Định Tính Salmonella

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

Tên đề tài:

ĐỊNH TÍNH SAMONELLA TRONG THỰC PHẨM

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

Lớp: 02ĐHTP1

Nhóm: 4

TÊN THÀNH VIÊN THAM GIA:

1. Nguyễn Thị Tố Linh 20051102522. Nguyễn Thị Hiền 20051101673. Giảng Thị Mộng Thu 20051105324. Đỗ Thị Mỹ Duyên 20051100875. Lê Thị Hằng 2005110104

Tp.HCM , ngày 14 tháng 5 năm 2014

GVHD: Nguy n Th Kim Oanhễ ịĐ tài: Đ nh tính Samonella trong th c ph mề ị ự ẩ

MỤC LỤC

BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC...................................................................................3

MỞ ĐẦU.............................................................................................................................5

NỘI DUNG..........................................................................................................................5

1.1. Lịch sử phát hiện....................................................................................................6

1.2. Phân loại Salmonella theo loài và theo kiểu huyết thanh.......................................6

1.3. Đặc điểm................................................................................................................9

1.3.1. Đặc điểm chung và đặc điểm nuôi cấy............................................................9

1.3.2. Tính chất hóa sinh...........................................................................................9

1.3.3. Cấu trúc của Salmonella................................................................................10

1.3.4. Yếu tố độc lực...............................................................................................12

1.3.4.1. Nội độc tố - Endotoxin...........................................................................12

1.3.4.2. Độc tố đường ruột...................................................................................13

1.3.4.3. Độc tố tế bào...........................................................................................14

1.3.5. Cơ chế gây bệnh............................................................................................14

1.3.5.1. Cơ chế gây bệnh thương hàn..................................................................15

1.3.5.2. Cơ chế gây nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn.....................................17

1.3.6. Nguồn gốc lây nhiễm.....................................................................................17

1.3.7. Tình hình nhiễm Salmonella trong nước và trên thế giới..............................18

1.3.7.1. Trên thế giới............................................................................................18

1.3.7.2. Trong nước.............................................................................................19

1.3.8. Các chỉ tiêu về Salmonella trong thực phẩm.................................................19

2.1. Phương pháp truyền thống :.................................................................................20

2.1.1. Giai đoạn tiền tăng sinh (pre – enrichment)..................................................21

2.1.2. Giai đoạn tăng sinh chọn lọc (selective enrichment).....................................21

2.1.3. Giai đoạn phân lập (isolation).......................................................................22

2.1.4. Khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa.......................................................23

2


2.2. Phương pháp hiện đại :.........................................................................................23

2.2.1. Phương pháp PCR.........................................................................................24

2.2.2. Phương pháp ELISA.....................................................................................27

2.2.3. Các biện pháp kiểm soát Salmonella trong thực phẩm.................................28

3.1. Nguyên tắc...........................................................................................................29

3.1.1. Dụng cụ và thiết bị........................................................................................30

3.1.2. Môi trường và hóa chất.................................................................................30

3.1.3. So sánh môi trường SPW và BPW................................................................32

3.2. Phương pháp thực hiện.........................................................................................33

3.2.1. Tăng sinh.......................................................................................................34

3.2.2. Tăng sinh chọn lọc.........................................................................................34

3.2.3. Phân lập và nhận diện....................................................................................35

3.2.4. Khẳng định....................................................................................................36

3.2.5. Khẳng định Salmonella bằng kháng huyết thanh..........................................40

TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................41

3


BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC

Họ và tên Công việc Đánh giá Chữ kí

1. Nguyễn Thị Tố Linh

- Tìm kiếm tài liệu- Làm word- Thuyết trình

Tích cực

2. Nguyễn Thị Hiền

- Tìm kiếm tài liệu- Làm word- Thuyết trình

Tích cực

3. Giảng Thị Mộng Thu

- Tìm kiếm tài liệu- Làm powerpoint- Thuyết trình Tích cực

4. Đỗ Thị Mỹ Duyên- Tìm kiếm tài liệu- Thuyết trình Tích cực

5. Lê Thị Hằng

- Tìm kiếm tài liệu- Thuyết trình Tích cực

4


MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày càng trở nên cấp thiết,

các báo cáo cho thấy phần lớn các vụ ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật. Đã có nhiều

cảnh báo, nhưng tình trạng ngộ độc thực phẩm vẫn đang leo thang và ngày càng nghiêm

trọng.

Có rất nhiều vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm, ví dụ như Clostridium butolinum,

Escherichia Coli, Listeria monocytogenes… trong đó, Salmonella là loài vi sinh vật gây

ngộ độc rất nguy hiểm. Salmonella thuộc họ Enterobactriaceae, gây ra bệnh thương hàn,

nhiễm trùng huyết và nhiều bệnh nghiêm trọng khác.

Xuất phát từ nhu cầu tìm hiểu về độc tố, khả năng gây bệnh và cách phát hiện

cũng như cách phòng phòng chống bệnh vi khuẩn Salmonella, chúng tôi thực hiện nghiên

cứu đề tài “định tính samonella trong thực phẩm” để có cái nhìn tổng quan hơn về vi

khuẩn Salmonella và một số chủng vi sinh vật khác.

5


NỘI DUNG

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN VỀ SALMONELLA

1.1. Lịch sử phát hiện

Năm 1885 Slamon và Smith (Mỹ) tìm được Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả và gọi tên là Bacilus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella. Nhưng sau đó Schweinittz và Dorset 1903 đã chứng minh bệnh dịch tả là do một loại vi rút gây nên và đã xác định S.choleraesuis là vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn.

Năm 1888 A.Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách người bệnh, ông gọi vi khuẩn này là Bacillus enteritidis và ngày nay vi khuẩn này được gọi là S.enteritidis. Vi khuẩn này cũng được gọi bằng nhiều tên khác như: Bacterium enteritidis, Bacillus gartner…

Năm 1889 Klein phân lập được S.gallinarum và Rettger cũng đã phân lập được S.pullorum năm 1909. Trước đây người ta cho rằng đây là hai loại vi khuẩn gây ra hai bệnh khác nhau lên đã gọi chung là bệnh phó thương hàn gà (Typhus avium) và căn bệnh có tên chung là S.gallinarum–pullorum.

Năm1896 C.Archard và Rbensauded đã phân lập được vi khuẩn S.paratyphi equi và S.paratyphi bacilus. Ngày nay vi khuẩn này được gọi tên là S.paratyphi Bvà đến năm 1898,S.paratyphi Ađã tìm được do N.Guyn và H Keyser.

Vi khẩn Salmonella

6

GVHD: Nguy n Th Kim Oanhễ ịĐ tài: Đ nh tính Samonella trong th c ph mề ị ự ẩ1.2. Phân loại Salmonella theo loài và theo kiểu huyết thanh.

- Về phân loại khoa học Salmonella được xếp vào:

Giới : Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gramma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Giống:Salmonella lignieres1900

Các loài điển hình:

Salmonella typhi: Gây bệnh thương hàn

Hinh 1.2. Vi khuân Salmonella typhi

Salmonella cholera_suis: Gây bệnh nhiễm trùng máu

7


Hinh 1.3. Vi khuân Salomonella cholera_suis

Salmonella entertidis: Gây rối loạn tiêu hóa

Hinh 1.4. Vi khuân Salmonella entertidis

Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng của chúng như S.typhi hay S.paratyphi A, B, C (typhoid = bệnh thương hàn, para = phó), hoặc theo vật chủ như S.typhimurium gây bệnh ở chuột,về sau người ta thấy rằng 1 loài Salmonella có thể gây ra nhiều hội chứng và có thể phân lập được ở nhiều loài khác nhau. Vì những lý do đó mà các chủng Salmonella mới phát hiện được đặt tên theo nơi mà nó được phân lập như S.teheran,S.congo,S.london.

Hiện nay theo phân loại của hệ thống Viện Pasteur thế giới, Trung tâm Kiểm soát và ngăn ngừa dịch bệnh của Mỹ CDC (Control and Prevent Disease Center), giống Salmonella được chia làm hai loài: S. enterica và S. bongori. Trong đó S. bongori gồm tất cả các kiểu huyết thanh (serotype) của loài phụ số V, và S. enterica được chia làm 6 loài phụ đánh số: I, II, IIIa, IIIb, IV và VI .Các loài và loài phụ này có thể phân biệt được bằng phản ứng sinh hóa. Trong mỗi loài phụ có nhiều kiểu huyết thanh.

Cho đến nay đã xác định được trên 2463 kiểu huyết thanh thuộc giống Salmonella. Theo hệ thống của Kauffman White, các kiểu huyết thanh này được chia dựa trên kháng nguyên thân O, kháng nguyên tiêm mao H và kháng nguyên bề mặt Vi. Phần lớn các kiểu huyết thanh được đặt tên theo công thức kháng nguyên, một số khác được đặt tên riêng như Enteritidis (S. enteritidis), Typhi (S. typhi), Paratyphi (S. paratyphi), Typhimurium (S. typhimurium)…

Bảng phân loại Salmonella theo loài và theo kiểu huyết thanh

8


Loài Loài phụ Số kiểu huyết thanhS. enterica

S. bongori

S. enterica enterica (I)S. enterica salamae (II)S. enterica arizonae (IIIa)S. enterica diarizonae (IIIb)S. enterica houtenae (IV)S. enterica indica (VI)

(V)

14544899432432412

20

Loài phụ S. enterica I hầu như chiếm đa số (99%), nó được tìm thấy ở hầu hết các động vật máu nóng. Loài phụ này chiếm 59% (1454/2463) trong tổng số kiểu huyết thanh của Salmonella có khả năng xâm nhập và gây nhiễm cao cho người và động vật máu nóng, trong khi đó các loài phụ khác hầu như ở động vật máu lạnh và môi trường. Như vậy có tới 41% (1009/2463) số kiểu huyết thanh không được phân lập từ bệnh phẩm của người, đây là một tỉ lệ rất có ý nghĩa để các cơ quan chức năng xem xét và sữa đổi các tiêu chuẩn hiện hành về Salmonella trong thực phẩm tạo điều kiện thuận lợi cho các nhà sản xuất tiêu thụ thực phẩm.

1.3. Đặc điểm

1.3.1. Đặc điểm chung và đặc điểm nuôi cấy

Salmonella là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy ý kích thước trung bình từ 0,5-3 µm, di chuyển bằng tiên mao trừ S. gallimarum và S. pullorum, không tạo bào tử, chúng phát triển tốt ở nhiệt độ 60C – 45,60C, thích hợp nhất ở 370C, phát triển trong pH 4.1- 9.0. Ở nhiệt độ từ 180C – 400C vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày.

Salmonella phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ. Có thể mọc trên những môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate).Trong đó môi trường XLD ít chất ức chế hơn nên thường được dùng để phân lập Salmonella.

Khẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường này là tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen, đôi khi tâm đen lớn bao trùm khẩn lạc,môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ.

9

GVHD: Nguy n Th Kim Oanhễ ịĐ tài: Đ nh tính Samonella trong th c ph mề ị ự ẩ1.3.2. Tính chất hóa sinh

Salmonella lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose, lactose, salicin và inositol, không sinh indole, không phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S,sử dụng được citrate ở môn trường Simmons.

Tuy nhiên không phải loài Salmonella nào cũng có những tính chất trên, các ngoại lệ được xác định là S.typhi lên men đường glucose không sinh hơi, không sử dụng citrate trong môi trường Simmon, hầu hết các chủng S.paratyphi và S.Cholerasuis không sinh H2S, khoảng 5% các chủng Salmonella sinh độc tố sinh bacteriocin chống lại E.Coli, Shigella và ngay cả 1 số chủng Salmonella khác.

1.3.3. Cấu trúc của Salmonella

Salmonella có ba loại kháng nguyên, đó là những chất khi xuất hiện trong cơ thể thì tạo ra kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiệu với những sản phẩm của sự kích thích đó, gồm: kháng nguyên thân O, kháng nguyên tiên mao H và kháng nguyên vỏ K. Vi khuẩn thương hàn (S.typhi) có kháng nguyên Vi (Virulence) là yếu tố chống thực bào giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu.

- Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O). Thành phân cơ bản là vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp. Trong cùng là

một lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và tới lớp màng ngoài (outer membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và lipopolysaccharide.

Bao bên ngoài lớp peptidoglycan là lớp phospholipid A và B (quyết định độc tố của Nội độc tố), sau đó là hai lớp polysaccharide không mang tính đặc hiệu. Kháng nguyên của nội độc tố có bản chất hóa học là lypopolysaccharide (LPS). Tính đặc hiệu của kháng nguyên O và LPS là một, nhưng tính miễn dịch thì khác nhau : kháng nguyên O ngoài LPS còn bao gồm cả lớp peptidoglycan nên tính sinh miễn dịch của nó mạnh hơn LPS. Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dày khoảng 8- 10 nm gồm 3 thành phần : Lipid A, polysaccharide lõi, kháng nguyên O. Màng ngoài còn có thêm các protein: Protein cơ chất: porin ở vi khuẩn còn gọi là protein lỗ xuyên màng với chức năng cho phép một số loại phân tử đi qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vô cơ. Protein màng ngoài: chức năng vận chuyển một số phân tử riêng biệt và đưa qua màng ngoài. Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài .

10


Kháng nguyên tiên mao (kháng nguyên H) - Kháng nguyên H: Chỉ có ở các Salmonella có lông. Hầu hết Salmonella đều có lông chỉ trừ S.galilarum, S.pulorum gây bệnh cho gia cầm. Kháng nguyên H là một loại kháng nguyên có bản chất là protit, kém bền hơn kháng nguyên O. Kháng nguyên H rất dễ bị phá huỷ ở nhiệt độ cao hoặc xử lý bằng cồn, axit yếu.

Kháng nguyên H chia làm 2 phase : Phase 1: Có tính chất đặc hiệu gồm có 28 loại kháng nguyên lông được biểu thị

bằng chữa số La tinh thường: a, b, c… Phase 2: Không có tính chất đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với các loại khác

đôi khi thành phần này có thể gặp ở E.coli. Pha 2 gồm có 6 loại được biểu thị bằng chữa số Ả Rập 1-6 hay chữa số La Tinh e, n, x…

Kháng thể kháng kháng nguyên H ngưng kết vi khuẩn bởi các roi của chúng. Sự ngưng kết này sẽ tạo thành những mảng kết tụ, chúng có thể bị tách bởi các yếu tố có khả năng cắt roi của vi khuẩn.

Kháng nguyên H không có tác dụng gây bệnh, không gây miễn dịch, nó đặc hiệu cho các loài vi khuẩn dựa vào kháng nguyên H để phân loại bằng phương pháp huyết thanh.- Kháng nguyên vỏ K

Kháng nguyên K: là kháng nguyên nằm ngoài kháng nguyên O và là nơi biểu hiện độc tố, được cấu tạo bởi polysaccharide của vỏ ngoài vách tế bào, thường kết hợp với tính gây độc chuyên biệt cho vật chủ. Nó ức chế sự biểu hiện của kháng nguyên O khi nó phát triển nhiều, ổn định với nhiệt độ, cồn và HCl.

Không phức tạp, có một kháng nguyên vỏ là kháng nguyên Vi và cũng có ở 2 type huyết thanh S.typhi và S.paratyphi. Kháng nguyên Vi-angtigen được Felix và các cộng sự phát hiện năm 1935. Kháng nguyên Vi gây hiện tượng ngưng kết chậm và xuất hiện các hạt vỏ, kháng nguyên Vi là kháng nguyên vỏ bao bọc bên ngoài kháng nguyên O, khánh nguyên Vi không tham gia vào quá trình gây bệnh.

11


Vị trí của các kháng nguyên của Salmonella

1.3.4. Yếu tố độc lực

Vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố: Ngoại độc tố và nội độc tố. - Nội độc tố của Salmonella rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét, độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật. - Ngoại độc tố chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, rồi lại cấy truyền như vậy từ 5 đến 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có khả năng gây bệnh cho động vật thí nghiệm. Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kỵ khí. Ngoại độc tố tác động vào thần kinh và ruột.

1.3.4.1. Nội độc tố - Endotoxin

Màng ngoài tế bào vi khuẩn gram âm nói chung và vi khuẩn Salmonella nói riêng, được cấu tạo bởi thành phần cơ bản là lipopolysaccharide (LPS). LPS có cấu tạo phân tử lớn, gồm 3 vùng riêng biệt với đặc tính và chức năng riêng biệt: Vùng ưa nước, vùng lõi và vùng lipit A.

Vùng ưa nước bao gồm một chuỗi polysaccharide chứa các đơn vị cấu trúc kháng nguyên O. Vùng lõi có bản chất là acid heterooligosaccharide, ở trung tâm nối kháng nguyên O với vùng lipit A. Vùng lipit A đảm nhận chức năng nội độc tố của vi khuẩn. Cấu trúc nội độc tố gần giống cấu trúc của kháng nguyên O. Cấu trúc nội độc tố biến đổi sẽ dẫn đến sự thay đổi độc lực của Salmonella.

12


Nội độc tố thường là lipopolysaccharide (LPS) được phóng ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải. Trước khi thể hiện độc tính của mình, LPS cần phải liên kết với các yếu tố liên kết tế bào hoặc các receptor bề mặt các tế bào như: Tế bào lâm ba cầu B, lâm ba cầu T, tế bào đại thực bào, tiểu thực bào, tế bào gan, lách.Rất nhiều các cơ quan trong cơ thể chịu sự tác động của nội độc tố LPS: Gan, thận, cơ, hệ tim mạch, hệ tiêu hoá, hệ thống miễn dịch; với các biểu hiện bệnh lý: Tắc mạch máu, giảm trương lực cơ thiếu oxy mô bào, toan huyết, rối loạn tiêu hoá, mất tính thèm ăn…

Nội độc tố tác động trực tiếp lên hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ, kích thích hình thành kháng thể.

- LPS tác động lên các tếbào tiểu cầu, gây sốt nội độc tố, theo cơ chế : Giải phóng các chất hoạt động mạnh như: Histamin. Ngưng kết các tiểu cầu động mạch. Đông vón, tắc mạch quản.

- LPS tác động lên quá trình trao đổi gluxit: LPS làm tăng cường hoạt lực của các men phân giải glucoz, các men phân giải glycogen, làm giảm hoạt lực các men tham gia quá trình tổng hợp glycogen…

1.3.4.2. Độc tố đường ruột

Về cơ chế miễn dịch và di truyền các Enterotoxin của Salmonella có quan hệ gần gũi với Choleratoxin, nên được gọi là Choleratoxin like enterotoxin (CT). Còn về đặc tính sinh học Enterotoxin của Salmonella không chỉ với giống CT mà còn giống với Enterotoxin của E.Coli.

Độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính: Độc tố thẩm xuất nhanh Rapid permeability facto (RPF) và độc tố thẩm xuất chậm Delayed permeability facto (DPF).

RPF giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của ruột, nó thực hiện khả năng thẩm xuất sau 1-2 giờ và kéo dài 48 giờ và làm trương các tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell). Độc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc, thành phần giống với độc tố chịu nhiệt của E.Coli, được gọi là độc tố chịu nhiệt của Salmonella. ST có khả năng chịu được nhiệt độ 1000C trong 4 giờ, bền vững ở nhiệt độ thấp, có thể bảo quản ở nhiệt độ -20oC. Cấu trúc phân tử gồm một chuỗi polysaccharide và một chuỗi polypeptide.

RPF kích thích co bóp nhu động ruột, làm tăng sự thẩm thấu thành mạch, phá huỷ tổ chức tế bào biểu mô ruột, giúp vi khuẩn Salmonella xâm nhập vào tế bào và phát triển tăng nhanh về số lượng. Vi khuẩn tích cực tăng cường sản sinh độc tố làm rối loạn cân

13

GVHD: Nguy n Th Kim Oanhễ ịĐ tài: Đ nh tính Samonella trong th c ph mề ị ự ẩbằng trao đổi muối, nước và chất điện giải. Quá trình bệnh lý đường ruột và hội chứng tiêu chảy càng thêm phức tạp và nghiêm trọng.

DPF của Salmonella có cấu trúc, thành phần giống độc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E.Coli, nên được gọi là độc tố không chịu nhiệt của Salmonella. Nó thực hiện chức năng phản ứng chậm từ 18-24 giờ. LT bị phá huỷở 700C trong vòng 30 phút vàở 560C trong vòng 4 giờ. LT có cấu trúc gồm 3 chuỗi polypeptid.

DPF làm thay đổi quá trình trao đổi nước và chất điện giải, dẫn đến tăng cường bài xuất nước và chất điện giải từ mô bào vào lòng ruột, cản trở sự hấp thu, gây thoái hoá lớp tếbào villi của thành ruột, gây tiêu chảy.

1.3.4.3. Độc tố tế bào

Khi cơ thể người và động vật bị tiêu chảy thì kèm theo hiện tượng mất nước và mất chất điện giải là hiện tượng hàng loạt các tế bào biểu mô ruột bị phá huỷ hoặc bị tổn thương ở các mức độ khác nhau. Sự phá huỷhay tổn thương đó là do độc tố tế bào củaSalmonella gây nên, theo cơ chế chung là:Ức chếtổng hợp protein của tế bào Eukaryotic và làm trương tế bào CHO.

Ít nhất 3 dạng độc tố của tế bào:

- Dạng thứ nhất: Không bền vững với nhiệt và mẫn cảm với trypsin. Dạng này được phát hiện ở rất nhiều serovar Salmonella; có trọng lượng phân tử trong khoảng từ 56 đến 78 kDa; không bị trung hoà bởi kháng thể kháng độc tố Shigella toxin hoặc Shigella - like. Độc tố dạng này tác động theo cơ chế là ức chế tổng hợp protein của tế bào Hela và làm teo tế bào. - Dạng thứ hai: Có nguồn gốc từ protein màng ngoài tế bào vi khuẩn có cấu trúc và chức năng gần giống các dạng độc tố tế bào do Shigella và các chủng (ETEC) sản sinh ra. Dạng độc tố này cũng phổ biến ở hầu hết các serovar Salmonella gây bệnh. - Dạng thứ ba: Có trọng lượng phân tử khoảng 62 kDa; có liên hệ với độc tố Hemolysin. Hemolysin liên hệ với các độc tố tế bào có sự khác biệt với các Hemolysin khác về trọng lượng phân tử và phương thức tác động lên tế bào theo cơ chế dung giải các không bào nội bào.

1.3.5. Cơ chế gây bệnh

Salmonella có thể gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện đến mức cả triệu tế bào trong một gram thực phẩm. Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn. Thời gian ủ bệnh kể từ khi tiêu thụthực phẩm bị nhiễm cho đến khi các

14

GVHD: Nguy n Th Kim Oanhễ ịĐ tài: Đ nh tính Samonella trong th c ph mề ị ự ẩtriệu chứng được biểu hiện là 12 – 36 giờ. Triệu chứng ngộ độc thường kéo dài từ 2 – 7 ngày. Không phải tất cả mọi người khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễmSamonella đều bị ngộ độc. Các loại thực phẩm có nguy cơ bị nhiễmSamonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và các sản phẩm từ trứng, thủy sản. Nguồn gây nhiễm các loại thực phẩm này thường là phân người và động vật, được nhiễm gián tiếp hay trực tiếp. Đặc biệt nguy hiểm cho người là các loàiSamonella typhi, S.paratyphi A, B, C gây sốt thương hàn.

Các chủng Salmonella và các biểu hiện bệnh thường gặp

1.3.5.1. Cơ chế gây bệnh thương hàn

Bệnh thương hàn do S.typhi và S.paratyphi A, B, C gây ra. Các yếu tố độc lực chính của vi khuẩn thương hàn là khả năng bám và xâm nhập vào tế bào chủ, khả năng nhân lên trong đại thực bào và nội độc tố. Kháng nguyên Vi có mặt ở S.typhi và S.pararatyphi C là yếu tố độc lực quan trọng, những chủng vi khuẩn gây bệnh thương hàn không có kháng nguyên Vi thì số lượng cần thiết để gây bệnh cao hơn rấtnhiều so với những chũng có kháng nguyên này.

Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa do thức ăn hay nước uống bị nhiễm bẩn, số lượng cần thiết để gây bệnh vào khoảng 10 5 đến 10 7

Đầu tiên, vi khuẩn thương hàn phải vượt qua môi trường axit của dạ dày, mặc dù chúng có khả năng đề kháng với axit nhờ có gen art (acid response tolerance), nhưng ở người bình thường, vi khuẩn thương hàn không thể tồn tại lâu, nuôi cấy dịch dạ dày âm

15

GVHD: Nguy n Th Kim Oanhễ ịĐ tài: Đ nh tính Samonella trong th c ph mề ị ự ẩtính sau 30 phút. Sau khi vượt qua được rào cản ở dạ dày, vi khuẩn di chuyển xuống ruột non rồi nhân lên ở đó, nhưng trong tuần đầu sẽ có 1 ít vi khuẩn đào thải theo phân, cấy phân dương tính trong 5 ngày không có nghĩa là bệnh thương hàn sẽ xảy ra. Từ ruột non, vi khuẩn thương hàn đi vào hạch mạc treo ruột nhờ tế bào M, một đại thực bào của mảng Peyer. Sau đó theo đường bạch huyết và máu gây nhiễm trùng toàn thân. Sau khoảng một tuần, nhiễm khuẩn huyết thứ phát xuất hiện. Vi khuẩn theo gan qua đường mật lại tiếp tục xâm nhập vào ruột non, tiếp tục nhân lên ở các mảng Peyer. Từ máu, vi khuẩn tới lách và các cơ quan khác. Trong ruột non, vi khuẩn chết và giải phóng ra nội độc tố. Nội độc tố kích thích dây thần knh giao cảm ở ruột gây ra hoại tử chảy máu và có thể gây thủng ruột, vị trí gây tổn thương thường nằm ở các mảng Peyer. Đây là biến chứng hay gặp ở cá bệnh nhân ăn sớm khi chưa bình phục, nhất là ăn các thức ăn cứng. Nội độc tố theo máu lên hệ thần kinh và kích thích trung tâm thần kinh thực vật ở não thất ba. Giai đoạn toàn phát bệnh, bệnh nhân sốt cao, biểu đồ thân nhiệt tăng lên theo thởi gian. Thân nhiệt tăng những nhiệt độ không tăng gây ra hiện tượng mạch và nhiệt độ phân ly.

Thời kì chưa có điều trị bằng kháng sinh, khoản một tuần ủ bệnh, diễn biến điển hình của bệnh thương hàn trải qua 4 giai đoạn, mỗi giai đoạn khoảng một tuần, Tuần thứ nhất thân nhiệt tăng cao, tuần thứ hai thì đau bụng, gan và lách to dồng thời có sự xuất hiện của các đốm hồng trên da, tuần thứ 3 có thể xuất hiện thêm các biến chứng như xuất huyết, thủng ruột, tuần thứ 4 sẽ xuất hiện thêm các biến chứng nguy hiểm dẫn đến tử vong, nếu không bệnh nhân sẽbình phục.

16


Bệnh nhân thường đau đầu, buồn nôn hoặc nôn, chướng bụng, tiêu chảy, khoảng 50% bệnh nhân sờ thấy gan và lá lách dưới sườn. Những trường hợp nặng thường có dấu hiệu ly bì, hôn mê, trụy tim mạch, không chữa trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong. Những biến chứng khác như viêm phổi cấp, viêm màng não, viêm gan, viêm tủy xương cũng có thể gặp.

Những bệnh nhân qua khỏi có khoảng 5 – 10% vẫn tiếp tục thải vi khuẩn qua phân trong quá trình hồi phục và 1- 4% trở thành người mang vi khuẩn lâu dài do vi khuẩn vẫn tồn tại trong túi mật. Tình trạng này có thể kéo dài đến nhiều năm và họ trở thành nguồn mang bệnh rất nguy hiểm.

1.3.5.2. Cơ chế gây nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn

Bênh thường xảy ra do ăn phải thức ăn bị nhiễm Salmonella, nhưng cũng có thể lây truyền trực tiếp. Căn nguyên thường do vi khuẩn S.enteritidis và S.typhimurium.

Vi khuẩn xâm nhập qua ruột non nhờ các tế bào M của mảng Peyer. Trên bộ gen của Salmonella có các tác nhân gâyức chế các chất kháng khuẩn có trong lysosome, biến đổi tế bào chủ đảm bảo cho sự tồn tại của vi khuẩn, làm cản trở hoạt động nội bào như giảm lượng NADH oxidase rất cần thiết cho việc sản xuất các hợpchất kháng khuẩn.

Sự hủy hoại của đại thực bào và các tế bào biểu mô lân cận, sự chết của vi khuẩn giải phóng nội độc tố đã gây nên tổn thương cho cơ thể vật chủ và gây ra các triệu chứng.

Thời gian ủ bệnh trung bình từ 10 – 48 giờ. Sau thời gian ủ bệnh, người nhiễm thường có biểu hiện như sốt, nôn, đau bụng và tiêu chảy. Mức độ sốt khác nhau tùy vào thể trạng từng người, tiêu chảy phân thường không có máu. Ở người lớn thường chỉ dẫn đến tình trạng rối loạn đường tiêu hóa, nhưng ở trẻ sơ sinh thường gây ra nhiễm trùng rất nặng, có thể dẫn đến tình trạng nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não và viêm xương. Ở những người khỏe mạnh, nhiễm trùng do nhiễm độc thức ăn thường tự khỏi sau 2-5 ngày rồi tự khỏi.

1.3.6. Nguồn gốc lây nhiễm

Các sản phẩm thịt nói chung, nhất là thịt gia cầm và thịt lợn. Tất cả các thức ăn tươi sống có nguồn gốc động vật đều có thể là nguồn vi khuẩn Salmonella. Vi khuẩn này sống tự do trong ruột động vật và có trên lông. Gia cầm có nhiều Salmonella nhất, tiếp theo là các động vật nuôi trong nhà và động vật hoang (vẹt, rùa, chó, ếch, chim mông biển, loài gặm nhấm, rắn). Vi khuẩn này có thể có trong thành phần dẫn xuất các chất từ

17

GVHD: Nguy n Th Kim Oanhễ ịĐ tài: Đ nh tính Samonella trong th c ph mề ị ự ẩđộng vật như gelatin hoặc nước bọt động vật, bởi côn trùng, loài gặm nhấm, chim hoặc các sản phẩm thịt nhiễm khuẩn gây nhiễm vào thực phẩm.

Ngoài ra có thể bị nhiễm từ người khỏe mạnh có mang vi khuẩn này. Thực phẩm có nguồn gốc thực vật ít có nguy cơ nhiễm khuẩn. Vì lí do bị ức chế bởi pH < 4 và có mặt vi khuẩn lactic nên các sản phẩm lên men ít bị nhiễm. Trứng và các sản phẩm trứng ví dụ như bột nhào, nước sốt mayonnaise, protit đông tụ tách từ sữa, gia cầm là nguồn mang nhiều Salmonella, nên trứng của nó cũng bị nhiễm vì vi khuẩn này có thể xuyên qua vỏ trứng và sinh sản trong lòng đỏ trứng.

Các sản phẩm sữa như sữa không thanh trùng, phomát từ sữa tươi, kem chất béo sữa, và các sản phẩm từ sữa nói chung được chế biến từ các nông trại, các thiết bị đều có thể gây nhiễm vào nguyên liệu, tạo môi trường thuận lợi choSalmonella, và từ đó gây nhiễm độc cho sản phẩm sữa. Nếu tiến hành axit hóa chậm thì vi khuẩn dễ dàng sinh sản trong phomát nhưng nó bị phá hủy với pH < 4,5. Những sản phẩm có sữa phải được giám sát chặt chẽ bởi chúng không được thanh trùng nữa, vì vậy nếu cóSalmonella trong sữa bột thì chúng vẫn có thể sinh sản được bởi chúng có khả năng tồn tại ở điều kiện khô hạn và lây nhiễm sang các sản phẩm khác

1.3.7. Tình hình nhiễm Salmonella trong nước và trên thế giới

1.3.7.1. Trên thế giới

Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở châu Âu giảm đều đặn từ những năm 1990 trở lại đây, trong năm 2007 có khoảng 152.000 ca nhiễm Salmonella trên người được phát hiện, sự sai lệch của báo cáo này là rất lớn, số lượng thực tế rất có thể gấp 10 lần như thế. Ở Mỹ, tình trạng có khá hơn, ổn định ở mức 15 ca trên 100.000 người từ năm 2001 do kiểm soát tốt Salmonella trong thực phẩm từ năm 1990, bao gồm các thực phẩm sữa, trứng, nước trái cây, sản phẩm tươi sống, rau, bánh kẹo, và đặc biệt là thịt. Một đợt dịch gần đây ở Mỹ gây ra bởi S.typhimurium nhiễm trong bơ đậu phộng đã gây ảnh hưởng đến hơn 700 người trên khắp nước Mỹ

Từ tháng 7/2009 tới nay, số ca nhiễm khuẩn Salmonella được phát hiện ở Mỹ đã tăng lên 184 người, thuộc 38 bang khác nhau. Cơ quan y tế của nước này vẫn chưa xác định nguyên nhân chính xác khiến số ca nhiễm khuẩn Salmonella tăng nhanh như vậy. Tuy nhiên, mới đây các chuyên gia y tế của bang Oregon cho rằng nguồn lây lan vi khuẩn Salmonella từ các sản phẩm xúc xích.Vừa qua, các cơ quan điều tra Mỹ đã thu hồi hơn 560 tấn xúc xích do nghi bịnhiễm vi khuẩn Salmonella, tất cả số lượng này đều do Công ty Daniele International sản xuất.Tuy nhiên, ông Jason Maloni, phát ngôn viên của công

18

GVHD: Nguy n Th Kim Oanhễ ịĐ tài: Đ nh tính Samonella trong th c ph mề ị ự ẩty này khẳng định: “Chưa có bằng chứng nào chứng minh các sản phẩm xúc xích của chúng tôi bị nhiễm vi khuẩn Salmonella”. Sự bùng nổ của số ca nhiễm khuẩn Salmonella ở khu vực tây bắc Thái Bình Dương đã khiến các cơ quan điều tra nghi ngờ rằng nguồn gây bệnh cho ổ dịch này là từ các sản phẩm xúc xích sau khi họ phát hiện rất nhiều người ăn xúc xích mua tại các cửa hàng ở khu vực này bị nhiễm khuẩn Salmonella. Các nhân viên điều tra tại bangWashington cũng cho biết 14 bệnh nhân bị nhiễm khuẩn Salmonella ở bang này, đã từng ăn xúc xích của hãng Daniele. Ngoài ra, các chuyên gia y tế khẳng định họ đã kiểm tra và phát hiện khuẩn Salmonella có trong các mẫu xúc xích của công ty này. Hiện tại, các nhân viên điều tra liên bang Mỹ vẫn đang làm việc để tìm ra nguyên nhân chính xác gây ra dịch nhiễm khuẩn Salmonella ở nước này. Vì thế, họ vẫn chưa thể kết luận sản phẩm xúc xích của Công ty Daniele có phải là nguồn lây bệnh chính hay không. Vì thế, những sản phẩm xúc xích của công ty này bị thu hồi là do kiểm tra bịnhiễm khuẩn Salmonella.

1.3.7.2. Trong nước

Theo ông Nguyễn Công Khẩn, Cục trưởng Cục ATVSTP cho biết, hiện nay, mạng lưới kiểm nghiệm ATVSTP đã được hình thành rộng khắp trong cả nước nhưng thực tế năng lực kiểm nghiệm nhiều chỉ tiêu về an toàn thực phẩm tại các địa phương vẫn rất hạn chế. Trong 330 mẫu hoa quả có tới 2,7% số mẫu có tỷ lệ tồn dư thuốc bảo vệ thực vật cao, nhất là ở táo đỏ, quýt và lê. Đặc biệt, trong số 1.416 mẫu thịt và sản phẩm từ thịt đã phát hiện tới 40,9% số mẫu nhiễm khuẩn Salmonella gây ra các bệnh về đường tiêu hóa. Hơn nữa, khu vực TP Hồ Chí Minh và Đồng Nai là những địa phương có tỷ lệ mẫu thực phẩm nhiễm Salmonella cao nhất, chiếm từ 84- 95% mẫu được giám sát.

1.3.8. Các chỉ tiêu về Salmonella trong thực phẩm

Hầu hết các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của Việt Nam cũng như các nước trên thế giới đều không cho phép sự có mặt của Salmonella trong thực phẩm. Vì vậy các phương pháp phân tích Salmonella là quy trình định tính trong một lượng mẫu thực phẩm nhất định. Sự hiện diện của chúng được kiểm tra gắt gao bởi các cơ quan chức năng. Theo tiêu chuẩn cho phép vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm của Bộ Y tế 4/1998, quy định không chấp nhận sự hiện diện của Salmonella trong 25 g hay 25 ml đối với tất cả các loại thực phẩm. Theo thông tư đã ban hành số 01/2000/TT – BYT của Bộ Y tế đối với thực phẩm sản xuất trong nước thì chỉ tiêu Salmonella bắt buộc phải kiểm tra đối với tất cả các loại thực phẩm .Ủy Ban Châu Âu quy định không được phát hiện Salmonella /25 g trong bất kỳ loại thực phẩm nào.

19


Theo phương pháp truyền thống việc phát hiện Salmonella bao gồm những bước như tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, các thử nghiệm sinh hóa và cuối cùng là thử nghiệm huyết thanh, tính chung mất khoảng 7 ngày để có kết quả.Hiện nay đã có nhiều nỗ lực để rút ngắn thời gian phát hiện Salmonella bằng những phương pháp như thử nghiệm ELISA, và thử nghiệm DNA. Việc khẳng định kết quả âm tính trong vòng 48 giờ đã là chuyện bình thường. Tuy nhiên một khi mẫu có khả năng dương tính, cần tiến hành các thao tác truyền thống để khẳng định sự có mặt của Salmonella.

Trong các yêu cầu về vi sinh đối với thực phẩm, Salmonella là một chỉ tiêu đặc biệt nhạy cảm, do tính chất gây bệnh của một số kiểu huyết thanh của Salmonella.

Yêu cầu của kiểm tra bắt buộc đối với Salmonella trong các loại thực phẩm theo Thông tư 01/2000/TT-BYT của Bộ Y tế

CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN

SALMONELLA

2.1. Phương pháp truyền thống :

Phát hiện Salmonella bằng phương pháp nuôi cấy: Đây là phương pháp định tính và kết quả được báo cáo là có hay không phát hiện Salmonella trên lượng mẫu được kiểm nghiệm. Do quy định không cho phép có mặt trong thực phẩm nhưng lại khó phát hiện,

20

GVHD: Nguy n Th Kim Oanhễ ịĐ tài: Đ nh tính Samonella trong th c ph mề ị ự ẩcho nên mẫu lấy tối thiểu phải 25g và quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải có thêm giai đoạn tiền tăng sinh để đạt hiệu quả cao. Điều này cần thiết vì Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương nặng qua quá trình bảo quản chế biến và sự tồn tại một số lượng lớn các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae, những vi khuẩn này sẽ cạnh tranh hay ức chế sự phát triển của Salmonella.

Để phát hiện Salmonella cần tiến hành bốn giai đoạn: tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Việc khẳng định dựa trên các kết quả thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh phù hợp.

2.1.1. Giai đoạn tiền tăng sinh (pre – enrichment)

Đây là khâu quan trọng không thể thiếu trong quy trình kiểm nghiệm đối với mẫu kiểm nghiệm không phải là mẫu bệnh phẩm. Người ta thường sử dụng môi trường tiền tăng sinh không chọn lọc, giàu dinh dưỡng, không chứa các chất ức chế đặc hiệu tạo điều kiện cho sự phục hồi sức sống và tăng trưởng của nhiều vi sinh vật hiện diện trong mẫu đã bị tổn thương trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm.

Ví dụ: nước peptone đệm Buffered Peptone Water (BPW) là môi trường tiền tăng sinh được khuyến khích sử dụng trong môi trường kiểm tra nhiều loại vi sinh vật gây bệnh thuộc họ Enterobacteriaceae; riêng FDA của Mỹ thì thường sử dụng Lactose broth cho một số nhóm thực phẩm.

Tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu cần chọn quy trình tiền tăng sinh phù hợp. Thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi trường tiền tăng sinh là 1:9, tuy nhiên tùy trường hợp cụ thể tỉ lệ này có thể thay đổi.

2.1.2. Giai đoạn tăng sinh chọn lọc (selective enrichment)

Giai đoạn này làm tăng mật độ Salmonella so với các vi sinh vật khác bằng cách ức chế hoặc ngăn chặn sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật khác, tạo thuận lợi cho việc phát hiện vi khuẩn này trong bước phân lập.

Các môi trường tăng sinh chọn lọc cho Salmonella thường được dùng là Rappaport Vassiliadis (RV), Tetrathionate Mueler Kauffman Broth (TT), Selenite Cystein Broth (SC) …Thông thường môi trường TT được dùng để phân tích các loại mẫu có thành phần chính là những loại thịt tươi sống, các mẫu có mật độ nhiễm vi sinh vật cao, các loại thức ăn gia súc, hay các loại thực phẩm khác.

21


Một vài nghiên cứu gần đây của AOAC (Association of Official Analytical Communities - Hiệp hội các nhà phân tích của Mỹ) cho rằng mặc dù môi trường Selenite Cystein Broth có chứa selenite ức chế mạnh các vi khuẩn khác ngoại trừ Salmonella nhưng muối sodium biselenite có thể gây ưng thư khi tiếp xúc với cơ thể người nên hạn chế sử dụng và thấy rằng môi trường RV có thể thay thế cho các loại môi trường trên để phân tích mẫu. Canh RV có tác dụng ức chế vi khuẩn khác nhờ vào MgCl2 bằng cách tác động lên thành tế bào vi khuẩn và nhờ vào màu xanh malachite ức chế các vi khuẩn Gram dương .

Cần lưu ý là không môi trường tăng sinh chọn lọc nào là môi trường tối ưu chung cho tất cả các dòng Salmonella. Mỗi loại môi trường tăng sinh chọn lọc được thiết lập dựa trên một số đặc điểm phát triển khác nhau của Salmonella, một số dòng Salmonella tăng trưởng được trong môi trường này nhưng lại không tăng trưởng được trong môi trường khác. Ví dụ: S. typhi không phát triển được trong môi trường RV và TT; S. dublin không phát triển được trong môi trường RV. Ngoài ra, mỗi môi trường chọn lọc được ủ ở một nhiệt nuôi cấy khác nhau như môi trường RV được ủ ở 420C, môi trường TT và SC được ủ ở 370C trong 22 – 24 giờ.

Ngày nay, các yêu cầu về vệ sinh thực phẩm đều khuyếch khích các phòng thí nghiệm sử dụng ít nhất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc Salmonella để tăng cường khả năng phát hiện tất cả các serotype Salmonella trong mẫu.

2.1.3. Giai đoạn phân lập (isolation)

Đây là bước tách biệt Salmonella trong canh khuẩn ra khỏi quần thể của chúng. Một số môi trường phân lập như Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLD), Bismuth Suffite Agar (BSA), Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose Agar (BGLS), Hektoen Entric Agar (HE)…Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái khuẩn lạc của Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau.

Một số đặc điểm chính của các môi trường trên là với sự hiện diện của nấm men, đường, peptone tạo thuận lợi cho sự tăng trưởng Salmonella và Shigella yếu ớt. Sự sản sinh ra H2S cũng có thể xảy ra nhờ sự hiện diện của sắt thiosufate và sắt citrate đã thể hiện bởi những khuẩn lạc có tâm đen do sự tạo nên sulfua sắt. Trên các môi trường phân lập khác nhau Salmonella sẽ cho các kiểu khuẩn lạc đặc trưng khác nhau. Trên môi trường XLD: khuẩn lạc màu hồng tròn, trong suốt, có hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có khả năng sinh H2S, trừ S. typhi thì khuẩn lạc trong suốt và không có tâm đen.

22


Trên môi trường BSA: khuẩn lạc Salmonella có màu nâu xám hay đen, có hay không có ánh kim tím trên bề mặt khuẩn lạc, môi trường xung quanh có màu nâu chuyển sang đen khi tăng thời gian ủ ấm, gây khó khăn cho việc nhận biết khuẩn lạc vi khuẩn Salmonella. Một số chủng có thể sinh khuẩn lạc màu lục với môi trường xung quanh ít nhiều có màu đen.

Trên môi trường BPLS: khuẩn lạc Salmonella điển hình trong suốt và hơi đỏ trong môi trường, có màu đỏ hồng xung quanh khuẩn lạc. Một số Salmonella xuất hiện khuẩn lạc màu lục trong suốt nếu bao quanh là vi khuẩn lên men lactose hoặc glucose gây ra vùng đó màu vàng xanh hoặc xanh; dưới 1% Salmonella không điển hình, chúng lên men đường lactose và xuất hiện khuẩn lạc vàng lục hoặc lục. [9, 37] Trên môi trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu xanh dương đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen. Một số loài Salmonella có thể phát triển thành khuẩn lạc có các chấm màu đen bóng, lớn hay phần lớn các khuẩn lạc hoàn toàn có màu đen. Một cách điển hình, có mộ số ít loài Salmonella sinh ra khuẩn lạc màu vàng có hoặc không có tâm đen. [9, 20] Cũng như bước tăng sinh chọn lọc, việc sử dụng hai hay nhiều môi trường phân lập sẽ cho phép gia tăng sự phát hiện số lượng các kiểu huyết thanh khác nhau trong mẫu, trong đó môi trường XLD được khuyến khích sử dụng. Hơn nữa, qua các bước tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc và phân lập thì tế bào Salmonella bị già và suy thoái, vì vậy cần phải phục hồi chúng bằng một trong các môi trường như Tryticase Soya Agar (TSA) hay Brain Heart Infusion (BHI) để nhân sinh khối và được dùng tiếp cho các phản ứng sinh hóa và phản ứng ngưng kết kháng huyết thanh về sau

2.1.4. Khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa

Đây là bước xác nhận các dòng vi khuẩn nghi ngờ Salmonella trên môi trường phân lập bằng các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh đặc trưng. Các biểu hiện sinh hóa của Salmonella như sau: glucose (+), lactose (-), indol (+), lysine decarboxylase (+), ornithine decarboxylase (+), urea (-), mannitol (+), sorbitol (+). Nếu các biểu hiện sinh hóa phù hợp, chủng phân lập được khẳng định lại bằng các thử nghiệm ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá và H đa giá.

Vi khuẩn sau khi phục hồi được cấy chuyển sang các môi trường thử nghiệm sinh hóa nhằm xác định các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella.

2.2. Phương pháp hiện đại :

Phương pháp truyền thống mất khá nhiều thời gian (5 ngày) để cho ra kết quả, do đó người ta đã phát triển rất nhiều phương pháp thử nhanh để phát hiện Salmonella trong

23

GVHD: Nguy n Th Kim Oanhễ ịĐ tài: Đ nh tính Samonella trong th c ph mề ị ự ẩcác mẫu thực phẩm và mẫu nước trong thời gian ngắn, từ đó có biện pháp xử lý kịp thời đối với các mẫu nhiễm. Xu hướng sử dụng PCR và IMS thường được sử dụng. Phương pháp PCR giúp phát hiện nhanh; tuy nhiên dễ xảy ra hiện tượng âm tính giả, đòi hỏi các thao tác phải thành thạo. Multiplex PCR giúp tiết kiệm thời gian, số lượng mẫu và chi phí; tuy nhiên lại có độ nhạy kém hơn. Người ta đã phát triển thêm phương pháp Real Time PCR từ PCR truyền thống. Phương pháp này có độ nhạy rất cao, cho kết quả sớm hơn, không cần phải chạy điện di sau phản ứng khuếch đại. Phương pháp miễn dịch từ phân tách là một lựa chọn tốt hơn. Nó có độ nhạy cao (< 104 CFU/ml), thời gian ngắn (thí nghiệm được thực hiện trong 4-5 giờ).

Bên cạnh những kỹ thuật Sinh học phân tử cơ bản để phát hiện và định danh Salmonella, còn có những phương pháp khác, như: phương pháp miễn dịch (huyết thanh học, kỹ thuật ELISA, Western blot). Và đôi khi để tăng hiệu quả, độ tin cậy cho xét nghiệm người ta còn kết hợp nhiều phương pháp với nhau, ví dụ: IMS-PCR assay (Immunomagnetic Separation and Polymerase Chain Reaction) để phát hiện Salmonella trong thực phẩm.

2.2.1. Phương pháp PCR

- Nguyên tắc : Phương pháp định tính này dựa vào việc xác định đoạn ADN đích có được

khuếch đại hay không. Quá trình xác định được thực hiện bằng cách điện di sản phẩm khuếch đại trên gel agarose, nhuộm màu ADN bằng etyl bromua và quan sát bằng đèn UV có bước sóng là 302 mm. Nếu trong mẫu có gen đích, trên bảng gel điện di sẽ xuất hiện sản phẩm khuếch đại có kích thước phù hợp với độ dài của đoạn ADN đích đã định. Nếu trong mẫu không có gen đích, trên gel diện di không xuất hiện sản phẩm khuếch đại hay sản phẩm khuếch đại có kích thước không phù hợp với đoạn ADN đích. - Thiết bị, dụng cụ, hoá chất và môi trường

Thiết bị, dụng cụ :+ Tủ ấm 370C. + Máy luân nhiệt. + Máy ly tâm dùng cho ống eppendorf 1,5 ml. + Máy lắc ống nghiệm. + Thiết bị điện di ngang và bộ nguồn điện di có điện thế hoạt động từ 80 đế150 volt.+ Hộp đèn soi UV có kính lọc 302mm. + Bộ chụp ảnh trên đèn UV. + Ống Eppendorf 0,2. 0,5 ml; 1,5 ml chuyên dùng cho PCR. Hoá chất, môi trường:

24


Mồi gồm hai mồi invA1 và invA2 được thiết lập cách nhau 520 bp trong gen invA có vai trò trong quá trình xâm nhiễm Salmonella vào thành ruột động vật và người. Trình tự của hai mồi như sau :

invA1 :5' -TTGTTACGGCTATTTTGACCA -3' invA2 : 5' -CTGACTGCTACCTTGGCTGATG -3' Nồng độ mồi sử dụng trong phân tích được pha loãng thành 6 pM trong

đệm TE. Ðệm TE có thành phần như sau : 10 mM Tris-HCl (pH = 8), 1 mM EDTA. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật và các loại hoá chất khác : Khuyến khích sử dụng

môi trường nuôi cấy dạng bột khô và các vật liệu dùng cho phản ứng khuếch đại PCR được tổng hợp thành kit đang được lưu hành trên thị trường có thành phần phù hợp như. Quá trình pha chế, bảo quản, sử dụng phải tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trong trường hợp sử dụng các vật liệu hoá chất riêng lẻ, độ tinh khiết của các thành phần và nước pha chế phải đảm bảo chất lượng dùng cho vi sinh và sinh họcphân tử.

Thang DNA :Nên sử dụng thang đo phù hợp có thể ước lượng được đoạn khuếch đại 520 bp. Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 520 bp đã biết trước làm thang đo trong phương pháp này.

Agarose : Sử dụng trong kỹthuật này là loại dùng để điện di ADN có kích thước nhỏhơn 1000 bp.

- Phương pháp tiến hành Lấy mẫu : Cân chính xác 25 g mẫu (hoặc một khối lượng chính xác tuỳtheo yêu

cầu) rồi cho vào bình tam giác hoặc bao PE vô trùng. Tăng sinh : Nhằm làm tăng số lượngSalmonella trong mẫu, các tế bào bị suy yếu

hay tổn thương cũng được phục hồi và phát triển. Giai đoạn này được tiến hành trong môi trường không chọn lọc và trên nguyên tắc cứ một phần khối lượng mẫu sẽbổ sung9 phần khối lượng môi trường tăng sinh. Nếu lấy 25 g mẫu, phải bổ sung 225 g môi trường tăng sinh dung dịch pepton đệm. Ủ mẫu có môi trường tăng sinh ở nhiệt độ 37,0 o C 1,0 o C trong khoảng 18 giờ 2 giờ.

Xử lý mẫu giải phóng DNA : Giai đoạn này nhằm thu nhận sinh khối sau khi tăng sinh, rửa sạch môi trường sau khi nuôi cấy, phá vỡ tế bào để giải phóng DNA. Cách xử lý như sau:

Lắc đều canh khuẩn tăng sinh. Hút 0,5 ml vào trongống eppendorf có thể tích 1,5 ml, ly tâm với tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút rồi loại bỏ phần môi trường lỏng bên trên. Rửa sinh khối bên dưới với nước cất vô trùng rồi tiếp tục ly tâm với chế độ như trên để loại bỏ phần nước.

Huyền phù sinh khối trong ống với 0,5 ml nước cất vô trùng. Ðun sôi cách thuỷtrong 10 phút. Ly tâm huyền dịch sau khi đun với tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5

25

GVHD: Nguy n Th Kim Oanhễ ịĐ tài: Đ nh tính Samonella trong th c ph mề ị ự ẩphút để lắng các mảnh vỡ tế bào xuống đáy. Phần dịch trong bên trên được coi là khuôn DNA để tiến hành phản ứng khuếch đại.

Khuếch đại Giai đoạn này nhằm làm tăng số lượng bản sao đoạn DNA đícha trên máy luân

nhiệt (thermocycler) bằng hai mồi đặc trưng. Quá trình khuếch đại được tiến hành trong khoảng 30 chu kỳ.

Chuẩn bị ống khuếch đại :+ Hút 45 ml hỗn hợp khuếch đại PCR 1,1 x cho vào trong ống nghiệm PCR có thể

tích 0,2 hoặc 0,5 ml, thêm vào 1 ml mỗi mồi invA1 và invA2 có nồng độ 6 pM và 3 ml mẫu khuôn ADN. Tổng thể tích trong một ống khuếch đại là 50 ml.

+ Ðối chứng dương: thay dịch khuôn DNA mẫu bằng dịch ADN của Salmonella chuẩn đã biết.

+ Ðối chứng âm: thay dịch khuôn DNA mẫu bằng nước cất vô trùng. Chương trình khuếch đại Các ống khuếch đại được đặt vào trong máy luân nhiệt. + Chương trình khuếch đại như sau: Duy trì nhiệt độ 950C trong 5 phút để làm biến

tính hoàn toàn các sợi DNA trong mẫu. Tiếp theo là 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước như sau: 950C/60 giây; 540C/45 giây và 720C/60 giây. Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu được giữ ở nhiệt độ 720C trong 10 phút, sau đó giữ ổn định ở nhiệt độ 200C cho đến khi điện di.

26


Ðiện di sản phẩm khuếch đại + Chuẩn bị gel điện di agarose 1%+ Gel agarose 1 % pha trong đệm TAE 1x được đun chảy hoàn toàn và đổ vào khay

điện di đã có sẵn các lược để tạo giếng. Gel điện di phải có độ dày khoảng 3 - 4 mm. Gel sau khi chuẩn bị được ngâm chìm hoàn toàn trong đệm TAE.

+ Chuẩn bị dịch điện di + Mẫu sau khi khuếch đại được nhuộm với 10 ml đệm tải mẫu 6x rồi trộn thật đều. + Ðiện di:Một giếng trong gel điện di được sử dụng cho thang DNA chuẩn hay mẫu

đối chứng dương. Nạp 10 ml dịch điện di đã chuẩn bị vào trong gel agarose. Tiến hành điện di trong 60 phútở hiệu điện thế100 vôn.

Nhuộm DNA, quan sát sản phẩm khuếch đại + Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫu :Pha dung dịch nhuộm DNA như sau: cho 0,2 ml

etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5 lít nước, pha vào trong khay chứa có miệng rộng hơn bản gel điện di.

+ Nhuộm gel : Ngâm bản gel đã điện di vào dung dịch nhuộm trong 10 phút. Rửa gel bằng nước trong khoảng 3 - 5 phút để loại bỏ phần etyl bromua dư.

+ Quan sát, chụp hình :Cho bản gel đã nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn rồi quan sát các vạch sáng đỏ của DNA xuất hiện trên bản gel. Sau đó, chụp hình để lưu trữ kết quả.

- Ðọc và giải thích kết quả

27


Kết quả phân tích chỉ được xem xét kết luận khi mẫu đối chứng dương tính có sản phẩm khuếch đại DNA với kích tước 520 bp và mẫu đối chứng âm không có sản phẩm này.

Mẫu được kết luận là dương tính Salmonella khi có sản phẩm khuếch đại 520 bp trên bản gel.

Mẫu được kết luận là âm tính khi không có sản phẩm khuếch đại, haysản phẩm khuếch đại có kích thước khác hơn 520 bp.

2.2.2. Phương pháp ELISA

ELISA được sử dụng rộng rãi dưới dạng các kiểu thương mại và có thể cải tiến để tự động hóa. ELISA có thể sử dụng để phát hiện và định lượng vi sinh thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh. Kĩ thuật này có độ nhạy khoảng 106 CFU/ml. tuy nhiên vẫn phải thực hiện bước tăng sinh và tăng sinh chọn lọc trước khi thực hiện các phản ứng miễn dịch

Transia Salmonella (Diffchamb AB, Sweden) là 1 bộ kit phát hiện nhanh Salmonella spp. dựa trên nguyên tắc E sanwich. Khi hỗn hợp tăng sinh chọn lọc được cho vào giếng, nếu có sự hiện diện của vi sinh vật mục tiêu, kháng nguyên tiêm mao của vi sinh vật sẽ tạo phức hợp với kháng thể cố định trên giếng và kháng thể tự do có gắn enzyme peroxydase tạo thành 1 phức hợp kép (sanwhich). Sau đó các kháng thể có gắn enzyme ở dạng tự do không tạo phức hợp sanwhich sẽ bị rửa khỏi phản ứng. Phức hợp sanwihch sẽ được phát hiện nhờ sự bổ sung cơ chất của phản ứng (ure peroxide và teramethylbenzidine).Enzyme peroxide sẽ thủy phân cơ chất tạo phản ứng màu xanh dương. Phản ứng kết thúc bằng cách bất hoạt enzyme bằng dung dịch kết thúc làm acid hóa môi trường và lầm môi trường chuyển từ màu xanh sang màu vàng.Sự hình thành màu vàng chứng minh sự hiện diện của kháng nguyên hay vi sinh vật mục tiêu và mật độ màu của vi sinh vật có thể xác định được bằng cách đo cường độ màu bằng máy so màu

2.2.3. Các biện pháp kiểm soát Salmonella trong thực phẩm

Đối với gia súc và gia cầm: Trong chăn nuôi cần chú ý đề phòng bệnh tật cho chúng. Phải kiểm tra thú y khi giết súc vật, điều này càng làm tốt thì càng ít có cơ hội bán hoặc xuất ra các loại thịt đã nhiễm Salmonella. Trong khi giết thịt phải đảm bảo tính riêng rẽ, tránh sự lây lan của vi khuẩn, chú ý tới các loại dụng cụ dùng khi giết thịt .

28


Trong bảo quản thực phẩm, đảm bảo thời gian cất giữ thực phẩm đã chế biến và các nguyên liệu. Chú ý thịt băm, patê... thịt nghiền mà không ướp lạnh ngay sau đó sẽ tạo điều kiện cho toàn bộ khối nguyên liệu đó nhiễm trùng mau chóng.

Đun sôi thực phẩm trước khi ăn là biện pháp tốt nhất. Thịt đã ướp lạnh thời gian đun nấu phải kéo dài hơn bình thường, khi đun phải đảm bảo nhiệt độ sôi cả bên trong miếng thịt (ít nhất là 5 phút). Thực phẩm còn thừa, thực phẩm dự trữ phải đun lại trước khi ăn. Với trứng có thể bị nhiễm Salmonella rất sớm ngay khi mới đẻ (trứng vịt, ngan, ngỗng...), vì vậy phải chế biến chín hoàn toàn, tuyệt đối không ăn sống hoặc hồng đào.Bảo đảm vệ sinh nơi ăn, tránh ruồi, nhặng, chuột.

Thực hiện nghiêm ngặt chế độ khám tuyển trước khi vào và khám định kỳ (1 năm/1 lần) đối với người tiếp xúc trực tiếp với thực phẩm nhất là thực phẩm đã nấu chín.

CHƯƠNG 3: QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CỤ THỂ

3.1. Nguyên tắc

Salmonella có thể được phát hiện ( phân tích định tính ) bằng một quy trình bao gồm 4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Salmonella thường có mặt trong mẫu với một số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện chung với một số lượng lớn vi sinh vật thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella.

29

GVHD: Nguy n Th Kim Oanhễ ịĐ tài: Đ nh tính Samonella trong th c ph mề ị ự ẩ- Bước tăng sinh : tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu cần chọn quy trình tăng sinh phù hợp. Thông thường tỷ lệ giữa mẫu và môi trường tăng sinh là 1 : 9, tuy nhiên tùy trường hợp mà tỷ lệ này có thể thay đổi - Bước tăng sinh chọn lọc : Các môi trường tăng sinh chọn lọc thường dùng để phát hiện Salmonella trong các mẫu thực phẩm là Rappaport Vassiliadis (RV), Selenite Cystein Broth,Tetrathionate Mueler Kauffmanm Broth (TT )… Các nghiên cứu gần đây cho thấy môi trường RV có thể thay thế cho các môi trường khác để phân tích nhiều mẫu khác nhau. Tuy vậy, môi trường TT thường được dùng để phân tích các mẫu thịt tươi sống, các mẫu có mật độ nhiễm cao, các mẫu thức ăn gia súc… Hiện nay người ta khuyến khích là nên dùng ít nhất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc để phát hiện tất cả các serotype Salmonella nếu có hiện diện trong mẫu. - Bước phân lập : nhằm tách và nhận dạng Salmonella khỏi các quần thể vi sinh vật khác trong mẫu. Nhiều loại môi trường rắn khác nhau được sử dụng để phân lập Salmonella, mỗi môi trường giúp nhận dạng các giống của nhóm này dựa trên một vài đặc tính. Hiện nay, các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm khuyến khích sử dụng ít nhất 2 loại môi trường phân lập khác nhau để tăng cường khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella, đặc biệt là môi trường XLD được khuyến khích sử dụng - Bước khẳng định : nhằm xác định lại các khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella xuất hiện trên môi trường phân lập. Bước này dựa trên các thử nghiệm sinh hóa và các thử nghiệm huyết thanh đặc trưng cho Salmonella. Các thử nghiệm sinh hóa được khuyến khích sử dụng là KIA/TSI, indol, LDC (Lysine decarboxylase), ODC ( Ornithine decarboxylase ), urea, manitol, sorbitol, các thử nghiệm huyết thanh O và H đa giá. - Áp dụng tiêu chuẩn: TCVN 4829:05

3.1.1. Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ

Bình tam giác, cốc, ống đong hình trụ 50, 100, 500 ml, ống nghiệm, hộp đĩa petri, que cấy vòng, que cấy thẳng, đèn cồn, bao PE vô trùng, kéo cắt, pince kim loại, khay kim loại, lame, và bơm hút chân không.

Thiết bị

Cân phân tích, máy đo pH, máy dập mẫu,pipetman, kính hiển vi, nồi hấp autoclave, tủ sấy vô trùng, tủ cấy an toàn sinh học, tủ ấm 370C, và tủ lạnh

3.1.2. Môi trường và hóa chất

30


Hóa chất

Các loại kháng huyết thanh O đa giá, hỗn hợp OMA, OMB và kháng huyết thanh đơn giá như nhóm A, B, C, D, E. Các loại kháng huyết thanh này do Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh sản xuất. Các loại carbonhydrate như sorbitol, dulcitol. Cồn 70o, cồn 96o và nước cất.

Môi trường

Bao gồm những loại môi trường thông dụng để nuôi cấy, phân lập và khẳng định Salmonella trong thực phẩm:

Môi trường Buffered Pepton Water (BPW): được sử dụng để tiền tăng sinh Salmonella hiện diện trong mẫu. Thành phần môi trường gồm: peptone 10 g/l, NaCl 5 g/l, Na2HPO4.12H2O 9 g/l, KH2PO4 1,5 g/l, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, pH sau khi khử trùng là 7.

Môi trường Rapparport Vassiliadis broth (RV): được sử dụng để tăng sinh chọn lọc cho Salmonella. Thành phần môi trường như sau: peptone đậu nành 4,5 g/l, MgCl2.6H2O 29 g/l, NaCl 8 g/l, K2HPO4 0,6 g/l, malachite green oxalate 0,036 g/l, pH 5,5 0,2. Phân phối 10ml môi trường vào ống nghiệm. Hấp khử trùng ở 115oC trong 15 phút.

Môi trường Xylose Lysine Desoxycholate agar (XLD): được dùng để phân lập Salmonella. Thành phần XLD bao gồm: cao nấm men 3 g/l, L – Lysine HCl 5 g/l, xylose 3,75 g/l, lactose 7,5 g/l, sucrose 7,5 g/l, sodium desoxycholate 1 g/l, NaCl 5 g/l, Na2S2O5 6,8 g/l, ammonium ferrous (II) citrate 0,8 g/l, phenol red 0,8 g/l, agar 18 g/l, pH cuối là 7,4 0,2. Đun sôi môi trường, không hấp. Để nguội đến 50oC. Môi trường đỗ trên đĩa petri và để khô trước khi cấy.

Môi trường Tryptic Soya Agar (TSA): được sử dụng để bảo quản và phục hồi giống vi sinh vật trong quá trình thí nghiệm. Thành phần TSA gồm: tryptone 15 g/l, peptone đậu nành 5 g/l, agar 15 g/l. Đun nóng để hòa tan agar trong cốc bercher, phân phối vào các ống nghiệm khoảng 5 – 7 ml. Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, pH sau khi khử trùng là 7,3. Sau đó để nguội khoảng 50 – 60oC rồi để thạch nghiêng.

Môi trường Triple Sugar Iron Agar (TSI) gồm môi trường 1 có thành phần như sau: peptone 20 g/l, NaCl 5 g/l, lactose 10 g/l, sucrose 10 g/l, glucose 1 g/l, Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O 0,2 g/l, Na2S2O3 0,2 g/l, phenol red 0,025 g/l, agar 13 g/l và môi trường 2 gồm các thành phần như sau: cao thịt 3g/l, cao nấm men 3g/l, peptone 15g/l, proteose peptone 5 g/l, glucose 1 g/l, lactose 10 g/l, sucrose 10 g/l, FeSO4 0,2 g/l, NaCl 5 g/l, Na2S2O3 0,3 g/l, phenol red 0,024 g/l, agar 12 g/l. Phân phối vào các ống

31

GVHD: Nguy n Th Kim Oanhễ ịĐ tài: Đ nh tính Samonella trong th c ph mề ị ự ẩnghiệm, mỗi ống 7 ml. Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, sau đó đợi nguội khoảng 50 – 60oC để nghiêng phần thạch sâu ở đáy ống cao 2,5 cm.

Môi trường Mannitol phenol red broth: được sử dụng để thử nghiệm khả năng lên men đường mannitol của Salmonella. Thành phần môi trường bao gồm: peptone thịt 5 g/l, peptone đậu nành 5 g/l, mannitol 10 g/l, NaCl 5 g/l, phenol red 0,018 g/l, pH sau khi khử trùng là 7,4 0,2.

Môi trường Lysine Decarboxylate broth (LDC): được sử dụng để thử nghiệm khả năng sinh enzyme lysine decarboxylase của Salmonella. Thành phần môi trường như sau: peptone 5 g/l, cao nấm men 3 g/l, dextrose 1 g/l, L-Lysine HCl 10 g/l, ferric (II) ammonium citrate 0,5 g/l, Na2S2O5 0,04 g/l, bromocresol purple 0,016g/l, pH 6,7.

Môi trường Urea broth: được dùng để thử nghiệm khả năng thủy phân urea của Salmonella. Thành phần môi trường như sau: cao nấm men 0,1 g/l, KH2PO4 9,1 g/l, Na2HPO4 9,5 g/l, urea 20 g/l, phenol red 0,08 g/l, pH 6,8.

Môi trường Sorbitol phenol red broth: được sử dụng để thử nghiệm khả năng lên men đường sorbitol của Salmonella. Thành phần môi trường gồm có: peptone thịt 5 g/l, peptone đậu nành 5 g/l, sorbitol 10 g/l, NaCl 5 g/l, phenol red 0,018 g/l, pH sau khi thanh trùng là 7,4 0,2.

Môi trường Dulcitol phenol red broth: được sử dụng để thử nghiệm khả năng lên men đường dulcitol của Salmonella. Thành phần môi trường gồm có: peptone thịt 5 g/l, peptone đậu nành 5 g/l, dulcitol 10 g/l, NaCl 5 g/l, phenol red 0,018 g/l, pH sau khi thanh trùng là 7,4 0,2.

Môi trường Malonate broth: được sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng malonate của Salmonella. Thành phần môi trường bao gồm: ammonium sulphate 2 g/l, dipotassium phosphate 0,6 g/l, monopotassium phosphate 0,4g/l, sodium chloride 2 g/l, sodium malonate 3 g/l, bromthymol blue 0,025 g/l. Phân phối 3 ml vào các ống nghiệm. Hấp ở 115oC trong 10 phút. pH cuối 6,7 0,2.

Môi trường Lactose agar 1%: được sử dụng để cảm ứng tạo ra enzyme β - galactosidase dùng trong thử nghiệm ONPG. Thành phần môi trường như sau: lactose 10 g/l, peptone 5 g/l, cao thịt 3 g/l, NaCl 10 g/l, agar 15 g/l. Đĩa giấy ONPG: được sử dụng để thử nghiệm ONPG về khả năng tổng hợp enzyme - galactosidase. Mỗi đĩa được phân phối vào mỗi ống nghiệm chứa 0,5ml nước cất đã vô trùng. Đĩa giấy ONPG. được sản xuất bởi hãng Biorad dạng thương phẩm.

3.1.3. So sánh môi trường SPW và BPW

Tiêu chí so sánh BPW SPWThành phần môi trường NaCl 5g NaCl 1g

32


Pepton 10g Nước cất 1 lít Na2HPO4 3,5g KH2PO4 1,5g

Pepton 8,5g Nước cất 1 lít

Vai trò

Là môi trường tiềm tăng sinh không chọn lọc để phân lập samollena từ thực phẩm

Là môi trường dùng để pha loãng mẫu.

Cơ chế

Cung cấp dinh dưỡng cho quá trình hồi phục các tế bào bị tổn thương trong quá trình bảo quản thực phẩm.

pH sau khử trùng pH = 7.2± 0.2 pH = 7± 0.2Nhiệt độ và thời gian khử

trùngHấp áp lực 15 phút ở

nhiệt độ 121oCHấp áp lực 20 phút ở

nhiệt độ 121oC

Phạm vi sử dụng

Sử dụng trong môi trường kiểm tra nhiều loại vi sinh vật gây bệnh thuộc họ Enterobacteriaceae

Sử dụng trong các môi trường kiểm tra vi sinh vật hiếu khí, coliforms, E.coli, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus.

Điều kiện bảo quản sau khi hấp khử trùng

Môi trường được bảo quản mát ở 45oC trong bể điều nhiệt

Môi trường được bảo quản mát ở 45oC trong bể điều nhiệt

3.2. Phương pháp thực hiện

33


3.2.1. Tăng sinh

Đối với các loại mẫu thông thường, tiến hành cân 25g mẫu vào túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu trong 15 hoặc 30 giây. Ủ ở 370C trong 18

34

GVHD: Nguy n Th Kim Oanhễ ịĐ tài: Đ nh tính Samonella trong th c ph mề ị ự ẩ– 24 giờ. Đối với một số loại mẫu có chứa các chất gây độc hoặc ức chế sự phát triển của Salmonella cần tiến hành quy trìnhđặc biệt :

- Đối với thịt gia cầm tươi sống : Đặt gia cầm vào một túi PE lớn, cho thêm 1 lít BPW, lắc bằng máy lắc 30 giây để môi trường thấm vào toàn bộ mẫu - Đối với mẫu sữa khô : Cân 25g mẫu vào túi PE vô trùng, cho thêm 225ml BPW, để yên ở nhiệt độ phòng khoảng 60 phút. Sau đó lắc cho tan hoàn toàn - Đối với các mẫu gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị : đồng nhất mẫu với tỷ lệ 1/100 trong BPW ( thay vì 1/10 như bình thường ) trước khi tăng sinh. Biện pháp này nhằm giảm nồng độ các chất ức chế sự tăng trưởng của Salmonella trong bước tăng sinh - Đối với các loại mẫu như casein, phomat, bơ và các sản phẩm tương tự khác : thực hiện dồng nhất mẫu trong môi trường tăng sinh đã được làm ấm đến 40 0 C - Đối với các sản phẩm chứa coca: đồng nhất mẫu trong môi - trường Skim Milk Broth được làm ấm đến 40 0 C - Đối với dừa, các sản phẩm từ dừa và các mẫu có hàm lượng chất béo cao: đồng nhất mẫu trong môi trường BPW, sau đó cho thêm 2– 3 giọt Triton X –100 trước khi ủ tăng sinh

3.2.2. Tăng sinh chọn lọc

Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, sau đó chuyển 0,1ml sang 10ml môi trường tăng sinh chọn lọc RV đã được ủ ấm đến 420C. Ủ ở 420C trong 18 – 24 giờ, khi cần thiết có thể kéo dài ủ thêm 24 giờ

Một số môi trường tăng sinh chọn lọc khác cũng được sử dụng, mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng chọn lọc dựa trên một đặc điểm phát triển của Salmonella, một số dòng chỉ có thể tăng trưởng trong môi trường này mà không thể tăng trưởng trong môi trường khác. Do vậy, để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella hiện diện trong thực phẩm cần phải dùng ít nhất hai loại tăng sinh chọn lọc khác nhau cho cùng một mẫu. Ngoài ra mỗi môi trường cần được ủ ở các nhiệt độ khác nhau

3.2.3. Phân lập và nhận diện

Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa môi trường phân lập đặc trưng cho Salmonella như XLD, HE, BS… Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái của khuẩn lạc Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau. Để chọn lọc và nhận dạng tất cả các dòng Salmonella cần sử dụng ít nhất hai loại môi trường chọn lọc phân biệt khác nhau

35

GVHD: Nguy n Th Kim Oanhễ ịĐ tài: Đ nh tính Samonella trong th c ph mề ị ự ẩcho cùng một mẫu. Các biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường khác nhau như sau - Môi trường XLD: khuẩn lạc tròn, lồi, trong suốt, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu hồng.

- Môi trường HE: khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đén quá lớn bao trùm khuẩn lạc.

36

GVHD: Nguy n Th Kim Oanhễ ịĐ tài: Đ nh tính Samonella trong th c ph mề ị ự ẩ- Môi trường BS: khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có ánh kim tím, môi trường chuyển thành màu nâu và sau đó chuyển sang màu đen nếu kéo dài thời gian ủ.

3.2.4. Khẳng định

- Từ mỗi môi trường phân lập cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc đặc trưng qua môi trường không chọn lọc như TSA. Ủ ở 370C trong 18 – 24 giờ. Các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường này được sử dụng cho các test sinh hóa và huyết thanh - Các thử nghiệm sinh hóa chính cần thực hiện cho Salmonella là: lên men glucose, urea, manitol, indol, H2S, VP, ODC, LDC, saccharose, sorbitol. - Các chủng Salmonella cho kết quả thử nghiệm như sau :

Thử nghiệm H2S (KIA hay TSI): Thử nghiệm khả năng lên men lactose, glucose và sinh khí H2S.

Về nguồn carbon, môi trường KIA chứa 2 loại đường là 1% lactose và 0.1% glucose. Khi cấy chủng vi sinh vật lên môi trường này có 3 trường hợp xảy ra đối với sự tăng trưởng của VSV: chỉ sử dụng glucose, sử dụng glucose và lactose, không sử dụng cả hai đường này. Salmonella chỉ lên men được đường glucose vì thế phần nghiêng của môi trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Thời gian ủ từ 18-24 giờ.

Về sinh hơi: đa số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường này. Có thể thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên trên tạo một khoảng không bên dưới đáy ống nghiệm.

37


Thử nghiệm KIA.

Ống 1: môi trường KIA không có VSV. Ống 2: xuất hiện màu vàng chứng tỏ VSV lên men lactose tốt (lên men glucose cũngtốt). Ống 3: có sinh khí, chứng tỏ lên men có sinh khí. Ống 4: màu đỏ trên phần thạch nghiêng, màu vàng dưới đáy chứng tỏ VSV chỉ lên men glucose. Ống 5: màu đen xuất hiện chứng tỏ có quá trình khử lưu huỳnh và sinh H2S. Thử nghiệm khả năng tổng hợp enzyme lysine decarboxylase (thử nghiệm LDC):

dùng que cấy vòng chuyển sinh khối từ môi trường TSA sang môi trường LDC broth. Ủ ở 37oC trong 24 giờ, Salmonella cho phản ứng kiềm có biểu hiện LDC dương tính khi môi trường có sinh khối và chuyển sang màu tím hoặc màu xanh.

38

GVHD: Nguy n Th Kim Oanhễ ịĐ tài: Đ nh tính Samonella trong th c ph mề ị ự ẩ Thử nghiệm urea : Dùng que cấy vòng lấy sinh khối từ môi trường TSA cấy

chuyển sang môi trường Urea phenol red. Ủ ở 370C trong 24 giờ, Salmonella không thủy giải urea nên không làm chuyển màu môi trường. Những vi sinh vật có phản ứng urea dương tính làm tăng pH môi trường nên sau khi nuôi cấy môi trường chuyển sang màu đỏ hồng.

Kết quả thử nghiệm urea Thử nghiệm VP (-):môi trường được sử dụng là môi trường lỏng Clark-Lubs (môi trường MR-VP), pH 6.9. Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ 18-24 giờ trên môi trường KIA. Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường. Thuốc thử Barritt gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn tuyệt đối, dung dịch B là 40% NaOH hay KOH. Trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4 giờ. Salmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP có hiện tượng không đổi màu trên bề mặt môi trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường.

39


Kết quả thử nghiệm VP(-)

Bảng biểu hiện đặc trưng củaSalmonella trong test sinh hóa

Thửnghiệm Môi trường Biểu hiện đặc trưng

H2S TSI/KIA Phần nghiêng đỏ, sâu vàng, nứt thạch và xuất hiện vạch đen

LDC LDC Không đổi màu

Urea Urea Không đổi màu

Manitol,sorbitol Manitol, sorbitol Bị acid hóa,môi trường chuyển sang màu vàng

Indol Trypton Không xuất hiện vòng đỏ khi nhỏ thuốc thử Kovac’s

VP VP Không đổi màu khi nhỏ α – napthol 5% và KOH 40%

40


3.2.5. Khẳng định Salmonella bằng kháng huyết thanh

Các thử nghiệm kháng nguyên cần được thử nghiệm song song với mẫu đối chứng bằng nước muối sinh lý để tránh hiện tượng ngưng kết giả. Hai loại huyết thanh đa giá cần dùng là Salmonella Polyvalent O và Salmonella Polyvalent H. Phản ứng (+) khi chủng thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh nhưng không ngưng kết với nước muối sinh lý

Thông thường tiến hành thử phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá và đơn giá để xác định chủng phân lập là Salmonella. Chia lame kính sạch làm hai phần: một phần nhỏ một giọi nước muối sinh lý để làm đối chứng âm và nhỏ một giọt huyết thanh. Lấy một ít sinh khối vi sinh vật từ môi trường TSA khuyếch tán vào giọt huyết thanh, làm tương tự với giọt nước muối sinh lý, tán đều. Chờ 30 – 60 giây quan sát trên nền đen, phản ứng ngưng kết kháng huyết thanh xảy ra khi không có hiện tượng ngưng kết ở giọt nước muối sinh lý hỗn hợp vẫn đục đều như sữa, còn ở giọt huyết thanh thì có hiện tượng ngưng kết, xuất hiện các kết tủa dạng hạt hoặc dạng sợi, dịch huyết thanh thì lại trong suốt . Sau khi quá trình thử nghiệm phản ứng sinh hóa phù hợp và có sự ngưng kết huyết thanh O đa giá và đơn giá thì kết luận Salmonella dương tính trong 25 g mẫu. Chỉ làm phản ứng với kháng huyết thanh sau khi đã xác định sinh hóa. Thực hiện phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá của vi khuẩn Salmonella trước, sau đó mới làm kháng huyết thanh đơn giá sau

41


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm- Trần Linh Phước.

2. Công nghệ vi sinh vật ( tập1-2) – Nguyễn Đức Lượng.3. Công nghệ vi sinh vật-Lương Đức Phẩm4. Ngộ độc và an toàn thực phẩm-Lê Ngọc Tú.5. Vi sinh vật học-Nguyễn Lân Dũng6. http://doc.edu.vn/tai-lieu/khoa-luan-tim-hieu-ve-vi-khuan-salmonella-11369/ 7. http://www.about-salmonella.com/ 8. http://www.textbookofbacteriology.net/salmonella.html 9. http://en.wikipedia.org/wiki/Salmonella 10. http://www.cdc.gov/salmonella/general/

42

http://www.cdc.gov/salmonella/general/

http://en.wikipedia.org/wiki/Salmonella

http://www.textbookofbacteriology.net/salmonella.html

http://www.about-salmonella.com/

http://doc.edu.vn/tai-lieu/khoa-luan-tim-hieu-ve-vi-khuan-salmonella-11369/

Documents

Định Tính Salmonella