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生化学Ⅲ 第5回
遺伝子の複製・変異・修復-1
今回のSBOs
DNAの複製の過程について説明できる
生化学Ⅲ SBO-8
DNAの複製の過程について説明できる
DNA Replication
SBO-8 課題(予習&復習)
DNAの複製に関連する基本的な用語の意味について確認し、ノートにまとめること。
複製起点、複製フォーク、DNAヘリカーゼ、DNAトポイソメラーゼ、DNAポリメラーゼ、プライマー、DNAプライマーゼ、リーディング鎖とラギング鎖、岡崎フラグメント、不連続複製、ヌクレアーゼ、DNAリガーゼ、テロメラーゼ、染色体の分配、細胞周期、サイクリン、サイクリン依存性プロテインキナーゼ
SBO-8 課題(予習&復習)-2
メセルソンとスタール(M.Meselson & F.Stahl)の研究
遺伝学に関する歴史上重要な研究(研究者・実験方法・研究結果・定説など)について確認し、ノートにまとめること。
SBO-8 小テスト-1
2本鎖DNAが解離して、1本鎖のDNAを鋳型に新たなDNAが合成される過程を半保存的複製という。
Yes No
DNAの複製(合成)は、適切な場所で、適切な時期に、正確に行われるよ!
DNAの複製
DNAの複製が始まる場所を、複製開始点と呼びます。
複製開始点
複製開始点
特定の塩基配列
複製開始点に特定のDNA結合タンパク質が結合してDNA合成が始まります。
複製開始点
複製開始点
特定の塩基配列
結合タンパク質
複製開始点でDNAが解裂して、1本鎖DNAになるよ。
DNAの解裂
複製ホーク
DNAポリメラーゼが鋳型DNA鎖に対して相補的なDNA鎖を合成するよ。
DNAの合成
DNAの複製
DNA replication
大腸菌のDNA複製に必要な因子
1,複製開始因子2,DNAヘリカーゼ3,DNAトポイソメラーゼ4,DNAプライマーゼ5,DNAポリメラーゼⅠ&Ⅲ6,DNAリガーゼ7,ヌクレオチド(4種類)
環状DNAの複製
環状DNAでは1カ所の複製起点からDNAの分離が始まり、複製フォークの両側にDNA合成が進行する。最終的に複製終結点で終了する。
複製された2つの環状DNAは、Ⅱ型トポイソメラーゼにより分離される(大腸菌の場合)。
細菌DNA、ミトコンドリアDNA、葉緑体DNA、プラスミドDNA。
環状DNAの複製モデル
複製起点
複製終結点
複製フォーク
原核生物のDNA複製
大腸菌の場合、複製開始点から複製が両方向に進行する。
複製開始点( oriC )
複製終結点( ter )
複製開始因子
最初に複製を制御するタンパク質(複合体)が複製起点(oriC)に結合する。
複製開始タンパク質
DNA
複製起点(複製開始点)
5'
3'
3'
5'
大腸菌ではDnaAなどが知られている。
DNAヘリカーゼ
DNAヘリカーゼは、複製起点に結合して2本鎖DNAを分離させ1本鎖にする。
DNA
複製起点
H H
5'
3'
3'
5'
大腸菌の場合、ヘリカーゼ活性を有するDnaBとDnaCが2本鎖DNAを両方向にほどく。
複製フォーク
ヘリカーゼの働きにより、複製フォークが形成される。
複製フォーク(replication fork)
H H
5'
3'
3'
5'
一本鎖DNA結合タンパク質
一本鎖DNAに結合して、ヘアピン構造の形成をふせぐ
一本鎖DNA結合タンパク質(single-strand DNA binding protein)
H H
5'
3'
3'
5'
DNAトポイソメラーゼ
DNAトポイソメラーゼは、2本鎖DNAの分離に伴い形成される超らせんを解消する。
←複製フォーク(replication fork)
複製フォーク→
H HT5'
3'
3'
5'
T
外部からのエネルギーを必要としない(ATP不要)
プライマーゼ
プライマーゼは分離したそれぞれのDNA鎖の一部分に相補的なRNAプライマー(10塩基程度)を合成する。
P
P
5'
3'
3'
5'
RNA primer
プライマーゼはRNA合成酵素(DNA依存RNAポリメラーゼ)
プライマーゼの詳細
RNA鎖の3‘末端水酸基とNTPの5’位のリン酸基をエステル結合させ、鋳型DNAに相補的なRNA鎖を合成する。
5'-ACUCUAGU-3'llllllll
3'-ATCTGAGATCTCGAGTTAGTAG-5'
NTPRNA
DNA
エステル結合 ↓
←水素結合
DNAポリメラーゼ
DNAポリメラーゼⅢがRNAプライマーに続いて鋳型DNAに相補的な新しいDNA鎖を合成する。
5' 3'
Pol-III
Pol-III
5'
3'
3'
5'
5'3'
DNAポリメラーゼⅢの詳細
DNA鎖の3'末端水酸基とdNTPのリン酸基をエステル結合させる。
5'-ACUCUAGUGCTCA-3'lllllllllllll
3'-CTGAGATCTCGAGTTAGTAGAT-5'
RNA
DNA
DNA
エステル結合 ↓
dNTP
DNA合成の方向性
DNAポリメラーゼは、鋳型DNA鎖を3‘→5’方向に読み取りながら、新しいDNA鎖を5‘→3’方向に伸長させる。
一方通行だよ
リーディング鎖とラギング鎖
リーディング鎖は、複製フォークの移動に伴って連続的に合成される。
5’
3’
3’
5’
複製開始点
H H
リーディング鎖
リーディング鎖とラギング鎖
5’
3’
3’
5’
複製開始点
H H
リーディング鎖
リーディング鎖の反対側はどうやって合成するでしょうか?
リーディング鎖とラギング鎖
ラギング鎖DNAは非連続的に合成される
5’
3’
3’
5’
複製開始点
H H
リーディング鎖
ラギング鎖真核生物:100~150ヌクレオチドずつ合成原核生物:1000~2000ヌクレオチドずつ合成
リーディング鎖とラギング鎖
ラギング鎖には岡崎フラグメントが形成される。
岡崎フラグメント
複製フォークの進行方向とは逆にDNAが伸長するラギング鎖では、岡崎フラグメントと呼ばれるDNA断片が合成される。
岡崎フラグメントの長さは、大腸菌で1~2千塩基対、真核細胞では100~200塩基対と言われている。
(Okazaki fragment)
DNAポリメラーゼⅠ
DNAポリメラーゼⅠは、RNAプライマーの除去機能とDNA合成機能を持つ
DNA5'
3'
3'
5'
Pol I
Pol I
DNAポリメラーゼⅠ
DNAポリメラーゼⅠはエキソヌクレアーゼ活性を持ち、RNAプライマーを分解除去する。
5'-CTAG AGAGCTCAATCAT-3'llll lllllllllllll
3'-GATCTGAGATCTCGAGTTAGTA-5'
RNA
DNA
DNA
5‘→3’エキソヌクレアーゼ活性:ヌクレオチドを末端から除去する働き
DNA
-3' 5'-
DNAポリメラーゼⅠ
DNAポリメラーゼⅠは、RNAプライマーを除去した後、相補的DNA鎖を合成する。
5'-CTAGACTCT TCAATCAT-3'lllllllll llllllll
3'-GATCTGAGATCTCGAGTTAGTA-5'DNA
DNA
5‘→3’DNAポリメラーゼ活性を有する
DNA dATP-3' 5'-
大腸菌のDNAポリメラーゼ
役割の異なる複数のDNAポリメラーゼが存在する。大腸菌のPolIはDNAの修復とRNAプライマーの除去。PolⅢはDNA複製と複製時のエラー校正。
ポリメラーゼ Ⅰ ポリメラーゼ Ⅱ ポリメラーゼⅢ
5’→3’DNA合成活性 + + +3’→5’DNA分解活性 + + +5’→3’RNA分解活性 + - -
DNAリガーゼ
DNAリガーゼは新たに合成されたDNA鎖の末端同士を結合させる。
DNA5'
3'
3'
5'
L
L
岡崎フラグメントの3’末端が隣接するDNAの5’末端と結合
DNAリガーゼの詳細
DNAリガーゼはATP依存的にDNA鎖の3'末端水酸基と5'末端リン酸基をエステル結合させる。
5'-CTAGACTCTAGAG CAATCAT-3'lllllllllllll lllllll
3'-GATCTGAGATCTCGAGTTAGTA-5'DNA
DNADNA
ATP3'末端水酸基
5'末端リン酸基
CT
原核生物の複製されたDNAの分離
DNAジャイレース(DNAトポイソメラーゼⅡ)は複製が完了したDNAを分離する。
参考:キノロン系の抗生物質は細菌のジャイレースを阻害する。
真核生物の細胞周期
分裂開始から次の分裂開始までを細胞周期という。細胞周期はG1、S、G2、Mの4段階に分かれている。
細胞周期とDNA合成
細胞分裂の前にDNAが合成(複製)される(例外:減数分裂の第2分裂前)
DNA合成 細胞分裂
細胞周期とDNA合成
DNA合成はS期に行われる。
DNA合成 細胞分裂
G1期
G2期
S期 M期
真核生物の染色体の複製と分離
間期
中心体核
核小体
間期
間期には遺伝子が発現しタンパク質が合成される
S期
S期にDNAが合成される。G2期のDNA量はG1期の2倍
真核生物の染色体の複製と分離
前期
星状体
染色体
真核生物の染色体の複製と分離
前期
紡錘糸
相同染色体
コルヒチンの作用
チューブリンの重合方向
コルヒチン
αチューブリンβチューブリン
コルヒチンはチューブリンの重合を阻害し、M期の進行を阻害する(微小管や中心体の形成阻害)。
真核生物の染色体の複製と分離
中期
赤道面
動原体
真核生物の染色体の複製と分離
後期
真核生物の染色体の複製と分離
終期
くびれ
真核生物の染色体の複製と分離
終期
娘核
細胞分裂
真核生物の染色体の複製と分離
間期
娘細胞細胞分裂
細胞周期のチェックポイント
環境は望ましいか?
すべてのDNAが複製したか?環境は望ましいか?
すべての染色体が紡錘体に付着しているか?
DNAが損傷していないか?
DNAが損傷していないか?
DNAが損傷していないか?
細胞周期のチェックポイント
サイクリンとサイクリン依存プロテインキナーゼ(CDK)
による制御
細胞周期の制御系
真核細胞では細胞周期にあわせてサイクリンの濃度が
変化し、サイクリン依存プロテインキナーゼ(CDK)の活
性が変化する。
細胞周期の制御系
サイクリンによって活性化したCDKは、細胞周期の進行
に必要なタンパク質をリン酸化する。
真核細胞の細胞周期はサイクリンとサイクリン依存プ
ロテインキナーゼ(CDK)によって制御される。
直鎖状DNAの複製モデル
テロメア テロメア複製起点
複製単位=レプリコン
直鎖状DNAの複製モデル
直鎖状DNAでは、複数箇所の複製起点からDNAの
分離が始り、DNAの複製が行われる。
真核細胞の染色体DNAの複製単位をレプリコンという
テロメア
復習:真核生物のDNAの両末端にはテロメアが存
在する。
5'
3'
3'
5'
テロメア テロメアセントロメア
(動原体)
テロメア
直鎖状DNAの末端は複製の度に少しずつ短くなる。
鋳型DNA鎖
新生DNA鎖 RNAプライマー
3’末端
欠失新生DNA鎖
鋳型DNA鎖
テロメア
テロメアがある程度短くなると細胞分裂できなくなる。
テロメア
3’末端
5’末端
5’末端側に続く
3’末端側に続く
短い
テロメア部分は、一方の3’末端が長く他方の5’末端が短い
t-ループ
D-ループ5’末端
3’末端
細胞内ではループ構造になる
テロメア
テロメアはタンパク質と結合してループ構造(D-loopと
t-loop)を形成する。
テロメラーゼ
RNAを鋳型にDNAを合成する(逆転写)活性を持つ。
テロメラーゼ
再生
直鎖状DNAの両末端に存在するテロメアは、DNA複製のたびに短くなる。テロメラーゼは必要に応じてテロメアを合成(再生)する。