遺伝子組換え実験€テキスト...Animal production experiments Animal inoculation experiments Virus bacteria Cultured cells 2017/4/6 6 注意点 Points to be noted 大阪大学では以下の実験も遺伝子組換え実験に相当します

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遺伝子組換え実験Living modified organism (LMO) experiments

謝辞：本資料の作成に当たり八木先生・堀口先生（微研）作成の研修資料等を参考にしました

遺伝子組換え実験のバイオハザード問題は核酸供与体や宿主のもつ既知の一般的バイオハザードとは別に，異種の，とくにかけ離れた種に由来する核酸を結合して生細胞で増殖させることにより，過去に自然界には存在しなかった遺伝構成をもつ生物が出現するという理由での予知できない危険性を問題視したことにはじまる。

（日本細菌学会「病原体等安全取扱・管理指針」より抜粋）

遺伝子組換え実験のバイオハザード問題は核酸供与体や宿主のもつ既知の一般的バイオハザードとは別に，異種の，とくにかけ離れた種に由来する核酸を結合して生細胞で増殖させることにより，過去に自然界には存在しなかった遺伝構成をもつ生物が出現するという理由での予知できない危険性を問題視したことにはじまる。

（日本細菌学会「病原体等安全取扱・管理指針」より抜粋）

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カルタヘナ法遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律

カルタヘナ法遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律

遺伝子組換え生物等の使用等の規制に関する動き

生物の多様性に関する条約のバイオセーフティに関する

カルタヘナ議定書（2000年モントリオールで作成）

生物の多様性に関する条約のバイオセーフティに関する

カルタヘナ議定書（2000年モントリオールで作成）

目的：生物の多様性の保全及び持続可能な利用に悪影響を及ぼす可能性のあるすべての遺伝子組換え生物等（Living Modified Organism (LMO) ）の国境を越える移

動、通過、取扱い及び利用を対象として、生物の多様性への悪影響（人の健康に対する危険も考慮したもの）を防止するため、採択

目的：生物の多様性の保全及び持続可能な利用に悪影響を及ぼす可能性のあるすべての遺伝子組換え生物等（Living Modified Organism (LMO) ）の国境を越える移

動、通過、取扱い及び利用を対象として、生物の多様性への悪影響（人の健康に対する危険も考慮したもの）を防止するため、採択

日本はカルタヘナ議定書の締結に向け、必要な国内法を整備

Cartagena Protocol on Biosafety to the Convention on Biological Diversity

International agreement which aims to ensure the safe handling, transport and use of living modified organisms (LMOs) resulting from modern biotechnology that may have adverse effects on biological diversity, taking also into account risks to human health.

History of regulations on the use of LMOs

Cartagena LowAct on the Conservation and Sustainable Use of Biological Diversity through Regulations on the Use of Living Modified Organisms

Municipal low

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対象となる実験Experiments subject to regulation

実験等実施時の手続きProcedures for experiments

留意していただきたいことImportant notices


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対象となる実験Experiments subject to regulation

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カルタヘナ法

遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律

第一種使用等Type 1 use

環境中への拡散を防止しないで行う使用等Use without measures to prevent dispersal into the environment

第二種使用等 Type 2 use

環境等への拡散を防止しつつ行う使用等Use with measures to prevent dispersal in to the environment

研究開発等に関わる第二種使用等にあたって取るべき拡散防止措置等を定める省令(二種省令)

拡散防止措置の内容、手続き等 Type 2 ordinance

二種省令に基づく告示(二種告示) Type 2 notification

認定宿主ベクター系のリスト、実験分類ごとの生物のリスト等

最高で１年以下の懲役もしくは百万円以下の罰金または両方最高で１年以下の懲役もしくは百万円以下の罰金または両方

Cartagena Low: Act on the Conservation and Sustainable Use of Biological Diversity through Regulations on the Use of Living Modified Organisms

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遺伝子組換え生物とは？What is LMO?

次の技術の利用により得られた核酸又はその複製物を有する生物＊

細胞外において核酸を加工する技術 (以下の場合を除く）

• 宿主と核酸供与体が同一の種に属する(セルフクローニング）

• 自然条件において起こる核酸の交換（ナチュラルオカレンス）

異なる科に属する生物の細胞を融合する技術

＊生物: 動植物個体・胚・配偶子ウイルスおよびウイロイド

非生物: ヒトの個体・胚・配偶子培養細胞、動物の組織・臓器

An organism that possesses nucleic acid, or a replicated product thereof, obtained through use of

Technologies for the processing of nucleic acid extracellularly

Technologies for fusing the cells of organisms belonging to different taxonomical families

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第二種使用における使用とはTypes of use covered by Type 2 Use

第二種省令における使用とはClassification of use in the Research and Development Type 2 Ordinance

これら行為のすべてが規制の対象

これら行為のそれぞれに拡散防止措置が決められている

All of these actions are covered by the regulations

Measures to prevent dispersal are stipulated for each of these actions

対象となる実験

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微生物使用実験

大量培養実験(培養器の容量が20リットルを超えるもの）

動物使用実験動物作成実験動物接種実験

植物等使用実験植物作成実験植物接種実験キノコ作成実験

実験実験遺伝子組換え実験遺伝子組換え実験

細胞融合実験細胞融合実験

Types of “experiments” in Type 2 Use

LMO experiments

Experiments Microorganism experiments

Large-scale culture experiments

Animal experimentsAnimal production experiments

Animal inoculation experiments

Plant experimentsPlant production experiments

Plant inoculation experiments

Mushroom development experiments

Cell fusion experiments

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プラスミドベクター

目的の遺伝子

培養細胞

組換え遺伝子導入

培養

増殖した組換え宿主

大腸菌等の汎用宿主

大量の組換えベクター

ウイルス産生用細胞

組換えウイルスまたはウイルスベクター

細菌・原虫等

感染実験等

培養細胞は生物ではないので組換え実験ではない

感染実験等

遺伝子導入


対象となる遺伝子組換え実験Types of LMO experiments

Microorganism experiments

Plasmid vector

E.coli

Virus/viral vector

bacteria

動物作成実験

ES細胞

受精卵

導入・組込み

トランスジェニックマウスノックアウトマウスなど

組換えベクター


培養細胞

細菌・原虫等

ウイルス

動物接種実験組換え実験ではない

組換え実験

接種

対象となる遺伝子組換え実験Types of LMO experiments

動物作成実験


動物接種実験


Animal production experiments


Virus

bacteria

Cultured cells

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注意点Points to be noted

大阪大学では以下の実験も遺伝子組換え実験に相当します

「ゲノム編集技術」等で作製された生物（導入核酸の有無に依らない）を扱う実験

バキュロウイルスで作製されたタンパク質（市販品を含む）を用いる実験のうち、ウイルスの残存･混入が科学的に否定されていない実験

ウイルスの残存･混入が否定されたiPS細胞等もレベルダウンの実験として実施 (P2→P1)

In Osaka university, the following experiments are considered to be LMO experiments

Experiments using the organisms that are generated with genome editing technology.

Experiments using the proteins produced by baculovirus (including commercially available products)

The iPS cells that are proved to be negative for virus contamination should be performed as a level down LMO experiment (P2=>P1)

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実験実施時の手続き等Procedures for experiments

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遺伝子組換え実験を行うためには、遺伝子組換え実験計画書を提出し、承認される必要がある！

To perform LMO experiments, the LMO-experiment protocol must be submitted and approved in advance!

遺伝子組換え実験を行うためには、遺伝子組換え実験計画書を提出し、承認される必要がある！

To perform LMO experiments, the LMO-experiment protocol must be submitted and approved in advance!

機関承認（大阪大学）と大臣確認Institutional approval (Osaka Univ.) and ministerial confirmation

機関承認（大阪大学）と大臣確認Institutional approval (Osaka Univ.) and ministerial confirmation

実験実施時の手続き等

実験実験遺伝子組換え実験遺伝子組換え実験

細胞融合実験細胞融合実験

第二種省令に執るべき拡散防止措置が定められている使用

第二種省令に執るべき拡散防止措置が定められていない使用

機関承認実験

大臣確認実験

全て大臣確認実験

Procedures for experiments

LMO experiments

Experiments

Cell fusion experiments

Institutional approval

ministerial confirmation

ministerial confirmation

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遺伝子組換え実験場所設置届様式1

遺伝子組換え実験計画申請書様式2

実験終了・中止・不実施報告書様式3

実験責任者変更届様式4

実験従事者変更届様式5

実験実施期間延長届様式6

（ただし当初計画が5年未満の計画に限る）

実験場所変更届様式7

遺伝子組換え実験計画変更届様式8

実験実施経過報告書様式9

遺伝子組換え生物等の国内移動様式10

遺伝子組換え生物等の輸出入様式11

教育訓練実施報告書様式12

機関承認に関わる学内手続Procedures for institutional approval

Many forms for LMO experiments, but only in Japanese…

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遺伝子組換え実験計画変更届の受理手続きが簡素化されています拡散防止措置区分の変更を伴わない場合などは、届け出のみで受理されます

遺伝子組換え実験計画変更届の受理手続きが簡素化されています拡散防止措置区分の変更を伴わない場合などは、届け出のみで受理されます

遺伝子組換え実験安全委員会は２ヶ月に1回ですLMO-experiment security committee (once every 2 months) 遺伝子組換え実験安全委員会は２ヶ月に1回ですLMO-experiment security committee (once every 2 months)

新規の遺伝子組換え実験施設は、事前に吹田市への届けが必要ですNew LMO experiment facilities must be notified to Suita city in advance 新規の遺伝子組換え実験施設は、事前に吹田市への届けが必要ですNew LMO experiment facilities must be notified to Suita city in advance

申請は早めにお願いします


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新規実験の申請はWeb申請システムになりましたWeb application system is available (but only in Japanese…)

新規実験の申請はWeb申請システムになりましたWeb application system is available (but only in Japanese…)

Ｗｅｂ申請以前に承認された実験計画に関する変更届等は紙で受け付けていますＷｅｂ申請以前に承認された実験計画に関する変更届等は紙で受け付けています


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遺伝子組換え実験は、適切な拡散防止措置がとられた決められた場所で行いますLMO experiments must be carried out in the designated areas that have measures to prevent dispersal

遺伝子組換え実験は、適切な拡散防止措置がとられた決められた場所で行いますLMO experiments must be carried out in the designated areas that have measures to prevent dispersal

拡散防止措置Containment measures

物理的な封じ込めPhysical containment

生物学的な封じ込めBiological contaiment

（レベル：P１〜P３）

取るべき拡散防止措置Measures that should be taken in order to prevent dispersal

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供与核酸と宿主のクラス（実験分類）

二種告示別表第２

Experimental classification of the recipient and donor organisms

Type 2 notification, table No. 2

Class 1 Class 2 Class 3 Class 4

Virulence

Transmissibility

mic

roor

gani

sms

virus/viroid

prokaryote/fungi

protozoa

animal/plant

None Low High High

Low High

E. coli, Yeast

Adeno associatedBaculo

Adenovirus, SV40Lentivirus

tuberculosisPathogenic E. coli

All, human, mouse

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平成26年7月1日に二種告示が改正されました

認定宿主ベクター系（別表1）微生物実験分類区分（別表2）が変わりました

平成26年7月1日に二種告示が改正されました

認定宿主ベクター系（別表1）微生物実験分類区分（別表2）が変わりました

二種告示別表第２遺伝子組換え実験安全の手引き P. 60Type 2 notification, table No. 2


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微生物使用実験宿主あるいは核酸供与体の実験分類のうち小さくない方を、拡散防止措置のレベルとする

動物作成実験宿主の実験分類を拡散防止措置のレベルとする

動物接種実験宿主あるいは核酸供与体の実験分類のうち小さくない方を、拡散防止措置のレベルとする

宿主

クラス 1 2 3

核酸供与体

1 P1(A) P2 (A) P3 (A)

2 P2 (A) P2 (A) P3 (A)

3 P3 (A) P3 (A) P3 (A)

微生物使用実験および動物接種実験の場合


host

donor


Animal production experiments


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自分が行っている遺伝子組換え実験のレベルを確認しましょうUnderstand the level of your LMO experiments

自分が行っている遺伝子組換え実験のレベルを確認しましょうUnderstand the level of your LMO experiments


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分らないときは読んでください分らないときは読んでください

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手洗い

窓の閉鎖

実験台

開放厳禁

入室制限

開放厳禁

入室制限

Ｐ１レベル実験室

• 通常の生物の実験室等laboratory for ordinary organisms

• 窓・ドアの閉鎖等Doors must be closed

• 飲食禁止Prohibition on eating/drinking

Ｐ２レベル実験室

• 安全キャビネットの設置Safety cabinet

• 高圧滅菌器の設置autoclave


Microorganism experiment P1

Microorganism experiment P2

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ネズミ返しの設置

アイソレータラックの使用（Ｐ２Ａ）

Ｐ１Ａ・Ｐ２Ａレベル実験室

ドアへの表示

動物実験における拡散防止措置Measures to prevent dispersal in animal experiments

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遺伝子組換え実験施設の表示

大阪大学の取り決めによるバイオハザード標識

吹田市の条例による標識

二種省令別表第二による表示

Signs for LMO experimental laboratory

Osaka UnivSuita city

Type 2 ordinance

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遺伝子組換え生物保管設備の表示

二種省令第六条による表示

フリーザー・液体窒素タンク等

保管容器等

Type 2 ordinance

Signs for LMO storage equipment and containers

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大臣確認実験

二種省令に取るべき拡散防止措置が定められていない使用等

細胞融合実験

実験分類リスト（二種告示別表第２）にない宿主または核酸供与体（病原性のある）を使用する場合

自立的増殖力と感染力を持ったウイルスまたはウイロイドの作製に関わる場合

宿主の実験分類がクラス3以上である場合

核酸供与体の実験分類がクラス4である場合

クラス３の核酸供与体の供与核酸が宿主の哺乳動物に対する病原性を著しく高めることが推定される場合

供与核酸がLD50 ≤ 100 µg/kg（認定宿主ベクター系使用の際は ≤ 100 ng/kg）の毒力を持つ毒素に関わる遺伝子である場合

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留意していただきたいこと

Important notices

組換え体の廃棄Disposal of LMO wastes

組換え体を含む廃棄物については、廃棄の前に組換え体を不活性化するための措置をとる必要がありますTake measures of inactivation before disposal of LMO wastes

組換え体を含む廃棄物については、廃棄の前に組換え体を不活性化するための措置をとる必要がありますTake measures of inactivation before disposal of LMO wastes

Agar plates使い捨て試験管tubes

培養液culture medium

オートクレーブAutoclave

殺菌剤の添加など（オートクレーブできない物のみ）Addition of Disinfectant

121℃ 20分以上121℃ 20分以上

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遺伝子組換え生物の移動

譲渡する側が情報を提供する（情報提供書）Provide information

譲渡する側が情報を提供する（情報提供書）Provide information

「○○先生、先生がウイルスベクターを用い作成されたiPS細胞を使用させていただきたいのですが、送ってくれませんか？」「わかりました。じゃあ、さっそく明日送ります.」

事前に安全主任者に確認庶務係に提出

事前に安全主任者に確認庶務係に提出

承認された実験計画書に記載されていない組換え体は譲渡・譲受できません!!The LMOs should be described in the approved research plans!!

承認された実験計画書に記載されていない組換え体は譲渡・譲受できません!!The LMOs should be described in the approved research plans!!

譲渡・譲受（国内）、輸出入にも事前の手続きが必要ですProcedures should be taken in advance for transfer of LMOs

譲渡・譲受（国内）、輸出入にも事前の手続きが必要ですProcedures should be taken in advance for transfer of LMOs

50万円以下の罰金

Transfer of LMOs

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遺伝子組換え実験の失敗・法令違反例

バキュロウイルスを用いて作成されたタンパク質試薬（遺伝子組換え体）を不活性化せずに廃棄した。

二種告示の実験分類のリストにない病原性のある宿主または核酸供与体（大臣確認実験）を、機関承認実験として実施した。

床敷き交換時に、誤って組換えマウスを廃棄した。実験計画書に記載されていない遺伝子組換え体を譲り受けた。遺伝子組換え実験室内で食品を保存・飲食した。実験室の扉を開けたままで遺伝子組換え実験を行っていた。動物実験室に逃亡防止措置が設置されていなかった。

バキュロウイルスを用いて作成されたタンパク質試薬（遺伝子組換え体）を不活性化せずに廃棄した。

二種告示の実験分類のリストにない病原性のある宿主または核酸供与体（大臣確認実験）を、機関承認実験として実施した。

床敷き交換時に、誤って組換えマウスを廃棄した。実験計画書に記載されていない遺伝子組換え体を譲り受けた。遺伝子組換え実験室内で食品を保存・飲食した。実験室の扉を開けたままで遺伝子組換え実験を行っていた。動物実験室に逃亡防止措置が設置されていなかった。

ナチュラルオカレンス・セルフクローニング、その他複雑な実験計画の際は実験者が安易に判断せず、安全主任者に相談してくださいナチュラルオカレンス・セルフクローニング、その他複雑な実験計画の際は実験者が安易に判断せず、安全主任者に相談してください

Examples of failure or violations of lows

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実験従事者の更新をお願いします(生物学実習受講者なども含む)

Renew members for LMO experiments

定期健康診断を必ず受診してくださいReceive periodical medical examinations!

Documents

遺伝子組換え実験€テキスト...Animal production experiments Animal inoculation experiments Virus bacteria Cultured cells 2017/4/6 6 注意点 Points to be noted 大阪大学では以下の実験も遺伝子組換え実験に相当します