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資料5 補足資料
令和元年12月26日
経済産業省 化学物質管理課
第1回省エネ型電子デバイス材料の評価技術の開発事業(機能性材料の社会実装を支える高速・高効率な
安全性評価技術の開発)中間評価検討会資料5 参考
1
研究開発項目
① 毒性発現メカニズムに基づく毒性評価技術の開発
(a) 薬物動態モデル等を活用した化学物質の体内動態評価技術の開発
(b) 細胞の化学物質応答性評価を基盤とする毒性評価技術の開発
– ア.薬物代謝酵素
– イ.胆汁酸トランスポーター
– ウ.核内受容体
– エ.肝細胞傷害
– オ.細胞小器官
– カ.細胞ストレス応答
– キ.非実質細胞(マクロファージ細胞)
– ク.遺伝子発現
② 人工知能を活用した予測モデルの開発(生体レベルでの毒性評価・予測
を実現する情報技術の開発)
– ア.肝毒性の6つのエンドポイントを対象としたプロトタイプシステムを構築
– イ.データマトリクスの構築
– ウ.インビトロ実験値予測モデルの構築
– エ. Tox-21活性スコア予測モデルの構築
2
研究開発項目① 毒性発現メカニズムに基づく毒性評価技術の開発(a) 薬物動態モデル等を活用した化学物質の体内動態評価技術の開発
(1)目標 生理学的薬物動態モデルを活用した、化学物質の体内濃度の推定手法の開発
(2)内容と成果 予測元となる対象物質のケミカルスペースを、東大院工 船津小寺研究室にて、5万物質の記述子を25区画で2次元可視化し、それらの多様性を確認・・・・予測モデル構築に用いた物質がモデル構築に有効である(一般化学物質は多様)
In vitro Caco-2 cell permiabiity measured
-1 1-1
1PBPK modeling of 159 compounds in rats
-1 1-1
1
Kamiya, Funatsu, Yamazaki et al. Chem. Res. Toxicol. 32:211-218, 2019; Yamazaki & Kamiya,
Toxicol. Res. 4, 295-301, 2019 と未発表データ
3
研究開発項目① 毒性発現メカニズムに基づく毒性評価技術の開発(a) 薬物動態モデル等を活用した化学物質の体内動態評価技術の開発
(1)目標 化学物質の体内濃度の推定手法の開発・・・消化管吸収の予測が極めて重要。さらに標的臓器での蓄積性の予測が毒性発現に重要な要素
(2)内容および成果 多様性を確保した化合物のin vitro生体膜透過係数を実測し、物性値から予測
消化管
小腸 門
脈 肝臓
全身循環
Basal side
(pH 7.4)
Polycarbonate
membrane
Apical side
(pH 6.0)
Human
Caco-2
cell sheet
0 500 1000
0
500
1000n = 14r = 0.85
p < 0.01
Papp, nm/s, rat intestine (IEC-18)
Papp, nm
/s, C
aco-2
腸管の pH 勾配を模倣した培養細胞系を利用
ヒトとラット由来細胞系での物質の膜透過係数は概ね比例
膜透過係数とHESS
掲載ラット肝 NOEL
に有意な逆相関
Kamiya, Funatsu, Yamazaki et al. Chem.Res.Toxicol. 32:211-218, 2019
0 2 40
2
4
Predicted logPapp
Observ
ed
logP
app
対象物質の分子量、logDapicalおよびlogDbasal を
説明変数として用いることで、化合物の in vitro 膜透
過係数を高精度かつ簡便に予測可能
膜透過
Kamiya, Funatsu, Yamazaki et al. Toxicol Rep, in revision
経口投与された物質の生体内運命
1 2 3
0
600
1200
Log(apparent permeability coefficient)
NO
EL, m
g/k
g/d
ay, fo
rhepato
toxic
ity
r = –0.88
p < 0.01
n = 27
r = 0.80
p < 0.01
n = 104
4
研究開発項目① 毒性発現メカニズムに基づく毒性評価技術の開発(a) 薬物動態モデル等を活用した化学物質の体内動態評価技術の開発
(1)目標 生理学的薬物動態モデルを活用した、化学物質の体内濃度(血中、肝臓等)の推定手法の開発(2)内容および成果 多様な159化合物のPBPKモデルパラメータを決定し、肝中濃度と毒性の関係精査
ka
Central V1
Liver Vh
Gut
clearance, CLh,int
clearance, CLr
FaFg
0 6000 120000
400
800
AUC in liver, ng h/mLL
OE
L,
mg
/kg
/da
y,
for
hepato
toxic
ity
r = -0.78p < 0.05
n = 7
After virtural oral administrationof 1.0 mg/kg to rats
化合物 CAS No.
PBPK
parametersPBPK modeling results
Ka,
1/h
V1,
L
CLh,int,
L/h
Cmax,
ng/mL
AUC,
ng h/mL
Liver
Cmax,
ng/mL
Liver
AUC, ng
h/mL
2-Mercaptobenzimidazole 583-39-1 1.9 1.6 0.1 172 2500 2550 11600
4-Nonylphenol 84852-15-3 1.4 1.2 48.4 203 1350 2440 6570
Paraacetaldehyde 123-63-7 2.9 0.2 0.1 1070 7930 840 5960
1,2,3-Trimethylbenzene 526-73-8 1.4 1.6 7.3 30 180 630 1130
1,2,4-Trimethylbenzene 95-63-6 1.5 1.7 7.6 29 175 683 1110
m-Cresol 108-39-4 2.9 0.1 2.0 459 421 913 668
Bisphenol A 80-05-7 3.5 2.6 62.4 14 66 1070 373
仮想投与(1 mg/kg)後肝中濃度面積AUCと血中AUCの相関係数は低い
調べた範囲において、単回投与時の1
日肝中濃度時間曲線下面積 (AUC) と最小作用量 (LOEL) は有意な逆相関
100 101 102 103 104 105 106100
101
102
103
104
105
106
AU
C in
liver,
ng
h/m
L
by P
BP
K m
od
elr = 0.61p < 0.0001n = 159
AUC in plasma, ng h/mLby PBPK model
生理学的薬物動態(PBPK)モデル概念図
Kamiya, Funatsu, Yamazaki et al. Chem.Res.Toxicol. 32:211-218, 2019
5
研究開発項目① 毒性発現メカニズムに基づく毒性評価技術の開発(a) 薬物動態モデル等を活用した化学物質の体内動態評価技術の開発
(1)目標 生理学的薬物動態モデルを活用した、化学物質の体内濃度の推定手法の開発(2)内容および成果 化合物のPBPKモデルパラメータを決定し、血中(血液毒性)や腎中(腎毒性)濃度と
毒性リスクの関係精査中 ・・・・一定の逆相関性を確認。生体内濃度と毒性発現との関連性を示唆
0 1 2 3 4 50
1
2
3
4
r = - 0.85
p < 0.05n = 6
Log (AUC in kidney, ng h/mL)
Log (
LO
EL,
renal, m
g/k
g/d
ay)
LOEL, renal, mg/kg/day
2-Mercaptobenzimidazole 12
4-Nonylphenol 50
1,2,4-Trimethylbenzene 300
1,2,3-Trimethylbenzene 300
Bisphenol A 600
m-Cresol 1000
LOEL, blood, mg/kg/day
2-Mercaptobenzimidazole 12
4-Nonylphenol 50
1,2,3-Trimethylbenzene 100
2-Aminobiphenyl 100
Bisphenol A 600
0 1 2 3 40
1
2
3
4
Log (Cmax in blood, ng/mL)
Log(L
OE
L,
blo
od
, m
g/k
g/d
ay)
r = - 0.94
p < 0.05n = 5
研究開発項目① 毒性発現メカニズムに基づく毒性評価技術の開発(a) 薬物動態モデル等を活用した化学物質の体内動態評価技術の開発
(1)目標 生理学的薬物動態モデルを活用した、化学物質の体内濃度の推定手法の開発(2)内容および成果 PBPKモデル用入力値を個別物性値や記述子にIn Vitro予測値を加え予測精度向上(3)今後の展開 メカニズムを考慮したさらに高精度の予測システム構築を検討中
Descriptor 説明
1Predicted_
logPappPredicted logPapp( in vitro 膜透過係数)
2 ClogP ClogP
3 fun_pH6.0 fun(分子型分率) pH6.0
4 fun_pH7.4 fun(分子型分率) pH7.4
5 logD_pH6.0 logD pH6.0
6 nHBDon number of hydrogen bond donor
7 MATS1dvmoran coefficient of lag 1 weighted by valence electrons
8 AATS2daveraged moreau-broto autocorrelation of lag 2 weighted by sigma electrons
9 ATSC1secentered moreau-broto autocorrelation of lag 1 weighted by sanderson EN
10 AATSC1dvaveraged and centered moreau-broto autocorrelation of lag 1 weighted by valence electrons
11 ATSC1arecentered moreau-broto autocorrelation of lag 1 weighted by allred-rocow EN
12 Mi mean of constitutional weighted by ionization potential
13 MID_N molecular ID on N atoms
14 BIC3 3-ordered bonding information content
15 ATSC6dcentered moreau-broto autocorrelation of lag 6 weighted by sigma electrons
16 BIC2 2-ordered bonding information content
17 SlogP_VSA2 MOE logP VSA Descriptor 2 (-0.40 <= x < -0.20)
18 JGI7 7-ordered mean topological charge
19 AATSC2saveraged and centered moreau-broto autocorrelation of lag 2 weighted by intrinsic state
20 nFAHRing aromatic fused hetero ring count
橙地:In Vitro予測値青地:物性値
白地:物理化学パラメータ以外のmordred記述子(パラメータ)
-2.500
-2.000
-1.500
-1.000
-0.500
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
-2.000 -1.000 0.000 1.000 2.000 3.000
Pre
dic
ted
logK
a
Original logKa
Rat LogKa(1/h)
R2=0.753N=158
記述子に、In Vitro膜透過予測値を加えることで、R2=0.654 ⇒ R2 =0.753へ精度向上
6
7
研究開発項目① 毒性発現メカニズムに基づく毒性評価技術の開発(b) 細胞の化学物質応答性評価を基盤とする毒性評価技術の開発
本事業におけるインビトロ試験
HESSのラット反復投与毒性試験データベースから28日間試験対象物質を中心に220物質を選択。下記のインビトロ試験系を確立し、被験物質の試験を実施
項目 内容
ア. 薬物代謝酵素 異物の解毒、代謝活性化に関わる酵素との反応性を評価
イ. 胆汁酸トランスポーター 肝毒性発現に関わる胆汁うっ滞影響を評価
ウ. 核内受容体 肝の異物代謝、エネルギー代謝等に関わる受容体への影響を評価
エ. 肝細胞傷害 ラット肝細胞に対する傷害作用を評価
オ. 細胞小器官 肝毒性発現に重要なミトコンドリア等の細胞小器官への影響を評価
カ. 細胞ストレス応答 細胞ホメオスタシスに関わるストレス応答系への作用を評価
キ. 非実質細胞(マクロファージ細胞)
細胞間クロストークによる間接的な肝障害作用・炎症制御を評価
ク. 遺伝子発現 マイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現量評価
8研究開発項目① 毒性発現メカニズムに基づく毒性評価技術の開発(b) 細胞の化学物質応答性評価を基盤とする毒性評価技術の開発
具体的成果
ア. 薬物代謝酵素 / イ. 胆汁酸トランスポーター7種のラットシトクロムP450(CYP)及びUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ(UGT)に対する被験物質の阻害活性を、組換え酵素及び発光基質を用いた実験系で評価した。
Proluciferin
誘導体
組換えP450 Luciferase発光
Luciferin
誘導体被験物質
(0.1, 1, 10 µM) 被験物質存在下で、>15%の発光量減弱
測定方法の概略(P450の例)
阻害作用あり
CYP1A1
CYP1A2
CYP2B1
CYP2C6
CYP2D1
CYP3A2
CYP2E1
UGT
32.7%
19.1%
30.0%
24.5%
8.6%
17.7%
5.9%
19.1%
陽性率酵素
220被験物質
残存活性値 80%0% 100%
MRP2 6.4%
9研究開発項目① 毒性発現メカニズムに基づく毒性評価技術の開発(b) 細胞の化学物質応答性評価を基盤とする毒性評価技術の開発
具体的成果
ウ. 核内受容体核内受容体発現プラスミド(PXR/PPARαの場合)、核内受容体応答配列を含むレポータープラスミドを培養細胞にトランスフェクションし、被験物質処置に伴うレポーター活性(転写活性)の変化を発光プレートリーダーで測定した。
AHR
PXR
PPARa
10.9%
35.0%
陽性率*
220被験物質
レポーター活性値(相対値) >201.0
HepG2細胞等 発現プラスミド
レポータープラスミド
Luciferase活性(発光)
の測定
被験物質(10, 30, 100 µM)
測定方法の概略
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1
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0
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0
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0
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1
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0
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1
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0
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0
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0
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0
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0
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1
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1
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1
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9
N
A
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A
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A
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A
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A
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A
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N
A
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.1
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1
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N
A
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1
受容体
14.5%
*最大値が>2.0を陽性と判定
細胞死により測定不可
10研究開発項目① 毒性発現メカニズムに基づく毒性評価技術の開発(b) 細胞の化学物質応答性評価を基盤とする毒性評価技術の開発
具体的成果
エ. 肝細胞障害 / オ. 細胞小器官初代培養ラット肝細胞に被験物質(6濃度)を曝露し、48時間後に細胞傷害性及び細胞小器官機能を評価した。
初代培養ラット肝細胞
被験物質6濃度(0.3-100 µM)48時間曝露
細胞傷害性評価•LDHアッセイ(逸脱酵素による細胞破壊評価)•Cell titerアッセイ(生細胞数)
細胞小器官機能評価ハイコンテントイメージング解析•核、細胞質(F-actin)、ミトコンドリア
核
細胞質
ミトコンドリア
Circle Ring Spot
RingSpot︓Ring内に含まれるSpotCircSpot︓Circle内に含まれるSpot
*CircleやRingは隣接の細胞と重なりうるが、⾃動細胞認識により設定される細胞境界が優先される。
測定範囲・対象
略称 定義
Count 数(Spot数)
Inten 蛍光強度(Intensity)
Area 蛍光⾯積
Var 全ピクセルの標準偏差
Size 直径
P2A 円形度︓4π✕⾯積÷周囲⻑^2
LWR ⻑さ・幅の⽐
Avg 全ピクセルの平均(細胞あたり)
Total 全ピクセル
細胞小器官イメージングの概略
11研究開発項目① 毒性発現メカニズムに基づく毒性評価技術の開発(b) 細胞の化学物質応答性評価を基盤とする毒性評価技術の開発
具体的成果
オ. 細胞小器官(続き)①各細胞小器官に由来する蛍光強度を下記のHCAパラメーターとして数値化
# Parameters
1 ValidObjectCount
2 SelectedObjectCount
3 SelectedObjectCountPerValidField
4 ObjectAreaCh1
5 ObjectShapeP2ACh1
6 ObjectShapeLWRCh1
7 ObjectTotalIntenCh1
8 ObjectAvgIntenCh1
9 ObjectVarIntenCh1
10 ObjectSizeCh1
11 RingTotalIntenCh2
12 RingAvgIntenCh2
13 CircTotalIntenCh2
14 CircAvgIntenCh2
15 CircRingAvgIntenDiffCh2
16 CircRingAvgIntenRatioCh2
17 RingSpotTotalIntenCh2
18 RingSpotAvgIntenCh2
19 RingSpotTotalAreaCh2
20 RingSpotAvgAreaCh2
21 RingSpotCountCh2
22 CircSpotTotalIntenCh2
23 CircSpotAvgIntenCh2
24 CircSpotTotalAreaCh2
25 CircSpotAvgAreaCh2
26 CircSpotCountCh2
# Parameters
27 RingTotalIntenCh3
28 RingAvgIntenCh3
29 CircTotalIntenCh3
30 CircAvgIntenCh3
31 CircRingAvgIntenDiffCh3
32 CircRingAvgIntenRatioCh3
33 RingSpotTotalIntenCh3
34 RingSpotAvgIntenCh3
35 RingSpotTotalAreaCh3
36 RingSpotAvgAreaCh3
37 RingSpotCountCh3
38 CircSpotTotalIntenCh3
39 CircSpotAvgIntenCh3
40 CircSpotTotalAreaCh3
41 CircSpotAvgAreaCh3
42 CircSpotCountCh3
核
細胞質(F-アクチン)
ミトコンドリア
②上記42のHCAパラメーターについて、6点濃度の測定値を利用して、最大値、最小値、積算値、絶対積算値、無影響濃度の5指標を算出
12研究開発項目① 毒性発現メカニズムに基づく毒性評価技術の開発(b) 細胞の化学物質応答性評価を基盤とする毒性評価技術の開発
3)具体的成果
オ. 細胞小器官(続き)
蛍光強度(6濃度の積算値:AUCabs)>10
被験物質
核(10パラメーター)
ミトコンドリア(16パラメーター)
細胞質(16パラメーター)
0閾値(0.6)
ValidObjectCount_AUCabs
SelectedObjectCount_AUCabs
SelectedObjectCountPerValidField_AUCabs
ObjectAreaCh1_AUCabs
ObjectShapeP2ACh1_AUCabs
ObjectShapeLWRCh1_AUCabs
ObjectTotalIntenCh1_AUCabs
ObjectAvgIntenCh1_AUCabs
ObjectVarIntenCh1_AUCabs
ObjectSizeCh1_AUCabs
RingTotalIntenCh2_AUCabs
RingAvgIntenCh2_AUCabs
CircTotalIntenCh2_AUCabs
CircAvgIntenCh2_AUCabs
CircRingAvgIntenDiffCh2_AUCabs
CircRingAvgIntenRatioCh2_AUCabs
RingSpotTotalIntenCh2_AUCabs
RingSpotAvgIntenCh2_AUCabs
RingSpotTotalAreaCh2_AUCabs
RingSpotAvgAreaCh2_AUCabs
RingSpotCountCh2_AUCabs
CircSpotTotalIntenCh2_AUCabs
CircSpotAvgIntenCh2_AUCabs
CircSpotTotalAreaCh2_AUCabs
CircSpotAvgAreaCh2_AUCabs
CircSpotCountCh2_AUCabs
RingTotalIntenCh3_AUCabs
RingAvgIntenCh3_AUCabs
CircTotalIntenCh3_AUCabs
CircAvgIntenCh3_AUCabs
CircRingAvgIntenDiffCh3_AUCabs
CircRingAvgIntenRatioCh3_AUCabs
RingSpotTotalIntenCh3_AUCabs
RingSpotAvgIntenCh3_AUCabs
RingSpotTotalAreaCh3_AUCabs
RingSpotAvgAreaCh3_AUCabs
RingSpotCountCh3_AUCabs
CircSpotTotalIntenCh3_AUCabs
CircSpotAvgIntenCh3_AUCabs
CircSpotTotalAreaCh3_AUCabs
CircSpotAvgAreaCh3_AUCabs
CircSpotCountCh3_AUCabs
13研究開発項目① 毒性発現メカニズムに基づく毒性評価技術の開発(b) 細胞の化学物質応答性評価を基盤とする毒性評価技術の開発
具体的成果カ. 細胞ストレス応答
緑色ルシフェラーゼ
TK pro 赤色ルシフェラーゼ応答配列
人工染色体ベクター
TK pro
パスウェイ
転写因子
各種の細胞ストレスが惹起されると活性化する転写因子
細胞生存率
ヒト肝癌由来HepG2細胞
96ウェルプレート
約30分間隔で72時間測定
酸化ストレス(Nrf2) 炎症応答(NF-κB, AP-1) 小胞体ストレス(ATF6, XBP-1) DNA損傷(p53) 低酸素(HIF1α) 熱ショック(HSF) サイトカイン応答(STAT3)
時間発光強度
9種類のストレス応答評価用細胞の作製に成功
ストレス応答および細胞毒性の時系列変化を同時に評価する測定系を確立
14研究開発項目① 毒性発現メカニズムに基づく毒性評価技術の開発(b) 細胞の化学物質応答性評価を基盤とする毒性評価技術の開発
具体的成果カ. 細胞ストレス応答
活性化不活性化
3種類のストレス応答に対する220物質の影響について解析 ストレス応答パスウェイおよび細胞毒性に関する合計10パラメーターを抽出
15研究開発項目① 毒性発現メカニズムに基づく毒性評価技術の開発(b) 細胞の化学物質応答性評価を基盤とする毒性評価技術の開発
具体的成果
キ. 非実質細胞(マクロファージ細胞)
220物質の評価を実施
パスウェイおよび細胞毒性に関する合計10パラメーターを抽出
NF-κB AP1 SEAP炎症応答に関与するNF-κBとAP-1の活性化に伴いSEAPレポーターが発現
SEAP
RAW264.7細胞
16
In vivo予測のためのin vitro試験パラメーターの最適化への取り組み
大量のデータ(数万件)
Deep learning等の技術でeffectiveにin vitroモデル相当の中間ネットワークが作られるだろう
数百程度のデータ数
実験研究者、情報解析技術者によるパラメーターの創出と最適化
A) In vitro実験結果からの抽出情報• AUC等の統計量• Emax、Emin
• 曲線の傾きB) NOELとLOEL毎の最適化
• NOEC (Non observed effect concentration)
• 活性化/非活性化C) In vitro実験情報の組み合わせ解析
• AOPとして解釈可能性
EP_LV01
(細胞傷害・炎症)
CYP2B1 0.007
CircSpotAvgIntenCh2 0.045
CYP2C6 0.078
CircSpotTotalIntenCh2 0.090
EP_LV02
(肝機能低下)
CYP3A2 0.000
CYP2C6 0.000
CircSpotAvgIntenCh2 0.001
CircAvgIntenCh2 0.004
CircTotalIntenCh2 0.016
CYP2B1 0.019
ObjectTotalIntenCh1 0.027
ObjectAvgIntenCh1 0.033
CYP1A1 0.036
CircSpotTotalIntenCh2 0.036
CYP1A2 0.074
LDH 0.074
EP_LV03
(肝機能亢進)
PPAR 0.015
CYP2B1 0.025
CYP2C6 0.039
ObjectAvgIntenCh1 0.054
CircSpotCountCh3 0.054
CYP1A2 0.058
EP_LV04(胆管障害)
CircSpotAvgIntenCh2 0.064
CYP2B1 0.072
CircSpotTotalIntenCh2 0.083
EP_LV05
(肥大)
CYP2B1 0.000
CYP2C6 0.002
ObjectAvgIntenCh1 0.010
PPAR 0.013
CYP1A1 0.024
CYP1A2 0.024
RingAvgIntenCh2 0.027
RingSpotTotalIntenCh2 0.031
RingTotalIntenCh2 0.051
PXR 0.094
EP_LV06
(脂質代謝異常)
CYP2B1 0.001
AHR 0.004
CircSpotAvgIntenCh2 0.033
ObjectAvgIntenCh1 0.042
CYP2D1 0.045
RingSpotAvgIntenCh2 0.061
RingSpotTotalIntenCh2 0.088
各アッセイに閾値を設定して陽性・陰性の2値とし、各エンドポイントの有無との関連性をχ二乗検定で解析した
Brown: P450Purple: Nuclear receptorCyan: Cytotoxicity
Blue: NucleusGreen: MitochondriaOrange: F-actin/cytoplasm17
インビトロ試験結果と肝臓のグループEPとの関連性
18
In vivo予測のためのin vitro試験パラメーターの最適化の取り組み例
Mordred記述子(約1500パラメーター)と、NOEL値及びLOEL値の関連性について、Spearmanの順位相関解析を実施し、ランキングを確認
ラット肝細胞HCA(核)vs. LOEL
同じ HCAパ ラ メ ー タ ー で もAUCabsとEmax、NOECなど、変数の種類(データ処理方法)により、順位が異なる。
EPの種類によっても順位は異なる。
19
In vivo予測のためのin vitro試験パラメーターの最適化の取り組み例
RAW264.7細胞のパラメーターとcNOEL
NOECが多くのエンドポイントで上位にランキング
グループEP 肝臓関連個別EP
20
研究開発項目① 毒性発現メカニズムに基づく毒性評価技術の開発(b) 細胞の化学物質応答性評価を基盤とする毒性評価技術の開発
細胞におけるマイクロアレイによる遺伝子発現量データ取得のためのプロトコルの構築 及び
遺伝子発現量データ等に基づく毒性メカニズム解析
1)目標
ヒト由来細胞及びラット由来細胞における遺伝子発現量データ取得のためのプロトコルを構築する
2)実施内容
• ヒト由来肝細胞HepaRG®及びラット初代培養肝細胞を用いて、細胞播種数、暴露時間、結果の
再現性等に関する検討を実施し、マイクロアレイによる遺伝子発現量データ取得のためのプロトコルを構築した。
• HepaRG®では10物質、ラット初代培養肝細胞では72物質の遺伝子発現量データを取得した。
3)具体的成果
• ヒト由来細胞(HepaRG®)及びラット初代培養肝細胞胞における遺伝子発現量データ取得のためのプロトコルを構築した。
• LDHアッセイの結果に基づくデータ受け入れ基準を策定し、再現性のある遺伝子発現量データが取得できるようになった。
4)今後の展開
• 取得したデータは、SDラットの肝臓における遺伝子発現量データ等との比較解析に活用する。
ヒト由来細胞及びラット由来細胞における遺伝子発現量データ取得のためのプロトコル構築
具体的成果
ク. マイクロアレイ
21
研究開発項目① 毒性発現メカニズムに基づく毒性評価技術の開発(b) 細胞の化学物質応答性評価を基盤とする毒性評価技術の開発
1)目標
既存の知見、動物試験データ、本PJで取得されたin vitroデータ等に基づく解析により、毒性発現に関わるイベントや毒性メカニズムを明らかにし、予測結果の信頼性を向上させる。
2)実施内容
• 肝毒性メカニズムに関わる既知見情報を整理している。
• 経済産業省Tox-Omicsプロジェクト及びToxicogenomics Project (TGP)で取得された雄ラットの肝臓における28
日間までの経時的な遺伝子発現量データと、ヒトまたはラットの細胞における遺伝子発現量データの比較解析等を実施している。
3)具体的成果
■ 肝毒性メカニズムに関わる既知見情報の例 : Oncotic necrosisに関わるイベントの整理
本PJで取得したin vitroデータ等を活用した毒性メカニズム解析に関する検討
AI-SHIPSのin vitro試験系で段階的なイベントをカバー
具体的成果 ク. マイクロアレイ(つづき)
22
研究開発項目① 毒性発現メカニズムに基づく毒性評価技術の開発(b) 細胞の化学物質応答性評価を基盤とする毒性評価技術の開発
3)具体的成果
■ 毒性試験データと各種in vitroデータ等の比較解析例:
②本PJで取得したin vitroデータ等を活用した毒性メカニズム解析に関する検討
4,4'-dichlorodiphenyl sulfone(DCDPs)SDラットへの28日までの経口反復投与試験:7日以降、50 mg/kg/day以上で限局性肝細胞壊死
DCDPsの肝細胞の壊死(Necrosis)の要因:Oncotic necrosisに類似した経路の可能性
Tox-Omicsプロジェクトのデータ
具体的成果 ク. マイクロアレイ(つづき)
23
1-(1) 化学構造記述子法50種類のMIEに対して2種類の陽性基準を適用し、総計100種類の予測モデルを構築機械学習アルゴリズムの試行を行い、良好な手法を探索
最終アルゴリズム:・ランダムフォレスト・勾配ブースティング採用
予測性能の外部検証ROC曲線下面積(AUC):総平均0.842
・NIH主催Tox21 data challenge 2014におけるwinnersの成績に匹敵・予測しうるMIE数において国内外に比肩する研究例は存在しない
研究開発項目②人工知能を活用した予測モデルの開発(生体レベルでの毒性評価・予測を実現する情報技術の開発)
エ. Tox-21によるMIE50種の予測モデルを構築
1-(2) 3D分子画像入力システム(DeepSnap)に基づく深層学習
DeepSnapを用いてTox21-MIEに対する予測モデル構築実験を施行
予測性能の検証外部検証時ROC曲線下面積(AUC):平均0.876
→従来法の成績をさらに上回る良好な予測性能さらに、計算コストの大幅に減少に成功
・Matsuzaka Y and Uesawa Y., Front Bioeng Biotechnol. 2019,28;7:65
・Matsuzaka Y and Uesawa Y., Int J Mol Sci. 2019,30;20
分子画像入力法は新規性が高く、国内外に類似した研究例は存在しない
1-(3) リガンド-タンパク質間相互作用エネルギースコアを使用したMIE予測ドッキングシミュレーション(myPresto)
↓
Tox21化合物とCARの結合親和性関連パラメーター↓
CARアゴニスト活性予測モデル(ドッキングスコア、吸着エネルギー等8種類のみを記述子として使用)
↓
予測性能の検証外部検証時ROC曲線下面積(AUC):0.833
リガンド-タンパク質間相互作用エネルギースコアは良好な記述子として機能することが判明相互作用エネルギースコアをMIE予測に用いる方法は新規性が高く、国内外に類似した研究例は存在しない
24
深層学習
研究開発項目②人工知能を活用した予測モデルの開発(生体レベルでの毒性評価・予測を実現する情報技術の開発)
エ. DeepSnapに基づく深層学習とリガンド-タンパク質間相互作用エネルギースコアを使用したMIE予測ドッキングシミュレーション(myPresto)