) spadaju bazični fuksin (engl. fuchsin basic),

pararozanilin i metil violet (Keusch 2012). Karakteriziraju ih tri fenilna (arilna) prstena

vezana za centralni C atom. Pararozanilin i bazični fuksin imaju amino skupne vezane na

arilnim prstenima (Horobin i Kiernan 2002).

Bazični fuksin (pararozanilin hidroklorid) obično se prodaje kao mješavina rozanilina,

pararozanilina, novog fuksina i Magenta II u omjerima specifičnim o proizvođaču. Za

korištenje u Schiffovom reagensu mora imati visoki udio pararozanilina (Santa Cruz

Biotechnology 2012). Schiffov reagens, koji služi za dokazivanje aldehida, često se koristi u

kombinaciji sa perjodnom kiselinom u tzv. periodic acid Schiff (PAS) metodi. Prvenstveno

služi za dokazivanje glikogena, ali se pomoću nje može prikazati škrob, mucini, bazilarne

membrane i amiloidna tjelešaca. Glikogen je homopolisaharid sastavljen od glukoza

UVOD

18

povezanih (α1→4) glikozidnim vezama koji se prosječno grana na svakih 8 do 12 podjedinica

pomoću (α1→6) veza (Nelson i Cox 2008). Temelj ove metode je oksidacija hidroksilnih

grupa polisaharida pomoću perjodne kiseline (HIO4) u aldehidne grupe koje reagiraju sa

Schiffovim reagensom (Slika 19.). Bazični fuksin, koji stvara kovalentne veze između

reagensa i polisaharida, zaslužan je za crveno obojenje (Kumar i Kiernan 2010). U

Schiffovom reagensu nalaze se sulfitni (HSO3-) ioni koji vezanjem za centralni C atom

bazičnog fuksina njega čine bezbojnim. Vezanjem fuksin sulfita za aldehid nastaje niz

struktura od kojih je zadnja fuksinski kation (Slika 20.) zaslužan za crveno obojenje (Keusch

2012).

Slika 19. Oksidacija glukoze perjodnom kiselnom (HIO4) radi dvije aldehidne skupe i cijepa veze između

C2 i C3 atoma. Preuzeto iz Bancroft i Gamble (2008).

Slika 20. Bazični fuksin, odnosno rozanilin (lijevo) dodatkom sulfita prelazi u bezbojni sulfitni oblik

(sredina) koji vezanjem za aldehid u konačnici daje crveno-ljubičasti kation. Preuzeto iz Keutsch (2012).

Pararozanilin se može zasebno koristiti u Schiffovom reagensu. Radi na istom principu

opisanom kod bazičnog fuksina (Slika 21.; Kumar i Kiernan 2010).

UVOD

19

Slika 21. Pararozanilin (lijevo) dodatkom sumporaste kiseline (H2SO3) prelazi u Schiffov reagent (desno).

Preuzeto iz Kumar i Kiernan (2010).

Metil ili kristal violet (Slika 22.) osim što se često koristi kod bojanja Gram pozitivnih

bakterija, služi za prikazivanje DNA.

Slika 22. Metil violet. Preuzeto sa www.sigmaaldrich.com

Jedna od najčešće korištenih nespecifičnih boja u citologiji je May-Grünwald Giemsa

(MGG). Nastaje kombiniranjem otopina May-Grünwald i Giemse. May-Grünwald sastoji se

od ksantenske boje eozina Y i tiazinske boje metilenskog modrila (Reagena 2003). Giemsa je

mješavina azura B, metilenskog modrila i eozina Y. Ako se radi u lužnatijim uvjetima uzorci

će biti više plavi nego u kiselim uvjetima gdje će biti više crveniji (Kumar i Kiernan 2010;

Reagena 2003).

Kod gmazova i vodozemca za brojanje krvnih stanica često se koristi Natt-Herrickova

otopina. U njoj se nalaze tiazinska boja toluidinsko modrilo i spomenuti metil violet (Lisičić

2005; Vetlab 2013).

UVOD

20

4. Ksantenske boje većinom su flourescentne, a ovisno o naboju mogu biti kationske ili

anionske (Bancroft i Gamble 2008). Eozin Y (eozin G, tetrabromoflourescin; Slika 23.)

anionska je boja koja služi za vizualizaciju DNA dajući joj crveno obojenje. Ukoliko se

kombinira sa kationskim azurom B (vezanim na DNA), doći će do promjene boje DNA iz

plave u ljubičastu. Eozin Y također se veže sa proteinima bogatim lizinima i argininima,

poput hemoglobina u eritrocitima te eozinofilnih granula leukocita (Kumar i Kiernan 2010).

Slika 23. Eozin Y. Preuzeto iz Kumar i Kiernan (2010).

5. Tiazinske boje sadrže šesteročlani prsten sastavljen od 4 atoma ugljika, atoma

sumpora i atoma dušika. Ove većinom kationske boje daju plava i ljubičasta obojenja i topive

su u vodi (Kiernan 2008). Metakromatske su što znači da apsorbiraju svjetlost pri različitim

valnim duljama ovisno o njihovoj koncentraciji i okolini (Bancroft i Gamble 2008).

Metilensko modrilo (engl. methylene blue, Slika 24.a) kationska je boja koja se

specifično veže na DNA. Privuku je fosfatni anioni okosnice, a stabilizira se Van der

Waalsovim silama za regije bogate adeninom i timinom. Ukoliko dođe do oksidacije i

demetilacije metilensko modrilo prelazi u azur B (Kiernan 2008; Kumar i Kiernan 2010)

Azur B (Slika 24.b) također boji DNA isto kao metilensko modrilo. Opaženo je kako

formira dimere i radi hidrofobne interakcije sa purinima i pirimidinima (Kumar i Kiernan

2010).

Toluidinsko modrilo (engl. toluidine blue, Slika 24.c) također je kationska boja koja

boji na istom principu kao alcian blue. Služi za prikazivanje GAGa, s kojima radi ionske

interakcije, ili nukleinskih kiselina, s kojima je povezana Van der Waalsovim silama (Kiernan

2008; Kumar i Kiernan 2010).

UVOD

21

Slika 24. Metilensko modrilo (a) oksidacijom gubi metilnu skupinu i prelazi u azur B (b). Toluidinsko

modrilo (c). Preuzeto iz Kumar i Kiernan (2010).

Kod enzimskih bojanja utvrđuje se aktivnost određenih enzima leukocita poput alkalne

fosfataze i nespecifičnih esteraza. Princip je sljedeći: enzim hidrolizira dodani supstrat koji se

zatim veže sa bojom s kojom tvori obojani talog na mjestu aktivnosti enzima. Enzimske

aktivnosti nisu iste kod svih leukocita, a ponekad su prisutne i u trombocitima.

a) Alfa-naftil butirat esteraza (ANBE) nespecifičan je enzim koji hidrolizira alfa-naftil

butirat (Slika 25.a) u alfa-naftol. Nastali produkt vezan sa pararozanilonom (obogaćenim

nitratnim skupinama) daje crveno obojeni talog (Strober 2001). Aktivnost ovog enzima

pokazuju monociti.

b) Pomoću aktivnost alfa-naftil acetat esterazi (ANAE) mogu se razlikovati stanice

monocitnog i neutrofilnog porijekla. Esteraze hidroliziraju estersku vezi sintetskog supstrata

α-naftil acetata pritom tvoreći α-naftol (Slika 25.b i c) koji se kovalentno veže sa fast blue RR

soli čime radi netopivi tamno plavo obojani talog (Chronolab 2012c; Kiernan 2008).

Slika 25. Esteraze cijepaju α-naftil butirat (a) i α-naftil acetat (b) na α-naftol (c). Obrađeno sa

www.sigmaaldrich.com.

UVOD

22

c) Supstrat alkalne fosfataze (ALP) je naftol AS-BI fosfat (Slika 26.) koji se hidrolizira

na fosfat i aril naftolamid. Slično ANAEu, aril naftolamid tvori kovalentne veze sa fast red ili

fast blue soli čime nastaje crveno, odnosno plavo obojani talog. Aktivnost ALP pronađena je

u ljudskim neutrofilima (Chronolab 2012b; Lowe 1998b).

Slika 26. Naftol AS-BI fosfat. Preuzeto sa www.sigmaaldrich.com

6. Dušične boje stabilizirane su diazo i tetraazo soli, obično pripremljenje kao dvostruke

soli cinkovog klorida. Diazo soli (ArN2+) nastaju dodavanjem dušićaste kiseline (HNO2) na

aromatske amine (ArNH2). Izrazito su nestabilne strukture koje za stabiliziaciju trebaju velike

ione suprotnog naboja poput metalnih soli tetraflouroborata, BF4- i tetraklorozinkata, ZnCl4

2-

(Christie 2001).

Fast blue RR salt (Slika 27.) i fast red TR salt spadaju u diazo soli koje se koriste za

prikazivanje aktivnosti hidrolitičkih enzima. Sa enzimskim supstratom rade kovalentne veze

tvoreći netopivi obojani talog (Chronolab 2012b).

Slika 27. Fast blue RR sol. Preuzeto sa www.sigmaaldrich.com.

Uz navedene tehnike često se koriste kontrastne boje za vizualizaciju jezgri. Obično se

uz sudan black B, alkalnu fosfatazu i alcian blue (koji boje crno i plavo) koristi boja nuclear

UVOD

23

fast red (za crveno obojenje), a uz periodic acid Schiff metodu i reakciju alfa-naftil butirat

esteraze (koje boje crveno) hematoksilin (za plavo obojenje jezgri).

7. Karbonilne boje, također često korištene u komercijalne svrhe, dobile su ime po

karbonilnoj C=O grupi. Obično imaju dvije ili više karbonilnih skupina povezanih

aromatskim prstenima.

Najpoznatija grupa karbonilnih boja su antrakvinoni u koje spada nuclear fast red

(NFR). Njihova se struktura sastoji od tri spojena šesteročlana prstena, dva aromatska na

rubovima i kvinona u sredini. Kvinon je struktua od dvije ketonske grupe na sešteročlanom

prstenu sa dvije dvostruke veze (Slika 28.a i b). NFR (Slika 28.d) koristi se za vizualizaciju

jezgre dajući joj crveno obojenje (Christie 2001). Anionska je boja kojoj je potreban mordant,

obično aluminijeva sol. Smatra se kako u interakciji nukleinskih kiselina sa kompleksom

aluminij-NFR sudjeluju ionske i ne-ionske veze (Kiernan 2008). Auksokromi su amino i

hidroksi grupe koje služe kao elektron donori i omogućuju batokromatski pomak, dok je

karbonilna grupa elektron akceptor. Radi se o brzom reverzibilnom redoks sustavu (Slika 29.)

gdje se benzokvinon reducira u hidrokvinon uz prijenos dva vodika (Christie 2001).

Slika 28. Kvinoni, orto- (a) i para-benzokvinon (b). Osnovna struktura antrakvinona (c). Nuclear fast red,

kvinonski dio nalazi se u sredini. Preuzeto iz Christie (2001) i sa www.sigmaaldrich.com.

Slika 29. Kvinon- hidrokvinon redoks sustav, karbonilna grupa kao elektron akceptor. Hidrokvinon skroz

desno. Preuzeto iz Christie (2001).

UVOD

24

8. Hematoksilin monohidrat (Natural Black 1) spada u prirodne boje. Ekstrakt je

grmovitog stabla Haematoxylum campechianum (Bancroft i Gamble 2008; Stains File 2012b).

Sam za sebe nije boja već se mora oksidirati u boju hematein (Slika 30.). Prirodna oksidacija

je dugotrajna i događa se na svjetlu i zraku. Kemijska oksidacija, koja je trenutna i relativno

kratkotrajna, koristi natrijev jodat, NaIO3 (kod Mayerovog, Gillovog i Carazzijevog

hematoksilina) ili živin oksid (Harrisov hematoksilin). Hematein je anionska boja sa slabim

afinitetom za tkiva stoga treba kationski mordant. Najbolje su aluminijeve (Gillov, Mayerov i

Carazzijev hematoksilin), željezove i volframove soli koje kompleksu daju neto pozitivan

naboj (Bancroft i Gamble 2008; IHC World 2011a i 2011b; Stains File 2012a). Ovisno o

mordantu boja se veže za različita tkiva i utječe na krajnje obojenje. Za vezanje na kromatin,

preciznije na nukleoproteinski lizin, koriste se aluminijeve soli. Smatra se kako u toj

interakciji sudjeluju ionske i ne-ionske veze (Kiernan 2008). Pri kiselim pH kompleks

hemateina i aluminija jezgri daje crveno obojenje, ali ispiranjem u slaboj bazičnoj otopini

prelazi u tamno plavu boju. Vodovodna voda je dovoljna, ali nekad treba litijev karbonat za

taj proces zvan "plavljenje" (eng bluing, Bancroft i Gamble 2008; Kiernan 2008) .

Slika 30. Hematoksilin lijevo, hematin desno. Zaokruženo je mjesto oksidacije. Preuzeto sa

www.sigmaaldrich.com

Većini navedenih metoda prethodi fiksacija. Fiksacija prvenstveno služi za očuvanje

izgleda i sastava tkiva, što se postiže narušavanjem aktivnost staničnih enzima (poglavito

autolitičkih), uklanjanjem vode i zamjenom topivih dijelova stanice netopivima te stvaranjem

kovalentnih veza (engl. cross-linking). Fiksirane stanice također su otporne na vanjske faktore

poput patogena i atmosferiliija. Najčešći fiksativi su formaldehid i alkoholi.

Otopljeni formaldehid zove se formalin i stvara različite interakcije sa

makromolekulama. To mogu biti kovalentne veze sa bočnim lancima proteina, modifikacije

nukleotida, stabilizacije nukleoproteinskih veza te vezanje sa nezasićenim lipidima. Međutim,

ne reagira sa ugljikohidratima (Bancroft i Gamble 2008).

http://en.wikipedia.org/wiki/Haematoxylum_campechianum

UVOD

25

Alkoholi dehidriraju stanice (uklanjaju vodu iz nje), čime narušavaju hidrofobne i

vodikove veze što uzrokuje promjene strukture proteina koji zatim koaguliraju. Time se

učvrste strukturni proteini (netopivi citoskeletni i lipoproteinski), ali se naruši citoplazmatska

struktura gdje proteini međusobno formiraju nakupine (Bancroft i Gamble 2008).

1.3. Citokemijske karakteristike krvnih stanica u kralježnjaka

Diferencijalna citokemijska analiza krvnih stanica otkriva specifične biokemijske

karakteristike pojedinih tipova stanica, posebice među leukocitima. Ovom se analizom mogu

otkriti pojedini podtipovi neutrofila, bazofila, eozinofila i limfocita ovisno o starosti ili stadiju

aktivacije te diferencijalnu pripadnost ovisno o vrsti životinje

U nastavku teksta navedeni su rezultati bojanja alcijanskim modrilom (AB), metodom

Schiffove baze i perjodne kiseline (PAS), sudanskim crnilom B (SBB), alkalnom fosfatazom

(ALP), nespecifičnim esterazama alfa-naftil acetat esterazom (ANAE) i alfa-naftil butirat

esterazom (ANBE) kod krvnih stanica različitih skupina kralježnjaka.

Eritrociti svih kralježnjaka u načelu ne daju pozitivne rezultate na opisane tehnike.

Trombociti kralježnjaka se uglavnom ne boje specifično citokemijskim metodama. Kod

sisavaca zajedno sa megakariocitima pokazuju jaku aktivnost nespecifičnih esteraza (ANAE)

(Chronolab 2012c). Kod X. laevis bojaju se PASom i pokazuju aktivnost nespecifičnih

esteraza (Hadji-Azimi i sur.1987).

Bazofili sisavaca boje se ABom. Ponekad pokazuju aktivnost ALPa. Negativni su na

SBB (Weiss i Wardrop 2010). Kod X. laevis citoplazmatske granule bazofila boje se crveno

metodom PAS (Hadji-Azimi i sur. 1987).

Eozinofili sisavaca pokazuju jaku aktivnost alfa-naftil acetat esteraza (ANAE), alfa-

naftil butirat esteraza (ANBE), alkalne fosfataze (ALP) i bojaju se SBBom (iznimka su

mačke; Weiss i Wardrop 2010).

Limfociti sisavaca rijetko pokazuju reaktivnost na citokemijske metode, npr. na

aktivnost ANAE (Sigma-Aldrich 2006). Aktivnost ALP zabilježena je u B stanicama. NK

stanice pokazuju slabu, fokalnu aktivnost nespecifičnih esteraza i boje se metodom PAS

(Weiss i Wardrop 2010).

Monociti sisavaca pokazuju aktivnost na nespecifične esteraze (ANBE i ANAE) koja se

pojačava sa njihovim sazrijevanjem u makrofage. SBB bojanje daje slabe rezultate (Weiss i

Wardrop 2010). Monociti X. laevis također su pozitivni na aktivnost nespecifičnih esteraza

(Hadji-Azimi i sur. 1987).

Neutrofili sisavaca pokazuju pozitivne rezultate na SBB, ALP i ANBE (Weiss i

Wardrop 2010). Kod X. laevis boje se PAS tehnikom (Hadji-Azimi i sur. 1987).

CILJ ISTRAŽIVANJA

26

2. CILJ ISTRAŽIVANJA

Ustanoviti ukupni broj eritrocita i leukocita, udjele pojedinih tipova leukocita te

vrijednost hematokrita zelene žabe Pelophylax ridibundus.

Utvrditi morfološke karakteristike (izgled i dimenzije) eritrocita, trombocita i različitih

tipova leukocita iz krvnih razmaza.

Diferencijalnim citokemijskim tehnikama utvrditi boje li se pojedini leukociti u

istraživane vrste jednako specifično kao i u ostalih kralježnjaka te postoje li razlike u

biokemijskim osobinama pojedinih stanica. Također, cilj je utvrditi mogu li se temeljem

diferencijalnih bojenja razlikovati pojedini podtipovi leukocita.

Utvrditi referentne podatke o karakteristikama krvnih stanica s obzirom da se rod

Pelophylax koristi u fiziološkim i genetičkim istraživanjima.

MATERIJALI I METODE

27

3. MATERIJALI I METODE

3.1. Uzorci

U ovom radu analizirani su krvni razmazi svježe krvi odraslih zelenih žaba (Pelophylax

ridibundus), oba spola, težine u rasponu od 55 do 80 g. Sve su žabe dekapitirane i špricama

(promjera 0,17mm) im je izvađena krv iz srca. Kroz šprice bio je provučen heparin kako bi se

spriječilo grušanje. Za bojanje May-Grünwald Giemsom (MGG) i citokemijske analize

odmah su napravljeni krvni razmazi, tri do šest stakalca po žabi. Ostavljeni su preko noći da

se osuše. Za određivanje ukupnog broja krvnih stanica krv se odmah razrijedila Natt-

Herrickovom otopinom.

Uzorci sedam žaba žrtvovanih u listopadu 2009. godine koristili su se za kompletnu

krvnu sliku, odnosno bojanje May-Grünwald Giemsom i određivanje ukupnog broja

leukocita. Za citokemijsko bojanje koristili su se uzorci šest žaba žrtvovanih u listopadu 2012.

godine. Svaka se citokemijska tehnika radila minimalno u triplikatu.

3.2. Određivanje ukupnog broja eritrocita i leukocita

Za pripremu Natt- Herrickove (N-H) otopine u 1 l destilirane vode potrebno je otopiti:

3,88 g natrijevog klorida, NaCl (Herbos, Hrvatska)

2,50 g natrijevog sulfata, Na2SO4 (Herbos, Hrvatska)

2,91 g natrijeva-hidrogen fosfat dodekahidrata, Na2HPO4 x 12 H2O (Kemika, Hrvatska)

0,25 g kalijevog dihidrogen fosfata, KH2PO4 (Kemika, Hrvatska)

7,50 ml formalina 37 %-tni (Alkaloid, Makedonija)

0,10 g metil violeta (Herbos, Hrvatska)

0,10 ml toluidinskog modrila, 1% (Herbos, Hrvatska)

Za određivanje ukupnog broja eritrocita nekoagulirana krv razrijedila se N-H otopinom

u omjeru 1:200 u eritrocitnim melanžerim i miješala na rotacijskoj miješalici (Ika) minimalno

15 minuta. Nakon toga kap iz melanžera se kapnula ispod pokrovnice u hemocitometar

(Bürker-Türk komoricu) i nakon 3 minute stajanja započelo se brojanje u 16 polja pod

svjetlosnim mikroskopom (400 x povećanje). Iz dobivenog broja izračunao se broj eritrocita

po ml krvi prema formuli: E = N x 800000 x 103

E = broj eritrocita / ml krvi

N = srednji broj eritrocita po kvadratiću

MATERIJALI I METODE

28

Za brojanje leukocita u leukocitni melanžer se navukla svježa krv do oznake 0,5 i N-H

otopina do oznake 11. Time je krv razrijeđena 20 puta. Na rotacijskoj miješalici uzorak se 3

minute miješao. Jedna kap krvi dodana je na hemocitometar sa 16 polja gdje su se pod

povećanjem 400x brojali leukociti. Broj ukupnih leukocita po ml krvi računao se prema

formuli: L = N x 5000 x 103

L = broj leukocita / ml krvi

N = srednji broj leukocita po kvadratiću

3.3. Određivanje vrijednosti hematokrita

Svježa krv navukla se u heparinizirane kapilare zataljene na jednom kraju, tri kapilare

po svakoj životinji. Centrifugirale su se 5 minuta na 5000 okretaja / min. Nakon toga se na

odgovarajućoj skali očitala vrijednost hematokrita. Prosječna vrijednost hematokrita

izračunala se iz prosjeka grupe koji je izračunat iz prosjeka životinja.

3.4. Bojanja May-Grünwald Giemsom (MGG)

Dobro osušeni krvni razmazi držali su se u May-Grünwald (J.T. Baker, Nizozemska)

otopini 7 minuta, nakon čega su isprani destiliranom vodom (dH2O) i držani u otopini Giemse

12 minuta. Otopina Giemse je napravljena od dva dijela vode i jednog dijela Giemse (J.T.

Baker, Nizozemska). Slijedilo je ispiranje destiliranom vodom i sušenje preko noći.

Takvi su preparati spremni za mikroskopiranje.

3.4.1. Morfološke karakteristike krvnih stanica

Mikroskopirali su se razmazi tretirani MGGom. Slike su dobivene pomoću

Olympusovog mikroskopa BX51 sa Olympusovom kamerom DP70 te pripadajućeg programa

DP Controller. Korištena povećanja bila su 40x bez imerzije te 60x i 100x sa imerzijom.

3.4.2. Računalna obrada podataka

Za izračunavanje udjela pojedinih leukocita iz MGG razmaza ručno su se brojali

bazofili, eozinofili, limfociti, monociti i neutrofili na 100 stanica.

Digitalna mjerenja uslikanih stanica napravljena su pomoću Carl Zeissovog programa

Axio Vision verzija 4.8.2. Statistička obrada podataka učinjena je u Microsoft Excel 2007

programu.

3.5. Citokemijske analize

Radile su se na osušenim krvnim razmazima, jedna tehnika po razmazu (iznimno

kombinacija alciana blue i periodic acid Schiffa). Razmazi su se nakapavali citokemijskim

bojama umjesto uranjanja u posude za bojanje histoloških preparata (engl. coplin jar). Za

MATERIJALI I METODE

29

svako stakalce bilo je potrebno oko 2,5 ml citokemijske boje. Otopine određenog pH

pripremale su se pomoću magnetske miješalici (Yellow line) i pH metra (Schott Instrument).

3.5.1. Alcijansko modrilo (AB)

Prema protokolu (Lowe 1998a) napravljene su otopine alcijanskog modrila (AB) sa

različitim pH.

1. Za pripremu otopine AB pH 3,1 u tikvicu (25ml) trebalo je:

250 mg alciana blue (AppliChem, Njemačka),

0,125 ml 0,5 % ledene octene kiseline (Kemika, Hrvatska)

dH2O.

AB se otopio u octenoj kiselini i dolila se dH2O do 25 ml.

2. Za pripremu ABa pH 2,5 u tikvicu (25ml) trebalo je:

250 mg ABa

0,75 ml ledene octene kiseline

dH2O

AB se otopio u octenoj kiselini i dolila se dH2O do 25 ml.

3. Za pripremu ABa pH 1 trebalo je:

25 ml klorovodične kiseline, HCl (Riedel- de Haën, Njemačka)

250 mg ABa

AB se otopio u HClu.

4. Za pripremu AB pH 0,2 u tikvicu (25ml) se doda

250 mg ABa

2,5 ml 10 %-tne sumporne kiseline, H2SO4 (Carlos Erba Reagents, Italija)

AB se otopio u H2SO4 i dolila se dH2O do 25 ml. Sve pripremljene otopine drže se

dobro zatvorene na 4°C.

Za vizualizaciju jezgri korištena je 0,1 %-tna otopina nuclear fast reda (NFR) prema

IHC World protokolu (2011c), ali bez dodatka timola (konzervans). Za prekrivanje 10

stakalca pripremljeno je 25 ml NFRa iz:

25 ml dH2O

25 mg nuclear fast red (AppliChem, Njemačka)

2,5 g aluminijevog-sulfat oktadekahidrata, Al2(SO4)3 x 18 H2O (Gram-Mol, Hrvatska)

NFR i aluminijev-sulfat otopili su se u vodi. Dobivena otopina kuhala se 5 minuta i ohlađena

filtrirala. Otopina NFRa čuvala se na 4°C.

MATERIJALI I METODE

30

Na suhe razmaze nakapala se destilirana voda i držala dvije minute. Nakon što se voda

istresla, uzorci su se nakapali različitim pH vrijednostima alciana blue (1, 2, 3 i 4). Uzorci su

se inkubirali 3, 4 i 5 minuta za sve pH vrijednosti. Slijedilo je ispiranje destiliranom vodom i

sušenje preko noći. Na suhe, obojane razmaze nakapala se otopina NFRa i nakon tri minute

isprala destiliranom vodom. Preparate se ostavilo sušiti preko noći.

3.5.2. Alfa-naftil acetat esteraza (ANAE)

Korišten je prilagođeni protokol (Sigma Aldrich, 2006) gdje se umjesto fast blue RR

salt kapsula (nedefinirane mase) koristio fast blue RR salt prah (Santa Cruz Biotechnology,

Amerika).

Fiskativ citrat-aceton-metanol se uvijek svježe pripremao od:

3,6 ml razrijeđene citratne otopine od tri-natrij-citrat-2-hidrata (Kemika, Hrvatska)

5,4 ml acetona (T.T.T., Hrvatska)

1 ml metanola (T.T.T., Hrvatska)

Za razrijeđenu citratnu otopinu napravila se prezasićena otopina natrijevog citrata

dodavanjem tri-natrij-citrat-2-hidrata u 10 ml dH2O sve dok se mogao otopiti. Otopina se

filtrirala, izmjeren joj je obujam i ulivena je 9 puta veća količina dH2O kako bi se dobila

razrijeđena otopina natrijevog citrata sa pH 4,5. Čuvao se na sobnoj temperaturi dobro

zatvoreno.

Prije pokusa trebalo je napraviti 50 ml razrijeđenog Trizma pufer. Prezasićena otopina

dobivena je otapanjem otprilike 1 žlice Trizma Base-a (Sigma, Njemačka) u 5 ml dH2O sve

dok se nije moglo više otopiti. Otopina je profiltrirana u tikvicu (50ml), pH je namješten na

7,6 i dodano je dH2O do 50 ml. Čuva se na sobnoj temperaturi dobro zatvoreno.

Uzorci su se fiksirali pripremljenim fiksativom minutu, isprali destiliranom vodom i

sušili 20-30 minuta. U međuvremenu se pripremila svježa otopina α-naftil acetata (ANA):

2 mg ANA (AppliChem, Njemačka)

200 μl etilen glikol monometil etera (EGME, Mreck, Njemačka).

ANA se otopio u EGMEu i morao odmah iskoristiti.

Za dva uzorka otopljeno je 5 mg fast blue RR soli u 5 ml Trizma pufera. Unutra se ulilo 200

μl otopljenog ANAa, promiješalo i odmah nakapalo na osušene fiksirane uzorke. Uzorci su se

zaštitili od svjetla i inkubirali 30 minuta. Nakon toga su se isprali destiliranom vodom i

ostavili sušiti preko noći. Nije bilo kontrasnog obojenja.

MATERIJALI I METODE

31

3.5.3. Alfa-naftil butirat esteraza (ANBE)

Za pripremu 25 ml puferiziranog formalin-aceton fiksativa pH 6,6 prema Stroberovom

protokolu (2001) trebalo je:

9,375 ml dH2O

6,25 mg bezvodnog natrijevog-hidrogen fosfata, Na2HPO4 (Kemika, Hrvatska)

31,25 mg kalijevog dihidrogen fosfata, KH2PO4

14,06 ml acetona

7,81 ml formalina

U vodi se otopio natrijev hidrogen fosfat i kalijev dihidrogen fosfat. Na kraju se

umiješao aceton i formalin te je pH namješten na 6,6. Fiksativ se čuvao dobro zatvoren na

4°C. Ova je količina bila dostatna za 10 uzoraka.

Prema Stroberu (2001) unaprijed je pripremljeno 100 ml fosfatnog pufera pri pH 6,3 (I),

2,5 ml pararozanilin-HCla (II) i 2,5 ml 4%-tne otopine natrijevog nitrata (III).

(I) Za pripremu 100 ml fosfatnog pufera pH 6,3 trebalo je:

100 ml dH2O

236,75 mg Na2HPO4

1,53 g KH2PO4

Obje soli su se otopile u vodi i pH im je namješten na 6,3.

(II) Za pripemu 2,5 ml pararozanilina-HCl potrebno je:

2 ml dH2O

0,5 ml koncentrirane HCl

0,1 g pararozanilin basea (Sigma, Njemačka)

HCl se umiješala u vodu nakon čega se dodao i otopio pararozanilin.

(III) Za 4 %-tnu otopine natrijevog nitrata(NaNO2) trebalo je:

2,5 ml dH2O

100 mg NaNO2 (Gram-Mol, Hrvatska)

NaNO2 se otopio u vodi.

Uzorci su bili fiksirani ohlađenim fiskativom 30 sekundi. Bez ispiranja vodom

ostavljeni su sušiti se 20ak minuta. Za pripremu inkubacijske otopine trebalo je svježe

umiješati:

a) 25 μl pararozanilina obogaćenog nitratnim skupinama (engl. hexazotied

pararosanilin) dobivenog miješanjem:

MATERIJALI I METODE

32

12,5 μl 4 %-tnog NaNO2 (III)

12,5 μl pararozanilin-HCl (II)

b) 250 μl otopine α-naftil butirata (ANB) dobivene otapanjem:

250 μl EGME

5 μl ANB

c) 4,75 ml pripremljenog fosfatnog pufera pH 6,3

Prvo su se umiješale otopine ANB i pararozanilina obogaćenog nitratnim skupinama,

zatim je dodan fosfatni pufer, otopina se filtrirala i nakapala na dva uzorka. Nakon 45 minuta

uzorci su se isprali destiliranom vodom i ostavili sušiti.

Nije napravljeno kontrasno obojenje.

3.5.4. Alkalna fosfataza (ALP)

Ovo je prilagođeni protokol (Lowe 1998b) gdje se fast blue RR salt koristio umjesto fast

red TR salt te nuclear fast red (NFR) umjesto hematoksilina.

Za pripremu 100 ml puferske otopine 0,2M Tris HCl u tikvici (150ml) trebalo je:

2,42 g Trisma base (Sigma Aldrich, Njemačka)

0,1M HCl

dH2O

U 40 ml dH2O otopljena je Trisma te je dodavan HCl dok nije postignut pH 8,3. Na

kraju se ulila dH2O do 100 ml. Otopina Tris-HCl može stajati na sobnoj temperaturi, a služi

za pripremu naftol AS-BI matične otopine.

Za pripremu 100 ml naftol AS-BI matične otopine trebalo je:

5 mg naftol AS-BI fosfata (AppliChem, Njemačka)

2 ml N,N-dimetilformamida (Gram-Mol, Hrvatska)

2 ml dH2O

natrijevog karbonata, Na2CO3 (Kemika, Hrvatska)

36 ml pripremljenog Tris-HCl pufera

60 ml dH2O

U N,N-dimetilformamidu otopio se naftol AS-BI fosfat, dodana je dH2O i natrijevim

karbonatom pH je podešen na 8,0. Zatim je dodan Tris-HCl pufer i dH2O.

Inkubirajuća otopina (za 10 uzoraka) svježe je napravljena od 25 ml matične otopine

naftol AS-BI fosfata i 25 mg fast blue RR soli, promješana, filtrirana i odmah nanešena na

MATERIJALI I METODE

33

suhe, nefiksirane razmaze. Vremena inkubacije su 8, 10, 13 i 15 minuta. Za vizualizaciju

jezgri koristio se NFR na isti način kao kod alcian blue tehnike.

3.5.5. Metoda Schiffove baze i perjodne kiseline (PAS)

Za pripremu Schiffova reagensa (Lowe 1998c) bilo je potrebno:

200 ml kipuće destilirane vode

1 g bazičnog fuksina (AppliChem, Njemačka).

2 g kalijevog disulfita (AppliChem, Njemačka)

2 ml koncentrirane klorovodične kiseline (HCl)

Žlica (cca 1 g) aktivnog ugljena (Kemika, Hrvatska).

U kipućoj vodi otopio se bazični fuksin. Kada se otopina ohladila na 50 °C umiješao se

kalijev disulfit i ohladilo na sobnu temperaturu. Zatim se ulila klorovodična kiselina i

ostavljeno je da stoji u mraku preko noći. Idući dan dodan je aktivni ugljen, smjesa se

protresla i filtrirala. Dobivena otopina prozirne je boje i čuvala se na 4 °C dobro zatvorena.

Za provjeru kvalitete Schiffova reagensa u 10 ml 35 % formalina (Alkaloid,

Makedonija) doda se par kapi reagensa. Ovo nije potrebno raditi, ali je korisno.

Za vizualizaciju jezgri koristio se Gillov hematoksilin (IHC World 2011a). Za pripremu

100 ml Gillovog hematoksilina potrebno je:

25 ml etilen glikola (AppliChem, Njemačka)

50 ml dH2O

200 mg hematoksilin monohidrata (AppliChem, Njemačka)

20 mg kalijevog jodida, KI (Kemika, Hrvatska),

2 g aluminijevog-sulfat oktadekahidrata, Al2(SO4)3 x18H2O (Gram-mol, Hrvatska)

2 ml ledene octene kiseline

dH2O

Etilen glikol se dodao u dH2O te se dodao hematoksilin, KI, alumijiev sulfat i ledena

ocetna kiselina. Natočila se dH2O do 100 ml. Otopina se miješala sat vremena na magnetskoj

miješalici. Gillov hematoksilin čuvao se dobro zatvoren na sobnoj temperaturi zaštićen od

svjetla.

Krvni razmazi nisu bili fiksirani. Na njih se nakapala dH2O i držala dvije minute. Višak

vode se izlio i odmah se tretiralo 10 minuta sa 1 %-tnom perjodnom kiselinom (Merck,

Njemačka). Slijedilo je ispranje vodom i tretman Schiffovim reagensom u vremenskim

intervalima 10, 13, 15 i 20 minuta. Na kraju su se razmazi isprali destiliranom vodom i

MATERIJALI I METODE

34

ostavili sušiti. Za vizualizaciju jezgri uzorci su nakapani Gillovim hematoksilinom. Nakon 3

minute isprani su dH2Oom i tretirani 1%-tnom otopinom litijevog karbonata 2 minute kako bi

se obojili plavo.

3.5.6. PAS i AB kombinacija

Prvi dio identičan je tretmanu ABom: nakapavanje nefiksiranih uzorka destiliranom

vodom u trajanju od dvije minute, izlijevanje viška vode, tretman ABom (dužina tretmana

ovisi o pHu: 4 min za pH 0,2 i 1, 3 min za pH 2,5 i 3,1) i ispiranje dH2Oom. Nije potrebno

sušenje.

Tretman PASom odmah počine 10 minutnom inkubacijom 1 %-tne perjodne kiseline.

Slijedi ispiranje destiliranom vodom i tretman Schiffovim reagensom (iste minutaže opisanom

u PAS metodi). Na kraju su uzorci isprani vodom.

Za vizualizaciju se koristio Gillov hematoksilin opisan kod PAS metode.

3.5.7. Sudansko crnilo B (SBB)

Prilagođeni protokol (WebPath 2012) koristi više metoda fiksacija te otopinu sudanskog

crnila B (SBB) čuva dobro zatvorenu na sobnoj temperaturi umjesto 60 °C.

Za pripremu otopine SBB potrebno je:

100 ml etilen glikola (AppliChem, Njemačka)

0,7 g SBBa (Sigma-Aldrich, Njemačka)

Dodani SBB u etilen glikolu se miješao 4 min u kupelj na 95 °C. Otopina se vruća

filtrirala i čim se ohladila na sobnu temperaturu, filtrirala se drugi put.

Koristili su se nefiksirani uzorci, uzorci fiksirani 10 %-tnim formalinom pH 7,4

(Alkaloid, Makedonija) dvije minute, uzorci fiksirani dvije minute mješavinom 96 %-tnog

etanola (Badel, Hrvatska) i 5 %-tne ocetene kiseline u omjerima 3:1, uzorci fiksirani

ohlađenim formalinom i acetonom 30 sekundi (kao u ANBE) i uzorci fiksirani jednu minutu

puferiziranom otopinom citrata, acetona i metanola (kao u ANAE). Za negativnu kontrolu

uzorci su tretirani acetonom (T.T.T., Hrvatska) tri minute kako bi se degradirale masti.

Ocijeđeni preparati uronili su se u etilen glikol (EG) pet miunta, kratko su osušeni i

ponovno vraćeni na pet minuta u EG. Nakon toga uzorci su ocijeđeni, nakapani otopinom

SBBa i inkubirani 5, 6, 7 i 8 minuta. Zatim su se istresli od viška boje i nakapali 85 %-tnim

etilen glikolom na pet minuta. Zadnji korak bilo je ispranje destiliranom vodom i sušenje par

sati. Za vizualizaciju jezrgi korištena je otopina nuclear fast red (NFR) opisana kod alcian

blue metode.

MATERIJALI I METODE

35

3.5.8. Morfološke karakteristike krvnih stanica

Mikroskopirali su se razmazi tretirani svim citokemijskim metodama. Slike su dobivene

pomoću Olympusovog mikroskopa BX51 sa Olympusovom kamerom DP70 te pripadajućeg

programa DP Controller. Koristila su se povećanja od 40x bez imerzije te 60x i 100x sa

imerzijom.

REZULTATI

36

4. REZULTATI

4.1. Određivanje ukupnog broja eritrocita i leukocita

Nakon potrebnih izračuna dobivene su slijedeće vrijednosti za eritrocite i leukocite

(Tablica 1.).

Tablica 1. Ukupni broj leukocita i eritrocita

Srednja vrijednost Standardna devijacija Median Min Max

Eritrociti x 106/ml 0,43 0,13 0,45 0,11 0,68

Leukociti x 103/ml 7,50 6,89 7,19 6,89 7,50

Ručnim brojanjem stanica najviše je izbrojano eritrocita. Od leukocita najčešći su bili

limfociti (veliki i mali), zatim neutrofili, eozinofili i monociti. Bazofila nije pronađeno na 100

stanica, ali se strpljenjem mogu pronaći na uzorcima. Ukupan broj pojedinih tipova leukocita

prikazan je u Tablici 7. Grafički prikaz udjela pojedinih tipova leukocita nalazi se na Slici 33.

4.2. Određivanje vrijednosti hematokrita

Nakon statističke obrade dobivene su slijedeće vrijednosti za hematokrit (Tablica 2.).

Tablica 2. Vrijednosti hematokrita

Srednja

vrijednost

Standardna

devijacija Median Min Max

0,43 0,13 0,45 0,11 0,68

4.3. Diferencijalna analiza pomoću bojanja May-Grünwald Giemsom

4.3.1 Eritrociti

Svi eritrociti, neovisno o starosti imaju ljubičasto obojanu jezgru i blijedu citoplazmu

(Slika 31.). Kod zelene žabe pronađeno je više stadija zrelosti eritrocita. Nezreli eritociti

okruglog su oblika i okrugle jezgre, intenzivnije obojane citoplazme. Prijelazni oblik iz

nezrelog u zreli ima okruglu jezgru, ali izduženiju stanicu nego nezreli. Zreli eritrociti

ovalnog su oblika i ovalne jezgre, smještene u centru. Većih su dimenzija nego nezreli i

REZULTATI

37

jezgra im zauzima manji dio citoplazme. Stari eritrociti imaju bijelu citoplazmu te ovalnu

ili okruglu jezgru svjetlije obojanu od zrelih i nezrelih eritrocita. U usporedbi sa zrelim i

nezrelim eritrocitima najvećih su dimenzija (visina i širina), uključujući i jezgru (Tablice 3.

i 4.).

Broj eritrocita po ml krvi prikazan je u Tablici 7.

Tablica 3. Prosječne dimenzije stanica nezrelih, zrelih i starih eritrocita izražene u μm sa

standardnom devijacijom te najmanjim i najvećim vrijednostima.

Širina Min Max Duljina Min Max

Nezreli 13,547 ± 1,264 10,41 15,14 17,446 ± 1,605 10,41 19,34

Zreli 15,114 ± 0,909 13,44 17,06 22,685 ± 1,595 19,47 25,68

Stari 18,489 ± 1,674 15,27 20,87 24,94 ± 2,169 21,83 28,36

Tablica 4. Prosječne dimenzije jezgri nezrelih, zrelih i starih eritrocita izražene u μm sa



Nezreli 6,192 ± 0,749 5,26 7,68 8,264 ± 1,051 7,36 10,97

Zreli 4,752 ± 0,577 3,65 6,29 8,699 ± 0,819 6,54 10,24

Stari 10,213 ± 3,454 5,7 16,89 13,272 ± 3,066 9,48 17,26

4.3.2. Trombociti

Ovisno o starosti mijenjaju oblik (Slika 31.). Nezreli trombociti sferičnog su oblika,

tamno ljubičaste okrugle jezgre sa vrlo malo rozo obojane citoplazme. Zreli trombociti su

ovalnog oblika, imaju ovalne tamno ljubičaste jezgre centralno smještene. Znatno su veći od

nezrelih (Tablice 5. i 6.). Ponekad se na razmazima trombociti mogu naći grupirani.

Tablica 5. Prosječne dimenzije stanica nezrelih, zrelih i starih trombocita izražene u μm sa



Nezreli 8,428 ± 0,657 6,33 9,69 10,591 ± 1,034 8,78 12,49

Zreli 7,564 ± 0,925 5,12 17,41 12,863 ± 1,523 10,41 17,41

REZULTATI

38

Tablica 6. Prosječne dimenzije jezgri nezrelih, zrelih i starih trombocita izražene u μm sa



Nezreli 6,484 ± 0,759 5,23 8,98 8,094 ± 0,984 6,37 10,58

Zreli 5,448 ± 0,789 3,25 6,62 9,83 ± 1,245 7,82 13,05

4.3.3. Agranulociti, limfociti

Najčešća su vrsta leukocita kod P. ridibundus. Jezgra tipičnog limfocita centralno je

pozicionirana i zauzima veliki udio stanice, dok se citoplazma vidi kao mali plavkasti prsten

oko tamno ljubičaste jezgre (Slika 32.). Prema veličini razlikuju se veliki i mali limfociti.

Prosječni promjer malih limfocita je 9,909 ± 0,869 μm (min 8,45 μm , max 11,92 μm) μm, a

velikih 11,591 ± 0,945 μm (min 10,07 μm, max 13,81 μm).

Ukupan broj malih i velikih limfocita prikazan je u Tablici 7.

4.3.4. Granulociti, neutrofili

Dosta su česti leukociti. Imaju bijelu citoplazmu u kojoj je segmentirana ljubičasta

jezgra. Broj segmenta varira od dva do četiri, najčešće ih je tri. Različitog su oblika, nekad su

smješteni na periferiji stanice, nekada u sredini (Slika 32.). Prosječni promjer neutrofila je

14,086 ± 1,558 μm (min 11,88 μm i max 17,78 μm).

Ukupan broj neutrofila prikazan je u Tablici 7.

4.3.5. Granulociti, eozinofili

Imaju narančasto obojane okrugle granule i ljubičasto obojanu jezgru centralno ili

ekscentrično smještenu (Slika 32.). Citoplazma je bijele boje. Broj jezgrinih segmenta varira

od jednog do četiri. Najčešće ih je dva. Prosječni promjer eozinofila je 12,707 ± 1,446 μm

(min 9,45 μm i max 16,68 μm).

Ukupan broj eozinofila prikazan je u Tablici 7.

4.3.6. Agranulociti, monociti

Sferičnog su oblika sa perifernom ljubičastom jezgrom i blijedo plavom citoplazmom

(Slika 32.). Jezgra može biti okrugla ili nepravilnog oblika, ali nije segmentirana. Spadaju u

jedne od najvećih krvnih stanica. Prosječni promjer je 14,364 ± 1,886 μm (min 11,6 μm i max

18,08 μm).

Ukupan broj monocita prikazan je u Tablici 7.

REZULTATI

39

4.3.7. Granulociti, bazofili

Jedine stanice nepravilnog sferičnog oblika, tamno ljubičaste jezgre i tamno ljubičasto-

plavih (skoro crnih) citoplazmatskih granula (Slika 32.). Najrjeđe su krvne stanice. Prosječni

promjer bazofila je 13,775 ± 1,099 μm (min 12,19 μm i max 15,03 μm).

Ukupan broj bazofila prikazan je u Tablici 7.

Slika 31. Rezultati bojanja eritrocita i trombocita May-Grünwald Giemsom (MGG).

REZULTATI

40

Slika 32. Rezultati bojanja leukocita May-Grünwald Giemsom (MGG).

Tablica 7. Ukupan broj velikih i mali limfocita, neutrofila, eozinofila, monocita i bazofila. Svaki tip

leukocita x 103 / ml krvi.

Srednja

vrijednost

Standardna

devijacija Median min max

Limfociti mali 1,08 0,97 0,9 0,18 2,86

Limfociti veliki 1,91 3,22 0,72 0,29 8,47

Neutrofili 0,96 0,73 0,82 0,03 1,94

Eozinofili 0,41 0,56 0,2 0,04 1,53

Monociti 0,71 0,75 0,6 0,06 2,06

Bazofili 0 0 0 0 0

REZULTATI

41

Slika 33. Udjeli pojedinih leukocita. Brojevi označavaju postotke.

4.4. Citokemijske analize

4.4.1. Alcijansko modrilo (AB)

Najbolji rezultati bojanja alcijanskim modrilom (AB) dobiveni su trominutnim

tretmanom pri pH 2,5 i 3,1 te četverominutnim pri pH 1 i pH 0,2 (Tablica 8.). Što je vrijeme

tretmana bilo dulje, to su se stanice više smežurale, neovisno o pH.

Tablica 8. Optimalne minutaže tretmana ABom ovisno o pH

min

pH

0,2 1 2,5 3,1

3 nema obojenja nema obojenja dobro obojano dobro obojano

4 svijetlo, ali dobro dobro obojano dobro obojano prejako obojano

5 dobro obojano nije dobro prejako obojano prejako obojano

Pri svim navedenim pH jezgre svih stanica obojane su plavo. Zreli eritrociti (Slika 34.a)

imaju neobojanu citoplazmu i oko jezgre daju pozitivnu reakciju na AB. Stari eritrociti (Slika

34.b) imaju vrlo blijedo obojanu jezgru i neobojanu citoplazmu. Pri svim pH pozitivna

reakcija na alcian blue (Tablica 9.) primjećena je kod limfocita (Slika 34.c i d) i monocita

(Slika 34.h) te nešto slabije kod neutrofila (Slika 34.e) i trombocita (Slika 34.g). Eozinofili

37,67

21,30

18,93

14,00

8,09

0,00

Veliki limfociti

Mali limfociti

Neutrofili

Eozinofili

Monociti

Bazofili

REZULTATI

42

(Slika 34.f) imaju obojane i neobojane granule koje se jako dobro vide. Bazofili nisu

pronađeni.

Boja nuclear fast red (NFR) daje dobre rezultate, čak pomaže u razlučivanju

unutarstaničnih struktura. Ljubičasto obojenje jezgre nastaje zbog preklapanja boja AB i NFR

(Slike 34.c, f, g i.h).

Slika 34. Rezultati bojanja alcijanskim modrilom (AB) i nuclear fast redom (NFR). Sve krvne stanice

imaju obojanu jezgru. Nezreli eritrociti pri pH 0,2 (a) i stari eritrociti pri pH 0,2 (b) su bez

citoplazmatskih obojenja. Monociti pri pH 2,5 (h) te limfociti pri pH2,5 sa NFR (c) i pH 3,1 (d) imaju

obojanu citoplazmu, kao i neki neutrofili pri pH 0,2 (e), poneki zreli trombociti pri pH 2,5 sa NFR (g) te

neke granule eozinofila pri pH 2,5 sa NFR (f). Mjerilo 20 μm.

4.4.2. Alfa-naftil acetat esteraza (ANAE)

Fiksacija krvnih razmaza je bila uspješna. Pozitivna je reakcija (Tablica 9.) pronađena

kod monocita (Slika 35.b) i nekih limfocita (crna boja). Ostale su stanice neobojane (Slika

35.a). Bazofili nisu pronađeni.

Slika 35. Rezultati reakcije alfa-naftil acetat esteraze (ANAE). Negativna reakcija kod zrelog trombocita

(a) i pozitivna kod monocita (b). Mjerilo 20 μm.

REZULTATI

43

4.4.3. Alfa-naftil butirat esteraza (ANBE)

Fiksacija je bila uspješna. Pozivitni rezultati (Tablica 9.) pronađeni su kod monocita te

ponekih zrelih trombocita i limfocita (Slika 36. ). Bazofili nisu pronađeni.

Slika 36. Rezultati reakcije alfa-naftil butirat esteraze (ANBE). Pozitivne reakcije kod nekih zrelih

trombocita (a), svih monocita (b) i pojedinih limfocita (d). Negativna reakcija u eozinofilu (c). Mjerilo 20

μm.

4.4.4 Alkalna fosfataza (ALP)

Nije bilo očekivanih pozitivnih rezultata, neovisno o vremenu inkubacije. Negativni

rezultati zapaženi su kod svih pronađenih stanica. Nuclear fast red dobro je obojao jezgre.

4.4.5. Metoda Schiffove baze i perjodne kiseline (PAS)

Provjera kvalitete Schiffova reagensa dala je neobičan rezultat, trenutnu promjenu boje

u tamno ljubičastu.

Pri inkubacijama od 10 i 13 minuta nije primjećeno pozitivno rozo obojenje. Pri 15 i 20

minuta dobivena su dobra obojenja sa normalnim oblikom stanica. Pozitivne reakcije (Tablica

9.) pronađene su kod limfocita (Slika 37.e), granula eozinofila (Slika 37.g) te u citoplazmi

nekih monocita (Slika 37.a), neutrofila (Slika 37.b) i nekih trombocita. Bazofili nisu opaženi.

Bojanje jezgri Gillovim hematoksilinom nije uspjelo.

Slika 37. Rezultati metode Shiffove baze i perjodne kiseline (PAS). Pozitivna reakcija kod monocita (a),

neutrofila pod PH2 filterom (b), negativna reakcija kod zrelih eritrociti pod PH2 filterom (c), nezrelog

trombocita pod PH2 filterom (d), pozitivna reakcija kod limfocita (e), neutrofila (f) i granula eozinofila

(g). Mjerilo 20 μm.

REZULTATI

44

4.4.6. PAS i AB kombinacija

Najbolji rezultati bojom alcianom blue (AB) dobiveni su trominutnom inkubacijom

ABa pri pH 2,5 i 3,1 te četverominutnom pri pH 1 i pH 0,2. Najbolji rezultati PAS metodom

dobiveni su 20 minutnom inkubacijom Schiffovim reagensom (Slika 38.). Za sve navedene

pH jezgre limfocita, trombocita, monocita i neutrofila obojane su plavo (zbog ABa), a

citoplazma istih crveno (zbog PASa).

Bojanje Schiffovim reagensom za sve pH u trajanju od 13 minuta ispalo je presvijetlo ili

je ostalo neobojano. Za 15 minuta najbolji rezultati postignuti su kod AB pH 0,2 i 2,5.

Inkubacija Schiffom 20 minuta dobro je obojala uzorke sa AB pH 1 i 3,1.

Boja nuclear fast red (NFR) dala je ljubičasto obojenje gdje se preklopila sa bojom AB

(najviše u jezgrama svih stanica).

Slika 38. Rezultati kombinirane metode alcijanskog modrila (AB) i periodic acid Schiff metode (PAS).

Pozitivne reakcije u zrelom trombocitu gore i limfocitu dolje AB pH1 (a), limfocitu AB pH1 (b), neutrofilu

AB pH1 (c), eozinofilu AB pH 1 (d), monocitu AB pH 2,5 (e) i bazofilu AB pH 2,5 (f). Mjerilo 20 μm.

4.4.7. Sudansko crnilo B (SBB)

Fiksacije formalinom, etanol octenom kiselinom, puferiziranim aceton-metanolom i

ohlađenim formalin-acetonom bile su uspješne kod svih uzoraka. Nefiksirani uzorci dali su

najbolje rezultate sedmominutnim bojanjem sudan blackom. Formalinom fiksirani uzorci ne

daju zadovoljavajuće rezultate pri ispitivanim minutažama. Kontrolni uzorci fiksirani ostalim

meotdama daju dobre rezultate nakon 5 i 6 minuta bojanja sudanom.

Pozitivna reakcija primjećena je u citoplazmi limfocita, neutrofila, monocita i

trombocita te vrlo slabo kod nezrelih i zrelih eritrocita (Tablica 9., Slika 39.). Stari eritrociti

REZULTATI

45

imaju potpuno neobojanu citoplazmu. Eozinofili imaju izrazito neobojane granule omeđene

crnim rubom (Slika 39.c). Bazofili imaju crne granule (Slika 39.f).

NFR daje odlične rezultate.

Slika 39. Rezultati bojanja tehnikom sudan black B (SBB) i nuclear fast red (NFR). Jezgre svih stanica

crvene su boje. Slaba reakcija u zrelom eritrocitu (a), negativna reakcija u starom eritrocitu (b) i

granulama eozinofila (c). Pozitivne reakcije u zrelom trombocitu (d), limfocitu (e), granulama bazofila (f),

neutrofilu (g) i monocitu (h). Mjerilo 20 μm.

Tablica 9. Rezultati svih citokemijskih analiza. + je pozitivan rezultat, - negativan, / znači da stanica nije

pronađena.

Ostale stanice Leukociti

Eritrociti Trombociti Limfociti Neutrofili Monociti Bazofili Eozinofili

AB - + - + + - + / + -

ALP - - - - - - -

ANAE - - + - - + / -

ANBE - + - + - - + - -

PAS - + - + + - + - / +

SBB + - + + + + + +

4.5. Atipične i neklasificirane stanice

4.5.1. "Raspadnute jezgre".

Nisu bile brojane, ali su dosta česte strukture (Slika 40.). Boja i morfologija odgovara

jezrgama starog eritrocita koje izgledaju manje kompaktno i "napuhano". Proizvoljno su

nazvane "raspadnute jezgre". Nisu uključene u analizu.

REZULTATI

46

Slika 40. Stari eritorcit (1, 5), zreli eritrocit (2, 3) i "raspadnuta jezgra" (4). Primjetiti sličnost oblika

jezgre starih eritrocita sa "raspadnutom". Obojano May-Grünwald Giemsom.

4.5.2. Neobične stanice

Pregledavanjem uzorka relativno često su se pojavljivale stanice proizvoljno nazvane

"ljubičaste jezgre" i nepoznate stanice slične monocitima. Nisu uključene u analize.

"Ljubičaste jezgre" (Slika 41.a) veličine su malih limfocita. Izrazito su tamne i kompaktne.

Ponekad imaju svijetlo roze "mjehuriće" u sredini (Slika 41.a). Stanice slične monocitima

imaju svijetlo ljubičastu jezgru koja izgleda vrlo rahlo i razasuta je po cijeloj citoplazmi.

Imaju citoplazmu blijedo plave do bijele boje. Veličina su kao monocit i veliki limfocit (Slika

41.b i c).

Slika 41. "Ljubičasta jezgra" (a). Na istom uzorku nepoznata stanica (b) i monocit (c). Obojano May-

Grünwald Giemsom.

REZULTATI

47

4.5.4. Azurofili i heterofili

Azurofili (Slika 42.a i b) su veličine monocita sa ekscentrično smještenom ljubičastom

jezgrom. U plavoj citoplazmi se vide plavkasto-ljubičaste granulice. U ovom radu ubrajali su

se u monocite.

Heterofili (Slika 42.c) su dimenzija kao neutrofil. Imaju segmentiranu jezgru ljubičaste

boje. Citoplazma im sadržava crvenkaste granulice. Nisu česte stanice, ima ih dosta manje

nego azurofila. U ovom radu ubrajali su se u neutrofile.

Slika 42. Azurofili (a i b), heterofil (c). Obojano May-Grünwald Giemsom.

4.5.5. Morfološke neobičnosti krvnih stanica

Nađeno je par atipično obojanih eritrocita, bilo u jezgri (Slika 43.a) ili citoplazmi (Slika

43. c). Nađeni su eritrociti čija jezgra izgleda fragmentirano (Slika 43.b). Također, pronađen

je eritrocit oblika suze (Slika 43.d) i eritrocit sa ekscentričnom jezgrom (Slika 43.f). Čak je

pronađen eritrocit u diobi (Slika 43.e).

Nađeno je više "bubrežastih" limfocita (Slika 44.a) te zreli trombocit vretenastog oblika

(Slika 44. b).

REZULTATI

48

Slika 43. Neobični eritrociti. Neobično obojana jezgra (a), fragment jezgre (b), neobično obojana

citoplazma (mogući prelazak u starog eritrocita) (c), oblik suze (d), eritrociti u diobi (e) i ekscentrična

jezgra (f). Obojano May-Grünwald Giemsom osim slike 43.f gdje je korištena boja sudan black B (SBB) i

kontrasno obojenje nuclear fast red (NFR).

Slika 44. "Bubrežasti" limfocit (a) i vretenasti trombocit (b). Obojano May-Grünwald Giemsom.

RASPRAVA

49

5. RASPRAVA

Eritrociti Pelophylax ridibundus najbrojnije su krvne stanice kao i u ostalih kralježnjaka

osim sisavaca. U usporedbi s ljudima (5 000 000 / ml krvi) P. ridibundus (430 000 / ml) ima

oko 10x manje eritrocita po ml krvi (Guyton i Hall 2006). Broj eritrocita žaba varira ovisno o

rodu. Rod Rana ih ima najviše, preko 500 000 / ml. Čini se kako P. ridibundus (prije zvana

Rana ridibundus) spada u ovu skupinu. U usporedbi sa Bombina bombina (250 000 / ml krvi)

i Xenopus laevis (75 000 / ml krvi) P. ridibundus ima daleko veću brojnost eritrocita (Arikan i

sur. 2010; Arserim i Mermer 2008; Hadji-Azimi i sur. 1987). Dimenzije zrelih eritrocita P.

ridibundus (cca 15 x 23 μm) i njihovih jezgri (cca 5 x 9 μm) otprilike su iste kao kod B.

bombina, ali su nešto veće od onih u X. laevis (Arikan i sur. 2010; Hadji-Azimi i sur. 1987).

Eritrociti Rana macrocnemis varijabilnijih su veličina od P. ridibundus (širirne 12 do 18 μm,

dužine 17 do 29 μm), ali prosječno sličnih dimenzija (Arserim i Mermer 2008). Gmazovi

imaju prosječno manje eritrocite i njihove jezgre. Kod poskoka otprilike iznose 13 x 18 μm sa

jezgrom 5 x 8 μm, a kod ruskih kornjača 10 x 20 μm sa jezgrom 4 x 6 μm (Lisičić 2005;

Knotková i sur. 2002). Eritrociti ovdje opisani kao nezreli vjerojatno su slični nezrelim

eritrocitima II opisanim kod X. laevis (Hadji-Azimi i sur. 1987).

Morfologija zrelih eritrocita P. ridibundus gotovo je identična u spomenutim žabljim

vrstama. Za razliku od gmazova (poskok i kornjača) i riba imaju malo izduženiju jezgru.

Vrijednost hematokrita P. ridibundus (43 %), R. macrocnemis (34 %) i X. laevis (37 %)

nalazi se unutar ljudskih granica- od 30 do 45 % (Arikan i sur. 2010; Arserim i Mermer 2008;

Guyton i Hall 2006; Wilson i sur. 2011). Zanimljivo kako kod poskoka vrijednost hematokrita

iznosi 73 % (Lisičić 2005). Vrijednost hematokrita riba varira ovisno o vrsti (Shigdar i sur.

2007).

Trombociti P. ridibundus i ostalih kralježnjaka nemogu se morfološki uspoređivati sa

ljudskima. Prosječni broj trombocita ptica je 25 000 000 / ml krvi, a riba 65 000 000 / ml krvi

što je deseterostruko manje nego u ljudi (Weiss i Wardrop 2010). To se može objasniti malom

veličinom ljudskih trombocita u usporedbi s ostalim kralježnjacima. Prosječni broj trombocita

spomenutih vrsti žaba mnogo je manji. Kod R. macrocnemis iznosi oko 31 000/ ml krvi

(Arserim i Mermer 2008), što je više nego kod X. laevis (19 000/ ml krvi) i B. bombina (13

000 / ml krvi; Arikan 2010). U ovom radu nije mjerena brojnost trombocita P. ridibundus s

RASPRAVA

50

obzirom da je dio njih morfološki jako sličan malim limfocitima, ali očekivano bi imali manju

vrijednost od R. macrocnemis i veću od B. bombina.

Morfologija trombocita također je očuvana u kralježnjaka osim u sisavaca. Kod

spomenutih gmazova Lisičić (2005) i Knotková i sur. (2002) nisu opisali vretanaste oblike, za

razliku od Shigdar i sur. (2007) koji su pronašli te oblike u ribi Maccullochella peelii peelii.

Jedino kod M. peelii peelii trombociti imaju segmentiranu jezgru (Shigdar i sur 2007).

Veličina trombocita i njegove jezgre u P. ridibundus (7,5 x 13 μm) prosječno je manja od

onih u B. bombina (cca 8,5 x 17 μm), ali jako slična poskokovim (8 x 13 μm) opisanih kod

Lisičića (2005).

Ukupan broj leukocita P. ridibundus kreće se od 5070 do 7500 / ml krvi što ga

smještava u ljudski raspon i čini skoro dvostruko većim od onog u R. macrocnemis (3500

leukocita / ml krvi) i X. laevis (Arserim i Mermer 2008, Hadji-Azimi i sur. 1987). Raspon

ukupnog broja leukocita P. ridibundus opisanog kod Gül i sur. (2011) kreće se od 4500 do

8000 / ml krvi, što se podudara sa dobivenim rezultatima.

Udio pojedinog tipa leukocita donekle se poklapa kod ljudi i P. ridibundus. Oboje

imaju najviše neutrofila i limfocita, s tim da ljudi imaju najviše neutrofila (40-75 %), a P.

ridibundus limfocita (prosječno 59 %). Udio monocita sličan je kod obje vrste (<10 %).

Eozinofili su češći u P. ridibundus (14 %) nego kod čovjeka (1-5 %). Bazofili su izrazito

rijetki (<1 %) u obje vrste (Reagena 2003). Uspoređujući P. ridibundus sa drugim vrstama

žaba, R. macrocnemis i X. laevis, također dobivamo slične omjere. P. ridibundus i X. laevis

imaju najviše limfocita, s tim da ih X. laevis ima skoro dvostruko manje (30 %). Udio

neutrofila im je otprilike isti, ali ih X. laevis ima malo više (27 %). X. laevis ima mnogo manji

udio eozinofila (1,2 %) i monocita (<2 %), ali zato skoro 40 % ukupnih leukocita otpada na

bazofile (Hadji-Azimi i sur. 1987). Davis (2011) je opisao udjele kod još 19 vrsti žaba i dosta

su slični ovim rezultatima. Najzastupljeniji su limfociti (prosječno 63 %), zatim neutrofili

(prosječno 19 %), bazofili (9 %) i eozinofili (6 %), a najmanje ima monocita (3 %). Kornjače

opisane kod Knotková i sur. (2002) također imaju najviše limfocita (46 %) i heterofila (37 %),

najmanje imaju azurofila, eozinofila i bazofila (svaki 5 %), dok monocita imaju nešto više od

P. ridibundus (12 %). Limfociti su najčešći i kod ribe M. peelii peelii opisane od Shigdara i

sur. (2007), čineći 61 % ukupnih leukocita, gotovo isto kao i P. ridibundus. Udio heterofila u

iste ribe skoro je trostruko manji (24 %), dok monociti i bazofili zajedno čine oko 10 %

leukocita.

RASPRAVA

51

Morfološki leukociti kralježnjaka jako su slični, iznimke su heterofili (izgledom sliče

eozinofilima i neutrofilima) i azurofili (podsjećaju na monocite).

Dimenzije velikih i malih limfocita spomenutih žabljih vrsta otprilike su istih promjera.

Najmanjih su dimenzija kod X. laevis, a najvećih kod P. ridibundus (Arserim i Mermer 2008;

Hadji-Azimi i sur. 1987). Obje vrste limfocita B. bombina veći su nego kod spomenutih

(Arikan i sur. 2010). Kod poskoka također su opisani mali i veliki limfociti, gotovo istih

dimenzija kao kod P. ridibundus (Lisičić 2005). Limfociti opisani kod kornjača od Knotková

i sur. (2002) izrazito su mali, promjera 6 μm. Morfološki izgledaju gotovo isto kod ostalih

spomenutih vrsta.

Neutrofili spomenutih žaba prosječno su nešto veći od ljudskih (Piršljin i Milinković

Tur 2009). X. laevis, P. ridibundus i poskok imaju gotovo iste promjere neutrofila, nešto

manje nego R. macrocnemis (Arserim i Mermer 2008; Hadji-Azimi i sur. 1987; Lisičić 2005).

Vodozemci i ljudi, za razliku od gmazova, imaju segmentiranu jezgru neutrofila. Najčešći

broj segmenta P. ridibundus je tri. Jezgra je ponekad smještena acentrično, slično kao kod

gmazova (Lisičić 2005).

Eozinofili P. ridibundus sličnih su dimenzija (promjera 13 μm) kao kod ljudi, X. laevis i

ruskih kornjača (Hadji-Azimi i sur. 1987; Knotková i sur. 2002). Kod poskoka nešto su većeg

promjera i imaju ekscentrično smještenu okruglastu jezgru slično ribi M. peelii peelii (Lisičić

2005; Shigdar i sur. 2007). Ljudi, zajedno sa pticama i vodozemcima imaju segmentiranu

jezgru eozinofila (Claver i Quaglia 2009). Najčešći broj segmenta u P. ridibundus je dva, isto

kao i kod ljudi.

Monociti ljudi nešto su većeg promjera od P. ridibundus (Piršljin i Milinković Tur

2009). Žabe R. macrocnemis i P. ridibundus te riba M. peelii peelii imaju gotovo iste

promjere, oko 14 μm, što ih čini nešto većima nego kod X. laevis, ali manjim nego kod B.

bombina (Arikan i sur. 2010; Arserim i Mermer 2008; Hadji-Azimi i sur. 1987; Shigdar i sur.

2007). Monociti P. ridibundus nešto su manji od onih u ruske kornjače (prosječni promjer 15

μm) i poskoka (prosječni promjer oko 20 μm). Slično gmazovima i ribama imaju ekscentrično

smještenu nesgementiranu jezgru. Kod poskoka i ljudi uglavnom je bubrežasta, kod kornjača

kockasta, dok kod žaba može bit okruglasta ili nepravilnog oblika. Citoplazma im je

uglavnom blijedo obojena (Lisičić 2005; Knotková i sur. 2002; Shigdar i sur. 2007). Kod

većine kralježnjaka monociti su najveće stanice.

Bazofili ljudi i X. laevis otprilike su istih veličina (prosječni promjer 12 μm), manji su

od onih u P. ridibundus koji su manji od onih u B. bombina (Arikan i sur. 2010; Hadji-Azimi

i sur. 1987). Bazofili gmazova manji su od žabljih, ali su ovalnog oblika sa centralnom

RASPRAVA

52

jezgrom. Jezgra nekad može biti skroz zaklonjena zbog citoplazmatskih granula kao što je to

slučaj kod kornjača. Kod poskoka nepravilnog je oblika, kod ljudi i ribe M. peelii peeli može

biti segmentirana, za razliku od okruglaste jezgre P. ridibundus (Lisičić 2005, Knotková i sur.

2002; Shigdar i sur. 2007).

Heterofili namjerno nisu bili opisivani u ovom radu iz više razloga. Glavni je što su se

May-Gründwald Giemsa (MGG) bojanjem jasno mogli razaznati neutrofili istih karakteristika

kao u sisavaca. Heterofili nisu opisani kod spomenutih vrsti žaba. Neki autori smatraju kako

bi trebalo promijeniti terminologiju u smislu da neutrofili budu samo kod sisavaca, a heterofili

kod ostalih kralježnjaka (Claver i Quaglia 2009). No, neki gmazovi i vodozemci imaju dobro

prepoznatljive heterofile i azurofile (Claver i Quaglia 2009; Hadji-Azimi i sur. 1987; Lisičić

2005).

Azurofili također nisu bili opisivani u ovom radu iz sličnih razloga. Kod žaba Rana

catesbeiana i X. laevis jako su rijetke stanice i morfološki se mogu lako zamijeniti sa

monocitima (Bricker i sur. 2012). Češće su opisivani kod gmazova nego kod vodozemaca

(Knotková i sur. 2002).

Neobične stanice pronađene kod P. ridibundus pojavile su se na večini uzorka. Stanice

nazvane "raspadnute jezgre" sliče jezgri starog eritrocita. Homogene su obojane, imaju

mjehuriće što im daje nepravilni oblik i većih su dimenzija od jezgri zrelih eritrocita. Moguće

da su prilikom rađenja razmaza stari eritrociti popucali i ispustili jezgru. Eritrocit čija jezgra

izgleda fragmentirano mogao bi sadržavati Howell Jollyjevo tjelešce koje nastaje nepravilnom

diobom jezgre. Eritrociti čudnog obojenja mogu biti ili prelazni oblici prema starim

eritrocitima ili mogu biti polikromatski. Eritrociti sa tamnim citoplazmatskim točkicama

(bazofilnim tjelešcima) koje nisu sličile jezgri su također pronađeni. Ukoliko gmazovi imaju

preko 40 % (a ptice preko 55 %) eritrocita s abnormalnom morfologijom to ukazuje na

različite poremećaje. Npr. poikilocitoza može nastati uslijed metaboličkih promjena ili

hemolize, bazofilna tjelešca mogu označavati pristunost parazita, hipokromija najčešće

karakterizira manjak željeza ili hemoglobina i tako dalje (Pendl 2006). Stanice nazvane

"ljubičaste jezgre" veličinom i bojom odgovaraju nezrelim limfocitima. Ponekad imaju

mjehuriće što nije karakteristika homogenih, kompaktnih nezrelih limfocita. Nepoznata

stanica sa vrlo rahlim kromatinom mogla bi biti raspadnuti monocit, makar sliči limfoblastu

X. laevis pronađenom u slezeni (Hadji-Azimi i sur. 1987). No, kod P. ridibundus ove "čudne"

stanice nisu bile česte.

RASPRAVA

53

Buduća istraživanja krvnih stanica P. ridibundus mogla bi uključiti heterofile i azurofile

s obzirom da su pronađeni kod vodozemaca i gmazova (Claver i Quaglia 2009; Knotková i

sur. 2002). Također bi se mogla raditi analiza brojnosti krvnih stanica P. ridibundus ovisno o

spolu. Razlike u brojnosti eritrocita između mužjaka i ženki pronađene su kod žabe

Pseudepidalea viridis (Gül i sur. 2011). U R. macrocnemis i Bufo bufo nisu pronađene

značajne statističke razlike, ali je opaženo kako ženke R. macrocnemis imaju nešto više

eritrocita, ali manje ukupnih leukocita (Arserim i Mermer 2008; Dönmez i sur. 2009). Razlika

u sastavu krvi punoglavca i odrasle žabe primjećena je kod R. catesbeiana, jedine istraživane

vrste do sad. Prosječno limfociti punoglavaca čine oko 80 % leukocita, a kod odraslih oko 50

% (Davis 2011).

Elektronska mikroskopija pruža odličan uvid stanične mikrostrukture i mogla bi riješiti

neka morfološka pitanja, poput identifikacije nepoznatih stanica.

Zanimljiva ideja bila bi istražiti postoje li krvne grupe ili analozi krvnim grupama

sisavaca kod P. ridibundus. Najviše istraživanja bilo je na sisavcima. Kod pasa postoji 8

krvnih grupa ovisnih o DEA (engl. dog erythrocyte antigen) antigenima, dok mačke imaju tri

grupe A, B i AB. Konji imaju najviše krvnih grupa, njih 30 od kojih su 8 glavne (Cornell

University College of Veterinary Medicine, 2010). Kod gmazova pronađeno je kako gušteri

imaju krvne grupe sličnije ljudskim Rhesus faktorima nego ABO grupi. Od ispitivanih vrsti

žaba (Rana temporaria) i riba (Gadus merlangus i G. luscus) nisu pronađene krvne grupe

slične ljudskoj (Ashhurst 1956).

Rezultati alcijanskog modrila (AB) pri pH 0,2, 1, 2,5 i 3,5 (Lowe 1998a) nisu se

značajno razlikovali što bi moglo značiti kako su krvne stanice P. ridibundus bogate sulfatnim

polisharidima (Green i Pastewka 1974; Kiernan 2008). Jezgre svih krvnih stanica obojale su

se ABom. To je bilo očekivano pri pH 2,5 i više, ali ne pri nižima (Kiernan 2008). Obično se

to dogodi zbog predugog tretmana, što ovdje nije bio slučaj. Produljene minutaže tretmanom

ABa (neovisno o pHu) rezultiralo je smežuranim stanicama, što je bilo očekivano s obzirom

da nisu bile fiksirane. Trebalo bi isprobati ovu tehniku sa fiksativom. Postoji mogućnost da je

jezgrin kromatin rahliji nego u ostalih kralježnjaka, ali u dostupnoj literaturi jedino je kod

sisavaca bilo bojanja ovom tehnikom (Weiss i Wardrop 2010). Dokaz da se zbilja radi o

jezgrama potvrđen je kontrasnim obojenjem nuclear fast red (NFR). NFR zasebno boji

nukleinske kiseline crveno, a poklapanjem sa AB nastaje ljubičasto obojenje jezgri.

Kod P. ridibundus pozitivnu reakciju imaju limfociti i monociti te nešto slabiju reakciju

neutrofili i trombociti. Eozinofili imaju obojane i neobojane granule. Očekivano bi bilo

RASPRAVA

54

bojanje membrane eritrocita s obzirom da je bogata negativno nabijenom sijalinskom

kiselinom. Kod sisavaca jedino su se granule bazofila bojale ABom (Weiss i Wardrop 2010),

ali oni nisu pronađeni u P. ridibundus.

Prije tretmana periodic acid Schiffom (PAS) preporuča se napraviti kontrolu Schiffova

reagensa. Dobar Schiffov reagens u reakciji sa formaldehidom brzo promjeni boju u crveno-

ljubičasto. Schiff kojem ističe trajnost ima dulju reakciju i daje tamno ljubičasto-plavu boju

(IHC World 2011d). Schiffov reagens u ovom radu odmah je dao tamno ljubičasto obojenje.

Zbog tog razloga produljeni su tretmani na 20 minuta umjesto 15 opisanih u Loweovom

protokolu (1998c).

Kod P. ridibundus pozitivne reakcije na PAS metodu imaju limfociti u citoplazmi i

eozinofili u granulama te neki monociti, neutrofili i trombociti u citoplazmi. Slične rezultate

dobili su Hadji-Azimi i sur. (1987) kod X. laevis gdje pozitivne rezultate daju trombociti i

neutrofili. Kod ribe M. peelii peelii pozitivnu reakciju na PAS daju trombociti, bazofili,

heterofili i dio limfocita. Primijećeno je kako se stare stanice riba intenzivnije boje PASom

(Shigdar i sur. 2009).

Kombinacija AB + PAS dala je očekivane rezultate kod P. ridibundus. Plava boja dolazi

od ABa, crveno-roza od PASa, a ljubičasta je na mjestu preklapanja ovih boja. Sve stanice

koje su se bojale zasebno sa jednom i drugom tehnikom, boje se sa ovom kombinacijom. To

se odnosi na limfocite, monocite, eozinofile, neutrofile, čak i trombocite. Tipične boje

navedenih stanica su plave za jezgru i ljubičaste ili crvenkaste za citoplazmu.

Reakcije nespecifičnih esterazi podudaraju se sa rezultatima opisanim kod riba M. peelii

peelii (Shigdar i sur. 2009), sisavaca (Chronolab 2012c; Weiss i Wardrop 2010), R.

catesbeiana (Bricker i sur. 2012) i X. laevis (Hadji-Azimi i sur. 1987). Kod spomenutih vrsti

samo se monociti boje nespecifičnim esterazama (alfa-naftil acetat esterazom, ANAE, i alfa-

naftil butirat esterazom, ANBE).

Pozitivna reakcija na ANAE kod monocita identična je u spomenutim vrstama. Svi

limfociti sisavaca i ribe M. peelii peeli te neki limfociti P. ridibundus imaju aktivne ANAE.

Ostale stanice P. ridibundus nisu pozitivne na ANAE, a bazofili nisu pronađeni. Bazofili i

heterofili ribe M. peelii peeli, kao i eozinofili, megakariociti te trombociti sisavca i trombociti

X. laevis pokazuju pozitivnu reakciju na ovu estarazu (Shigdar i sur. 2009, Weiss i Wardrop

2010).

RASPRAVA

55

Pozitivnu reakciju na ANBE također pokazuju monociti spomenutih vrsti osim ribe M.

peelii peelii (Shigdar i sur. 2009). Kod P. ridibundus pozitivne rezultate daje samo poneki

zreli trombocit i limfocit. Neutrofili R. catesbeiana imaju aktivnu ANBE kao i neutrofili

sisavaca (Bricker i sur. 2012; Weiss i Wardrop 2010). Eozinofili sisavaca i X. laevis također

imaju aktivne ANBE, čija je aktivnost pronađena u bazofilima X. laevis (Hadji-Azimi i sur.

1987; Weiss i Wardrop 2010). Bazofili P. ridibundus nisu pronađeni, makar bi mogli dati

pozitivni rezultat.

Iz rezultata nespecifičnih esterazi može se vidjeti kako su ANAE i ANBE očuvane u

monocitima skoro svih kralježnjaka. Za ostale stanice ima premalo podatka za iznošenje

zaključka.

Alkalna fosfataza (ALP) P. ridibundus nije dala nikakve pozitivne rezultate, neovisno o

duljini tretmana. Iako je protokol opisan sa fast red TR (Sigma-Aldrich 2006) soli, u ovom

radu korištena je fast blue RR sol iz razloga što oboje spadaju u istu vrstu boja i trebale bi na

isti način tvoriti obojani produkt (Kiernan 2008) te radi uštede s obzirom da se koristila i kod

alfa-naftil acetat esteraze (ANAE). Paralelno su bojani uzorci riba babica (Barbatula

barbatula) i miševa (Mus musculus) koji su pod istim uvjetima dali očekivano tamno plavo do

crno obojenje limfocita. Limfociti se također boje kod sisavaca i djelomično kod ribe M.

peelii peelii. Zanimljivo kako neutrofili sisavaca i heterofili (funkcijski isti neutrofilima) te

ribe pokazuju pozitivnu reakciju na ALP (Shigdar i sur. 2009; Weiss i Wardrop 2010). Kod

sisavaca eozinofili u citoplazmi također pokazuju aktivnost (Weiss i Wardrop 2010). Jedino

su Bricker i sur. (2012) ispitivali ovaj enzim u R. catesbeiana, gdje su samo granule bazofila

dale dobar rezultat, a kod X. laevis gdje nije bilo pozitivnih rezultata.

Ovo bi moglo značiti da limfociti P. ridibundus i X. laevis imaju drukčije ili

modificirane enzime, možda sa promjenjenim aktivnim mjestom. Zanimljivo je kako rod

Rana (sličniji P. ridibundusu) ima aktivnost u bazofilima, a udaljenija X. laevis nigdje.

Bojanje metodom sudan black B (SBB) jako je variralo o metodi fiksacije. Nefiksirani

uzorci dali su odlične, očekivane rezultate, crnu citoplazmu neutrofila, limfocita te uglavnom

crnu staničnu membranu. U ovom radu bilo je dosta eksperimentiranja sa fiksacijom

kontrolnih uzoraka P. ridibundus. Formalin je dao najlošije rezultate jer je otapao lipide

(Bancroft i Gamble 2008). Zato su on i aceton upotrebljeni kao negativne kontrole. P.

ridibundus pokazuje jake pozitivne rezultate u citoplazmi limfocita, neutrofila i monocita.

Slabiju reakciju pokazuje citoplazma trombocita te nezrelih i zrelih eritrocita. Kod starih

RASPRAVA

56

eritrocita, kao i u drugim citokemijskim tehnikama, nema obojenja. Granule eozinofila nisu

obojane nego imaju crni rub, za razliku od bazofilnih granula. To bi značilo kako su granule

eozinofila unutar lipidne membrane, dok su granule bazofila bogate lipidima. Zajedničko

ostalim žabama (X. laevis i R. catesbeiana) i sisavcima su crna citoplazmatska obojenja

neutrofila. R. Catesbeiana, kao i P. ridibundus, pokazuje pozitivne rezultate u citoplazmi

eozinofila. Kako se SBBom boje heterofili ribe M. peelii peelii, to dodatno utvrđuje njihovu

povezanost sa neutrofilima. Pozitivne rezultate također pokazuju neki limfociti (Shigdar i sur.

2009). Eozinofili sisavca također pokazuju pozitivne reakcije na SBB kao i neki monociti

(Weiss i Wardrop 2010).

Postoje i druge citokemijske metode koje nisu testirane u ovom radu, većina zbog

ograničenih financijskih mogućnosti. Osim za identifikaciju tipova leukocita, citokemijske

metode pomažu klasifikaciji različitih akutnih leukemija (Chronolab 2012a, 2012b, 2012c i

2012d).

Peroksidaze se nalaze u fagocitnim vakuolama i služe u obrani od patogena. Što su one

aktivnije, to su leukociti intenzivnije obojani. Ako su aktivne u mijelodinoj lozi onda se

nazivaju mijeloperoksidazama. Obično se rezultati peroksidaza i SBBa poklapaju (Chronolab

2012d; Shigdar i sur. 2009). Najjaču aktivnost u sisavaca imaju eozinofili, monociti i

neutrofili (u primarnim granulama). Štoviše, peroksidaze neutrofila aktivne su kod svih

kralježnjaka, odnosno kod riba aktivne su u njihovim ekvivalentima, heterofilima (Shidgar

2009, Bricker i sur. 2012; Hadji-Azimi i sur. 1987). Eozinofili ptica i gmazova pokazuju

aktivnost ovog enzima, kao i poneki žablji eozinofili, heterofil i trombociti (Bricker i sur.

2012; Claver i Quaglia 2009; Hadji-Azimi i sur. 1987). Zanimljivo je kako kod gmazova i

ptica aktivnost mijeloperoksidaza postoji u neutrofilima, ali ne i u heterofilima (Claver i

Quaglia 2009). To bi moglo značiti kako su ipak neutrofili glavni fagociti za razliku od

heterofila.

Kisela fosfataza (ACP, engl. acid phosphatase) aktivna je u većini hematopoetskih

stanica sisavaca. Može pomoći kod identifikacije razvojnih stadija stanica i vrsta limfocita.

Jaku aktivnost ACP pokazuju makrofagi, dok nešto slabiju plazma stanice, megakariociti i

monociti. Slabe reakcije imaju neutrofili, mijelociti i promijelociti (Chronolab 2012a). ACP je

aktivna kod eozinofila i heterofila ptica (Claver i Quaglia 2009) te u svim leukocitima ribe M.

peelii peelii (Shigdar i sur. 2009). Kod vodozemaca u dostupnoj literaturi nije testirana

aktivnost ovog enzima.

RASPRAVA

57

Kloroacetat esteraza specifična je esteraza prisutna u svim leukocitima ribe M. peelii

peelii, osim monocita (Shigdar i sur. 2009). Kod žaba aktivna je u monocitima te u

neutrofilima R. catesbeiana (Bricker i sur. 2012).

Zanimljivo je kako u dostupnoj literaturi nema citokemijskih analiza azurofila.

Što se tiče fiksacije ugljikohidrata, varira ovisno o tome što se želi očuvati. Ako se

proučava glikogen, koji je topiv u vodi, treba se izbjegavati formalin, makar je moguće sa

puferiziranim formalinom. Način fiksacije ovisi koje strukture želimo očuvati. Ako su u

pitanju lipidi, osmijev tetraoksid pokazao se dobrim fiksativom, dok formaldehid (CH2O),

alkohol i aceton nisu dobar izbor jer otapaju lipide. Sa druge strane alkohol i aceton dobri su

izbor fiksacije kod ispitivanja aktivnosti enzima jer im ne narušavaju aktivnost, ali ni ne

fiksiraju proteine. Fiksacija također utječe na promjene pH stanica. Formalin radi lužnatije

uvjete koji mogu smanjiti broj kationa (npr. NH3+ grupa) za razliku od alkohola koji može

smanjiti broj anionskih skupina, poput fosfata u kromatinu (Bancroft i Gamble 2008).

Pozitivne i negativne kontrole nisu bile svugdje moguće, ali nisu ni bile nužno potrebne.

Za pozitivne kontrole koristili su se mišji uzorci, gdje se zna kako stanice izgledaju kod

pojedinih citokemijskih bojanja. Pozitivne kontrole citokemijskih tehnika također se vide u

specifičnom bojanju određenih stanica (npr. nespecifične esteraze koje bojaju monocite crno).

Primjećeni su različiti rezultati kod usporednih tretmana citokemijskim tehnikama

hibernirajućih i kontrolnih uzoraka P. ridibundus. Hibernirajući uzorci (korišteni za

uhodavanja protokola) reagirali su očekivano na fiksaciju formalinom kod sudan black B

tehnike za razliku od kontrolnih. To bi moglo indicirati na drukčiju membransku strukturu.

Kod alcian blue tehnike primjećeno je kako se jezgre hibernirajućih uzoraka slabije boje nego

kod kontrolnih. To bi moglo značiti kako imaju kompaktniju jezgru, moguće zbog smanjenje

transkripcije uslijed stanja mirovanja. Na ovome bi se mogla raditi genomska istraživanja, čak

i epigenetska kako bi se utvrdilo što točno uzrokuje ove promjene. Ostali rezultati nisu se

značajno razlikovali od kontrolnih uzoraka korištenih u ovom radu. Također, bilo bi

informativno imati citokemijske analize ostalih žaba i usporediti ih na evolucijskoj skali, što

bi moglo dati uvid o mogućoj evoluciji i adaptaciji enzima.

Dobiveni rezultati mogli bi se sagledati i sa filogenetskog stajališa koje bi sigurno

rasvjetlilo mnoga pitanja iz ovog rada.

ZAKLJUČAK

58

6. ZAKLJUČAK

Brojnost eritrocita i leukocita Pelophylax ridibundus te vrijednost hematokrita nalazi se

u rasponu ostalih žaba. Najveći udio leukocita redom čine limfociti, neutrofili, eozinofili,

monociti dok je udio baozfila najmanji.

Morfologija i dimenzije eritrocita i leukocita, sa manjim razlikama, odgovaraju onima

opisanim kod ostalih žabljih vrsti. Leukociti s najvećim prosječnim promjerom su monociti,

zatim slijede neutrofili, bazofili, eozinofili te veliki i mali limfociti. Svi neutrofili i eozinofili

imaju segmentiranu jezgru koja može biti centralno i acentrično smještena. Monociti i

leukociti imaju ekscentričnu nesgmentiranu jezgru, koja je ponekad u monocitima

nepravilnog oblika. Bazofili imaju centralnu nesegmentiranu jezgru koja može biti zaklonjena

zbog citoplazmatskih granula.

Citokemijskim analizama pokazanao je kako nije lako identificirati pojedini tip

leukocita. Limfociti se boje alcijanskim modrilom (AB), metodom Schiffove baze i perjodne

kiseline (PAS) i sudanskim crnilom B (SBB) te ponekad pokazuju aktivnost nespecifičnih

esterazi (NSE). Neutrofili se boje jedino SBBom, ponekad ABom i PASom. Monociti uvijek

pokazuju aktivnost nespecifičnih esterazi, boje se ABom, SBBom i ponekad PASom.

Eozinofili nemaju aktivne NSE. Boje se SBBom, PASom i ponekad ABom. Bazofili su

negativni na alfa-naftil acetat esterazu (ANAE), bojaju se SBBom, ali nisu pronađeni kod AB,

alfa-naftil butirat esteraze (ANBE), alkalne fosfataze (ALP) i PAS metode. Jezgra svih

eritrocita boji se ABom. U citoplazmi nezrelih i zrelih eritrocita postoji slabo obojenje

SBBom. Na ostale metode ne reagiraju. Stari eritrociti se ne boje niti jednom metodom.

Trombociti se boje SBBom, slabo ABom i PASom te ponekad pokazuju aktivnost ANAE.

Niti jedna stanica nije pozitivna na ALP.

Azurofili i heterofili nisu opisani što ne isključuje mogućnost njihovog postojanja.

LITERATURA

59

7. LITERATURA

Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. (1994): Molecular Biology of

the Cell. 3.izdanje. Garland Publishing.

Arserim S.K., Mermer A. (2008): Hematology of the Uludağ Frog, Rana macrocnemis

Boulenger, 1885 in Uludağ National Park (Bursa, Turkey). E.U. Journal of Fisheries &

Aquatic Sciences 25: 39-46.

Ashhurst D.E. (1956): Red Blood-Cell Antigens in some lower Vertebrates. The Journal of

Experimental Biology 33: 249-255.

Baker J.R. (1956): Improvements in the Sudan Black Technique. Quarterly Journal of

Microscopical Science 97: 621-623.

Bancroft J.D., Gamble M. (2008): Theory and practice of histological techniques. 6. izdanje.

Edinburgh: Churchill Livingstone.

Bayliss High O.B. (1981): The histochemical versatility of Sudan Black B. Acta Histochem

Suppl. 24: 247-55.

Bricker N.K., Raskin R.E., Densmore C.L. (2012): Cytochemical and immunocytochemical

characterization of blood cells and immunohistochemical analysis of spleen cells from 2

species of frog, Rana (Aquarana) catesbeiana and Xenopus laevis. Vet Clin Pathol 41: 356-61.

Christie R.M. (2001): Colour Chemistry. 1.izdanje. The Royal Society of Chemistry.

Chronolab (2012a): Acid phosphatase. http://www.chronolab.com/hematology/5_3_3.htm;

pristupljeno 27.9.2012.

Chronolab (2012b): Alkaline phosphatase.

http://www.chronolab.com/hematology/5_3_1.htm; pristupljeno 27.9.2012.

Chronolab (2012c): Alpha- naphtyl- acetate- esterase.

http://www.chronolab.com/hematology/5_3_2.htm; pristupljeno 27.9.2012.

Chronolab (2012d): Myeloperoxidase. http://www.chronolab.com/hematology/5_3.htm;


Claver i Quaglia J.A., Quaglia A.I.E. (2009): Comparative Morphology, Development, and

Function of Blood Cells in Nonmammalian Vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine 18:

87-97.

LITERATURA

60

Cornell University College of Veterinary Medicine (2010): Blood types.

http://ahdc.vet.cornell.edu/clinpath/modules/coags/bldtype.htm; pristupljeno 3.1.2013.

Davis A.K. (2011): Amphibian Leukocyte Profiles.

http://wildlifehematology.uga.edu/Amphibians/index.htm; pristupljeno 5.10.2012.

Desai S.P. (2006): Laboratorijske pretrage u kliničkoj medicini, praktični pristup. 1.izdanje.

Placebo.

Dönmez F., Tosunoğlu M., Gül C. (2009): Hematological values in hermaphrodite, Bufo bufo

(Linnaeus, 1758). North-Western Journal of Zoology 5: 97-103.

Dugdale D.C. (2011): Blood differential, A.D.A.M. Medical Encyclopedia.

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003657.htm; pristupljeno 8.1.2013.

Feidantsis K., Anestis A., Vasara E., Kyriakopoulou-Sklavounou P., Michaelidis B. (2012):

Seasonal variations of cellular stress response in the heart and gastrocnemius muscle of the

water frog (Pelophylax ridibundus). Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol 162: 331-

339.

Fominykh A.S., Liapkov S.M. (2011): The formation of new characteristics in life cycle of

the marsh frog (Rana ridibunda) in thermal pond conditions. Zh Obshch Biol 72: 403-421.

Green M.R., Pastewka J.V. (1974): Simultaneous differential staining by a cationic

carbocyanine dye of nucleic acids, proteins and conjugated proteins II Carbohydrate and

sulfated carbohydrate-containing proteins. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry

22: 774-781.

Gül C., Tosunoğlu M., Erdoğan D., Özdamar D. (2011): Changes in the blood composition of

some anurans. Acta Herpetologica 6: 137-147.

Guyton A.C., Hall J.E. (2006): Textbook of Medical Physiology. 11. izdanje. Elsevier

Saunders.

Hadji-Azimi I., Coosemans V., Canicatti C. (1987): Atlas of adult Xenopus laevis

hematology. Developmental and comparative immunology 11: 807-874.

Horobin R., Kiernan J. (2002): Conn's Biological Stains: A Handbook of Dyes, Stains and

Fluorochromes for Use in Biology and Medicine. 1. izdanje. Williams & Wilkins.

IHC World (2011a): Gill's Hematoxylin Protocol.

http://www.ihcworld.com/_protocols/counterstain_solutions/gill_hematoxylin.htm;


LITERATURA

61

IHC World (2011b): Mayer's Hematoxylin Protocol.

http://www.ihcworld.com/_protocols/counterstain_solutions/mayer_hematoxylin.htm;

pristuupljeno 10.10.2012.

IHC World (2011c): Nuclear Fast Red Counterstain Protocol.

http://www.ihcworld.com/_protocols/counterstain_solutions/nuclear_fast_red.htm;


IHC World (2011d): PAS (Periodic Acid Schiff) Staining Protocol.

http://www.ihcworld.com/_protocols/special_stains/pas.htm; pristupljeno 20.9.2012.

Keusch P. (2012): Schiff's Reagent, Objective: Test for Aldehydes. http://www.uni-

regensburg.de/Fakultaeten/nat_Fak_IV/Organische_Chemie/Didaktik/Keusch/D-ald_add-

e.htm; pristupljeno 14.1.2013.

Kiernan J.A. (2008): Histological and Histochemical Methods. 4. izdanje. Scion Publishing

Ltd.

Knotková Z., Doubek J., Knotek Z., Hájková P. (2002): Blood Cell Morpholody and Plasma

Biochemistry in Russian Tortoises (Agrionemys horsfieldi). Acta Vet. Brno 71: 191-198.

Kumar G.L., Kiernan J.A (2010): Education Guide Special Stains and H & E. 2. izdanje.

Dako North America.

Lester V. K., Taropley H. L., Latimer K.S. (2005): Small Mammal Hematology: Leukocyte

Identification in Rabbits and Guinea Pigs.

http://www.medirabbit.com/EN/Hematology/Cells/Leukocyte.htm; pristupljeno 12.1.2013.

Lisičić D. (2005): Hematologija poskoka, Vipera ammodytes (Serpentes, Viperidae).

Magistarski rad. Biološki odsjek, Prirodoslovno-matematičkoga fakulteta Sveučilišta u

Zagrebu

Lowe (1998a): Alcian Blue, Histopathology, University of Nottingham.

http://www.nottingham.ac.uk/pathology/protocols/alcblue.html; pristupljeno 26.9.2012

Lowe (1998b): Alkaline Phosphatase, Histopathology, University of Nottingham.

http://www.nottingham.ac.uk/pathology/protocols/alkphos.html; pristupljeno 27.9.2012.

Lowe (1998c): Periodic Acid, Schiffs, University of Nottingham.

http://www.nottingham.ac.uk/pathology/protocols/pas.html; pristupljeno 26.9.2012.

LITERATURA

62

Marracci S., Michelotti V., Guex G.D., Hotz H., Uzzell T., Ragghianti M. (2011): RrS1-like

sequences of water frogs from Central Europe and around the Aegean Sea: chromosomal

organization, evolution, possible function. J Mol Evol. 72 : 368-382.

Nelson, D.L., Cox M.M. (2008): Lehninger Principles of Biochemistry. 5 .izdanje. W.H.

Freeman and Company.

Pendl H. (2006): Morphological changes in red blood cells of birds and reptiles and their

interpretation. Israel journal of veterinary medicine 61: 1-13.

Piršljin J., Milinković Tur S. (2009): Diferencijalna krvna slika.

http://www.vef.unizg.hr/org/physio/files/diferencijalna_krvna_slika.pdf; pristupljeno

14.11.2012.

Reagena (2003): May-Grünwald-Giemsa Staining Solutions.

http://www.reagena.fi/www/en/products/pdf/instructions/MGG_eng.pdf; pristupljeno

19.12.2012.

Reece M. . (2012): Physiology of Self Renewal.

http://www.medicalsciencenavigator.com/physiology-of-self-renewal; pristupljeno 11.1.2013.

Santa Cruz Biotechnology (2012): Product book Basic Fuchsin (CAS 632-99-5).

http://www.scbt.com/datasheet-203731-basic-fuchsin.html; pristupljeno 6.1.2013.

Shigdar S., Cook D., Jonest P., Harford A., Ward A.C. (2007): Blood cells of Murray cod

Maccullochella peelii peelii (Mitchell). Journal of Fish Biology 70: 973–980.

Shigdar S., Harford A., Ward A.C. (2009): Cytochemical characterisation of the leucocytes

and thrombocytes from Murray cod (Maccullochella peelii peelii, Mitchell). Fish & Shellfish

Immunology 26: 731-736.

Sigma- Aldrich (2006): Naphthol AS-D Chloroacetate Esterase and α- Napthyl Acetate

Esterase (Procedure No.90).

http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/General_Information/1/91.Par.0001.F

ile.tmp/90.pdf ; pristupljeno 24.9.2012.

Stains File (2012a): Carazzi's Alum Hematoxylin.

http://stainsfile.info/StainsFile/stain/hematoxylin/aluminum/carazzi.htm; pristupljeno

10.10.2012.

Stains File (2012b): Hematoxylin & Hematein.

http://stainsfile.info/StainsFile/dyes/75290.htm; pristupljeno 8.1.2013.

LITERATURA

63

Stains File (2012c): Lysochromes. http://stainsfile.info/StainsFile/theory/lysochrm.htm;


Strober W. (2001): Wright-Giemsa and nonspecific esterase staining of cells. Curr Protoc

Immunol. App. 3C. doi: 10.1002/0471142735.ima03cs21.

Usmanova N.M., Litvinchuk S.N., Kazakova E.A., Kazakov V.I. (2010): Variation of BM224

microsatellite in green frogs of the genus Rana. Tsitologiia 52: 858-862.

Venkat C. (2010): Myelodysplastic syndrome. http://updates.clltopics.org/2126-

myelodysplastic-syndrome; pristupljeno 12.1.2013.

Vetlab (2013): Natt & Herrick's Stain for Direct counting of Avian and Reptilian Blood Cells.

http://www.vetlab.com/Natt%20&%20Herricks%20Procedure.pdf; pistupljeno 13.1.2013.

WebPath (2012): Anatomy-Histology Tutorials

http://library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/MANUALS/SUDANF.PDF, pristupljeno

18.9.2012.

Weiss D. J. i Wardrop K. J. (2010): Schalm's Veterinary Hematology. 6. izdanje. Wiley-

Blackwell.

Wilson S., Felt S., Torreilles S., Howard A., Behan C., Moorhead R., Green S. (2011): Serum

Clinical Biochemical and Hematologic Reference Ranges of Laboratory-Reared and Wild-

Caught Xenopus laevis. J Am Assoc Lab Anim Sci (50): 635-640.

Documents

Diferencijalna i citokemijska analiza krvnih stanica zelene žabe … · 2018-04-17 · Kod embrija sisavaca hematopoeza počinje u žumanjčanoj vreći (gdje se stvaraju eritrociti