HEREDITAS (Beijing) 2013年 5月, 35(5): 607―615 ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn 综 述

收稿日期: 2012−09−27; 修回日期: 2012−10−23 基金项目: 国家自然科学基金项目(编号：81260021, 81200631, 81171184, 31060139, 30860086, 30660059), 江西省科技支撑计划-社会发展支撑

计划重点项目(编号：2010BSA09500)和江西省青年科学基金资助项目(编号：20114BAB215019)资助

作者简介: 汤晓丽, 在读博士, 讲师, 研究方向：糖尿病的分子机制 Tel: 13767974378; E-mail: xltangmail@163.com; 邓立彬, 博士, 副教授, 研究方向：生物信息学。E-mail: denglb@big.ac.cn 汤晓丽和邓立彬同为第一作者。

通讯作者: 梁尚栋, 博士, 教授, 研究方向：神经生理与神经药理。Tel: 0791-86360552; E-mail: liangsd88@163.com 网络出版时间: 2013-3-14 8:47:42 URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20130314.0847.001.html

DOI: 10.3724/SP.J.1005.2013.00607

固醇调节元件结合蛋白 1 及其靶基因网络

汤晓丽 1,2, 邓立彬 3, 林加日 3, 张伟龙 3, 刘双梅 1, 魏懿 3, 梅普明 3, 汪雁 3, 梁尚栋 1

1. 南昌大学医学院生理学教研室, 南昌 330001; 2. 南昌大学医学院生物化学教研室, 南昌 330001; 3. 南昌大学转化医学研究院, 南昌 330001

摘要: 固醇调节元件结合蛋白 1(Sterol regulatory element-binding protein 1, SREBP-1)是重要的核转录因子之一,

能调控内源性胆固醇、脂肪酸、甘油三酯和磷脂合成所需酶的表达, 以维持血脂动态平衡。研究表明, SREBP-1

及其靶基因网络的异常可引起胰岛素抵抗、Ⅱ型糖尿病、心功能紊乱、血管并发症和肝脂肪变等一系列代谢性

疾病。近年高通量组学技术的发展极大扩展了对 SREBP-1 靶基因及其转录调控模式的了解。文章对 SREBP-1

蛋白结构、活化过程、DNA 结合位点及其调控的靶基因等方面的研究进展进行了综述, 并着重介绍了基于组学

数据的转录调控网络的构建, 这将有助于更好的认识 SREBP-1在脂类代谢中的作用, 为深入探讨脂质代谢性疾

病的治疗提供新线索。

关键词: 固醇调节元件结合蛋白 1; 靶基因; 基因调控网络; 脂类代谢

Sterol regulatory element binding protein 1 and its target gene net-works

TANG Xiao-Li1,2, DENG Li-Bin3, LIN Jia-Ri3, ZHANG Wei-Long3, LIU Shuang-Mei1, WEI Yi3, MEI Pu-Ming3, WANG Yan3, LIANG Shang-Dong1 1. Department of Physiology, Medical College of Nanchang University, Nanchang 330001, China; 2. Department of Biochemistry, Medical College of Nanchang University, Nanchang 330001, China; 3. Institute of Translational Medicine of Nanchang University, Nanchang 330001, China

Abstract: Sterol regulatory element binding protein 1 (SREBP-1) is one of the important nuclear transcription factors. SREBP-1 can maintain lipids dynamic equilibrium by regulating the expression of enzymes required for synthesis of en-dogenous cholesterol, fatty acids, triglycerides and phospholipids. Anomalies of SREBP-1 and its target genes can cause a

series of metabolic diseases such as insulin resistance, type Ⅱ diabetes, heart dysfunction, vascular complications and

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hepatic steatosis. In these years, the development of high-throughput technologies has greatly expanded our knowledge about SREBP-1 target genes and the pattern of transcriptional regulation. Here we reviewed recent research progress of SREBP-1, with a focus on the protein structure, activation process, DNA binding sites and target genes. Most importantly, we showed the transcriptional regulatory networks based on omics datasets, which will contribute to a better understanding of the role of SREBP-1 in lipid metabolism and provide new clues for the treatment of lipid metabolism disorders.

Keywords: sterol regulatory element binding protein 1; target genes; gene regulatory networks; lipid metabolism

固醇调节元件结合蛋白 (Sterol regulatory ele-ment-binding proteins, SREBPs)属于碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链(bHLH-Zip)转录因子家族, 包含 3 个成员：SREBP-1a、SREBP-1c 和 SREBP-2。SREBPs是位点特异性的转录因子, 主要在肝脏和脂肪细胞中表达, 它通过调节脂肪代谢相关酶的基因表达来调控动物体内的脂肪合成。研究发现, SREBP-1的过度表达将引起糖脂代谢的紊乱, 导致脂肪在非脂肪组织中过度积聚, 从而引发肥胖、胰岛素抵抗、二型糖尿病和脂肪肝等代谢类疾病[1]。

1 SREBP-1的生物学特性

SREBP-1a 和 -1c 由位于 17p11.2 同一基因SREBF-1 编码, 是因第一个外显子转录起始位点的不同而产生的不同剪切体。在蛋白结构方面 , SREBP-1a 的转录激活区域略长于 SREBP-1c, 故活化能力强于 SREBP-1c[2]。实验表明, SREBP-1a主要在培养细胞中表达, SREBP-1c主要在肝脏和脂肪细胞中表达, 大多数研究表明 SREBP-1 主要调节脂肪酸代谢[3]。

1.1 SREBP-1的结构特征

人类的 SREBP-1由 1 147个氨基酸组成, 具有 3个结构域：(1)由 480个氨基酸残基组成的氨基末端, 包含结合 DNA的 bHLH-Zip区域, 是转录因子的功能活化区域; (2)由 80个氨基酸残基组成的两个疏水跨膜部分, 其连接部分为一伸入内质网腔约 30个氨基酸的小环; (3)由 590 个氨基酸残基组成的羧基末端, 该结构起着重要的调节作用[4]。

1.2 SREBP-1的活化

SREBPs 前体嵌于内质网膜, 与 SREBP 裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein, SCAP)紧

密结合成 SCAP/SREBP复合物。当胞内胆固醇水平高时, 胰岛素诱导基因蛋白与 SCAP作用, 使 SCAP/ SREBP 复合物滞留在内质网。反之, 胆固醇浓度低时, SCAP与胆固醇分离, 使胰岛素诱导基因蛋白与SCAP的作用中断, SCAP伴随 SREBP从内质网转到高尔基体; 再经位于高尔基体的两种蛋白酶(S1P、S2P)的水解, 释放出 N端 bHLH-Zip区域, 成为核型SREBP(Nuclear SREBP, nSREBP)。nSREBP快速转入核内, 与靶基因的 SER 序列相结合, 启动靶基因转录[3~5]。目前有研究认为, SREBP-1c前体的水解与细胞内胆固醇的浓度无关, 可能由胰岛素调控, 具体机制还不明确[6,7]。

2 nSREBP-1的转录调控网络分析

基因的正确表达依赖于转录系统的有序调控 , 转录因子与其靶基因之间的调控组成了复杂的网

络。这方面的研究有助于我们了解细胞对内部和外

部信号的反应, 并对探讨疾病的发病机理有着非常重要的意义。细胞中转录因子在适当的条件下结合

特定顺式作用元件 , 即转录因子结合位点 (Trans-cription factor binding site, TFBS), 激活或抑制靶基因的转录。因此, 发现转录因子的 TFBS是构建转录调控网络的关键问题, 而 TFBS 所对应靶基因的确认往往需要整合基因差异表达信息。尤其是在构建

特定生理或病理状态下的转录因子调控网络时, 必须获得相应状态下的基因差异表达数据。

目前研究 SREBP-1转录调控的模型可概括为两类：一类是直接模型, 即通过转基因/基因敲除调整小鼠体内 SREBP-1表达或在体外培养细胞中过表达SREBP-1[8~10], 这类研究在实验技术方面的要求较高; 另一类是间接模型, 根据实验对象分为体内和体外两种情况。体内模型是在动物禁食后给予高糖

第 5期 汤晓丽等: 固醇调节元件结合蛋白 1及其靶基因网络 609

饮食, 刺激肝脏 SREBP-1 的表达[11,12]。另一种是在

培养的细胞内, 加葡萄糖和/或胰岛素诱导 SREBP-1及其调控的靶基因的表达[13,14]。间接模型是根据机

体多数脂肪是由糖代谢转变而来的原理, 这类研究有助于深入了解糖尿病、肥胖等代谢综合征的发病

机理, 为疾病防治提供新靶点。

2.1 nSREBP-1的结合位点

TFBS 是与转录因子结合的 DNA 片段, 长度从几个到十几个碱基对不等。转录因子常常同时调控

若干个基因, 其在不同基因上的结合序列不完全相同, 但具有一定的相似性。每个转录因子的结合位点通常都有特定的模式, 称为模体。传统实验可以用凝胶迁移 (Electrophoretic mobility shift assays, EMSA)、DNase足迹法(DNase footprinting)、指数富集配体的系统进化(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)及染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)等技术来确定候选基因调控区域的 TFBS, 但这些方法均不能实现全基因组系统的分析。目前传统研究认

为 nSREBP-1 的结合位点应包含 SREs(5′-TCACNC CAC-3′)和(或)E-盒(5′-CANNTG-3′)两种模体[15,16]。

而根据已知两种 TFBS 的模体信息, 可在全基因组范围内预测 SREBP-1 可能的结合位点。2008年, Rome 等[8]利用芯片技术研究过表达 nSREBP-1原代培养人的肌肉细胞 , 并在差异表达基因上游 1 kb区域进行 SREs模体电子搜索, 确定了 652个候选的 nSREBP-1 调控基因。但这类研究必须基于已有模体的序列信息, 不能实现未知结合位点或模体的发现。而研究表明 SREBPs 自身是非常低效的转录因子, 只有接近 Sp1、NF-Y/CBF和 CREB等共调蛋白的结合位点时才能强烈刺激靶基因的表达[17,18], 所以, 通过经典的模体信息来寻找转录因子调控的靶基因这种方法可能已并不全面。

近年来, 生物学家将染色质免疫沉淀实验与高通量核酸杂交技术相结合, 在基因组水平“从头”发现转录因子和基因调控区域的结合, 从而构建转录因子的调控网络。2008年, Reed等[19]利用染色质

免疫沉淀芯片 (ChIP-chip)技术 , 在人肝癌细胞HepG2中证实 E-盒是 SREBP-1首选的结合位点, 并验证了一些已知的 SREBP-1靶基因。但由于芯片上

探针数目的限制, 这类实验仅能筛查转录起始位点(Transcriptional start sites, TSS)上游 1~5 kb的区域, 因此不能肯定这些结合位点在全基因组中的代表性。

最近得益于次代测序技术(Next generation se- quencing, NGS)的应用, nSREBP-1 结合位点的研究获得了突破性进展。2009年, Seo等[17]利用 ChIP-seq技术实现了在全基因组内“从头”发现 SREBP-1的结合位点。该研究在转录起始位置上游、转录终止

位置下游、内含子及 5′UTR区都发现了 nSREBP-1c的结合位点, 并在小鼠肝组织中成功发现了 1 个新的 SREBP-1模体(5′-ACTACANNTC CC-3′)。作者认为这一模体是 SRE的一个功能变体。由于 SREBP-1c 是 SREBPs 家族中在肝脏组织表达最高的一个成员, 故这一新的模体被认为是 SREBP-1c 在肝脏组织的模体。但值得提出的是, 该研究并没有发现 nSREBP-1经典的模体(SREs 或 E-盒)。Seo 等认为这可能是模型差异所导致的 [17], 因为 Shimomura 等研究表明, 在体外培养的细胞系中 SREBP-1a 的表达量高于SREBP-1c, 而在肝组织中 SREBP-1c 的表达量是SREBP-1a的 9倍[20]。此外, 测序技术的灵敏度高于杂交芯片也可能是导致差异的原因之一。最近, 有学者提出用 ChIP-seq 数据分析模体时, 应该基于在已识别的一组 TFBS内存在多个模体的假设[21]。

2.2 nSREBP-1调控的靶基因

目前较明确的 SREBP-1靶基因包括：低密度脂蛋白受体基因 (LDLR)[15], 乙酰辅酶 A 羧化酶

(ACC)[22, 23], 脂肪酸合成酶(FASN)[24], 甲状腺激素应答 Spot 14(S14)[25], 葡萄糖激酶(GK)[26]和磷酸烯

醇式丙酮酸激酶(PCK1)[27]等脂肪合成和葡萄糖代谢

有关的基因。据文献统计, 至 2008 年已发现 79 个SREBP-1在肝脏组织中调控的靶基因[19]。随着表达

芯片的普及应用及对 nSREBP-1结合位点的深入研究, nSREBP-1调控的靶基因谱也得到了极大的扩增。基于最新的ChIP-chip和ChIP-seq的研究, 在全基组内已发现上百个 nSREBP-1调控的候选基因[8,17,19]。我们对

最近两项高通量组学验证的 SREBP-1靶基因进行了对比, 发现ChIP-seq与ChIP-chip两种技术可相互印证(表 1)。但由于 ChIP-seq能实现真正的全基因组分析, 因此我们以 Seo 等的实验数据为基础构建禁食后再高糖喂养的小鼠肝脏 SREBP-1转录调控网络[17]。

610 HEREDITAS (Beijing) 2013 第 35卷

表 1 高通量组学研究所验证的 SREBP1 靶基因

基因名称 早期论文 ChIP-seq TFBS[17] ChIP-chip TFBS[19] 差异表达倍数[17]

乙酰乙酰 CoA合成酶 [9] 1 NaN 14.36

乙酰辅酶 A羧化酶 β [23] * NaN 3.90

ATP-柠檬酸裂解酶 [40] * 1 10.80

短链酰基辅酶 A合成酶 2 [41] 1 * 4.86

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 1 [27] * * −5.90

甾醇 14α-去甲基化酶 [46] 1 1 3.93

7-脱氢胆固醇还原酶 [47] * 1 4.56

长链脂肪酸延长酶 6 [48] 1 NaN 13.22

脂肪酸合酶 [24] 1 0 17.96

胆固醇 7a-羟化酶 [49] * 0 −2.22

法尼基二磷酸合酶 [30] 1 1 7.55

葡萄糖-6- 脫磷酸 氢酶 [50] 1 1 2.14

肝葡萄糖激酶 [26] * NaN 5.22

线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶 [30] 1 NaN 3.54

羟甲基戊二酰辅酶 A还原酶 [51] * 1 2.55

胰岛素诱导基因 1 [52] * 0 2.85

异戊烯二磷酸 δ异构酶 1 [46] 1 1 5.26

羊毛甾醇合成酶 [46] 1 1 4.72

MID1 相互作用蛋白 1 [9] * 1 5.49

甲基丙二酸尿症 [53] 1 1 2.06

二磷酸甲羟戊酸脱羧酶 [46] 1 NaN 6.01

甲羟戊酸激酶 [54] 1 1 2.01

前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶 [55] 1 NaN −5.90

磷酸脱氢酶 [50] * 1 8.04

细胞磷酸甲戊二羟酸激酶 [46] * 1 3.76

C4-甲基甾醇氧化酶 [9] * NaN 2.35

甾醇 C5脱氢酶 [46] * 1 2.42

载脂蛋白 A5 [56] * 0 −2.31

硬脂酰辅酶 A去饱和酶 [57] * 1 2.70

角鲨烯单加氧酶 [46] 1 * 6.05

固醇调节元件结合因子 1 [58] * NaN 5.11

StAR相关脂质转运结构域 4 [9] * NaN 2.30

甲状腺激素应答 Spot 14 [25] 1 0 37.30

注：1 代表存在临近 TFBS/有表达; 0 代表不存在临近 TFBS/无表达; *代表临界值; NaN代表芯片上无对应探针。

通过整合 ChIP-seq 和差异表达数据 , 可将SREBP-1 调控的基因分为 3 类模型 (图 1A)：①SREBP-1 直接调控的靶基因：即存在临近 TFBS 的差异转录基因。如, Fasn、乙酰乙酰 CoA 合成酶基因(Aacs)、法尼基二磷酸合酶基因(Fdps)、线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶基因(Gpam)、甾醇 14α-去甲基化酶基因(Cyp51)、角鲨烯环氧化酶基因(Sqle)等, 这与前期的研究结果相符(表 1)[28~33]。②SREBP-1间接

调控或远程调控的基因：即不存在临近 TFBS 的差异转录基因。推测这些基因可能是 SREBP-1或高糖条件间接调控的基因 , 如前期研究中几个公认的SREBP-1调控基因：3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A合酶(Hmgcs1)、法尼基二磷酸法尼基转移酶 1(Fdft1)、乙酰辅酶 A羧化酶 α(Acaca)、苹果酸酶(Mel)等虽表达差异很大 , 但基因临近区域没有发现相应的TFBS。这种间接调控的可能机制是 SREBP-1 通过

第 5期 汤晓丽等: 固醇调节元件结合蛋白 1及其靶基因网络 611

其他转录因子(或共激活因子)相互作用而实现的对靶基因的调控[21]。③SREBP-1可能调控的靶基因：暨存在临近可疑的 TFBS(即测序数据分析提示可能为假阳性的 TFBS)的差异转录基因, 如胰岛素诱导基因 1(Insig1)、肝葡萄糖激酶(Gck)、Pck1、ATP-柠檬酸裂解酶(Acly)等基因。前期研究提示这几个基因均与 SREBP-1 的调控相关 [34~37], 但 Gck 是否为SREBP-1 介导的靶基因目前还存在争议[38,39]。综合

分析这些实验结果, 我们认为 SREBP-1 对靶基因的调控机制还需更深入的研究; 尤其是上述的后两类基因还可能是高糖饮食通过其他代谢通路而引起一

些相关基因表达改变。

2.3 nSREBP-1调控网络及靶基因功能

SREBP-1 作为重要的核转录因子, 同众多靶基因之间构成了调控网络, 不但在脂肪从头合成中发挥重要的调控作用, 而且是多种代谢综合症中的关键连节点。因此构建转录调控网络有助于系统了解

SREBP-1 的调控作用、靶基因的表达变化及其参与的生物学通路。根据临近调控基因模型我们利用 Seo等的实验数据, 构建了以 SREBP-1 为核心的转录调控网络(图 1B), 并进行功能注释。如图所示, 该网络共涉及 487个 TFBS, 85个直接调控的差异转录基因(Differentially expressed genes, DEGs)及 26个 DEGs富集的生物学通路。图中可见大量的 TFBS(405 个)无对应的临近差异表达基因。这些 TFBS 的错误发现 率 (False discovery rate, FDR) 均 小 于 阈 值(FDR=0.2), 已尽可能排除测序及分析环节的假阳性的可能。原理上 ChIP技术所捕获的 DNA是细胞内与转录因子发生结合的区域, 应是具有调控功能的元件, 但实际情况可能并非这样理想。因为 ChIP实验对抗体的品质要求高, 品质较差的抗体以及免疫沉淀环节的低严紧性洗涤往往造成非特异性 DNA的沉淀[40], 产生高背景和假阳性。因此, 这些无临近DEGs的 TFBS的功能及作用还需后续实验验证。此外, 85个直接调控的差异转录基因中仅 16个是已知的 SREBP-1调控的靶基因(表 1), 其余新发现的这些基因也有待后续的功能学研究验证。

Seo 等在 ChIP-seq 数据分析中, 利用临近基因模型 , 对结合位点两侧的临近基因进行功能注释 , 发现显著富集的通路除包括脂类代谢和碳水化合物

代谢外, 还包括“细胞内蛋白质运动和定位”、“细胞的增殖和分化”以及“凋亡”等。而我们运用多

个软件对差异表达的基因进行了生物学通路分析 , 确证了“脂肪酸代谢”、“丙酮酸代谢”、“胆固醇的

生物合成”等通路显著富集; 但并未发现“细胞的增殖和分化”以及“凋亡”等通路中存在调控基因

富集。这一结果提示 SREBP-1调控的临近基因与相同状态下细胞差异表达的基因共享相似的代谢通路, 在全基因组的水平上印证了 SREBP-1及其靶基因在糖脂代谢中的作用。我们的分析同时提示, 临近基因模型虽然提示了 SREBP-1 可能调控的靶基因, 但由于基因表达的时空特异性, 这些基因并不一定同步表达, 因此, 在调控网络分析时“临近调控基因差异表达模型”较“临近基因模型”更为合适。

3 结语与展望

随着测序技术的飞速发展, 基因表达调控已成为生物学研究的一个重要领域, 并取得了相当大的进展。研究特定生物学过程(如疾病发生)中转录因子及其与靶基因的相互作用关系即转录调控网络, 有助于我们深入理解特定生命现象的可能机制。但在

构建 SREBP-1 调控网络的过程中, 我们也发现一些问题。

首先, 表达数据尚不完整; 传统的基因表达芯片只能代表基因组中部分编码序列, 因此不能真正实现全基因组范围内基因表达差异的筛查。目前 , 在新一代高通量测序技术迅猛发展的基础上 , RNA-seq(暨 RNA 测序技术)[41]应运而生。RNA-seq技术可对特定组织或细胞中所有 RNA进行测序, 能在全基因组范围内以单碱基分辨率检测和量化基因

转录。因此, 在今后构建 SREBP-1转录调控网络时, 如能将 RNA-seq与 ChIP-seq两种技术相结合, 即可无偏的实现全基因组内 SREBP-1结合位点及靶基因的筛查。

另一方面, RNA-seq 和 ChIP-seq 为组学研究带来了高分辨率的海量数据的同时, 也对数据分析提

出了极大的挑战。目前在基因组中预测 TFBS 的各种算法还普遍存在假阳性率偏高的问题, 且不同的算法之间的差异较大。如测序峰的 FDR阈值, 设置过高或过低均能导致假阳性或假阴性的结果。如何

有效地对测序数据进行针对性的生物信息学处理和

第 5期 汤晓丽等: 固醇调节元件结合蛋白 1及其靶基因网络 613

分析, 高山等已进行了相应讨论[42]。 其次, 在实验设计或模型选择上, 直接模型可

能比间接模型(如细胞培养时加高糖和/或胰岛素刺激, 或动物禁食后再饲以高糖饮食这两种模型)能更好地解释 SREBP-1的调控机理。因为在高糖培养或再喂养的过程中我们无法排除高糖对细胞或动物体

内其它基因的表达影响。在 Seo 的数据中, 很多差异表达的基因没有 SREBP-1 的 TFBS, 或结合位点的假阳性率超过阈值, 导致我们无法判断这些基因与 SREBP-1是否存在直接调控关系。

最后, 随着基因芯片及测序技术等在 SREBP-1转录调控研究中的应用, 发现了大量表达下调的基因[8,12]。而传统研究中 SREBP-1 转录抑制的作用较少报道, 如 Pck1, 微粒体甘油三酯转运蛋白(Mttp), 载脂蛋白 A5(Apoa5)[27,43,56]。因此, 为了更深入全面理解转录因子的调控机制 , 更为精确的实验设计 , 更合理的生物信息分析方法都是今后研究转录因子

及其调控网络要攻克的一些难题。

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