Embed Size (px)
Citation preview
SVEUČILIŠTE U RIJECIODJEL ZA BIOTEHNOLOGIJUDiplomski sveučilišni studijBiotehnologija u medicini
Mia MerlakDiplomski rad
Parametri oksidativnog stresa i upalnog odgovora na BV-2 mikroglija stanicama u in vitro hipoksiji
Rijeka, 2014SVEUČILIŠTE U RIJECI
ODJEL ZA BIOTEHNOLOGIJU
Diplomski sveučilišni studijBiotehnologija u medicini
Mia MerlakDiplomski rad
Parametri oksidativnog stresa i upalnog odgovora na BV-2 mikroglija stanicama u in vitro hipoksiji
Rijeka, 2014Mentori rada: Prof. dr. sc. Jasenka Mršić Pelčić Prof. dr. sc. Natalia Kučić
Diplomski rad obranjen je dana ______________________ pred povjerenstvom: 1. Prof. dr. sc Sandra Kraljević Pavelić(predsjednik)2. Prof. dr. sc Miranda Mladinić Pejatović(član)3. Prof. dr. sc. Natalia Kučić(član)
Rad ima 43 stranice, 18 slika, 3 tablice i 58 literaturnih navoda
SAŽETAK:
U fiziološkim uvjetima, mikroglija stanice u središnjem živčevlju su odgovorne za niz dinamičnih staničnih funkcija neophodnih za normalno funkcioniranje kao npr. sinaptička plastičnost, funkcija makrofaga, imunološka zaštita mozga itd. Međutim, primijećeno je da u određenim patološkim uvjetima, aktivacija mikroglije može doprinjeti neuronalnom oštećenju. Cilj ovog rada bio je ispitati
ponašanje BV-2 mikroglija stanica u uvjetima kontrolirane in vitro hipoksije. Nakon uspostave modela, BV-2 mikroglija stanice izložene su hipoksiji (<2% kisika) tijekom 6 sati. Neposredno po završetku hipoksije te nakon 24 h, 48 h, 72 h i 168 h, praćene su promjene morfoloških obilježja stanice, ekspresija markera oksidativnog stresa (iNOS) te markeri upale odnosno oštećenja stanice (COX-2, Hsp70; MHC I, IL-1β). Promjena morfološkog statusa mikroglija stanica te povećana ekspresija gore spomenutih pokazatelja oksidativnog stresa i upale u različitim vremenskim razdobljima nakon izloženosti patološkim uvjetima, upućuju na zaključak da je u našem eksperimentalnom modelu došlo do snažne aktivacije mikroglija stanica, kao odgovor na kontroliranu hipoksiju.
Ključne riječi: Mikroglija, hipoksija, oksidativni stres, moždana upala, BV-2
TITLE: The parameters of oxidative stress and inflammatory response on BV-2 microglial cells under in vitro hypoxia
SUMMARY:
In physiological conditions, microglial cells in the central nervous system are responsible for a series of dynamic cellular functions necessary for the normal functioning, e.g. synaptic plasticity, macrophage function of the brain, immunological protection of the brain, etc. However, it has been shown that in
certain pathological conditions, activation of microglia may contribute to neuronal damage. The aim of this study was to investigate the behavior of BV-2 microglial cells under controlled in vitro hypoxia. After the establishment of the model, BV-2 microglial cells were exposed to hypoxia (<2% oxygen) for 6 hours. Immediately after the end of hypoxia and following to 24, 48, 72 and 168 hr period, the change of the morphological characteristics of the cells and the expression of markers of oxidative stress (iNOS) and inflammation or cell damage (COX-2, Hsp70, MHC class I, IL-1β) were monitored. The alteration of the morphological status of microglial cells and increased expression of the above-mentioned indicators of oxidative stress and inflammation in different periods of time after exposure to pathological conditions, suggests that in our experimental model, there was a strong activation of microglial cells in response to controlled hypoxia.
Key words: Microglia, hypoxia, oxidative stress, neuroinflammation, BV-2
SADRŽAJ
1. UVOD..............................................................................................................................................1
1.1. Hipoksija.................................................................................................................................1
1.1.1. Nedostatak energije i ekscitotoksičnost.........................................................................2
1.1.2. Peri-infarktne depolarizacije...........................................................................................3
1.1.3. Upala...............................................................................................................................4
1.1.3.1. Citokini u upali mozga.............................................................................................4
1.1.3.2. Kemokini u upali mozga..........................................................................................5
1.1.3.3. Stanične adhezijske molekule.................................................................................5
1.1.3.4. Matriks metaloproteinaze......................................................................................6
1.1.3.5. Regulatorni T limfociti.............................................................................................6
1.1.4. Programirana stanična smrt............................................................................................7
1.2. Slobodni radikali, oksidacijski stres i mehanizmi nakon hipoksije...........................................8
1.2.1. Slobodni radikali.............................................................................................................8
1.2.2. Oksidacijski stres.............................................................................................................8
1.3.3. Oksidacijski stres kao reakcija na hipoksiju...........................................................................9
1.3. Mikroglija..............................................................................................................................10
1.4. Model BV-2 mikroglija stanica..............................................................................................15
1.5. Parametri mjereni u istraživanju...........................................................................................16
1.5.1. COX-2............................................................................................................................16
1.5.2. Hsp70............................................................................................................................16
1.5.3. iNOS..............................................................................................................................17
1.5.4. IL-1..............................................................................................................................17
1.5.5. MHC-I............................................................................................................................18
2. CILJ RADA......................................................................................................................................19
3. MATERIJALI I METODE..................................................................................................................20
3.1. Materijali..............................................................................................................................20
Kemikalije:....................................................................................................................................20
Mediji i puferi:..............................................................................................................................20
3.2. Metode.................................................................................................................................21
3.2.1. Uzgoj adherentne BV-2 stanične linije..........................................................................21
3.2.2. Postizanje hipoksijskih uvjeta u izobaričnoj komori......................................................21
3.2.3. Mikroskopska analiza....................................................................................................22
3.2.4. Priprema staničnog lizata..............................................................................................22
3.2.5. Gel-elektroforeza..........................................................................................................22
3.2.6. Elektroblot proteina s akrilamidnog gela na nitroceluloznu membranu.......................22
3.2.7. Kemiluminiscencija.......................................................................................................22
4. REZULTATI....................................................................................................................................23
4.1. Morfološke promjene na BV-2 mikroglija stanicama u uvjetima in vitro kontrolirane hipoksije...........................................................................................................................................23
4.2. Ekspresija pokazatelja oksidativnog stresa i upale BV-2 mikroglija stanica u uvjetima in vitro kontrolirane hipoksije.......................................................................................................................25
5. RASPRAVA....................................................................................................................................32
5.1. Morfološke promjene na BV-2 mikroglija stanicama u uvjetima in vitro kontrolirane hipoksije...........................................................................................................................................32
5.2. Ekspresija pokazatelja oksidativnog stresa i upale BV-2 mikroglija stanica u uvjetima in vitro kontrolirane hipoksije.......................................................................................................................32
6. ZAKLJUČAK...................................................................................................................................36
LITERATURA..........................................................................................................................................37
ZAHVALA..............................................................................................................................................42
ŽIVOTOPIS............................................................................................................................................43
1. UVOD
1.1. Hipoksija
Hipoksija je stanje praćeno sniženom razinom kisika u arterijskoj krvi, a kao posljedica javljaju se poremećaji u funkcioniranju organa, sustava i stanica (1). Nedostatak kisika naročito pogađa stanice središnjeg živčevlja (SŽ), poglavito moždanog tkiva. Živčane stanice mozga su postmitotičke. One naime ne posjeduju sposobnost razmnožavanja te su oštećenja mozga, bez obzira na porijeklo, karakterizirana trajnim promjenama i rezultiraju neurološkim deficitima. Budući da ishemija i hipoksija predstavljaju vrlo čest patofiziološki uzrok moždanog oštećenja, predmet su intenzivnog istraživanja. Pri tom se koriste različiti eksperimentalni in vivo ili in vitro modeli koji “imitiraju” kliničku sliku niza bolesti praćenih ishemijom/hipoksijom mozga kao što su infarkt miokarda, zastoj srca, neregularni otkucaji srca, trauma mozga odnosno ishemijski moždani udar.
Slika 1. Kaskada štetnih događaja nakon hipoksije (preuzeto i prilagođeno iz 2)
Kaskada patoloških događaja nakon infarkta uključuje ekscitotoksičnost, periinfarktne depolarizacije, upalu i programiranu staničnu smrt (slika 1).
1
1.1.1. Nedostatak energije i ekscitotoksičnost
Moždano tkivo koristi velike količine kisika i glukoze te ovisi o oksidativnim fosforilacijama za stvaranje energije. Prekid dotoka krvi u mozak ograničava dotok nutrijenata, pogotovo kisika i glukoze. Niske razine ATP-a (adenozin trifosfata) uzrokuju nefunkcioniranje mnogih mehanizama koji održavaju integritet stanice i narušavaju potrebnu energiju za postizanje ionskih gradijenata (3). Zbog manjka energije odnosno ATP-a membranski potencijal je izgubljen pa se neuroni i glija depolariziraju. Posljedično tome somatodendritički i presinaptički Ca2+
kanali se aktiviraju i ekscitacijske aminokiseline se otpuštaju u vanstanični prostor (slika 2). Istovremeno, presinaptički povrat ekscitatornih aminokiselina, proces ovisan o energiji, je spriječen, što povećava akumulaciju glutamata u vanstaničnom prostoru. Glutamat se veže na glutaminske receptore omogučujući dodatni priljev unutarstaničnog kalcija i natrija u živčane stanice. Aktivacija NMDA glutaminskih receptora doprinosi prezasićenju stanica Ca2+. Kao rezultat pretjerane aktivacije glutamatom, Na+ i Cl- ulaze u neurone putem kanala za monovalentne ione (AMPA receptorski kanal, od engl. α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor) (4). Voda potom pasivno ulazi s obzirom da je priljev u stanicu Na+ i Cl- puno veći od priljeva K+ izvan stanice, što izaziva edem koji uzrokuje intrakranijalni tlak i vaskularnu kompresiju. Povećana unutarstanična koncentracija Ca2+ se smatra odgovornom za početak serije citoplazmatskih i nuklearnih događaja koji utječu na razvoj ozljede tkiva, a aktivacija fosfolipaze A2 i ciklooksigenaze generira slobodne radikale izazivajući oksidacijski stres (5). Primarni nedostatak energije dovodi do učinaka koji rezultiraju nekrozom – staničnom smrću zbog poremećenog integriteta stanice, oštećenog citoskeleta i stanične membrane. Nekroza se događa u stanjima ozbiljne i uznapredovale hipoksije i ishemije prilikom čega stanice nabubre i puknu, dovodeći do stanične i neuronske smrti. Nakon puknuća stanica, stanični sadržaj se otpusti u okolno živčano tkivo, što dovodi do upale.
2
Slika 2. Pojednostavljeni prikaz patofizioloških mehanizama kod ishemijske ozljede mozga (preuzeto i prilagođeno iz 2)
1.1.2. Peri-infarktne depolarizacije
Ranije je spomenuto da se ishemični neuroni i glija depolariziraju zbog nedostatka energije i otpuštanja K+ i glutamata. Neki dijelovi mozga se teško repolariziraju, ali u svakom slučaju potrebna je energija. Ponavljajuće depolarizacije, odnosno peri-infarktne depolarizacije su česta pojava u hipoksiji (6). Što su češće i brojnije, to imaju jači negativni utjecaj na infarkt.
3
1.1.3. Upala
Kao što je već spomenuto upala je uz oksidativni stres jedan od važnih patofizioloških mehanizma koji se pojavljuju nakon hipoksičnog insulta. Niz mehanizama koji se događaju u mozgu nakon hipoksije i oksidativnog stresa kao što su djelovanje stanica imunološkog sustava i otpuštanje raznih medijatora upale (citokini, kemokini, slobodni radikali) izazivaju upalu. Takvi stimulansi potiču kompleksne biološke odgovore vaskularnog tkiva koji imaju zaštitnu ulogu i kao cilj ukloniti patogene i oštećene stanice, da organizam može započeti proces ozdravljenja. Mehanizmi upale potiču urođeni imunološki odgovor, a daljni procesi aktiviraju i specifičnu, stečenu staničnu imunost. Iako upala prvotno nastaje zbog zaštite mozga smatra se da istovremeno ima i štetan i blagotvoran učinak na oporavak. Naime hipoksija u mozgu izaziva kronični upalni odgovor imunoloških stanica čije djelovanje u krajnosti dovodi do veće štete na neuronima.
1.1.3.1. Citokini u upali mozga
Citokini su grupa malih glikoproteina koji se stvaraju kao odgovor na antigene i imaju ulogu medijatora za reguliranje urođene i stečene imunosti. Njihova koncentracija u mozgu se povećava u raznim bolestima i kao rezultat oštećenja tkiva. Izlučuju ih stanice imunološkog sustava kao i rezidentne moždane stanice (neuroni i glija) (7). Periferni fagociti, limfociti T, NK stanice i leukociti luče razne citokine koji doprinose moždanoj upali. Istraživanja su pokazala da sljedeći citokini izazivaju upalu nakon ishemičnog infarkta: tumor nekrozirajući faktor (TNF-), interleukini (IL-1, IL-6, IL-20, IL-10) i transformirajući faktor rasta (TGF-). Uočeno je da IL-1 i TNF- imaju negativan utjecaj na ozljedu mozga, dok TGF- i IL-10 imaju neuroprotektivnu ulogu (8,9). Pojačano stvaranje proupalnih citokina i smanjen nivo protuupalnog IL-10 izazivaju pogoršanje stanja mozga i lošiji klinički ishod. Isto tako povećane razine ekspresije IL-1 izazivaju veći priljev neutrofila i održavanje upalnog stanja. IL-1 također povećava razinu cirkulirajućeg IL-6 (10) koji je povezan sa oticanjem mozga (stvaranjem edema). Koncentracija IL-20 se povećava nakon indukcije sa IL-1 preko NF-B staničnog puta, a poznato je i da IL-20 također potiče stvaranje IL-6. Protuupalni citokin IL-10 djeluje tako da inhibira IL-1 i TNF-, suzbijajući izražaj i aktivaciju njihovih citokinskih receptora, te stoga ima neuroprotektivnu ulogu u akutnom ishemičnom infarktu.
4
1.1.3.2. Kemokini u upali mozga
Kemokini imaju važnu ulogu u staničnoj komunikaciji i regrutiranju stanica u upali. Ekspresija kemokina monocitnog kemoprivlačnog proteina 1 (MCP-1), makrofagnog upalnog proteina-1a (MIP-1a) i fraktalina ima negativan utjecaj na oporavak mozga nakon ishemije jer povećava infiltraciju leukocita (11). Razna istraživanja potkrepljuju činjenicu da uslijed hipoksije razine kemokina porastu i tako privlače migrirajuće imunološke stanice, a njihovom inhibicijom se smanjuje ozljeda.
1.1.3.3. Stanične adhezijske molekule
Sve je više dokaza da stanične adhezijske molekule (CAMs) imaju važnu ulogu u patofiziologiji ishemičnog infarkta. U prvim danima napada citokini potiču povećanu ekspresiju adhezijskih molekula koje su odgovorne za adheziju i migraciju leukocita. Leukociti se kotrljaju po endotelnoj površini i prijanjaju uz endotelne stanice. Interakcije između leukocita i vaskularnog endotela su posredovane trima glavnim grupama CAM molekulama: selektini, imunoglobulinska superobitelj i integrini. Selektini, posebno E- i P- selektini su više izraženi i sudjeluju u kotrljanju i regrutiranju leukocita tokom ranog stadija odgovora na hipoksiju. Iz imunoglobulinske superobitelji najviše su istraživane unutarstanične adhezijske molekule-1 (ICAM-1) i vaskularne adhezijske molekule-1 te je dokazano da im je u upalnom stanju mozga ekspresija povećana, a za to su odgovorni citokini. Također je uočeno da razina ekspresije više topljivih unutarstaničnih adhezijskih molekula-1 (sICAM-1) je povećana u pacijenata koji nisu preživjeli infarkt, nego u onih koji su preživjeli. Ta činjenca upućuje na to da je upala u mozgu odgovorna za brže umiranje stanica i pogoršanje stanja u odgovoru na ishemiju, odnosno hipoksiju. Inhibicija aktivacije i infiltracije leukocita u ishemično tkivo se kontinuirano istražuje pri čemu se tehnike sve više unaprjeđuju jer se pokazalo da adhezijske molekule imaju značajnu ulogu u terapiji upale (12).
1.1.3.4. Matriks metaloproteinaze
5
Matriks metaloproteinaze (MMPs) su obitelj proteolitičkih enzima koji su odgovorni za remoduliranje vanstaničnog matriksa i imaju sposobnost degradacije svih njegovih sastojaka. Ekspresija MMPa u normalnom razvijenom mozgu je jako niska, skoro nemjerljive razine, ali u upalnom odgovoru na ozljedu je visoko izražena (13). Neuroni, astrociti, mikroglija i endotelne stanice sve eksprimiraju MMP nakon ozljede. Novija istraživanja pokazuju da je slom krvno-moždane barijere povezan sa ekspresijom i aktivacijom MMP (14). MMP-2 i MMP-9 su proteinaze koje su najviše uključene u moždanu ishemiju.
1.1.3.5. Regulatorni T limfociti
Već je spomenuto da nakon hipoksije mozga slijedi odgovor urođenog i stečenog imunološkog sustava. Zadnja istraživanja pokazuju da regulatorni T limfociti (Treg) uspješno štite stanice kontrolirajući imunološki odgovor u fiziološkim uvjetima kao i u raznim sistemskim upalama središnjeg živčanog sustava. Treg stanice stvaraju se od strane dendritičkih ili antigen-prezentirajućih stanica sa izraženim imunosupresivnim posrednikom indoleaminom 2, 3-dioksigenazom (enzim kinureninskog puta koji pretvara triptofan u kinurenin) (15). Interferon- i TNF-, koji su prisutni u velikim količinama u ishemičnom mozgu u mikrogliji, induciraju indoleamin 2, 3-dioksigenazu kao odgovor na kroničnu imunološku aktivaciju (16). U slučajevima inhibicije Treg stanica dolazi do veće štete u mozgu i trajnijih posljedica, jer Treg smanjuje aktivaciju rezidentnih mikroglija i T stanica koje su glavni izvor TNF- i IFN- (25). Treg stanice djeluju tako da umanjuju štetne i pretjerane aktivacije imunološkog sustava pa sprječavaju razvitak autoimunih bolesti. Također proizvode citokin IL-10 koji, kao što je već spomenuto, ima veliki učinak u reagiranju na infarkt, a nagađa se da ima i ulogu u moduliranju produkcije indoleamin 2, 3-dioksigenaze. Zbog Treg stanica smanjuje se sekundarno pogoršanje nakon infarkta zbog protudjelovanja na produkciju proupalnih citokina i modulirajući invaziju i aktivaciju limfocita i mikroglije u hipoksičnom mozgu. Treg antagoniziraju povećano stvaranje TNF- i IFN- i na taj način odgađajući naknadno pojavljivanje upale i time smanjuju štete u mozgu (17).
1.1.4. Programirana stanična smrt
6
Apoptoza, nekroza i ostale programirane stanične smrti su događaji koji se javljaju najkasnije u kaskadi patofizioloških događaja nakon hipoksije. Apoptoza može zadesiti stanice mozga koje su ugrožene zbog pretjerane aktivacije glutaminskih receptora, preobilne razine Ca2+
unutar stanice, kisikovim radikalima ili oštećenjima mitohondrija i DNA (18). Što će se desiti ovisi o prirodi i intenzitetu stimulusa, vrsti stanice i stadija životnog ciklusa ili razvoja. Dva su glavna puta za aktivaciju apoptoze: intrinzični i ekstrinzični put. Intrinzični put uključuje unutarnje događaje kao poremećaj mitohondrija i otpuštanje citokroma C što dovodi do smanjenja aktivacije kaspaza. S druge strane ekstrinzični put se odvija preko površinskih staničnih receptora koji mogu biti aktivirani sa specifičnim ligandima koji se vežu za tzv. “receptore smrti” (19).
1.2. Slobodni radikali, oksidacijski stres i mehanizmi nakon hipoksije
1.2.1. Slobodni radikali
U ljudskom metabolizmu tokom života svakodnevno se događaju brojne kemijske reakcije koje su zaslužne za održavanje normalnih funkcija organizma. Disanje, odnosno unos elementa kisika u naše tijelo je neophodno za život. Kada stanica koristi kisik za stvaranje energije, kao posljedica stvaranja ATP-a u mitohondrijima, stvaraju se slobodni radikali. Slobodni radikali u vanjskoj ljusci posjeduju jedan ili više nesparenih elektrona, pa tako sve slobodne radikale karakterizira iznimno visoka
7
reaktivnost, što je rezultat njihova nastojanja da popune valentnu orbitalu tj stabilnu elektronsku konfiguraciju. Biokemijski su najznačajniji reaktivni oblici kisika (ROS) i reaktivni oblici dušika (RNS). Kao što je spomenuto proces stvaranja radikala u stanici je neprekidan i vezan uz normalne metaboličke reakcije, a to stvaranje reguliraju enzimi poput NO sintetaza (NOS) i NAD(P)H oksidaza i njihovih izoformi. ROS i RNS su poznati po svojoj dvojnoj ulozi da djeluju štetno i blagotvorno u organizmu. Pri niskim koncentracijama pokazuju blagotvoran učinak u staničnim odgovorima i imunološkoj funkciji, dok pri visokim koncentracijama izazivaju stanje štetno za organizam (20). Visoke koncentracije slobodnih radikala mogu nastati zbog njihovog unosa iz vanjskog okoliša (dim cigareta, radijacija, lijekovi, zagađenja...) ili u staničnom metabolizmu ako dođe do prevelike produkcije ROS-a (mitohondrijski respiratorni lanac ili prekomjerna stimulacija NAD(P)H). U oba slučaja nastaje preveliki broj slobodnih radikala koje organizam ne uspijeva uništiti i njihova akumulacija izaziva oksidacijski stres.
1.2.2. Oksidacijski stres
Oksidacijski stres se definira kao stanje u kojem je pomak ravnoteže u staničnim oksidativno-redukcijskim reakcijama u smjeru oksidacije. Dolazi do prekomjernog stvaranja slobodnih radikala kisika te ih stanice biološkog sustava zadužene za razgradnju nisu u mogućnosti razgraditi, što rezultira promjenama vezanim uz oštećenje stanica. Oksidacijsko oštećenje utječe na strukturu i funkciju brojnih biomolekula (polinezasićenih lipida, ugljikohidrata, proteina i nukleinskih kiselina) što rezultira promjenama u strukturi i funkciji stanica, tkiva i organa. Tako nastala oštećenja mogu narušiti homeostazu iona, prijenos signala u stanici, gensku transkripciju te tako dovesti do drugih poremećaja. Oksidacijski stres ima značajnu ulogu u etiopatogenezi kardiovaskularnih i infektivnih bolesti, karcinoma, dijabetesa, neurodegenerativnih bolesti, fibroze, hemolize te procesa starenja.
1.3.3. Oksidacijski stres kao reakcija na hipoksiju
Oksidacijski stres je uobičajeno stanje koje izazivaju različite upalne stanice nakon ishemičnog infarkta. Nakon hipoksije upalne stanice
8
se aktiviraju i generiraju ROS preko nekoliko enzimskih puteva tako da potaknu ekspresiju proupalnih medijatora, uključujući citokine i adhezijske molekule (21). Osim preko upale, ROS se također generira i kroz druge mehanizme kao što su inhibicija mitohondrija, preveliki priljev Ca2+ i reperfuzijske ozljede. U mitohondrijima, koji u su u zdravom stanju izvor ROS-a, kod hipoksije dolazi do oštećenja unutarnje membrane i oksidacije proteina što uzrokuje nepravilnosti u transportu elektrona, istiskivanje H+ i produkciju ATP-a. Mitohondrijska membrana postaje propusna, što izaziva bubrenje i prestanak produkcije ATP-a i prekomjerno stvaranje slobodnih radikala. Citokrom C se otpušta iz mitohondrija i to nadalje vodi do apoptoze. Superoksid (O2-) je primarni radikal čije je stvaranje generirano putem ciklooksigenaze (COX), ksantin dehidrogenaze, ksantin oksigenaze i NADPH oksidaze, dok mijeloperoksidaza (MPO) i monoamin oksidaza (MAO) dalje iz superoksida generiraju hipoklornu kiselinu i vodikov peroksid (H2O2) (21). Dušični oksid (NO) je slobodni radikal topljiv u vodi koji nastaje iz L-arginina uz tri vrste NO sintetaza (NOS). Hipoksija uzrokovana ishemijom potiče aktivaciju NOS-a tipa I i III u neuronima i vaskularnom endotelu, a NOS tip II (iNOS) aktivnost se odvija u glija stanicama i infiltrirajućim neutrofilima. Nakon stvaranja NO i superoksidnog aniona formira se izrazito reaktivna vrsta, peroksinitrit, koji potiče ozljedu tkiva (22). Kisikovi slobodni radikali su također zaslužni za signaliranje unutar stanice koje potiče upalu i apoptozu. Zbog velike količine reaktivnih kisikovih oblika da se zaključiti da je oksidativni stres važan medijator u ozljedi tkiva koja uslijedi nakon hipoksije, te su slobodni radikali općenito važna meta u terapijskom poboljšavanju ishoda ishemičnog infarkta.
1.3. Mikroglija
Mozak i leđna moždina čine centralni živčani sustav koji je imunološki privilegiran radi odvojenosti od ostatka tijela endotelnim stanicama i nožicama astrocita koje ih obavijaju čineći krvno moždanu barijeru. S obzirom na nepristup mnogim imunološkim stanicama inače zaduženim za obranu organizma mozak i leđna moždina posjeduju mikroglija stanice koje ispunjavaju homeostaznu i obrambenu ulogu te se nalaze u parenhimu živčanog sustava. Zbog velike osjetljivosti živčanog tkiva mikroglija stanice reagiraju i na najmanje patološke promjene u centralnom živčanom sustavu, a to postižu jedinstvenim kalijevim kanalima koji reagiraju i na najmanje promjene u koncentraciji ekstracelularnog kalija. Zbog potrebe održavanja moždane homeostaze i odvijanja cijelog niza imunoloških funkcija mikroglija stanice su izrazito plastične i prolaze razne strukturalne promjene. Iako postoji mnogo više tipova mikroglija stanica (23), mogu se podjeliti u tri osnovna fenotipa, ameboidni, razgranati i aktivirani (24) (slika 3).
9
Slika 3. Ilustrirani prikaz vrsta stanica mikroglije (preuzeto i prilagođeno iz 24)
Ameboidna mikroglija je fagocit i obavlja funkciju “čistača” tako da pronalazi antigene, strani materijal, oštećene stanice, stanice u apoptozi, DNA fragmente i slične sadržaje te djeluje kao aktivni makrofag tijekom razvoja (25). Također je i prekursor neaktiviranoj razgranatoj mikrogliji, koja se kao odgovor na razne infekcije, traume i ishemiju aktivira u postnatalnom mozgu i putuje na mjesto ozljede (26). Na razgranatoj mikrogliji u normalnom razvijenom mozgu izraženi su određeni stanični biljezi važni u imunološkom odgovoru, kao npr. molekule glavnog sustava tkivne podudarnosti, MHC (od engl. mean histocompability complex) – II molekule (27), a kao odgovor na razne vrste trauma mozga i brojne molekule izražavaju se i mnogi drugi receptori te mikroglija mijenja svoje mirujuće, nadzorno stanje u aktivno, izvršno stanje (slika 4). Zajedničko svojstvo tih molekula je da sve predstavljaju prijetnju strukturalnom i funkcionalnom integritetu središnjeg živčanog sustava. Stanice mikroglije sposobne su prepoznati široki spektar molekula, a također imaju i raznovrstan učinak na modulaciju upalnog odgovora, bilo da ga započinju, pojačavaju ili umiruju (28) (Tablica 1).
Tablica 1. Primjeri signala koji mjenjaju stanje stanica mikroglije iz mirujućeg u aktivno (prilagođeno po 28)Skupina signala i modulatora PrimjeriPovršinske strukture i DNA/RNA virusnog, bakterijskog ili gljivičnog porijekla
Agonisti receptora koji prepoznaju uzorak (engl. pattern recognition receptors - PRR)
10
TLR1-TLR4, TLR6, TLR9: bakterijski LPS, proteoglikani stanične stjenke i lipoteikoična kiselina (LTA), podjedinice ovojnice retrovirusa gp41 i gp120
Abnormalni endogeni proteini Agregati beta amiloida, Aβ25-35, Aβ40, Aβ42, prionski proteini
Komplement Komponente sustava komplementa C1q, C5Protutijela Imunoglobulini raznih klasa i izotipova (IgG,
IgA, IgM) prezentiranih u obliku imunoloških kompleksa
Citokini Čimbenici stimulacije kolonija i citokini: M-CSF, GM-CSF, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IFN-γ, TNF-α, TGF-β
Kemokini Ligandi koji se vežu na kemokinske receptore: CCR3, CCR5, CXCR, CXCR2, CXCR4, CX3CR1, IL-8R
Neutrofilni čimbenici Neutrofilni čimbenik porijeklom iz mozga – BDNF, neutrofilni čimbenik porijeklom iz stanica glije – GDNF (engl. glia derived neutrophic factor), čimbenik rasta živaca – NGF (engl. Nerve growth factor), neutrofini NT-3 i NT-4
Komponente krvne plazme Albumin, fibronektin, fibrinogen, trombinOstali proteini i peptidi Apolipoprotein E (ApoE), proteini toplinskog
šoka Hsp60, Hsp70, CD40L, melanocitni stimulirajući hormon – MSH, endotelin, S100 proteini, vazoaktivni intestinalni peptid (VIP)
Spojevi povezani s prijenosom podražaja živčanim stanicama
ATP i srodni proteini, β-adrenergični agonisti, glutamat, kainat, NMDA
Ioni Ioni kalija i manganaOstali spojevi Kanabinoidi, ceramidi, gangliozidi,
lipofosfatidična kiselina (LPA), melanin, endogeni opijati (endomorfini), čimbenici aktivacije trombocita – PAF (engl. Platelet activating factor), prostaglandinE2, steroidni hormoni
11
Slika 4. Ilustrirani prikaz razgranate neaktivirane mikroglija stanice i aktivirane mikroglija stanice (preuzeto i prilagođeno iz 30)
Aktivirani oblik mikroglije, uz MHC I i II glikoproteine, na svojoj staničnoj površini izražava i mnoge druge receptore kao što su imunoglobulini, receptori komplementa, citokina/kemokina i Toll-like receptori (tablica 2). Takve mikroglija stanice imaju svojstva slična dendritičkim stanicama i njihov broj naglo poraste u infektivnim i upalnim uvjetima. Djeluju kao antigen prezentirajuće stanice aktivirajući citotoksične i Th1 limfocite koji zahvaljujući specifičnim površinskim markerima, prolaze kroz krvno moždanu barijeru i direktno se vežu na mikroglija stanice da prime antigene i unište ih (29). Osim što mikroglija doprinosi stečenom imunom odgovoru preko interakcija sa CD4+ i CD8+
limfocitima djeluje i na urođeni imuni odgovor. Izražavaju Toll-like receptore (TLRs), CD14 i manozne receptore (tablica 2) koji prepoznaju molekularne uzorke patogena PAMPs (eng. pathogen-associated molecular patterns) poput LPS-a, peptidoglikana i teikoične kiseline koji se nalaze u staničnoj stjenci bakterija. Zasada je istraženo da receptori
12
kemokina/citokina i njihovi ligandi (tablica 2 i 3) imaju kritičnu ulogu u aktiviranju mikroglije i usmjeravanju te tako i direktan utjecaj na oporavak mozga nakon infekcije ili ozljede (26). Mnogi takvi receptori su izraženi i na astrocitima pa se pretpostavlja da predstavljaju i komunikacijski signal između mikroglije i astrocita. Važno je napomenuti da aktivirana mikroglija izražava receptore i ligande za proupalne (IL-1, IL-6, IL-12, IL-23, TNF-) i protuupalne (TGF- i IL-10) klase citokina. Spomenuto je da je ATP glavni čimbenik posredovanja unutarstanične komunikacije u imunološkom i živčanom sustavu, a s obzirom da mikroglija stanice imaju purinergične receptore njihova stimulacija uvelike utječe na funkciju mikroglije, a najviše na kemotaksiju i produkciju citokina. U nekim slučajevima aktivirana mikroglija izražava opioidne ( i ), kanabinoidne i benzodiazepinske receptore (26). Njihovom stimulacijom također utječemo na veliki broj funkcija uključenih u patogenezu infekcije živčanog sustava. Takvi receptori se mogu aktivirati ne samo endogenim opioidima i kanabinoidima nego i derivatima biljaka opiuma i kanabisa. Od liganda i sekretornih produkata uz spomenute citokine i kemokine valjalo bi izdvojiti i već spomenute matriks metaloproteinaze (MMPs) koje su odgovorne za prolaz kroz krvno moždanu barijeru, emigraciju leukocita u živčani sustav i uništenje tkiva. MMPs su iz obitelji cink-ovisnih enzima i njihova sposobnost za razgradnju proteina koji se nalaze u vanstaničnom matriksu utječe na infekcije živčanog sustava kao i upalu i neurodegenerativne poremećaje. Također istraživanja živčanog sustava koji je doživio traumu, potrovanje ili hipoksiju pokazuje da aktivirana mikroglija luči MMP-2, MMP-3 i MMP-9 metaloproteinaze kao odgovor na razne stimulanse (13). Napravljene su studije na mišjim, svinjskim i ljudskim stanicama mikroglije i sve su pokazale da aktivirana mikroglija ima sposobnost produkcije superoksida. Dok mikroglije izolirane iz mišjih stanica nakon aktiviranja stvaraju velike količine dušikovog oksida (NO) ljudske to čine u puno manjoj mjeri. Mogućnost da mikroglija izaziva proizvodnju slobodnih radikala kao sto su ROS (reaktivni oblici kisika) i RNS (reaktivni oblici dušika) je važno u mehanizmima obrane od unutarstaničnih organizama i moguće štete neurona ako se toksične molekule nađu u vanstaničnom prostoru.
Tablica 2. Receptori mikroglijalne stanične membrane
Receptori čistačiAdhezijske molekule
13
-Imunoglobulinksa (Ig) superobitelj Ig Fc receptori (FcγRI, RII, RIII) MHC I glikoproteini MHC II glikoproteini CD4 receptori Međustanične adhezijske molekule 1 (ICAM-1)-Integrini Antigen 1 povezan sa leukocitnom funkcijom (LFA-1; CD11a/CD18;CR1) Mac-1 (CD11b/CD18; CR3) p150, p95 (CD11c/CD18;CR4)-Receptori komplementa: C1q, C5aReceptori citokina/kemokina-IFN-α, IFN-β, IFN-γ-IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, IL-16-TNF-α-M-CSF, GM-CSF-CCR, CXCR, CX3CRToll-like receptoriCD14 receptoriManozni receptoriPurinergični receptoriOpioidni receptori (µ,κ)Kanabinoidni receptoriBenzodiazepinski receptori (mitohondrijska membrana)Receptori objavljeni u literaturi, na čiju ekspresiju može utjecati stanje aktivacije kao i anatomsko mjesto, dob i životinjske vrste od kojih potječu mikroglije. (preuzeto i prilagođeno iz 26)
Tablica 3. Sekretorni produkti mikroglija
Citokini (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, IL-16, IL-23, TNF-α, TGF-β)Kemokini CC: CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES CXC: CXCL8/IL-8, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL12/SDF-1α CX3C: CX3CL1/fraktalinMatriks metaloproteinaze (MMP-2, MMP-3, MMP-9)Slobodni radikali: superoksid, dušikov oksidEikozanoidi: PGD2, leukotrijen C4Faktori rasta: faktor rasta neurona, faktor rasta fibroblastaProteaze: elastaza, plazminogenKatepsini B i LKvinolinksa kiselina, glutamatAmiloidni prekursor proteinaFaktori komplementa: C1, C3, C4Sektretorni produkti objavljeni u literaturi, na čiju ekspresiju može utjecati stanje aktivacije kao i anatomsko mjesto,dob i životinjske vrste od kojih potječu mikroglije. (preuzeto i prilagođeno iz 26)
1.4. Model BV-2 mikroglija stanica
14
Napravljene su mnoge studije na modelima životinja i primarnim kulturama, ali s obzirom na slabu mogućnost proliferacije i činjenicu da za svega nekoliko eksperimenata za dokazivanje mehanizama bolesti i signaliranja je potrebno 15-30 svježih mozgova glodavaca javila se potreba za alternativnom staničnom linijom. Podaci dobiveni izolacijom iz primarnih mikroglija i ex vivo eksperimenata nisu zadovoljavajući zbog ograničene količine biološkog materijala pa se noviji eksperimenti o aktivaciji mikroglije i signaliranju sve više izvode na modelu BV-2 stanica. BV-2 stanice su dobivene iz raf/myc imortaliziranih mišjih neonatalnih mikroglija, a dosad su korištene za mnoge farmakološke studije, studije o fagocitozi, mnogim imunološkim otkrićima i u preko 200 publikacija. U radu A. Henn i sur. detaljno su ispitane funkcije tih stanica u upalnim odgovorima i ispitana je valjanost zamjene za primarne mikroglije i mikroglije u in vivo eksperimentima (31). Ispitali su odgovor BV-2 stanica mikroglije na lipopolisaharid u in vitro i in vivo uvjetima. Transkriptomske i proteomske analize su pokazale da su uzorci reagiranja BV-2 stanica i primarnih mikroglija slični, ali da BV-2 stanice pokazuju manju ekspresiju gena. Ispitane stanice također pokazuju očekivanu produkciju NO i funkcionalni odgovor na IFN- koji su važni parametri za prikladnu interakciju sa T-stanicama i neuronima. Dokazano je da BV-2 stanice stimuliraju i ostale glija stanice, kao i to da potiču translokaciju NF-κB i produkciju IL-6 u astrocitima (31). Rad A. Hann kao i radovi Lunda i suradnika o sekreciji citokina i MAP kinaznom signaliranju (32) te rad o fagocitozi Hirta i Leista (33) dovoljan su dokaz da se BV-2 stanice mogu koristiti kao valjana zamjena za primarne mikroglije u mnogim eksperimentima uključujući i studije o kompleksnim staničnim interakcijama.
1.5. Parametri mjereni u istraživanju
1.5.1. COX-2
COX-2 odnosno ciklooksigenaza 2 je protein koji je homodimer, a svaki monomer ima molekularnu masu od oko 70 kDa. To je enzim koji pretvara arahidonsku kiselinu u prostaglandin H2. Znatno je povećan u patofiziološkim odgovorima od strane upalnih stimulansa IL-1 i drugih faktora rasta (34). Potiče upalu u svim oštećenim tkivima i mozgu. Tokom produkcije prostaglandina, stvaraju se i reaktivni kisikovi oblici koji skupa
15
sa ostalim citokinima i upalnim agentima aktiviraju mikrogliju. U slučajevima kad je mikroglija prestimulirana proizvodi citotoksične elemente koji uništavaju neurone i stimuliraju prekomjernu ekspresiju COX-2. Zanimljivo je da COX-2 enzim ne uništava neurone kroz upalu, već da oksidira druge molekule u dopaminskim neuronima koje zatim reagiraju i unište druge komponente stanica (35).
1.5.2. Hsp70
Hsp70 je obitelj heat shock proteina za koju je dokazano da djeluje imunoregulativno, uključena je u oblikovanje mehanizama upale i štiti mozak nakon raznih povreda i ishemije. Hsp70 imaju molekularnu masu od oko 70kDa i uključeni su u odmatanje i zamatanje drugih proteina. Imunološki odgovor Hsp se pojavljuje u svim upalnim bolestima. U upalnim modelima administracija Hsp zaustavlja upalna oštećenja i izaziva produkciju protuupalnih citokina. Kada u upali temperatura u stanici poraste do razine da započne denaturacija proteina induciraju se Hsp70 i djeluju tako da se vežu na hidrofobne krajeve proteina, izložene radi stresa, sprječavajući tako daljnju denaturaciju ili agregaciju. Hsp70 su povezani i sa autofagijom, pa tako peptidi eksprimirani na MHC II molekulama stanica u stresu služe kao ciljna mjesta T stanicama doprinoseći smanjenju upalnog odgovora. Također djeluju tako da štite stanice od oksidativnog stresa jer se proteini u stresu parcijalno odmataju i agregiraju. Parametri oksidativnog stresa kao hidrogen peroksid, superoksid i dušikov oksid svaki izazivaju jedinstven odgovor na stres. Svaki od tih parametra potiče ekspresiju jedinstvenog seta gena, koji smanjuju njihove štetne učinke (36).
1.5.3. iNOS
NOS odnosno sintetaza dušičnog oksida (NO) je porodica enzima koje kataliziraju NO iz L-arginina. Inducibilna izoforma, iNOS, je uključena u imunološki odgovor i karakterizira je jaka nekovalentna veza sa kalmodulinom (CaM) i Ca2+. Gensku ekspresiju iNOS reguliraju razni putevi uključujući NF-B i IFN- (preko JAK-STAT kaskade) koji djeluju pozitivno na ekspresiju. NF-B (nuklearni faktor kappa lakog lanca aktiviranih B stanica) se pojavljuje kao odgovor na razne upale dok citokin IFN- (interferon gamma) je kritičan u odgovoru na prirođenu i stečenu imunost te se također javlja u infekcijama. Iz toga je vidljivo da se i sam iNOS javlja u upalnim i infektivnim stanjima. Nakon što je broj sintetaza u stanici
16
porastao samu proizvodnju dušičnog oksida iNOS sintetizira u velikoj količini uz prisustvo raznih stimulansa, proupalnih citokina, IL-1 (interleukin-1), TNF- i sam INF- (37).
1.5.4. IL-1
U obitelj IL-1 (interlukin-1) spada 11 vrsta citokina, koji imaju ulogu u reguliranju imunog i upalnog odgovora u infektivnim stanjima organizma. Il-1 se sintetizira kao prekursor protein nakon stimulacije. Njegova ekspresija je inducirana transkripcijskim faktorom NF-B nakon izlaganja alarmina (endogenih molekula otpuštenih nakon ozljede tkiva, upale i u autoimunim bolestima i kancerogenezi) i PAMPs urođenim imunim stanicama koje na sebi imaju Toll-like receptore (TLRs) (slika 5). To znači da su za sekreciju IL-1 potrebna dva signala. PAMPs stimulira sintezu pro-IL-1, ali ne i njegovo lučenje, dok su alarmini zaduženi za aktivaciju kaspaze-1 koja cijepa pro-IL-1 u IL-1, omogućujući njegovo lučenje. Zbog pretjerane ekspresije IL-1 u centralnom živčanom sustavu tijekom upale i indukcije u hipotalamusu smatra se da je važan neuroregulator u odgovorima na upalne stresore i da regulira neuroendokrine funkcije u takvim stanjima.
17
Slika 5. Sekrecija IL-1β nakon stimulacija TLR-a sa PAMPs i alarminima (preuzeto i prilagođeno iz 38)
1.5.5. MHC-I
MHC-I molekule se sastoje od dva polipeptidna lanca, i 2-mikroglobulina koji su međusobno povezani nekovalentnom vezom. Zbog svoje strukture sposobne su prezentirati antigene T stanicama, a nalaze se na antigen prezentirajućim stanicama, ali mogu se inducirati i na ostalim stanicama nakon stimulacije interferonom ili nekim drugim stimulansom koji se eksprimira u upalnom okruženju. IFN-γ povećava ekspresiju MHC I preko aktivacije JAK/STAT1 signalnog puta. Prezentirajući antigene citotoksičnim limfocitima igraju ključnu ulogu u stečenom imunom odgovoru, ali novija istraživanja su pokazala da također djeluju i na urođeni imunološki odgovor. Dokazano je sinergično djelovanje unutarstaničnih MHC I molekula i Toll like receptora preko mehanizma međusobne komunikacije odnosno crosstalka. Crosstalk rezultira formiranjem Fps-SHP-2 puta te tako kontrolom urođenog imunološkog odgovora preko TLR-a. Pretjerana reakcija imunološkog sustava može dovesti do kronične upale, alergije ili autoimunosti, a opet nedovoljna aktivacija rezultira neprimjerenom zaštitom tokom infekcije ili nedovoljnim aktiviranjem stečenog imunog odgovora koji vodi do bolesti pa čak i smrti. Upravo radi toga važna je ravnoteža između intenziteta odgovora, a MHC I molekule su jedne od ključnih u takvoj kontroli (39).
2. CILJ RADA
Cilj ovog rada bio je:
1. Razviti model in vitro hipoksije na BV-2 liniji mikroglija stanica
2. Pratiti parametre njihove aktivacije pri čemu su kao glavni indikatori oni prisutni kod oksidacijskog stresa, upale i općenito oštećenja. Stoga smo za pojedinačne ciljeve odredili pratiti izražaj proteina iNOS kao biljega oksidacijskog stresa te COX2, Hsp70, IL-1 i MHC-I kao biljega upale i stanične aktivacije.
18
3. MATERIJALI I METODE
3.1. Materijali
Kemikalije:
PBS (fiziološka otopina puferirana fosfatnim puferom)Natrij klorid (NaCl) 140 mM, KemikaKalij klorid (KCl) 2,7mM, KemikaNatrij hidrogenfosfat-2-hidrat (Na2HPO4 x H2O) 6,5 mM, KemikaKalij dihidrogenfosfat (KH2PO4) 1,5 mM, KemikaKalcij klorid (CaCl2) 0,7 mM, Kemika
19
Magnezij klorid-6-hidrat (MgCl2 x 6H2O) 0,7 mM, Kemika
Mediji i puferi:
Medij D-MEM (medij za uzgoj imortaliziranih linija), PAN BiotechMedij D-MEM 1,1 L-Glutamin 2 mM, Penicilin 1x105 U/I, Streptomicin sulfat 0,1 g/l, Gentamicin sulfat 0,05 g/l Fetalni goveđi serum (FCS) 10%, PAN Biotech
Puferi: Running pufer (Tris base, ROTH + glicin, Fisher chemical + SDS, Fisher scientific + H20) Transfer pufer (Tris base, ROTH + glicin, Fisher chemical + metanol, Kemika + H2O)
Laboratorijsko posuđe:
Petrijeve posude za uzgoj stanica, GreinerVolumetrijske tikvice, Carl RothStaklene menzure, Carl RothPosuđe za Western blot analizu, BioRad
Protutijela:
COX2 poliklonsko protutijelo, Santa CruziNOS/NOS2 monoklonsko protutijelo, Santa CruzIL-1 poliklonsko protutijelo, Santa CruzAnti Ld/Db (klon 28-14-8s) mišje protutijeloHSP70 protutijelo, Santa Cruz-aktin monoklonsko protutijelo, Santa Cruz
3.2. Metode
3.2.1. Uzgoj adherentne BV-2 stanične linije
BV-2 stanična linija imortalizirane mišje mikroglije uzgojena je u D-MEM mediju, u plastičnim Petrijevim posudama pri temperaturi od 37C i uz 5% CO2. BV-2 stanice su stanice sklone prijanjanju za plastiku što olakšava odstranjenje iz kulture ostalih stanica jednostavnom promjenom medija.
20
Nakon nekoliko dana (3-5) uzgoja, stanice prekriju dno Petrijeve posude te se mogu prebaciti u nove, gdje se uzgajanje nastavlja do željene gustoće.
3.2.2. Postizanje hipoksijskih uvjeta u izobaričnoj komori Uzgojenoj liniji BV-2 mišjih mikroglija stanica, koje su održavane u standardnim uvjetima stanične kultivacije, inducirana je in vitro hipoksija. Postupak je izveden u komori (slika 6) u kojoj je postupnim uvođenjem 98% dušika razina kisika smanjena na < 2% i potom održavana tijekom 6 sati.
Slika 6. Izobarična komora
3.2.3. Mikroskopska analizaBV-2 mikroglija stanice su zatim analizirane svjetlosnom fazno-kontrastnom mikroskopijom (Olympus) neposredno nakon te 24 h, 48 h, 72 h i 168 h nakon hipoksije.
3.2.4. Priprema staničnog lizataBV-2 stanice odljepljene su od podloge i resuspendirane u puferu za lizu (0,3 ml) inkubacijom od 10 minuta na ledu. Talog stanica centrifugiran je 5 minuta na 14000 RPM na +4C. Dobiveni supernatant služi kao uzorak za western blot analizu.
3.2.5. Gel-elektroforezaProteini iz staničnog lizata su zatim razdvojeni poliakrilamid gel-elektroforezom (SDS-PAGE). Korišteni su 8, 10 i 12 % gelovi. Tijekom
21
elektroforeze proteini su razdvojeni na gelu i usljedio je bloting na nitroceluloznu membranu. Elektroforeza je rađena na 150 V cca jedan sat.
3.2.6. Elektroblot proteina s akrilamidnog gela na nitroceluloznu membranu
Nakon elektroforeze proteina gel je uronjen u renaturirajući pufer i inkubiran 10 minuta. Blotiranje se radi s transfer puferom koji se sastoji od TBS-a i metanola. Kompleks za bloting koji se sastoji od filter papira, gela i membrane uklopljen u transfer puferu blotira se 30 minuta na 25V/110mA.
3.2.7. KemiluminiscencijaProteini blotirani na membrani postaju vidljivi nakon inkubacije membrane sa protutijelima obilježenim biotinom i streptavidinom konjugiranim s peroksidazom koja razgradi supstrat luminol/jodofenol. Kemiluminiscentni signal se zabilježi izlaganjem membrane na film. Vrijeme ekspozicije je različito; od nekoliko sekundi do 30 minuta.
4. REZULTATI
4.1. Morfološke promjene na BV-2 mikroglija stanicama u uvjetima in vitro kontrolirane hipoksije
22
Slika 1. Mikroskopska analiza stanica mikroglije nakon 6h izloženosti hipoksiji.
Fazno-kontrastnom mikroskopijom analiziran je odgovor stanica na uvjete hipoksije. Uočena promjena staničnog fenotipa kroz morfološke karakteristike predstavlja indirektan pokazatelj stanične aktivacije. Promjene su praćene nakon 6h hipoksije kontinuirano kroz period od 24h, 48h, 72h i 168h (7dan). U usporedbi sa kontrolom (1.1) gdje je vidljiv
23
1.1 Kontrola 1.2 0’ nakon 6h hipoksije
1.3 24h nakon 6h hipoksije 1.4 48 nakon 6h hipoksije
1.5 72h nakon 6h hipoksije 1.6 168 h nakon 6h hipoksije
dvojni fenotip stanica, kod stanica analiziranih neposredno nakon hipoksije (1.2) vidljiva je istovjetna promjena morfoloških karakteristika kao i na slici koja prikazuje stanice nakon 24 sata (1.3). Stanice izgledaju okruglastije i smatramo da je taj izgled upućuje na stanje prije potpune aktivacije. Na slikama koje prikazuju promjene nakon 48 i 72 sata nakon hipoksije (1.4, 1.5) također je vidljiv dvojni fenotip stanica. Neke stanice imaju razgranatiji, a neke okruglastiji izgled. Očito je da nisu sve stanice isto reagirale na hipoksiju, te da postoji više različitih vrsta. Stanice sa slike nakon perioda od 168 h (1.6) pokazuju samo razgranati oblik.
4.2. Ekspresija pokazatelja oksidativnog stresa i upale BV-2 mikroglija stanica u uvjetima in vitro kontrolirane hipoksije
24
Slika 2. Reprezentativni uzorci blotova mjerenja razine ekspresije parametara oksidacijskog stresa (iNOS) te upale i oštećenja (COX-2, Hsp70, IL-1β, MHC II) iz skupina kontrola te BV-2 mikroglija stanice izložene hipoksiji tijekom 6 sati.
25
Slika 3. Učinak in vitro hipoksije na ekspresiju iNOS-a u BV-2 mikroglija stanicama neposredno nakon te 24 h, 48 h, 72 h i 168 h po završetku hipoksije: Denzitometrijska analiza blotova (iNOS/β-aktin omjer). Razine ekspresije iNOS-a su izražene kao postotak apsolutne vrijednosti pripadajuće kontrolne skupine.
26
Slika 4. Učinak in vitro hipoksije na ekspresiju COX-2 u BV-2 mikroglija stanicama neposredno nakon te 24 h, 48 h, 72 h i 168 sati po završetku hipoksije: Denzitometrijska analiza blotova (COX-2/β-aktin omjer). Razine ekspresije COX-2 su izražene kao postotak apsolutne vrijednosti pripadajuće kontrolne skupine.
27
Slika 5. Učinak in vitro hipoksije na ekspresiju Hsp70 u BV-2 mikroglija stanicama neposredno nakon te 24 h, 48 h, 72 h i 168 sati po završetku hipoksije: Denzitometrijska analiza blotova (Hsp70/β-aktin omjer). Razine ekspresije Hsp70 su izražene kao postotak apsolutne vrijednosti pripadajuće kontrolne skupine.
28
Slika 6. Učinak in vitro hipoksije na ekspresiju IL-1β u BV-2 mikroglija stanicama neposredno nakon te 24 h, 48 h, 72 h i 168 sati po završetku hipoksije: Denzitometrijska analiza blotova (IL-1β/β-aktin omjer). Razine ekspresije IL-1β su izražene kao postotak apsolutne vrijednosti pripadajuće kontrolne skupine.
29
Slika 7. Učinak in vitro hipoksije na ekspresiju MHC I u BV-2 mikroglija stanicama neposredno nakon te 24 h, 48 h, 72 h i 168 sati po završetku hipoksije: Denzitometrijska analiza blotova (MHC I/ β-aktin omjer). Razine ekspresije MHC I su izražene kao postotak apsolutne vrijednosti pripadajuće kontrolne skupine.
30
Učinjena je Western blot analiza razine ekspresije pokazatelja oksidativnog stresa (iNOS), te upale i oštećenja (COX-2, Hsp70, IL-1β, MHC I) u BV-2 mikroglija stanicama koje su tijekom 6 sati bile izložene uvjetima jake hipoksije. Gore spomenuti pokazatelji mjereni su neposredno nakon te 24 h, 48 h, 72 h i 168 sati po završetku hipoksije (Slika 2-7).
Temeljem rezultata prikazanih (Slika 3), evidentno je da izlaganje BV-2 stanica mikroglije uvjetima hipoksije dovodi do postupnog, kontinuiranog povećanja ekspresije iNOS-a kao pokazatelja izloženosti oksidacijskom stresu. Rast ekspresije iNOS-a vidljiv je već neposredno nakon prekida izlaganja hipoksiji dok se najizrazitije promjene bilježe nakon 168 sati. Rezultati prikazani na ostalim slikama pokazuju da morfološke promjene uslijed aktivacije stanica nisu uvjetovane samo oksidacijskim stresom nego i upalom. Naime vidljivo je da dolazi do značajne ekspresije COX-2 (Slika 4) odmah po završetku hipoksičnih uvjeta uz postupni rast izražaja navedenog proteina, uz maksimalni porast nakon 168 sati. Sličan vremenski slijed i intenzitet ekspresije bilježi se i u uzorcima mjerenja MHC I (Slika 7) dok mjerenja razine ekspresije Hsp70 pokazuju također brz porast ekspresije, uz maksimalni izražaj postignut nakon 48 sati te postepeno smanjivanje u vremenskom period nakon toga (Slika 5). Sličnu dinamiku ekspresije pokazuje i IL-1β (Slika 6)
31
5. RASPRAVA
5.1. Morfološke promjene na BV-2 mikroglija stanicama u uvjetima in vitro kontrolirane hipoksije
Prvi cilj ovog rada bio je morfološki dokazati aktivaciju mikroglija stanica u odgovoru na hipoksiju. Dobiveni rezultati pokazuju potpunu aktivaciju BV-2 modela mikroglija stanica 48 sati nakon hipoksije, ali je vidljivo da stanice i neposredno nakon izvlačenja iz komore pokazuju promjenu u morfologiji iz razgranatog u aktivirani nerazgranati oblik. Rezultati prijašnjih istraživanja u kojima su stanice mikroglije izložene nekom upalnom poremećaju upućuju da aktivacija morfološki znači da smanjuje svoju razgranatost i postiže zaobljeniji oblik (41). Osim rada Shenga i suradnika napravljena su i mnoga druga istraživanja vezana uz promjenu morfologije te postoje razna tumačenja remodeliranja i plastičnosti stanica mikroglije (42,43,44).
5.2. Ekspresija pokazatelja oksidativnog stresa i upale BV-2 mikroglija stanica u uvjetima in vitro kontrolirane hipoksije
Rezultati Western blot biokemijskih analiza također upućuju na aktivaciju mikroglija stanica. Naime, vidljivo je da uz promjene morfologije stanica dolazi i do pojačane ekspresije pokazatelja oksidacijskog stresa i upalnog oštećenja, u usporedbi s kontrolnim vrijednostima. Ovisno o vremenu praćenja (0', 24h, 48h, 72h, 168h), i ekspresija ispitivanih pokazatelja oksidacijskog stresa i upalnog oštećenja te morfološka aktivacija stanica se proporcionalno povećavala.
Iz dobivenih rezultata vidljivo je da dolazi do pojačane ekspresije iNOS-a neposredno po završetku hipoksičnog stresa te da porast razine ekspresije postupno raste s maksimumom postignutih vrijednosti nakon 168 sati. Navedeno ukazuje na brz razvoj oksidacijskog stresa koji progredira tijekom 7 dana, paralelno s morfološkom aktivacijom stanica. U nizu ispitivanja hipoksije/ishemije moždanih struktura pa i mikroglija stanica u in vivo uvjetima (npr. eksperimentalni modeli moždanog udara te imunohistološke analize humanog mozga tijekom autopsije) pokazano je da inducibilni odnosno imunološki oblik NOS-a (iNOS) biva pojačano izražen uslijed oksidacijskog stresa nakon ishemičnog inzulta. Navedeni parametar kao pokazatelj hipoksično-ishemičnog oštećenja stanice predstavlja i često korišteni model ispitivanja potencijalno korisnih lijekova koji bi mogli inhibicijom ekspresije i aktivacije iNOS-a spriječiti daljne
32
širenje oštećenja moždanih struktura. U istraživanju H. M. Gibbons-a (40) koji je izazvao aktivaciju BV-2 stanice mikroglije lipopolisaharidom, rezultati pokazuju povećanu ekspresiju ciklooksigenaze (COX-2) i inducibilne NO sintetaze (iNOS). Slično našim rezultatima, i u ovih je autora ekspresija COX-2 bila inicijalno brza i izraženija, iako nakon 168 sati oba proteina bilježe otprilike istu razinu ekspresije. Navedeno ukazuje na zaključak da je upalni parametar vjerojatno dominantan te posljedično dovodi do aktivacije mehanizama oksidacijskog stresa iako podaci iz različitih studija navode na zaključak da nije jednostavno precizno definirati koji proteini se prvi eksprimiraju i je li prvotno oksidacijski stres taj koji izaziva upalu ili je upala ta koja povećava broj slobodnih radikala. Ipak, u većini radova je otkriveno djelovanje i povezanost inducibilnih izoformi (COX-2 i iNOS) u uvjetima hipoksije i ishemije, neovisno o korištenom modelu, uz ekspresiju niza drugih proupalnih stimulansa kao npr. superoksida, NF-B, prostaglandina i dušičnog oksida (NO) (45). Navedeno upućuje na zaključak da pojačana aktivacija mikroglije dovodi do daljnjeg povećanja i amplifikacije neuronalnog oštećenja uvjetovanog hipoksičnim stimulusom i posljedično dovodi do širenja oštećenja na okolne neurone (reaktivna mikroglioza).
Y. J. Kim i suradnici (2006) su proučavali stanične interakcije između medijatora otpuštenih od strane mikroglija stanica i inducibilne sintetaze (iNOS) te je pokazano da je IL-1 jedan od prvih proteina koji se eksprimiraju na mikrogliji u uvjetima hipoksičnog oštećenja te da je ključan regulator u indukciji iNOS-a. Pokazano je i da je pojačana ekspresija IL-1 prisutna ne samo u uvjetima akutnog oštećenja nego i u ljudskom mozgu tijekom starenja. Nadalje, inkubacija IL-1 neutralizirajućeg IL-1 protutijela umanjuje stvaranje dušićnog oksida (NO) koji se stvara uz pomoć iNOS preko NF-B signalnog puta (46) što ukazuje na mogućnost farmakološke manipulacije navedenim parametrom potencijalnog oštećenja. Rezultati našeg istraživanja pokazuju također povećanu ekspresiju citokina IL-1. Ekspresija IL-1 postigla je maksimalnu vrijednost u odnosu na kontrolu skupinu 48 h sati nakon hipoksije, uz kasnije smanjenje razine ekspresije. Navedena dinamika ekspresije IL-1 je u skladu s očekivanjima jer se radi o jednom od prvih proteina koji se aktiviraju nakon stresogenog stimulusa. Sličan maksimum aktivacije zabilježen je i u slučaju heat shock proteina Hsp70 tj. 48 h nakon hipoksije. Prvi koji su prikazali rezultate povećane ekspresije Hsp70 nakon ishemije su Nowak i Ikeda (47). U njihovom radu Hsp70 je promatran kao marker vijabilnosti živčanih stanica što je bilo dovoljno da se pretpostavi njegova imunoregulativna uloga u upali mozga i dobar temelj za mnoga druga istraživanja čije su rezultate objedinili Yenari i suradnici (48). Pregledni članak pokazuje imunoprotektivnu i protuupalnu ulogu Hsp70 u raznim modelima ozljede mozga odnosno živčanog sustava. Da bi u
33
potpunosti razumjeli mehanizme njegova djelovanja potrebne su daljnje studije, ali radovi Shepparda (49) i Changa (50) detaljno su opisali navedene mehanizme i ulogu Hsp70 u staničnom oštećenju. Naime, Hsp70 ima negativan utjecaj na fosforilaciju u NF-B signalnom putu, te na taj način smanjuje produkciju NOS-a i samu aktivaciju mikroglije te u konačnici štiti neurone od trajnog oštećenja. Iako je uloga Hsp70 u uvjetima hipoksije/ishemije kontroverzna, većina autora smatra da se radi o markeru koji je pokazatelj staničnog stresa i koji iskazuje potencijalno neuroprotektivno djelovanje putem anti-inflamacijskih mehanizama. Pojačana ekspresija Hsp70 u našem modelu pokazuje brzu aktivaciju mehanizama koji vjerojatno pokušavaju spriječiti stanično oštećenje. Obzirom da nakon 48 sati dolazi do pada aktivacije, uz izraziti porast pokazatelja stresa i upale kao što su iNOS i COX-2, evidentno je da su toksični stimulusi nadvladali pokušaj Hsp70 protektivnog mehanizma.
Analizirali smo i eksprimiranost MHC I proteina na aktiviranim mikroglija stanicama. Radi se o osjetljivom pokazatelju mehanizama uključenih u imunološke reakcije tkiva te postishemičnih promjena odnosno reaktivnosti tkiva. Poznato je da kod hipoksije ili nekog degenerativnog poremećaja mozga, periferni T limfociti migriraju kroz krvno moždanu barijeru do mjesta ozljede, ali malo se zna o mehanizmu djelovanja. Rad Yanga (51) dokazuje da BV-2 mikroglija stanice potaknute na aktivaciju, luče TNF- koji potiče eksprimiranje MHC I molekula na endotelu krvnih žila. Daljnji transmigracijski i adhezijski pokusi pokazuju da je povećana ekspresija MHC I molekula povezana s transendotelnom migracijom T stanica. Naši rezultati pokazuju brzu indukciju ekspresiju MHC I molekula koja se povećava tijekom vremena i najviše vrijednosti doseže nakon 168 sati od završetka hipoksičnog stimulusa.
Iz svega iznesenog, evidentno je da je aktivacija mikroglija stanica brzi pokazatelj staničnog odgovora na hipoksiju. Mikroglija proliferira, migrira do mjesta oštećenja, povećava ekspresiju različitih površinskih pokazatelja oštećenja te se transformira u fagocite koji su zaduženi za uklanjanje nekrotičnih neurona uz uvažavanje integriteta neurona u okolici koji su preživjeli oštećenje. Budući da njena aktivacija započinje vrlo brzo, predstavlja prethodnicu morfološki detektibilnih neuroloških promjena. U funkcionalnom smislu, aktivacija mikroglije može biti mač s dvije oštrice. S jedne strane može iskazati citotoksične učinke aktivacijom i otpuštanjem različitih medijatora upale i oštećenja npr. reaktivnih kisikovih spojeva, NO, proteinaza i proupalnih citokina, ali s druge strane može poticati i oporavak tkiva lučenjem neuroprotektivnih faktora uključenih u zaštitu neurona. Post-ishemične farmakološke modulacije mikroglijalnog odgovora mogu pomoći u poboljšanju strukturnih i funkcionalnih ishoda nakon cerebralne hipoksije/ishemije. U
34
tom smislu su provedena istraživanja kao npr. istraživanje K. N. Nama i suradnika (2013.) (39) koje pokazuje inhibiciju aktivacije mikroglije butilideneftalidom (BP). BP djeluje neuroprotektivno smanjujući otpuštanje proupalnih molekula od strane aktiviranih mikroglija. BP smanjuje proizvodnju dušićnog oksida (NO), tumor nekrozirajućeg faktora (TNF-) i interleukina (IL-1). Također u mnogim istraživanjima korišteni su i drugi inhibitori. U radu Alexandra Cupida korišten je Rimidyl (52) koji smanjuje ekspresiju ciklooksigenaze 2 (COX-2), a lipokortin 1 u radu Minghettija (53) koji uz COX-2 inhibira i inducibilnu sintetazu (iNOS). Istraživanje Choia i Parka (54) sa astaksantinom pokazuje da dolazi do smanjenja produkcije NO i ekspresije COX-2 i iNOS-a. Nadalje, torilin djeluje na mnoge signalne puteve kao npr. MAPK/ERK i NF-B i tako inhibira iNOS, COX-2 i IL-1 (55). Neuropeptid Y (56, 57), a i mnogi drugi inhibitori, predmet su velikog broja istraživanja jer smanjuju negativne efekte IL-1 i djeluju na mobilnost mikroglije.
Dobiveni rezultati pokazuju da je in vitro model hipoksije uspješno uspostavljen, a daljnja ispitivanja potrebna su radi evaluacije i potvrde prezentiranih preliminarnih rezultata.
6. ZAKLJUČAK
1. Izlaganje BV-2 mikroglija stanica uvjetima kontrolirane in vitro hipoksije dovodi do njihove aktivacije što je evidentno promjenom u morfologiji stanica.
35
2. Aktivacija stanica uvjetovana je oksidacijskim stresom (ekspresija iNOS) i upalnim odgovorom (ekspresija COX-2, Hsp70; MHC I, IL-1β).
3. Promjene morfologije i ekspresija pokazatelja oksidacijskog stresa i upale vremenski su determinirane.
4. Temeljem dobivenih rezultata evidentno je da je model in vitro hipoksije uspješno uspostavljen.
LITERATURA
1. C. Guyton, J. E. Hall. Medicinska fiziologija. Medicinska naklada 2006.2. U. Dirnagl, C. Iadecola, M. A. Moskowitz. Pathobiology of ischaemic
stroke: an integrated view. Trends Neurosci 1999; 22:391-73. R. L. Martin, H.G Lloyd, A.I. Cowan. The early events of oxygen and
glucose deprivation: setting the scene for neuronal death?. Trends in Neuroscience 1994; 17:251-7
4. K. Park, D. G. Nehls, G. M. Teasdale, J. McCulloch. Effect of the NMDA antagonist MK-801 on local cerebral blood flow in focal cerebral ischaemia in the rat. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 1989; 9:617-22
36
5. G. Y. Sun, J. Xu, M. D. Jensen, S. Yu. Phospholipase A2 in astrocytes: responses to oxidative stress, inflammation, and G protein-coupled receptor agonists. Molecular Neurobiology 2005; 31:27-41
6. K. A. Hossman. Periinfarct depolarizations. Cerebrovascular and brain metabolism reviews 1996; 8:195-208
7. F. C. Barone, G. Z. Feuerstein. Inflammatory mediators and stroke: new opportunities for novel therapeutics. J Cereb Blood Flow Metab 1999; 19:819-34
8. Y. Zhu, G. Y. Yang, B. Ahlemeyer, L. Pang, X. M. Che, C. Culmsee, S. Klumpp, J. Krieglstein. Transforming growth factor-beta 1 increases bad phosphorylation and protects neurons against damage. J Neurosci 2002; 22:3898-909
9. P. A Spera, J. A. Ellison, G. Z. Feuerstein, F. C. Barone. IL-10 reduces rat brain injury following focal stroke. Neurosci Lett 1998; 251:189-92
10. W. M. Clark, L.G. Rinker, N.S. Lessov, K. Hazel, F. Eckenstein. Time course of IL-6 expression in experimental CNS ischemia. Neurol Res 1999; 21:287-92
11. J. S. Kim, S. C. Gautam, M. Chopp, C. Zaloga, M. L. Jones, P. A. Ward, K. M. A. Welch. Expression of monocyte chemoattractant protein-1 and macrophage inflammatory protein-1 after focal cerebral ischemia in the rat. J Neuroimmunol 1995; 56:127-34
12. G. Yilmaz, D. N. Granger. Cell adhesion molecules and ischemic stroke. Neurol Res 2008; 8:783-93
13. J. Montaner, J. Alvarez-Sabin, C. Molina, A. Angles, S. Abilleira, J. Arenillas, M. A. Gonzalez, J. Monasterio. Matrix metalloproteinase expression after human cardioembolic stroke: temporal profile and relation to neurological impairment. Stroke 2001; 32:1759-66
14.M. Asahi, X. Wang, T. Mori, T. Sumii, J. C. Jung, M. A. Moskowitz, M. E. Fini, E. H. Lo. Effects of matrix metalloproteinase-9 gene knock-out on the proteolysis of blood-brain barrier and white matter components after cerebral ischemia. J Neurosci 2001; 21: 7724-32
15. M. D. Sharma, B. Baban, P. Chandler, D. Y. Hou, N. Singh, H. Yagita, M. Azuma, B. R. Blazar, A. L. Mellor, D. H. Munn. Plasmacytoid dendritic cells from mouse tumor-draining lymph nodes directly activate mature Tregs via indoleamine 2,3-dioxygenase. J Clin Invest 2007; 117:2570-82
16. J. C. O'Connor, C. Andre, Y. Wang, M. A. Lawson, S. S. Szegedi, J. Lestage, N. Castanon, K. W. Kelley,R. Dantzer. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha mediate the upregulation of indoleamine 2,3-dioxygenase and the induction of depressive-like behavior in mice in response to bacillus Calmette-Guerin. J Neurosci 2009; 29:4200-9
17. Liesz, E. Suri-Payer, C. Veltkamp, H. Doerr, C. Sommer, S. Rivest, T. Giese, R. Veltkamp. Regulatory T cells are key cerebroprotective immunomodulators in acute experimental stroke. Nat Med 2009; 15:192-9
18. M. Leist, P. Nicotera. Apoptosis, excitotoxicity, and neuropathology. Exp Cell Res 1998; 239:183-201
19. R Broughton, D. C. Reutens, C. G. Sobey. Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia. Stroke 2009; 40:331-9
37
20. M. Valko, D. Leibfritz, J. Moncol, M. T. Cronin, M. Mazur, J. Telser. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol 2007; 39:44-84
21. Z. S. Vexler, X. N. Tang, M. A. Yenari. Inflammation in adult and neonatal stroke. Clin Neurosci Res 2006; 6:293-313
22. T. Kristian, B. K. Siesjo. Calcium in ishemic cell death. Stroke 1998; 29:705-18
23. F. R. Walker, S. B. Beynon, K. A. Jones, Z. Zhao, R. Kongsui, M. Cairns, M. Nilsson. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain Behav Immun. 2014. 37: 1-14
24. P. del Rio-Hortega. Microglia. Cytology and cellular pathology of the nervous system 1932.
25. J. T. Voyvodic. Cell death in cortical development: how much? Why?So what?. Neuron 1996; 16:693-6
26. R. B. Rock, G. Gekker, S. Hu, W. S. Sheng, M. Cheeran, J. R. Lokensgard, P. K. Peterson. Role of microglia in central nervous system infections. Clin Microbiol Rev 2004; 17:942-64
27. M Mittelbronn, K. Dietz, H. J. Schluesener, R. Meyermann. Local distribution of microglia in the normal adult human central nervous system differs by up to one order of magniture. Acta Neuropathol 2001; 101:249-55
28. U. K. Hanisch, H. Kettenmann. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci 2007; 10:1387-94
29. H. G. Fischer, G. Reichmann. Brain dendritic cells and macrophages/microglia in central nervous system inflammation. J. Immunol 2001; 166:2717-26
30. R. L. Blaylock, J. Maroon. Immunoexcitotoxicity as a central mechanism in chronic traumatic encephalopathy-A unifying hypothesis. Surg Neurol Int 2011; 2:107
31. A. Henn, S. Lund, M. Hedtjarn, A. Schrattenholz, P. Porzgen, M. Leist. The suitability of BV2 cells as alternative model system for primary microglia cultures or for animal experiments examining brain inflammation. ALTEX 2009; 26:83-94
32. S. Lund, P. Porzgen, A. L. Mortensen, H. Hasseldam. Inhibition of microglial inflammation by the MLK inhibitor CEP-1347. J Neurochem. 2005; 92:1439-51
33. U. A. Hirt, M. Leist. Rapid, noninflammatory and PS-dependent phagocytic clearance of necrotic cells. Cell Death Differ 2003; 10:1156-64
34. T. A. Samad, K. A. Moore, A. Sapirstein, S. Billet, A. Allchorne, S. Poole. Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS. Nature 2001; 410:471-5
35. R. Sanchez-Pernaute, A. Ferree, O. Cooper, M. Yu, A. L. Brownell, O. Isacson. Selective COX-2 inhibition prevents progressive dopamine neuron degeneration in a rat model of Parkinson's disease. J Neuroinflammation 2004; 1:6
38
36. T. J. Borges, L. Wieten, M. J. van Herwijnen, F. Broere, R. van der Zee, C. Bonorino, W. van Eden. The anti-inflammatory mechanisms of Hsp70. Front Immunol 2012; 3:95
37. M. Ding, B. A. St. Pierre, J. F. Parkinson, P. Medberry, J. L. Wong, N. E. Rogers, L. J. Ignarro, J. E. Merrill. Inducible nitric-oxide synthase and nitric oxide production in human fetal astrocytes and microglia. J. Biol. Chem 1997; 272:11327-35
38. N. Said-Sadier, D. M. Ojcius. Alarmins, inflamasomes and immunity. Biomed J 2012; 35:437-49
39. X. Sheng, L. Xingguang, B. Yan, Z. Xuhui, H. Chaofeng. Constitutive MHC class I molecules negatively regulate TLR-triggered inflammatory responses via the Fps–SHP-2 pathway. Nature immunology 2011; 13:551-559
40. K. N. Nam, K. Kim, K. Cho, W. Jung, J. Park, S. Cho, S. Park. Prevention of inflammation-mediated neurotoxicity by butylidenephthalide and its role in microglial activation. Cell Biochem Funct. 2013. 31: 707-712
41. H. M. Gibbons. Microglial activation and inhibition: implications for neurodegeneration. The University of Auckland. 2004;
42. J. G. Sheng, R. E. Mrak, W. S. Griffin. Neuritic plaque evolution in Alzheimer's disease is accompanied by transition of activated microglia from primed to enlarged to phagocytic forms. Acta Neuropathol. 1997 94:1-5.
43. S. Rasmussen, Y. Wang, P. Kivisäkk, R. T Bronson, M. Meyer, J. Imitola, SJ. Khoury. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing--remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 2007. 130: 2816-2829
44. J. J Rodríguez, H. N. Noristani, T. Hilditch, M. Olabarria, C. Y. Yeh, J. Witton, A. Verkhratsky. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease. Neurosci lett. 2013. 552: 129-134
45. Minagar, P. Shapshak, R. Fujimura, R. Ownby, M. Heyes, C. Eisdorfer. The role of macrophage/microglia and astrocytes in the pathogenesis of three neurologic disorders: HIV-associated dementia, Alzheimer disease, and multiple sclerosis. J Neurol Sci. 2002. 202: 13-23
46. L. Minghetti, A. Nicolini, E. Polazzi, C. Créminon, J. Maclouf, G. Levi. Inducible nitric oxide synthase expression in activated rat microglial cultures is downregulated by exogenous prostaglandin E2 and by cyclooxygenase inhibitors. Glia. 1997. 19: 152-160
47. Y. J. Kim, S. Y. Hwang, E. S. Oh, S. Oh, I. O. Han. IL-1beta, an immediate early protein secreted by activated microglia, induces iNOS/NO in C6 astrocytoma cells through p38 MAPK and NF-kappaB pathways. J Neurosci Res. 2006. 84:1037-1046
48. T. S. Nowak, J. Ikeda, T. Nakajima. 70-kDa heat shock protein and c-fos gene expression after transient ischemia. Stroke. 1990. 21:107-11
49. M. A. Yenari, R. G. Giffard, R. M. Sapolsky, G. K. Steinberg. The neuroprotective potential of heat shock protein 70 (HSP70). Mol Med Today. 1999 5: 525-531.
39
50. P. W. Sheppard, X. Sun, M. Khammash, R. G. Giffard. Overexpression of heat shock protein 72 attenuates NF-κB activation using a combination of regulatory mechanisms in microglia. PLoS Comput Biol. 2014. 10
51. C Chang, S. D. Chen, T. K. Lin, W. N. Chang, C. W. Liou, A. Y. Chang, S. H. Chan, Y. C. Chuang. Heat shock protein 70 protects against seizure-induced neuronal cell death in the hippocampus following experimental status epilepticus via inhibition of nuclear factor-κB activation-induced nitric oxide synthase II expression. Neurobiol Dis. 201462:241-9.
52. Y. M Yang, D. S. Shang, W. D. Zhao, W. G. Fang, Y. H. Chen. Microglial TNF-α-dependent elevation of MHC class I expression on brain endothelium induced by amyloid-beta promotes T cell transendothelial migration. Neurochem Res 2013; 38: 2295-304.
53. Cupido, B. Catalin, F. Kirchhoff. Cox-2 inhibitors reduce microglia inflammation in vivo. Confrence: Glia 2014
54. L. Minghetti, A. Nicolini, E. Polazzi, A. Greco, M. Perretti, L. Parente, G. Levi. Down-regulation of microglial cyclo-oxygenase-2 and inducible nitric oxide synthase expression by lipocortin 1. Br J Pharmacol 1999; 126:1307-14.
55. S. K. Choi, Y. S. Park, D. K. Choi, H. I. Chang. Effects of astaxanthin on the production of NO and the expression of COX-2 and iNOS in LPS-stimulated BV2 microglial cells. J Microbiol Biotechnol 2008; 18:1990-6.
56. Y. Choi, M. K. Lee, S. Y. Lim, S. H. Sung, Y. C. Kim. Inhibition of inducible NO synthase, cyclooxygenase-2 and interleukin-1beta by torilin is mediated by mitogen-activated protein kinases in microglial BV2 cells. Br J Pharmacol 2009; 156:933-40.
57. R. Ferreira, T. Santos, M. Viegas, L. Cortes, L. Bernardino, O. V. Vieira, J. O. Malva. Neuropeptide Y inhibits interleukin-1β-induced phagocytosis by microglial cells. J Neuroinflammation 2011; Dec 2; 8:169
58. R. Ferreira, T. Santos, L. Cortes, S. Cochaud, F. Agasse, A. P. Silva, S. Xapelli, J. O. Malva. Neuropeptide Y inhibits interleukin-1 beta-induced microglia motility. J Neurochem 2012; 120:93-105.
40
ZAHVALA
Zahvaljujem svojim mentorima, prof. dr. sc. Jasenki Mršić Pelčić i prof. dr. sc. Nataliji Kučić na nesebičnoj pomoći, brojnim savjetima i konstruktivnim kritikama. Zahvaljujem svojim roditeljima i sestri na pruženoj podršci i strpljenju.
41
ŽIVOTOPIS
PERSONAL INFORMATION Mia Merlak
Kalvarija 16b, 51000 Rijeka (Croatia)
0912280955
Sex Female | Date of birth 1 Sep 90 | Nationality Croatian
42
WORK EXPERIENCE
2012 Manufacturing labourerJadran Galenski Laboratorij, Rijeka (Croatia)
EDUCATION AND TRAINING
2005–2009 Srednja stručna spremaPrva riječka hrvatska gimnazija, Rijeka (Croatia)
2009–2012 Sveučilišni prvostupnik biotehnologijeSveučilište u Rijeci, Odjel za biotehnologiju, Rijeka (Croatia)
2012–Present Magistar biotehnologije u mediciniSveučilište u Rijeci, Odjel za biotehnologiju, Rijeka (Croatia)
2006 English language courseUniversity of Cambridge, Cambridge (United Kingdom)
12/06/2013
Waters Institute, Bohinjska Bistrica (Slovenia)
Seminar (tekućinska kromatograija, masena spektrometrija, laboratorijska informatika, mikrokalorimetrija)
07/07/2013–13/07/2013 Summer SchoolMass Spectrometry in Biotechnology & Medicine, Dubrovnik (Croatia) http://www.msbm.org/Home.html
14/06/2013–27/06/2013 Summer SchoolPatofiziologija aktualnih javnozdravstvenih problema i bolesti, Rijeka (Hrvatska)
PERSONAL SKILLS
Mother tongue(s) Croatian
Other language(s) UNDERSTANDING SPEAKING WRITING
Listening Reading Spoken interaction Spoken production
English C1 C2 C1 C1 C1
talijanski B1 B2 A2 B1 B1
Levels: A1/A2: Basic user - B1/B2: Independent user - C1/C2: Proficient userCommon European Framework of Reference for Languages
Communication skills - rad u timu i individualno- prezentacijske i govorničke vještine stečene na seminarima
Job-related skills -kultiviranje stanica
-rad na svjetlosnom mikroskopu-gel-elektroforeza-Western blot
Computer skills MS Office, HTML, Statistica, PyMol, Chimera,
43
Driving licence AM, B
44
