101-081-035최종보고서

고정밀 센서기술

Highly-precise sensor technology

전자소자를 이용한 수질 유해균 검침 키트 개발

Development of an electrical device to detect pathogenic

microbes in water

연세대학교 산학협력단

환 경 부

제 출 문

환경부장관 귀하

본 보고서를 “전자소자를 이용한 수질 유해균 검출 키트 개발 과제의” 최

종보고서로 제출합니다.

년 월 일2011 7 26

주관연구기관명 연세대학교 산학협력단:

연구책임자 정효일:

연 구 원 남용석:

백묘아:〃

최선미:〃

문희성:〃

곽봉섭:〃

권기호:〃

김형준:〃

최정헌:〃

이정현:〃

보고서 초록

사업명 차세대 핵심환경기술개발사업 기술분류 실용

연구과제명 전자소자를 이용한 수질 유해균 검출 키트 개발

최종성과품 전자소자를 이용한 수질 유해균 검출 모듈

수행기관

주관기관( )

기관

기업 명( )연세대학교 산학협력단 설립일 2004

주소 서울시 서대문구 성산로 연세대학교262

대표자

기관장( )홍대식 연락처 02-2123-6500

홈페이지http://www2.yonsei.ac.kr/rese

arch/index.asp팩스 02-2123-8619

연구과제

개요

주관연구책임자 정효일 소속부서 기계공학부전화

E-mail

02-2123-5814

uridle7@yonsei.ac.

kr

실무담당자 문희성전화

E-mail

010-8868-2764

moonhs@yonsei.a

c.kr

참여기업 주 코젠바이오텍( )

총사업비

천원( )

정부출연금민간부담금

합계현금 현물

355,000 14,500 105,500 475,000

총연구기간 년2008.3.1 ~ 2011.2.28 ( 3 )

연구개발

결과

최종목표

- 음용수 및 지하수 내의 감염성 세균의 분리 정제 및 측정에 관한,

기반 기술 개발과 바이오칩 시스템 고안 및 구현.

멤브레인 필터를- 이용한 수질 내 유해세균의 포집 및 농축 기술

및 효과적인 발광 측정 방법 개발ATP .

세균의 정량 정보를 신속하게 측정하는 것이 가능하고 휴대가 용- ,

이한 바이오칩 키트의 개발.

개발내용 및

결과

차년도[1 ]

소자를 이-DEPIM(Dielectrophoretic impedance measurement)

용한 센서 설계 및 을MEMS(Microelectromechanical systems)

이용한 제작

민감도 향상을 위한 최적화 및 성능 평가-

차년도[2 ]

유전영동 과 유체역학을 이용한 매질내-Dielectrophoresis(DEP, )

부유 세균의 및 기술trap sorting

세균이 부유한 매질이 바뀌어도 액상에서 일관된 측정을 할 수-

있는 전처리 기술 개발

센서 소자와 전처리 칩의 집적- microfluidic

차년도[3 ]

센서소자와 전처리 칩의 통합 및 화- microTatal Analysis System

샘플 전처리 및 시료 주입 자동화 기술 확립-

센서의 출력 신호를 해석 및 하는 키트의 개발- display

최종 산물의 사양[ ]

사양 세부 내용

측정원리 발광 반응ATP

측정센서 Photo-diode

측정범위 대장균 마리100≥

측정량 1ml≥

측정 세균 대장균

정확도 95%≥

측정시간 분10≤

무게 2 kg≤

개발기술의

특징장점․

기존의 센서들은 를 이용하거나 가격이 비싸고 다루기 힘- DNA

든 항체를 사용했으나 본 연구개발은 비교적 다루기 쉬운 효소와

발광 반응을 통한 전기 신호로 측정.

배양법이나 법에 들어가는 시간과 노력이 절- bio-conjugation

감됨으로써 검침시간이 빠르고 비전문 인력도 운용 가능.

멤브레인 필터를 이용해 간단하면서도 빠르고 효율적으로 수질-

내 세균 분리 포집 및 농축, .

소형화된 기기와 간단한 조작법으로 이동성 및 사용성 우수- .

기대효과

기술적 및(

경제적 효과)

본 연구 개발결과는- 기존의 복잡한 전처리 및 배양 시간이 없

이 세균 검침이 가능한 기술에 관한 것으로써 사후 검침이 아닌

사전 검침 및 모니터링이 가능하게 됨으로써 세균 정량 센서의

사용을 가능하게 함으로써 음용수 위생 관리에 새로운 전기를 마

련할 것으로 예상됨

본 연구 개발 결과와 유사한 시스템으로 음용수 뿐만 아니라-

다른 대상에서의 세균 정량도 가능

적용분야 자 내외100

과학기술적

성과

특허

국내 출원 건: 3

국외 -

논문

게재

SCI 논문 건SCI 5

비SCI -

기 타 -

사업화

성과

매출액

개발후 현재까지 -

향후 년간 매출3 억원50

시장

규모

현재의 시장규모국내 억원: 10

세계 억원: 200

향후 년 예상되는 시장규모(3 )국내 억원: 50

세계 억원: 500

시장

점유율

개발후 현재까지 -

향후 년3국내 : 30%

세계 : 5%

세계시장

경쟁력

순위

현재 제품 세계시장 경쟁력 순위 -

년 후 제품 세계시장 경쟁력 순위3 위3 ( 10%)

목 차

제 장 서론1 13…………………………………………………………………………

제 절 연구개발의 중요성 및 필요성1 ………………………………………………13

연구개발의 중요성 및 필요성1. …………………………………………………13

제 절 연구개발의 국내외 현황2 ․ ……………………………………………………15

해외 기술개발 동향시장1. ․ ……………………………………………………… 15

국내 기술개발 동향시장2. ․ ……………………………………………………… 21

제 절 연구개발대상 기술의 차별성3 ………………………………………………25

제 장 연구개발의 목표 및 내용2 ………………………………………………27

제 절 연구의 최종목표1 …………………………………………………………… 27

음용수 및 지하수 내의 감염성 세균의 분리 정제 및 측정에 관한 기반 기술 개발과1. ,

바이오칩 시스템 고안 및 구현…………………………………………………… 27

멤브레인 필터를 이용한 수질 내 유해세균의 분리 및 정제 기술 및 발광 반응을2. ATP

이용한 효과적인 검침…………………………………………………………… 27

세균의 정량 정보를 신속하게 측정하는 것이 가능하고 휴대가 용이한 바이오칩 키트3. ,

의 개발………………………………………………………………………… 27

제 절 연도별 연구개발의 목표 및 평가방법2 ………………………………………28

연구개발의 목표1. ……………………………………………………………… 28

연구개발의 평가방법2. ………………………………………………………… 29

제 절 연도별 추진체계3 …………………………………………………………… 30

연도별 추진체계1. ……………………………………………………………… 30

제 장 연구개발 결과 및 활용계획3 ……………………………………………31

제 절 연구개발 결과 및 토의1 …………………………………………………… 31

주요 실험결과분석 현황1. ․ ……………………………………………………… 31

연구개발 결과 요약2. …………………………………………………………… 89

연도별 연구개발목표의 달성도3. ………………………………………………… 91

연도별 연구성과 논문 특허 등4. ( · )……………………………………………… 92

관련분야의 기술발전 기여도5. ……………………………………………………96

연구개발결과의 활용계획6. …………………………………………………… 97

제 장 참고문헌4 101…………………………………………………………………

부록 104………………………………………………………………………………

그 림 목 차

그림 년 지역별 수질 오염 기준 초과율1.1 2005 ………………………………… 13

그림 수질내 유해세균 분리 검침 센서의 개발1.2 ………………………………… 14

그림 사의 전처리 와 국내 판매용1.3 Kikkoman lumitester( ), kit( ) ATPkit左 中

set( )右 ………………………………………………………………………………17

그림 사의 와 기기 구동을 위한 시료의 전처리 과정1.4 ATTO Liminecencer( ) ( )左 右

……………………………………………………………………………………… 18

그림 사의 와 기기의 구동을 위한 전처리 과정1.5 Perkin Elmer luminometer( ) ( )左 右

……………………………………………………………………………………… 19

그림 미세유로 내에서의 된 세균의 선택적 분리1.6 labeling ……………………… 20

그림 를 이용한 내 세균 정량 실험1.7 interdigitated microelectrode pure water

set up ……………………………………………………………………………… 21

그림 전극 사이에 형성된 의 을 이용한 임피던스 측정법1.8 bacteria pearl chain

……………………………………………………………………………………… 22

그림 미생물로부터 를 추출하고 발광 효소를 가해주는 전처리 과정을 담당하1.9 ATP

는 왼쪽 과 발광된 빛의 양을 측정하는 키트 가운microfluidic chip( ) Photo Sensor (

데 와 두 소자를 하고 패키징 했을 때의 조감도 오른쪽) integration ( ) ……………… 23

그림 공기 중 미생물 포집 및 정량 시스템1.10 ……………………………………24

그림 고체배지를 이용한 세균 정량 시스템1.11 ……………………………………25

그림 세균 농도에 따른 임피던스 값1.12 ………………………………………… 25

그림 기존 배지법과 본 연구진의 측정 방법의 차별성1.13 ………………………… 26

그림 본 연구진이 구상한 의 개략도2.1 Biochip …………………………………… 27

그림 3.1 Dielectrophoresis ……………………………………………………… 33

그림 마이크로 채널 내에서 마이크로 전극에 의한 전기장 형성 해석3.2 ………… 34

그림 유전영동을 이용한 연속 입자 분리기의 원리3.3 …………………………… 35

그림 유전영동을 이용한 연속 입자 분리기 제작 공정도3.4 ……………………… 37

그림 본 연구진이 개발한 유전영동을 이용한 연속 입자 분리기3.5 ……………… 38

그림 실험장치의 구성3.6 ………………………………………………………… 39

그림 다양한 유속 조건에 따른 의 를 이용한 분리3.7 polymer bead DEP ………… 41

그림 세균 먼지분리 실험 후 먼지 정량 데이터3.8 / ………………………………… 43

그림 3.9 e. coli와 먼지가 안에서 분리 된 모습DEP separator ………………… 43

그림 배지 내 미생물 검침 센서 모식도3.10 …………………………………… 46

그림 전극의 차이와 고체 배지 부피에 의한 임피던스의 변화3.11 ………………… 50

그림 임피던스에 의해 측정된 박테리아의 성장곡선과 흡광도의 비교3.12 ………… 51

그림 고체와 액체 배지에서의 전극 값 비교3.13 ……………………………………53

그림 박테리아의 개체수의 다양한 초기 값에 의한 고체배지에서의 검침 시간3.14

……………………………………………………………………………………… 55

그림 세 가지 다른 타입의 배지에서 임피던스 값과 광학적 방법을 이용한 박테리3.15

아의 성장곡선 ……………………………………………………………………… 56

그림 세 가지 배지의 초기 임피던스3.16 ………………………………………… 58

그림 미세유로 채널 내의 입자가 전기영동분극힘을 받아 이동하는 모습3.17 …… 60

그림 에서 미세유로 채널의 구조3.18 Separation part …………………………… 61

그림 미세 유로 채널 내 생성과 입자들의 이동3.19 sheath flow ………………… 61

그림 본 실험에서 을 포집 및 검침하기 위한 방법의 모식도3.20 particle ………… 62

그림 과 전극 사이의 거리에 따른 전기장 분석3.21 Guideline detection part ……63

그림 의 전극에 교류 전류를 가하기 전과 전류를 가한 뒤 세균의3.22 Detection part

거동 분석…………………………………………………………………………… 64

그림 의 농도에 따른 임피던스 측정 분석3.23 Escherichia coli ……………………64

그림 좌 미세유로 내에 샘플을 층류 유동으로 흘려주면서 아래쪽에 있는 전극3.24 ( )

구조로 포집 및 측정하는 구조 우 설계된 측정 소자의 모식도. ( ) ………………… 65

그림 미세유로 채널의 제작 과정3.25 ……………………………………………… 66

그림 본 실험을 위해 구축된 시스템3.26 ………………………………………… 67

그림 설계된 의 전기장 해석 결과3.27 device ……………………………………… 68

그림 미세유로 내의 힘 분포3.28 DEP ……………………………………………… 69

그림 대장균 농도별 임피던스 측정값 검은색 실선은 추세선3.29 . ………………… 71

그림 바이오 임팩터를 이용한 고체배지 집적된 바이오센서 시스템3.30 ……………72

그림 바이오 임팩터의 실제 모습 좌 노즐 부분 우3.31 ( ), ( )………………………… 73

그림 시간의 지남에 따라 배지의 이온조성에 의하여 나타나는 컨덕턴스 그래3.32

프…………………………………………………………………………………… 73

그림 의 주파수에서의 컨덕턴스의 변화3.33 40Hz ( S)Δ ………………………… 74

그림 측정 실험을 위해 사용된 실험 장비3.34 set up…………………………… 75

그림 외부 제거 유전 영동 소자 모식도3.35 ATP ………………………………… 76

그림 일정한 농도의 세포가 존재할 때 외부 의 농도 별 발광3.36 E. coli ATP ATP

반응 결과…………………………………………………………………………… 77

그림 일정한 농도의 외부 가 존재할 때 농도 별 발광 반응 결3.37 ATP E.coli ATP

과…………………………………………………………………………………… 78

그림 유속별 포집 효율3.38 ……………………………………………………… 78

그림 제작된 측정기기3.39 ATP (ver1)…………………………………………… 78

그림 필터에 의한 전처리 및 측정의 개념도3.40 ………………………………… 80

그림 측정 장치 외관3.41 ATP (ver2) …………………………………………… 81

그림 기기 내부의 모습3.42 ………………………………………………………… 82

그림 본 기기의 구성도3.43 ………………………………………………………… 83

그림 주요 부품 사진 좌 반응 챔버 및 포토 다이오드 부분 우상3.44 ( ) . ( )LCD

우하 과Controller. ( )Microcontroller Unit Main Board. ………………………… 84

그림 음용수내 세균 측정 장치 의 외관 모습3.45 ver 3 ………………………… 85

그림 세균 농도별 발광도 측정3.46 ATP ………………………………………… 86

그림 본 논문에 사용한 마이크로 채널 및 변수의 모식도3.47 …………………… 86

그림 요철을 포함한 마이크로 채널의 제작 공정 모식도3.48 ……………………… 87

그림 유체의 혼합 결과와 실제의 채널 모습3.49 ……………………………………88

표 목 차

표 그림 에서 보여지는 세가지 샘플의 측정된 그리고 값3.1 3.12 Z, OD600, .Δ Δ η

……………………………………………………………………………………… 56

표 전도도 상에서 다양한 주파수 조건에서의 입자의 거3.2 D.W. ( =1.8 S/cm)μ

동…………………………………………………………………………………… 67

표 대장균과 매질 의 물성치3.3 (D.W.) …………………………………………… 69

제 장 서론1

제 절 연구개발의 중요성 및 필요성1

연구개발의 중요성 및 필요성1.

우리나라 지하수수질기준에 의하면 년 이후부터 다양한 일반세균이 검사항목에 추‘04

가되어 지하수 수질오염도가 상당히 부각되고 있음.

전국 지하수 오염현황과 수질변화 추세를 정기적으로 파악하기 위해 연도별로 상 하반/

기를 나눠 지하수수질오염을 측정한 결과 오염 초과율은 전반적으로 증가하는 추세임.

기준 초과율은 미비하나 지하수 특성상 대수층을 통해 다른 지역으로 오염이 확산된다,

는 점을 고려하면 주변 관정도 오염되었을 우려가 커 실제 오염 관정은 상당히 광범위,

한 것으로 추정됨.

년에는 신규 추가된 일반세균 초과율이 높아 전체 초과율이 일시 증가했으나‘04 ,

년에는 세균 초과지점의 시설개선 등으로 초과율이 약간 낮아진 반면 연도별 상‘05 , /

하반기 모두 초과된 지점도 곳이나 조사되어33 , 오염 지하수의 수질이 여전히 개선되

지 않은 것으로 나타났음.

오염우려지역의 경우 폐기물매립지역 및 분뇨처리장 인근지역은 일반세균의 초과율이,

높았으며 일반지역의 경우 도시지역 농림지역 자연환경보전지역, (3.1%), (2.8%), (2%)

에서 일반세균 대장균군 등에 의한 초과율이 높았음, .

그림 년 지역별 수질 오염 기준 초1.1 2005

과율

이중 음용수로도 사용하고 있는 지점의 초과율은 2.9%이며 주로 일반세균 대장균군, ,

등이 검출되어 음용중지 시설개선 등의 조치를 취하였음, , .

이 같은 지역별 조사결과는 최근 대규모로 발생한 유사 식중독 환자 발생지역과 겹치

고 있음. 실제 년 월 이후 발생한 유사 식중독 환자는 총 명으로 이 중 인2007 7 2314

천이 가장 많은 명이었으며 서울이 명 경기가 명이었음 인천에서는 학교1398 681 , 235 .

외에도 환경연구단지 내 국립환경과학원 등에서도 유사 식중독 환자가 발생했음.

이미 학교 및 집단급식소에서 상용하고 있는 지하수의 이상이 유해균주에 의해 오30%

염되어 있으며 식중독의 위험성이 있으므로 신속한 조치를 필요로 함.

현재 수질오염 세균의 검침방법은 유해균주를 검침하는데 최소한 이틀 정도의 시간이

소요되고 증식이 느린 세균의 경우 배양기간이 일주일 또는 그 이상 연장될 수 있으며,

시료를 분석하기 위한 전문 인력의 기술을 많이 필요로 함.

또한 이 검침 방법은 수질 내에 존재하는 유해 균주에 의한 오염 여부를 시료 채취 후

약 일 후에 알 수 있기 때문에1~2 , 즉각적 조치가 어렵고 최근 많이 개발된 항체를 이

용한 검침방법의 경우 고가의 시료를 필요로 하면 전문가의 분석이 필요한 번거로움이

있음.

하지만 본 연구진이 제안한, 전기영동 분극 유전영동 를(DEP, Dielectrophoresis : )

그림 수질내 유해세균 분리 검침 센서의 개발1.2

이용한 수질 내의 유해균주의 분리 검침 방법을 이용한다면 실시간으로 소량의 샘플만,

으로도 음용수의 유해균주 오염의 유무를 판단 할 수 있기 때문에, 신속한 조치가 가능

함.

현재 국내외적으로 바이오칩 시장이 바이오 또는 의료 관련으로만 기하급수적으로 커

지는 추세임. 하지만 국내의 바이오센서 연구와 제품화는 주로 의료기기 분야에 치중되

어 환경에 응용할 수 있는 제품 개발 및 연구에는 투자와 인력이 부족한 실정임.

본 연구진이 제안한 수질 유해세균 검침용 환경 모니터링 센서 칩 기술은 차세대 바이

오 칩 시장을 선점할 수 있음.

제 절 연구개발의 국내외 현황2 ․

해외 기술개발 동향시장1. ․

식품의 유해 병원성 미생물 검출을 위한 분석법으로 가장 널리 사용되는 방법은

배지법 및 생화학적 테스트임 생화학적 테스트는 프랑스 사의. bioMeriux API,

그리고 가 널리 보급되어 있으나 최근에는 유전자검사법을 병행VITEK, VIDAS ,

하여 진단에 사용하고 있음.

나노와이어와 탄소나노튜브에 미생물을 인식하는 특정 항체를 고정하여 측정을 하는

바이오센서들이 최근 보고되고 있음.

하지만 이와 같은 방법은 시간과 비용이 많이 발생함 본 제안과 같이. 고가의 생화학

시료 없이 전자 소자와 바이오칩 기술을 이용해 빠르게 액상 샘플에서 세균을 검침하

는 기술은 세계적으로 보고된 바가 없음.

가 유전자 검사법을 이용한 검침.

국외 계측 장비 회사의 경우 PCR 중합효소 연쇄 반(polymerase chain reaction;

응)을 이용해 특정 세균의 를 검침하는 방법을 통해 샘플 내 세균을 동정하고DNA

있음 하지만 이런 장비들은 고가이면서 보관에도 주의를 필요로 하는 생화학 물질.

을 사용하고 있으며 장비 자체도 부피가 크고 고가임 또한 검침에도 시간이 많이.

걸리고 특정 세균의 유무를 판별할 수는 있으나 정량은 매우 어려운 시스템으로

되어 있음.

주 중합효소 연쇄 반응의 순서는 단계로 이루어짐 열을 이용하여 두 가* ) PCR : 3 .

닥의 를 분리하는 열변성 과정 을 거친 후 온도를 낮추어 시발DNA (denaturation) ,

체 가 증폭을 원하는 서열 말단에 결합 하게 하고 다시 열을(primer) (annealing) ,

약간 올려서 를 합성하는 중합 반응 을 일으DNA (polymerization or extension)

킴 열변성 과정은 보통 에서 열을 이용하여 가닥의 의 상보적인 염기. 95 2 DNA℃

의 수소결합을 가닥으로 떨어뜨리는 과정이며 결합 반응은 약 에서 한1 , 55~65℃

가닥의 에 시발체가 상보적인 염기서열에 결합하는 과정임 마지막으로 중합DNA .

반응은 한 가닥의 주형 에 시발체가 붙은 다음의 염기에 중합효DNA( DNA) DNA

소 를 이용하여 주형 의 상보적인 염기를 합성하여 두 가닥의(polymerase) DNA

으로 연장시킴 그 후 다시 열변성 과정 결합 반응 중합 반응을 반복하여DNA . , ,

를 증폭하게 됨 중합효소 연쇄 반응 회를 시행하면 유전 물질은 배로 증폭DNA . 1 2

됨 따라서 반응의 반복에 의한 기하급수적인 증폭이 가능하고 중합효소 연쇄 반. ,

응을 회를 반복하면 이론상으로 의 승배의 유전자가 증폭됨n 2 n .

세계 제 위의 의료진단키트 회사인1 Roche 사는 HIV, HCV, HBV, HPV 와 같은 주

요 병원체에 대한 유전자진단키트들을 판매하고 있으며 우리나라를 비롯한 전 세계 병,

원의 임상검사센터에서 이 키트를 사용하고 있음 또한. , Salmonella, Listeria

monocytogens, E.coli O157, 종에 대한 키트를 생산하고 있음3 .1)

유전자분석키트 개발의 선두 업체인 AppliedBiosystems( 사는 년에ABI) 2006

Salmonella, Listeria monocytogens, E.coli O157, Campylobacter jejunii, 종4

의 식중독균 검출을 위한 단일진단키트를 출시함.2)

Dupont 사는 Salmonella, Listeria monocytogens, E.coli O157,

Campylobacter jejunii, Enterobacter sakazakii 의 오염을 조사할 수 있는 종의4

키트를 생산하고 있음real-time PCR .3)

나 를 이용한 검침. ATP

소수의 기업만이 세균이 함유하고 있는 를 이용하여 부유 세균을 검침하는 방ATP

법을 이용한 제품을 판매하고 있으나 고가이면서 정성 분석이 불가능 하고 검침 속

도도 느린 단점이 있음.

일본 사의 의 원리는 세균의 대사산물 과 이Kikkoman lumitester (ATP) Luciferin

반응 할 때 나타나는 형광세기를 을 이용하여 측정하는 장비를 개발하여lumitester

시판중임 세균의 농도에 따라 발현되는 형광 세기가 늘어나는 원리를 이용한 것.

임 이와 비슷한 장비로 일본 사의 미국. ATTO luminecencer MCA, Perkin

사에서 개발한 는 가 있음Elmer ATPlite luminometer .

ü 일본 제품명KIKKOMAN ( ) - : Lumitester 4)

사의 의 원리는 병원균의 대사산물 과 이Kikkoman lumitester (ATP) Luciferin

반응 할 때 나타나는 형광세기를 을 이용하여 측정함 빛의 세기를lumitester .

전기적 신호로 변환하여 신호 창에 그 값을 나타냄 그 형태는 그림 에서. 1.3

보는 바와 같음.

국내의 휴코 바이오에서 독점 수입하여 국내에 시판하는 제품임 이 제품은 실.

시간 측정이 가능하고 휴대성이 좋으며 이라는 전처리 를 개발하여, Lucipac kit

전처리 과정이 간단하다는 장점이 있으나 가격이 수 백만원대를 호가하여 많이,

쓰이지는 못하고 있음.

그림 사의 전처리 와 국내 판매용1.3 Kikkoman lumitester( ), kit( ) ATPkit左 中

set( )右

ü 일본 제품명ATTO ( ) - : Luminecencer MCA 5)

사의 그림 는 위의 사의ATTO luminecencer MCA( 1.4) Kikkoman lumitester

과 같은 종류 로 이 역시 미생물 유무에 의한 빛의 세기를 측정luminometer

하는 기기임.

그러나 사의 제품과는 달리 측정 이 확립이 되지 않아 원하는 병Kikkoman set

원균을 감지하기 위해서는 실험실에서의 전처리가 필요하다는 단점이 있음.

따라서 이 제품은 휴대를 할 수 없으며 시료를 채취한 후 실험실로 다시 가져,

와서 측정을 해야 하기 때문에 시료의 이동시 오염의 우려가 있어 신뢰성 있는

분석이 어려운 단점과 전처리 과정의 복잡함으로 인해 작동이 어렵다는 단점이

있음.

그림 1.4 사의 와 기기 구동을 위한 시료의 전처리 과ATTO Liminecencer( )左

정( )右

ü 미국 제품명Perkin Elmer ( ) - : ATPlite 6)

미국의 사에서 개발한 는 을 이용하여 병원Perkin Elmer ATPlite luminometer

균을 감지하는 로서 그 원리는 위의 두 회사와 같음kit .

이 제품은 를 이용하여 한 번에 여러 가지의 병원균을 감지 할96-well plate

수 있다는 장점이 있으나 이 역시 전처리 과정이 매우 복잡하고 병원균의 분석, ,

을 위해서는 수 시간이 필요하여 실시간 측정이 어렵기 때문에 현장에서의 실시

간 검침이 불가능한 단점이 있음.

또한 가 들어가는 고가의 가 필요함, 96well plate luminometer .

그림 1.5 사의 와 기기의 구동을 위한 전처리 과정Perkin Elmer luminometer( )左

( )右

다 유전 영동 분야.

본 연구진이 제안한 유전 영동은 전기장이 걸린 유체 내 입자들이 고유의 전기적

표현형 에 따라서 상이한 거동을 보인다는 원리를 이용하는(electrical phenotype)

기술로써 내에서 입자들은 분리 원하는 위치로 이동 시킬 때 많이Microsystem ,

사용되고 있는 방법임.7)

년대 후반을 시작으로 유전영동을 이용한 미세입자의 조작 분리 농축 등의1990 , ,

연구가 활발하게 이루어지고 있음 초기에는 단순히 미세입자의 움직임 자체를 관.

찰하고 해석하는 연구가 많이 진행되다가 근래 들어 서로 다른 입자를 분리,

하고 혼합물에서 특정물질 만을 취해 농축 하는(separation, sorting) (enrichment)

연구가 활발히 진행되고 있음.

본 방법을 이용한 연구로 폴리머 입자 효모 혈액 세포 동물 세포를 이용한 연구, , ,

는 보고된바 있으나 세균을 이용한 연구는 매우 드뭄.

생화학적 친화성 을 이용한 방법으로 세균을 분리해낸 연구가(affinity) labeling

의 교수 연구팀에 의해 보고된 바 있음UC Santa Barbara Soh .8) 그림( 1.6)

그림 미세유로 내에서의 된 세균의 선택적 분리1.6 labeling

라 임피던스 측정 분야.

내에서 서로 다른 입자를 임피던스의 차이에 의해 구분하는 연구가microsystem

보고되었음 미세 입자의 임피던스를 직접 측정하는 연구보다는 입자를 부유하고.

있는 매질과 함께 측정하는 것이 대부분이며 혈구 과, apoptotic cell normal cell

을 구분할 수 있다고 보고되었음 또한 임피던스 측정법은 입자의 농도를 측정하거.

나 세포의 을 측정하는 등의 정량분석에도 사용되어지고 있음proliferation .

대학의 교수 연구팀에 의하면Arkansas Johnson interdigitated microelectrode

를 이용해 된 내에서 단 한 마리의 까지도 검출할 수control medium salmonella

있다고 보고되었음. 9)

그림 를 이용한1.7 interdigitated microelectrode pure

내 세균 정량 실험water set up

대학의 교수팀도 비슷한 원리를 이용하여 식품내 세균을 검침하는Purdue Bashir

센서를 만들었음 이는 교류 전기장을 인가 시켜 세균 입자들이 전극 사이에서.

을 형성하도록 한 후 임피던스를 측정하는 방법임pearl chain . 10)

이와 같은 시스템들은 이 순수하고 일정하게 된 상태에서 실험을medium control

진행한 것으로 조성이 다른 지하수나 상수원에 바로 적용하기 까지는 기술적으로

극복해야 할 점들이 많음.

국내 기술개발 동향시장2. ․

국내에서 본 제안과 같이 고가의 생화학 시료 없이 전자 소자와 바이오칩 기술을 이용

해 빠르게 액상 샘플에서 세균을 검침하는 연구를 수행하는 기관은 본 연구진이 유일

함.

가 유전자 검사법을 이용한 검침.

국내에 기기를 제작하는 기업은 삼성 바이오니아 두 곳이며 이를 세균 검침에 응PCR ,

용하려면 복잡한 전처리 과정을 추가적으로 거쳐야 함.

특정 세균 검침용으로 특화된 키트 기기는 수입에 많이 의존하고 있는 실정임 하PCR .

지만 이들은 고가이면서 보관에도 주의를 필요로 하는 생화학 물질을 사용하고 있으며

장비 자체도 부피가 크고 고가임 또한 검침에도 시간이 많이 걸리고 특정 세균의 유무.

를 판별할 수는 있으나 정량은 매우 어려운 시스템으로 되어 있음.11)

최근에 국내 바이오벤처인 인트론바이오테크놀로지는 세포 배양시 세포를 오염시키는

세균인 마이코플라즈마 를 검출할 수 있는 연구용 키트를 개발했음` (mycoplasma)' . 51

종의 마이코플라즈마를 검출할 수 있도록 특수하게 고안된 기술을 접목한 제품임PCR .

본 연구의 참여 기업인 코젠 바이오텍은 년 중소기업부품소재기술개발 사업2002 ,

의 일환으로 종의 식중독균에 대한 시스템을 국내 최초로 개발하9 multiplex-PCR

여 출시하였음 이 키트는. 한번의 반응으로 종의 식중독균을 검출PCR 9 할 수 있는

멀티플렉스 시스템으로 노동력과 검사의 신속 편의성 면에서 훨씬 우수한 것으로,

판단됨 이 성과는 국내 최초로 식중독균에 대한 유전자 동시진단시스템을 개발. ,

도입하였다는데 큰 의의를 가지며 특히 식품의약품안전청 질병관리본부 시도보건, ,

환경연구원 등과의 학문 기술 교류를 진행하고 있음 본 제품은 삼성에버랜드를, .

비롯한 대기업 식품연구소에 납품하고 있고 일본시장의 진입도 목표로 하고 있음.

추가적으로 식품 유래 식중독과 관련된 바이러스 및 원충의 유전자검출 시스템도

개발한 실적이 있음.12)

나 를 이용한 검침. ATP

국내에서 와 광센서를 이용해 세균을 검침하는 연구를 수행한 기관은 본 연구진이ATP

유일함.

본 연구진은 공기를 농축하여 공기중 부유세균을 빠르고 직접적으로 측정할 수 있

는 초소형 고감도 미생물 검침기기를 개발 하였음.13) 공기중 부유세균들로부터

를 추출한 후 발광시켜 이를 정량하는 방법임 모델 균주로는ATP . B. subtilis와

E.coli JM110가 사용되었고 검침 기기의 감도는 106 로써 저농도 미생물도cells/ml

그림 전극 사이에 형성된 의1.8 bacteria pearl chain

을 이용한 임피던스 측정법

검침 가능함을 보였음 본 연구의 결과물은 현재 상업화 준비 중에 있음. .

다 유전 영동 분야.

국내에서는 소수의 연구 그룹만이 유전영동 을 이용해 미세입자(dielectrophoresis)

를 하고 있음 이들은 크기가 다른 의 분리manipulation . bead ,14) 과viable

의 분리에 성공하였음non-viable yeast .15)

하지만 이들 연구는 정제된 샘플을 이용하여 두 가지의 서로 다른 입자를 binary

하게 구분만 한 것으로 검침은 하지 않았고 또 실제 음용수에 적용하기에는 무리가

있음.

본 연구진은 를 이용하여 생체입자를 분리DEP 하는 연구를 수행해왔음 미국의.

대학과 공동연구를 통해 을 하는 연구를 수행했고 최근Drexel Liposome sorting ,

에 삼성 종합기술원과 함께 공기 중 먼지와 미생물들을 농축하여 microfluidic

내에서 미생물을 분리해 내는데 성공chip 하였음 본 기술을 이용하면 음용수 내에.

서 미생물을 비침습적이고 빠르게 할 수 있음sorting, manipulation .

라 임피던스 측정 분야.

국내에서는 세균을 검침하기 위해 임피던스를 측정하는 연구는 본 연구진 외에는

보고된 바가 없음.

최근 식품안정성에 중점을 두고 식품에서 Listeria monocytogenes를 신속 정확,

하게 감지하기 위한 바이오센서를 개발하는데 임피던스 측정을 이용한 사례가 있

음 그러나 이것은 임피던스 측정을 통해 세균을 직접적으로 검침하는 것이 아니. ,

라 를 이용하여 분리된 세포가immunomagnetic beads Listeria cytopathogenic

그림 미생물로부터 를 추출하고 발광 효소를 가해주는 전처리 과정을 담당하는1.9 ATP

왼쪽 과 발광된 빛의 양을 측정하는 키트 가운데 와 두 소microfluidic chip( ) Photo Sensor ( )

자를 하고 패키징 했을 때의 조감도 오른쪽integration ( ).

를 나타내는지 측정하기 위해 감염된 조직 세포의 임피던스를 측정하는 방activity

법임.

그림 공기 중 미생물 포집 및 정량 시스템1.10

본 연구진은 DEPIM(Dielectrophoretic Impedance Measurement)을 이용하여 미생물

을 직접적이고 빠르게 검침하기 위한 시스템을 개발한바 있음 은. DEPIM

로 유체내의 입자들을 전극에 붙인 후 임피던스를 측정하여 정량dielectrophoresis

하는 기술임 본연구진은 이렇게 고안한 시스템을 통해 저 농도 마리. (10~1000 /ml)

의 Bacillus subtilis, Acinetobactor calcoceticus, Micrococcus Luteus 의 정량

에 성공하였다 이에 대해 삼성 종합 기술원과 함께 특허를 출원 했음. .

본 연구진은 미생물 배양기 제조업체인 주 퍼멘텍의 지원으로 미생(Fermentor) ( )

물이 배양되는 동안 실시간으로 농도를 정량화 할 수 있는 센서를 개발하고 있음.

배지 는 시간이 지나면서 극성을 가지는 미생물의 대사물질과 미생물 자체(media)

에 의해서 전기적인 성질을 가지게 되는데 에 의한 의 변화를 측정AC impedance

하면 미생물의 정량화가 가능하다는 원리를 이용했음.16)

본 연구진은 미생물의 생체 임피던스 측정을 통해 고체 배지내의 미생물의 존재 유

무를 실시간으로 측정하는 연구를 수행 중에 있음 미생물이 시간에 따라 고체 배.

지에서 증식이 되며 각각의 미생물은 고체 배지 내에서 저항의 역할을 함으로서,

임피던스의 값이 증가하게 됨을 확인할 수가 있었음 이를 통해 미생물의 생체 임.

피던스 측정을 통해 저농도 고농도의 박테리아도 측정 가능한 센서로의 활용 가능~

성을 확인할 수 있었음.

그림 고체배지를 이용한 세균 정량 시스템1.11

그림 세균 농도에 따른 임피던스 값1.12

제 절 연구개발대상 기술의 차별성3

1. 대부분의 연구들이 세균의 대사 결과에 의한 화학적 변화를 측정하는 간접적인 방법인데

비해 본 연구진의 방법은 박테리아를 직접적으로 측정 방법임.

2. 다른 연구들은 시간이 많이 들어가는 미생물 배양 많은 비용이 들고 유지가 어려운 생물,

질 사용하여 측정을 하는 방법을 사용했으나 본 연구는 이러한 점들은 지양함.

3. 기존의 연구 방법은 매질 자체의 변화에 대응하지 못하지만 본 연구진의 방법은 그에 대

한 대응책을 갖췄음. 한 가지 매질만을 대상으로 하면 기존의 방법으로도 측정이 되지만(

매질이 바뀔 때 예 다른 위치 종류의 샘플 는 매질 자체의 성질의 영향으로 측정값의 일( : , )

관성이 없어짐.)

4. 본 연구는 세균이 포함된 샘플의 종류에 상관없이 전처리 과정을 통해 세균microfluidic

만을 직접적으로 정량하는 방법으로 가존 연구들과는 달리 음용수에 바로 적용할 수 있음.

그림 기존 배지법과 본 연구진의 측정 방법의 차별성1.13

제 장 연구개발의 목표 및 내용2

제 절 연구의 최종목표1

1. 음용수 및 지하수 내의 감염성 세균의 분리 정제 및 측정에 관한 기반 기술 개발과,

바이오칩 시스템 고안 및 구현.

2. 멤브레인 필터를 이용한 수질 내 유해세균의 분리 및 정제 기술 및 발광 반응을ATP

이용한 효과적인 검침

3. 세균의 정량 정보를 신속하게 측정하는 것이 가능하고 휴대가 용이한 바이오칩 키트의 개,

발.

그림 2.1 본 연구진이 구상한 의 개략도Biochip

가 정량적 목표. (Speculation)

주요 항목 성능

측정 세균 대장균

정확도 95%

측정 시간 분 이내10

측정 한계 마리100 /ml

검지 오차 미만5%

제 절 연도별 연구개발의 목표 및 평가방법2

1. 연구개발의 목표

구분 연구개발의 목표 연구개발의 내용 비고

차년1

도

을 응용한 센서 설계-DEPIM

소자의 효율적인 비-DEPIM

균일 교류 전기장 발생을 위한

전극구조

주관

공정을 이용한 제작-MEMS소자의 소형화 및 제작 공정-

의 최적화주관

민감도 향상을 위한 센서 구조- DEPIM

최적화

실험을 통한 설계안의 검증-

및 성능 평가주관

차년2

도

멤브레인 필터 유체역학을 이용한-

매질내 부유 세균의 및trap

기술 개발Sorting

멤브레인 필터를 이용한 농축-

및 기술 개발 및 효율 증trap

대

주관

매질이 바뀌어도 세균의 개체수에-

따라 일관된 측정을 할 수 있는 전

처리 기술 개발

세균 입자의 농도에는 변화가-

없이 부유 매질의 제어주관

센서 소자와 전처리- microfluidic

칩의 설계integration

전처리와 발광 측정을 동시에-

수행하는 소자 제작주관

차년3

도

센서 소자와 전처리 칩의 통합 및-

화micro Total Analysis System

센서 소자와 전처리 칩의 효과-

적인 통합 및 패키징 방법 연구주관

샘플 전처리 및 시료 주입 자동화

기술 확립

-microfluidic chip connrol

기술.

위한- power management

구축system

주관

센서의 출력 신호를 해석 및-

하는 키트의 개발display

음용수를 대상으로 하는 고감도-

세균 검침 실험을 통한 검증 및

최적화.

주관

2. 연구개발의 평가방법

구분 세부 내용 평가의 착안점 및 기준

차1

년도

소자의 설계 및 제작-DEPIM 제작의 용이성 및 센서의 크기- (1cm x

1cm)

민감도 향상을 위한 소자의 최적화- 아상의 정확도-90%

이상의 재현성-90%

마리 의-10 /ml resolution

차2

년도

부유 세균의 신속한 포집 및 전처리 기-

술 개발

포집 효율- : 95%

측정 시간 분 이내- : 10

매질이 바뀌어도 세균의 개체수에 따라-

일관된 측정이 가능하도록 하는 전처리

기술 확립

매질이 바뀌어도 세균입자의 개수는-

이상 유지95%

매질이 바뀐 후 전도성이 표준 매질과-

이내의 차이 유지5%

차3

년도

센서 소자와 전처리- microfluidic chip

의 및 최적화integration

정확도 이상- : 95%　

측정 시간 분 이내- : 10

측정 용량- : 1ml

측정 한계 마리- : 100 /ml

소자 및 칩의 패키징-

소자 및 크기- chip : 10cm X 5cm

이내

리더기와의 호환 용이성-

샘플 전처리 및 시료 주입 및 혼합-

기술 확립

내의 유체 구동-microfluidic system

유속 : 0.1~25ml/min

내부 전원 장치의 적정 전압 인가 여-

부

직류Frequency :

Voltage : 0 ~ 20V

미만Voltage variation : 10%

최종

평가

센서의 출력 신호 해석 및 영상 출력-

하는 리더기 개발

포토 다이오드에서 출력된 전압 신호-

를 필터링 해석하여 농도로의 변환 기, ,

술 확립

정확도 이상- 95%

측정 오차 미만- 5　： ％

다양한 음용수 내 저농도 세균의 검-

침측정 한계 마리- : 100 /ml

제 절 연도별 추진체계3

1. 연도별 추진체계

구분 연구개발의 내용추 진 일 정

비 고1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

차년도1

을 응용한 센서 설DEPIM

계주관

공정을 이용한 제MEMS

작주관

민감도 향상을 위한

센서 구조 최적화DEPIM주관

차년도2

멤브레인 필터 유체역

학을 이용한 매질내 부

유 세균의 및trap

기술 개발Sorting

주관

매질이 바뀌어도 세균

의 개체수에 따라 일관

된 측정을 할 수 있는

전처리 기술 개발

주관

센서 소자와 전처리

칩의microfluidic

설계integration

주관

차년도3

센서 소자와 전처리 칩

의 통합 및 micro Total

화Analysis System

주관

샘플 전처리 및 시료

주입 및 혼합 기술 확

립

주관

센서의 출력 신호를 해

석 및 하는 키display

트의 개발

주관

제 장 연구개발 결과 및 활용계획3

제 절 연구개발 결과 및 토의1

1. 주요 실험결과분석 현황․

가 유전 영동을 이용한 기술 입자 제어 기술. cell sorting ( )

기술의 필요성(1)

최근 위생에 대한 관심이 증대함에 따라 공중보건을 위협하는 박테리아 바이러,

스 곰팡이 등과 같은 미생물에 대한 실시간 검침 및 정량법에 대한 수요가 늘,

고 있음

특히 전염이 높고 및 인체에 심각한 피해를 주는 유해세균의 경우는 빠른 검침

에 의한 조기경보시스템 의 도입이 필요함(Early Warning System, EWS) .

하지만 이를 뒷받침 할 수 있는 측정 기술은 현재 부재한 상황

현재 가장 많이 쓰이고 있는 배지법은 배지에 시료를 도포하여 세균이 증식하는

지 또 얼마나 많이 증식하는지를 직접 눈으로 관찰함으로써 검출하는 방식,

이는 배양에만 최소 하루 이상이 소요되고 모든 과정이 숙련된 전문인이 수작업

으로 진행해야 하는 번거로움이 있어 빠른 검침에 의한 조기경보시스템으로는

적합하지 않음.

이에 따라 최근에 임피던스 컨덕턴스 인덕턴스(Impedance), (conductance),

같이 검침시간이 빠른 전기신호를 이용한 검침 및 정량법에 대한(Inductance)

연구가 활발히 진행되고 있음(17), 18), 19)).

이는 계측 장비를 이용한 자동화된 정확 고감도의 측정이 가능하기 때문에 조, ,

기 조기경보시스템에 적합한 방식임.

음용수와 같은 환경 시료를 전기를 이용한 방식으로 측정하기 위해서는 측정대

상인 세균뿐만 아니라 다양한 물질이 포함된 샘플을 채취해 직접적인 측정 배양(

과정 없이 을 해야 함) .

이 과정에서 시료 속에 포함된 먼지들은 전기적 측정 방식에 오차로 작용해 검

침에 큰 어려움을 끼침(20)).

이에 본 연구진은 세균 검침을 위한 전처리 과정으로써 non-biological

예 먼지 등 부터 박테리아를 분리해내는 세포 분리기를 고안material( : ) .

측정 대상 시료에서 검침 대상인 세균만을 선택적으로 분리를 한 후 측정을 하

면 생체특이적 면역반응 항원 항체 반응 이나 유전자 분석방법을 사용하지 않고( )

간단한 전기적 검침이 가능함

음용수내 저농도 세균을 검출 하기 위해서 또 감도 향상을 위해 먼저 부유 세,

균을 센서 표면으로 끓어 오는 기술이 필요함 즉 유전 영동 를 통한 입. , (DEP)

자 제어 관련 기술이 확보 돼 있어야 전기적 검침 기술을 적절하게 적용 할 수

있음.

미세유체 기술 과 유전 영동 기술(2) (Microfluidics) (Dielectrophoresis)

미세유체 기술은 마이크로 사이즈의 유체 채널(Microfluidic) (Microfluidic

을 이용해 유체를 제어하는 기술로 기존의 방식의 시료 처channel) Bench-top

리 방식에 비해 많은 장점을 가지고 있음

미세유체 기술은 방식으로 잘 알려진 공Photo-lithography microfabrication

정 기술을 이용해 설계 및 제작이 용이함

또한 작은 크기로 인해 최소한의 양의 시료를 가지고 효율적인 분석을 할 수 있

고 시스템의 전력 소모가 작으며 분석 시간이 짧아 짐

작은 크기와 저렴한 제작 비용으로 이동성 와 일회성 사용(Portability)

이 가능해 현장에 직접 가져가 간편하게 측정을 하고 일회용 소(Disposability)

모품 처럼 쓸수 있다는 장점이 있음

미세유체를 이용해 세포를 포함한 미세 입자를 제어하는 다양한 기술들 수력(

학21)22) 어쿠스틱, 23) 자기력, 24)25) 이 발표가 되었지만 전기장을 이용해 제어)

하는 방식인 유전 영동법 이 최근 많은 관심을 불러일(Dielectrophoresis, DEP)

으킴.

유전영동은 불균일한 전기장에서 입자와 매질의 분극화 되면서 발(Polarization)

생하며 입자와 전기장의 분극화도에 따른 입자의 움직임을 뜻함.26)

이때 입자가 전기장이 강한 쪽으로 끌려가는 힘을 받는 것을 강positive DEP,

한 쪽에서 밀려나는 힘을 받는 것을 라 함negative DEP .27)28)

그림 3.1 Dielectrophoresis

유전영동을 이용하면 작은 전력으로 입자에 표식이나 전처리 없이 선택적으로,

그리고 빠르고 효율적으로 입자를 제어할 수 있다는 장점이 있음

이때 유전영동 으로 인해 구형의 입자가 받게 되는 힘 는 다음과(DEP force)

같은 수식으로 표현됨

FDEP=2πεmε0r3Re[FCM] |E

2|

입자의 직경(r : , εm 매질의 유전율: , ε0 진공의 유전율: ,

Re[FCM 의 실수부 전기장] : Clausius-Mossotti(CM)factor , E: )

유전영동과 미세유체를 이용한 연구는 그동안 많은 관심 속에 이뤄졌지만 환경

기술을 위한 연구는 거의 진행이 되지 않아 의생명 분야에 치우쳐진 경향이 있

음

본 연구진은 새로운 전극 구조를 갖는 미세유체 유전영동 세포분리기를 고안.

이를 통해 먼지 시험입자 를 분리non-biological material ( , (Polymer Bead))

하는 기술을 개발.

연구 방법(3)

가 세포 분리기 설계( )

마이크로시스템 에서 교류 전기장을 인가하면 마이크로 전극의(Microsystem)

가장 자리 부분 에 가장 강한 전기장이 형성됨 따라서 입자들은 이 전(edge) .

극의 가장자리를 기준으로 인력을 받거나 척력을 받음 전극 구조상에서 전기.

장의 양상을 해석프로그램인 를 이용해 시각화하면 그COMSOL Multiphisics

림 와 같음3.2 .

그림 3.2 마이크로 채널 내에서 마이크로 전극에 의한 전기장 형성 해석

그림 의 밝은 부분이 전기장이 강한 부분이며 입자가 를 보3.2 positive DEP

일 때 전극의 가장자리 부분으로 끌려가고 를 보일 때 밀려나negative DEP

는 것을 예상할 수 있음.

고안된 장치는 로 만들어진 미세유체 채널과 실리콘 웨이퍼에 금으로PDMS

패턴한 마이크로 전극으로 이뤄짐.

미세유체 채널은 주요 구간이 330 m width, 30 m height, 11 mmμ μ

의 크기를 갖음length .

전극은 의 회전반경을 갖는 호 모양이고 입자는459.49 mm -0.79°~

의 입사각으로 전극 위를 지나가게 설계됨0.79° .

그림 3.3 유전영동을 이용한 연속 입자 분리기의 원리

두 전극간의 거리는 이며 분리영역에서의 길이는 임25 m 11mm .μ

고안된 장치는 개의 를 위한 개의 개의3 inlet(sheath flow 2 inlet, 1 sample

과 개의 으로 이루어 졌음inlet) 2 outlet .

그림 은 고안된 장치의 작동 원리를 나타내고 있음 힘을3.3 . negative DEP

받는 입자는 전극의 가장자리로부터 밀려나는 힘을 받아 그림의 아래 부분으

로 밀려나게되어 최종적으로 로 나가게됨outlet II .

힘을 받는 입자는 전극의 가장자리로부터 인력을 받아 채널을positive DEP

지나면서 전극 가장자리 부분을 따라가게 되고 최종적으로 으로 나가outlet I

게됨.

힘을 거의 받지 못하는 입자는 채널의 중앙부위로 흘러가다 로DEP outlet II

나가게됨.

이러한 원리를 이용해 서로다른 특성을 보이는 입자들을 분리할 수 있DEP

음 그림 의 은 나 와 분리가 되는 것. 3.3 particle type I particle type II III

임.

는 의 영향으로 채널 중앙 부위에 되는sample flow sheath flow focussing

데 이는 이렇게 곡선 전극간 부위에 접선 방향으로 입자들이 흘러갈 때 본

설계가 가장 좋은 효과를 보일 수 있기 때문임.

먼지와 같이 구성 물질이 복잡한 경우 움직임을 분석하기 쉽지 않음 하지만.

고안된 장치는 먼지 속에 섞여 있는 세균을 위에 설명한 원리로 분리해 낼

수 있음.

기존에 연구에서 쓰이던 구조는 를DEP slanted electrode negative DEP

이용해 입자들을 분리 입자의 크기를 바탕으로 효과적으로 분리를 할 수 있.

으나 분리하고자 하는 입자중 한 종류는 다른 한 종류는negative, positive

를 보일 경우 분리가 쉽지 않다는 단점이 있음DEP .

이에반해 본 연구진이 고안한 입자 분리는 좀더 넓은 범위의 입자들을DEP

분리할 수 있고 먼지와 같이 복잡한 구성을 가져 거동이 한 입DEP broad

자도 분리 할 수 있다는 장점이 있음.

나 세포 분리기 제작( )

고안된 장치는 미세유체채널 과 밑면에 있는 미세전(Microfluidic channel)

극으로 구성됨.

밑면에 있는 전극은 일반적인 방법으로 제작 되었음 인Photolithography . 4

치 실리콘 웨이퍼에 SiO2로 절연층을 만들고 그 위에 금을 증착하였음 금.

은 하고 화학적으로도 안정한 금속으로 많이 사용 되고 있음biocompatible .

이때 금과 실리콘 웨이퍼의 을 높이기 위해 를 사이에 증착하였adhesion Ti

음.

이후 를 로 스핀코팅하고 를 이용해 패턴을 전사하PR (AZ1512) 1 m UVμ

였음 전사된 패턴을 로 이용하여 와. PR mask Au developer

를 이용해 전극을 패턴하였으며 마지막으로BOE(Buffered oxide etchant)

은 아세톤을 이용해 제거되었음PR .

미세유체 채널은 과정으로 제작되었음 를soft-lihography . SU8 2025 30

의 높이로 실리콘 웨이퍼 위에 스핀코팅하고 이를 통해 채널의 깊이가m (μ

결정됨 를 이용해 패턴을 만듬) UV .

만들어진 에는 가 부어져 채널이 만들어짐 는 경화SU8 mold PDMS . PDMS

제와 의 비율로 섞어서 사용됬고 진공 챔버를 이용해 기포를 제거함10:1 .

역시 한 물질로 의료용 미세유체 소자에 많이 이용되PDMS biocompatible

는 추세임.

경화된 는 몰드로부터 떼어내 산소 플라즈마 처리를 한 후 전극과PDMS

됨bonding .

설명된 본 소자의 제작 과정은 아래의 그림과 같음 는 밑면에 위치한. (a)

전극을 제작하는 과정이고 는 미세유로를 제작lithograpy, wet etching (b)

하는 과정soft-lithograpy .

이러한 제작 공정을 거쳐 제작된 미세유체 세포 분리기는 아래의 그림과 같

음

그림 3.4 유전영동을 이용한 연속 입자 분리기 제작 공정도

다 샘플 준비( )

먼지와 세균의 분리 실험에 앞서 시험 입자 를 이용(Polymer microbead)

한 사전 실험을 선행

크기의0.71 m polystyrene bead(R700, Duke Scientific Corporation)μ

와 크기의2 m polystyrene bead (4202A, Duke Scientificμ

를 이용Corporation)

매질로 사용된 물질은 증류수로 의 낮은 전도성을 갖고 있음0.18mS/m .

본 실험을 포함한 본 과제를 위해 사용하는 모델 세균는 Escherichia coli

로 한국종균협회에서 구입 구입된 세균은 에서. Nutrient Broth(Difco) 24

시간 배양 시킨 뒤 separation에 사용했으며 증류수와 세균을 섞어 세균혼

합액을 제조.

먼지는 에어컨의 필터에서 채집하여 증류수와 혼합.

라 실험 장비( )

두 개의 주사기 펌프를 통해 과 에 각각 샘플과 증류수sample sheath flow

를 공급 테프론 튜브를 이용해 주사기와 연결하였고 함수발생기를. device

이용해 교류 전기장을 인가함.

장치 내에서 이러나는 현상은 현미경을 이용해 실시간으로 관찰됨.

그림 3.5 본 연구진이 개발한 유전영동을 이용한 연속 입자 분리기

그림 3.6 실험장치의 구성

실험 결과(4)

가( ) 입자의 거동DEP

고안된 장치의 최적 구동 조건을 결정하기 위해 간단한 interdigitated

를 이용해 입자의 다양한 주파수의 전압을 인가했을 때 입자가electrodes

어떻게 거동하는지를 관찰함.

매질은 의 전도성을 갖는 증류수를 이용하였고 의 진폭을 갖0.18mS/m 5V

는 전압을 인가.

Micrococcus luteus 종의 세균의 경우 에서 의 영역에서70kHz 10MHz

거동을 보이고 이하의 영역에서는 거positive DEP 50kHz negative DEP

동을 보임.

의 지름을 갖는 의 경우 역시 이하에서는0.71 m polymer bead 50kHzμ

거동을 보였고 의 영역에서는negative DEP 100kHz~1MHz positive

거동을 보임DEP .

지름을 갖는 의 경우 이하에서2 m polymer bead 10MHz negativeμ

거동을 보이는 것을 확인함DEP .

먼지의 경우 대부분의 주파수 영역에서 특정 성질을 보이지 않음DEP .

이러한 결과들은 를 주파수를 이용0.71 m, 2 m polymer bead 1MHzμ μ

하면 분리할수 있다는 사실을 알려줌.

또한 해당 주파수를 이용하면 와Micrococcus luteus 2 m polymerμ

를 분리 할 있고 먼지와도 분리가 가능 한 것을 알 수 있음bead .

나 시험입자의 분리( )

먼지와 세균의 분리 실험에 앞서 고안된 장치의 분리 성능을 검증하고 정량

적으로 평가하기 위해 와 를 이용해 분리0.71 m 2 m polymer beadμ μ

실험을 진행함.

이는 세균의 경우 사이즈가 비슷한 와 실험에 사0.71 m polymer beadμ

용한 먼지와 크기가 비슷한 를 통해 해당 샘플을 모사2 m polymer beadμ

하여 실험을 진행한 것임.

두 입자 모두 3.3x106 농도로 시료를 만들어 사용했으며 유량particles/mL

은 를 기준으로 가지main flow 0.5 l/min, 2.5 l/min, and 5 l/min 3μ μ μ

경우를 사용함 이때 유속이 늦을수록 입자가 힘을 받는 시간이 늘어. DEP

나기 때문에 분리가 효과적으로 되는 것으로 나타남.

위 실험 조건 중 가장 낮은 유속 조건일 때 이 경우0.71 m beadsμ

순도 의 경우 를 얻을 수 있었96.2% purity( ), 2 m beads 90.7% purityμ

음 그림. ( 3.7)

그림 3.7 다양한 유속 조건에 따른 의 를 이용한 분리polymer bead DEP

인가 전기장은 진폭에 의 주파수를 갖는 사인파였으며 이때 전압5V 1MHz

은 동안 인가 하다가 동안 휴지기를 주고 다시 동100ms 100ms 100ms

안 인가 동안 휴지기를 주며 반복적으로 인가와 휴지기를 주는 방, 100ms

식을 사용함.

이는 를 받는 입자가 전극의 가장자리에 붙어버리는 것을 막positive DEP

기 위한 방편임.

살아있는 세포가 전기장이 강한 전극의 가장자리에 붙게 되면 에viability

안좋은 영향을 받고 가 될 수도 있기 때문에 세포를 살아있는 상태로lysis

계측을 하는 경우라면 반드시 피해야 하는 상황임.

의 의 경우 그림 의 과 같이 미0.71 m polymer bead 3.3 particle type Iμ

세유체 채널 내를 지나가고 의 경우2 m polymer bead particle type IIμ

과 같이 움직이는 것으로 관찰됨.

다 세균과 먼지의 분리( )

의 먼지와0.03 g/ml 3.3x106

농도의 세균을 혼합해 시험 용액을 만cells/ml

들어 미세유체 세포분리기에 주입함.

실험에서 사용한 조건은 시험입자를 이용한 실험과 동일.

세균의 경우 현미경을 이용해 로 정량이 가능하고 이를 이용해cell count

분리 성능을 계산할 수 있지만 먼지의 경우 육안으로 정량하기가 불가능하

기 때문에 를 이용한 흡광도 측정법으로 정량을 시도함spectrophotometer .

그림( 3.8)

먼지의 농도와 훕광도간의 상관관계를 통해 도출한 결과 주입한 농도 대비

배 희석된 것으로 나타남 따라서 의 분리 효율을 보임7.6 . 86.8% .

이때 세균은 의 분리 효율을 보임89.6% .

그림 는 세균과 먼지가 채널내 각기 다른 위치 에 지3.9 (lateral position)

나감으로써 분리가 되는 것을 나타내는 사진.

그림 3.8 세균 먼지분리 실험 후 먼지 정량 데이터/ .

그림 3.9 e. coli와 먼지가 안에서 분리DEP separator

된 모습.

결론(5)

본 연구를 통해 유전영동 와 미세유체 를 이용해 연속(DEP) (Microfluidics)

적으로 세균과 먼지를 분리하는 장치를 고안함.

본 실험을 통해 살아있는 세균과 가 성공적으로 분non-biological material

리되는 것을 확인하였음.

인 세균 이외의 물질 먼지 는 전기저 신호를 이용한 측정에 오Target cell ( )

차로 작용해 정확한 측정을 불가능하게 만들기 때문에 이를 제가하는 기술

이 필요함.

본 장치는 먼지와 함께 포집된 세균샘플로부터 세균만을 추출해 측정부에

효율적으로 이송하는 기술로 응용이 가능함.

나. 임피던스 측정을 통한 세균 정량 기술

박테리아 모니터링의 중요성(1)

실시간 병원성 미생물의 검침은 공공복지 증진을 위한 필요 요소임.

일반적으로 병원성 미생물은 음식물이나 물 그리고 대기질에서 식중독이나 호흡, ,

기와 관련된 심각한 질병을 야기하곤 함 게다가 홍역 탄저병 인플루엔자 천연두. , , ,

그리고 코감기 바이러스 와 같은 질병을 야기하는 작은 공기 중 미립(rhinovirus)

자의 경우는 바이오테러를 야기 시킬 수도 있음.

전통적인 박테리아의 검침은 시간 이상의 시간동안 박테리아가 성장해 만드는24

콜로니를 계수함으로써 수행되었음.

최근 수 년 동안 좀 더 빠르고 효과적인 검침을 위해서 면역학적인 방법을 수반하

는 몇 가지 방법들이 등장했는데 생물학적인 실험 광학적인 실험 그리고 전기화, , ,

학적인 실험 등 다양한 방법들이 있음. 29)30)31)

그 외에는 공기 중의 박테리아를 실시간으로 를 이용한 화학발광정도를 변환ATP

하여 측정하는 방법이 있음 전기적인 방법은 또한 임피던스 교류회. (Impedance :

로에서 전류가 흐르기 어려운 정도를 나타냄 복소수로서 실수부분은 저항 허수부. ,

분은 리액턴스를 의미하며 크기 뿐 아니라 위상도 함께 표현할 수 있는 벡터량,

임 나 컨덕턴스 전기저항의 역수 또는 어드미턴스의 실수부 전. Conductance : ,） （

도도라고 도 함 캐패시턴스 콘덴서 또는 절연된 도체가 전하를.), (Capacitance :

저장하는 능력을 나타내는 양을 뜻함 전기용량이라고도 함 와 같은 유전체적 물. .)

성치를 이용한 검침 방법이 개발되어 왔음.

지금까지 미생물에서의 임피던스를 이용한 방법은 우선적으로 액체배지에 적용이,

되어왔음.

박테리아의 성장은 배지의 두 가지 중요한 요소에 의해 변화되는 임피던스에 의해

확인할 수 있는데 첫째 요인은 박테리아의 대사 작용이 일어나는 동안 발생되는, ,

가스와 이산화탄소 중탄산소 그리고 수소 이온등과 같은 이온물질의 방출에 의해, ,

서 생김 이온물질은 배지 전체적으로 확산이 되어 배지의 유전적 물성치를 변화시.

키게 됨.

우리는 박테리아의 성장을 배지의 임피던스를 측정함으로써 실시간 모니터링 가능

한 고체배지 집적된 임피던스 바이오센서를 제안함 고체배지는 다루기 쉽고 휴대.

할 수 있으며 액체배지와 비교하여도 많은 장점을 가지고 있음 이런 장점에도 불.

구하고 바이오센서에서 박테리아의 성장에 관한 모니터링을 위해서는 많이 사용되,

지 않았음.

우리의 연구가 바이오센서에서 고체 배지상에서 임피던스를 이용한 첫 시도라고 할

수 있음 이 논문에서 고체배지의 생물 전기적인 특성을 폭넓게 조사했고 전극과. , ,

의 간격에 배지의 양을 조사했음 우리는 또한 배지의 임피던스가 박테리아 성장과.

연관되어 실시간 변화하는 것을 관찰하였음.

우리의 혁신적인 임피던스 집적 바이오센서는 미생물을 위한 실시간 측정 시스템의

발전에 기여할 것임 특별하게 이 바이오센싱 방법은 공중보건의 증진을 위한 병. ,

원성 미생물의 검침에 적용할 잠재성을 가지고 있음.

두 번째 요인은 전극에 직접적으로 박테리아 세포를 붙이는 것인데 그것은, Debye

디바이 길이 를 변화시켜 결과적으로 전극 경계면의 물성치를 변화시킴length( ) .

박테리아의 성장을 배지의 임피던스를 측정함으로써 실시간 모니터링 가능한 고체

배지 집적된 임피던스 바이오센서를 제안함.

고체배지는 다루기 쉽고 휴대할 수 있으며 액체배지와 비교하여도 많은 장점을 가

지고 있음 이런 장점에도 불구하고 바이오센서에서 박테리아의 성장에 관한 모니. ,

터링을 위해서는 많이 사용되지 않았음 우리가 알고 있는 한 바이오센서에서 고. ,

체 배지상에서 임피던스를 이용한 첫 시도라고 할 수 있음.

고체배지의 생물 전기적인 특성을 폭넓게 조사했고 전극과의 간격에 배지의 양을,

조사했음.

우리는 또한 배지의 임피던스가 박테리아 성장과 연관되어 실시간 변화하는 것을

관찰하였음 우리의 혁신적인 임피던스 집적 바이오센서는 미생물을 위한 실시간.

측정 시스템의 발전에 기여할 것임 특별하게 이 바이오센싱 방법은 공중보건의. ,

증진을 위한 병원성 미생물의 검침에 적용할 잠재성을 가지고 있음.

본 연구진은 미생물의 생체 임피던스 측정을 통해 고체 배지내의 미생물의 존재 유

무를 실시간으로 측정하는 연구를 수행 중에 있음 미생물이 시간에 따라 고체 배.

지에서 증식이 되며 이에 따라 임피던스의 값이 증가하게 됨을 확인할 수가 있었

음 이를 통해 미생물의 생체 임피던스 측정을 통해 저농도 고농도의 박테리아도. ~

측정 가능한 센서로의 활용 가능성을 확인할 수 있었음 그림( 3.10).

임피던스를 이용한 고체배지센서의 제작 방법 및 샘플 준비(2)

가( ) 배지와 박테리아 샘플 준비

실험에 사용된 미생물은 Bacillus subtilis (ATCC 11774), Pseudomonas

aeruginosa 그리고(ATCC 15442), Staphylococcus aureus subsp. aureus

로 로부터 분주를(ATCC 12692) American Type Culture Collection (ATCC)

받았음.

에서 정보를 얻은 박테리아 유기체마다 상응하는 선택적인 배양 배지를 사용ATCC

하였음.

우리는 는Nutrient Broth (NB) (BD Biosciences, USA) B. subtilis에, Tryptic

는Soy Broth (TSB) (Scharlau Chemie S.A., Spain) P. aeruginosa 그리고,

는Luria Broth (LB) (Alpha Bioscience, USA) S. aureus 에 사용하였음.

Nutrient Agar (NA) (BD Biosciences, USA), Tryptic Soy Agar (TSA)

(Scharlau Chemie S.A., Spain), and Luria Agar (LA) (Alpha Bioscience,

와 같은 고체배지는 액체배지에 를 첨가하여 만들게 되었USA) 1.5% agar (w/v)

음.

박테리아는 도에서 흔들어주며 하루 밤을 성장하게 되고 세포의 농도는 분37 , UV

광기 에 의(T60U Spectrometer, PG Instrument Ltd.) optical density 600nm

파장에서 측정하도록 하였음 분광 광도계 특정 파장의 빛을 분광하여 시료에 통( :

과시켜 빛의 투과율과 흡수율을 측정하는 장치임 흡광도는 투과율의 로그 함수로.

나타냄.).

배양된 박테리아 샘플은 103 의 농도로 희석하였고 각각 초기의 농도를 상응cells ,

하게 맞춰주었음 그리고 희석된 샘플을 고체배지 표면에 떨어트려 도상에서 배. 37

양시켰음.

나( ) 임피던스 측정 장비의 제작

임피던스 집적된 바이오센서는 정방형(15mm width×15mm length×5mm

의 두 개의 평면 전극으로 이루어져 있음 그림depth) 3.10(a).

이 벽은 의 두께의 아크릴 판으로 구성되어 있음5mm .

전극은 실리콘 웨이퍼에 의 과 의(15mm width×10mm length) 200 Cr 3000Å Å

그림 3.10 배지 내 미생물 검침 센서 모식도

로 이루어졌고 벽의 바깥부분에 붙여져 있음 전기 와이어를 전극에 붙이기 위Au , .

하여 의 벌크 수용액상 식각 방법을, TMAH (tetramethylammonium hydroxide)

사용하였음.

웨이퍼 표면에 서로 맞물린 골드 패턴이 코팅된 또 다른 미소전극을 도입했음 그림(

이 맞물린 미소전극은 정방형 벽면의 바닥에 붙였음 이 맞물린 패턴은3.10(b)). .

쌍을 이루고 있는 가닥의 전극 폭 길이 로 이루어져 있음18 , 200 m, 13mm .μ

모든 디바이스는 사용하기 한 시간 전에 도의 분 고온멸균 후 도에서 시121 15 65 1

간 건조되었음.

다( ) 임피던스 측정과 분석

우리는 로 에서HP42942A impedance analyzer (Agilent, USA) 40Hz 110MHz

의 주파수 범위에서의 임피던스를 측정하였음.

임피던스의 변화와 전극의 갭 그리고 과 고체배지의 부피(10, 15, 20, 25mm)

그리고 사이의 관계를 조사하였음(1.0, 1.5, 2.0, 2.5 ml) .

실시간 박테리아의 성장 모니터링에서 고체배지의 임피던스 변화는 매 시간씩2 10

시간을 와Agilent 34970A switch unit (Agilent, USA) LabVIEW (National

을 이용하여 측정하였음Instrument, USA) .

우리는 데이터 분석을 통해서 다음과 같은 공식에 정의되는 의 주파수에서의40Hz

임피던스의 변화 (ΔZ 를 얻었음) .

은 박테리아가 없을 때의 임피던스의 절대 값을 의미함 그리고|Z|control .

는 박테리아가 존재할 때의 임피던스의 절대 값을 의미함|Z|bacteria .

라( ) 분광 광도계를 이용한 박테리아의 개체 수 측정

우리의 실험값을 입증하기 위하여 고체배지 표면의 세포의 농도를 분광기를 이용,

하여 정량하였음.

세포의 초기 농도를 103 로 접종한 후에 고체배지 샘플을 매 시간마다 이온cells , 2

을 제거한 순수한 물에 녹여 박테리아를 재 부유 하였음(D.W, 5ml) .

부유된 박테리아는 3000×g 분 원심분리기를 이용하여 분리하였고 표면에 뜨10 ,

는 것은 버렸음.

수확된 박테리아는 의 순수한 물에에 흡광도를 측정하기 위하여 재 부유하였1ml

음 박테리아의 개체수의 정량은 흡광도 에서 측정되었음. 600nm .

실험의 결과 및 박테리아 모니터링의 장점(3)

가( ) 고체 배지의 임피던스 물성치의 특성

생물전기적인 임피던스는 몸체의 전체 수분량과 관련되어 있음 이 이론에서 동종. ,

의 전도력 있는 생체적합물질의 임피던스 는 다음의 공식에 표현됨(Z) .

는 특별한 물질의 저항력이고 은 전극사이의 떨어진 정도 는 물질의 교차정P , L , A

도를 의미하며 은 물질의 부피를 의미함, V=AL .

이 공식을 이용하여 우리는 측정된 임피던스 데이터와 전극의 간격 혹은 고체 배지

의 부피와의 관계를 조사하였음.

그림 는 고체배지의 용적 측정의 변화와 다양한 전극의 간격에 따른 임피던스3.11

의 변화를 보여줌 배지의 부피는 일정하게 유지되었을 때 에서 로 전. 10mm 25mm

극의 간격이 증가함에 따라 임피던스는 증가되었음 그림, ( 3.11(a)).

게다가 일정하게 유지된 전극의 간격에서는 고체 배지의 부피가 에서 로1.0 2.5ml

증가함에 따라 임피던스는 감소하였음.

이러한 결과들은 의 공식으로부터 얻어진 값과 일치함 그러므로 우리는 고체(2) . ,

배지가 동종의 전도력 있는 생체적합물질로써 생물 임피던스 측정을 위해 쓰일 수-

있음을 확신할 수 있음.

미생물 배양에 따른 배지의 임피던스 변화를 측정하기 전에 고체 배지 고유의 전기

적 특성을 알아보았음 그 결과로 배지의 양과 임피던스 변화는 반비례하며 배지.

양쪽의 전극 거리와 임피던스 변화는 비례하는 것을 알 수 있었음 이는 배지가 균.

질의 전기적 물질이며 전기적 특성을 측정한 미생물 검침 연구에 적합하다는 것을

보여 줌 그림( 3.11).

나( ) 고체배지 바이오센서를 이용한 박테리아 성장의 임피던스를 이용한 모니터링

박테리아 성장의 실시간 모니터링을 위한 고체배지 바이오센서의 실현가능성은 흡

그림 3.11 전극의 차이와 고체 배지 부피에 의한 임피던스의 변화

전극 사이의 차이의 효과 임피던스 변화에서 고체배지의 부피(a) (b) .

범례 그리고 범례(a): 1.0ml (+), 1.5ml(×), 2.0 ml( ), 2.5 ml( ).◆−

그리고 굳은 선은(b): 10mm( ), 15mm(×), 20mm( ), 25mm(×).▲ −

임피던스의 변화와 간격과 부피와의 관계를 보여줌 모든 측정은 박테리.

아 없이 이루어졌음.

광도 의 값과 동시에 추정하였음600nm .

그림 은 시간 측정하면서 임피던스 신호와 흡광도 의 값의 일시적3.12 10 600nm

인 변화를 보여줌 박테리아가 액상에서 고체상태의 환경에 적응하는 시간인. lag

상태에서 시간 시간 임피던스의 변화는 없음(0 -2 ) .

따라서 세포의 개체수는 증가하지 않음 그 후에 임피던스의 변화는 박테리아의. ,

성장만큼 상당하게 변했음 이론적으로 박테리아가 기하급수적으로 증가하는 상태. ,

로 들어가게 되면 임피던스 시작은 급격하게 줄어듦, .

이 측정에서 우리는 배양의 시간 후 작은 변화는 박테리아의 개체수가 일정하게, 8

유지되는 상태를 나타낸다고 생각했음 임피던스 성장 곡선은 또한 흡광도. 600nm

에서 증명된 세포 성장과 상응함 그림 으로부터 우리는 고체배지의 임피던스. 3.12

변화와 박테리아의 성장은 매우 밀접한 관련이 있음을 확인했음.

고체배지 위에서의 박테리아의 신진대사는 액체 배지에서와 매우 다르지 않음 이.

온성의 대사산물은 고체배지 표면의 다공성 구조를 통해서 아래쪽으로 확산됨.

아가 홍조류인 우뭇가사리에 존재하며 젤화 되는 성질이 있음 는 단단하고(Agar : .)

그림 3.12 임피던스에 의해 측정된 박테리아의 성장곡선과 흡광도의 비교.

성장곡선은 B. subtilis.의 초기농도103 개에서 시작하였음 범례 임피던스의 변화와의. :

관계 값 으로 표기하였고 흡광도 에서의 값은 로 표기하였음( Z) ( ) 600nm ( ) .Δ — – – –

다소 스며들진 않지만 아가 가닥의 무수 사이에 작은 구멍으로 이온물질은 확산될,

수 있음 이러한 아가의 물성치를 기반으로 아가의 확산 분석을 포함해서 박테리아.

종의 저항과 미생물의 주화성 분석에 다양하게 쓰여지게 됨.

게다가 수소와 산소 이온은 효과적인 전달자로 의 아가가 들어있는 고체배지, , 3.5%

에 와 의 깊이로까지 시간 안에 확산됨0.4 0.5cm 2 .32) 의 아가가 들어있는 고1.5%

체배지보다 의 아가가 들어있는 배지가 실험적으로 좀 더 크게 만들어지고 확3.5%

산도 더 빠르게 일어나게 됨 확산된 대사산물은 배지의 전도도를 높이고 임피던스.

를 감소시키게 되어 박테리아 성장의 실시간 모니터링의 새로운 검침 양식으로 제

안할 수 있음.

표면에서 배양되는 미생물에 의해 생성된 이온성 대사 물질이 고체 배지의 다공성

구조를 통해 표면에서부터 아래쪽으로 확산되어 배지의 임피던스 변화를 유도함.

배지 양쪽에 위치하는 전극이 배지의 임피던스 변화를 측정함 미생물 성장에 따른.

임피던스 변화와 미생물 농도의 변화를 비교 분석 결과 배지의 임피던스 변화가 미

생물의 성장과 밀접한 관련이 있으며 본 고체 배지 센서가 배지의 임피던스 변화를

효과적으로 검침할 수 있음을 보여주었음 그림( 3.12).

다( ) 고체배지와 함께 집적된 평행한 양쪽 전극의 평가

고체배지의 임피던스의 변화는 또한 바닥에 집적된 미세전극을 통해서 측정 가능했

음 그림 에서와 같이 액체배지에서 측면 전극에 의해 얻어지는 임(IMEs). 3.13(a) ,

피던스 값은 시간 배양 이후로부터 감소되기 시작하는 반면 고체배지의 임피던스6 ,

값은 시간 배양 이후로부터 시작됨2 .

액체배지의 임피던스의 감소는 고체배지의 임피던스의 감소만큼 천천히 일어남 비.

록 두 배지의 임피던스 값은 상당히 다른 변화를 보여주지만 액체배지에서 배양된

것의 흡광도 에서의 데이터의 경향과 고체 배지와 상당히 비슷하였음 그600nm . (

림 3.13(b)). 33)34)

움직임이 없는 조건하의 액체배지에서의 박테리아 배양은 즉각적으로 침전물이 됨.

그리고 물질대사 산물 또한 디바이스의 바닥에 축적이 됨.

바닥면의 물질대사 산물은 위쪽 방향으로 확산되어짐 한 편 고체배지에서의 아래. ,

쪽으로 향하는 확산은 좀 더 효과적이고 그것에 의하여 임피던스의 변화가 용이하,

게 됨.

결과적으로 고체배지와 함께 양쪽에 집적된 전극은 박테리아 성장과 함께 수반되는

배지의 임피던스의 변화를 민감하게 모니터 할 수 있음.

그림 에서 보이는 것처럼 바닥면의 는 액체배지의 임피던스 변화는3.13(a) , IMEs

그림 3.13 고체와 액체 배지에서의 전극 값 비교

성장 곡선의 임피던스 값 성장곡선에 따른 광학적인 값(a) (b) .

범례 바닥면에 미세전극으로 집적된 고체배지에서의 임피던스 값(a): (–

양쪽에 전극을 둔 채로의 액체배지 에서의 임피던스 값), ( · ),– – – –

그리고 양쪽에 평행한 전극을 둔 상태의 고체배지에서의 값( ).—

범례 고체 배지 그리고 액체 배지(b): ( ) ( · ).— – –

검침하였지만 고체배지의 임피던스 변화를 검침하지 못했음, .

이러한 결과들로 우리는 양쪽의 전극이 매크로 단위의 고체배지의 임피던스의 변화

를 측정하는데 적당하다는 것을 알아냈음 비록 바닥면의 는 매크로 단위의. IMEs

고체배지의 임피던스 변화의 측정에 효율적이지는 못했지만 그것은 아마도 얇은 박

막 타입의 필름을 측정하는 바이오센서에 적당할 것임.

라( ) 각기 다른 박테리아 농도와 임피던스의 변화의 변화량

우리는 박테리아의 초기의 박테리아 개체 수와 관련된 성장 비율을 고체 배지 바이

오센서를 이용하여 측정하였음.

배지 미생물 센서의 검침 한도를 알아보기 위해 다양한 초기 미생물 농도에 따른

임피던스 변화를 측정하였음 그림( 3.14).

박테리아의 성장 곡선은 고체배지의 를 이용하여 알 수 있었음 임피던스의 바Z .Δ

뀌는 변화율 을 의미하는 포인트 점의 경우 문지방 값을 초과함( Z/ t) .Δ Δ

그것은 검침 시간(td 으로 정의됨 앞서서 식재료에 들어있는 박테리아의 검침을) .

위하여 를 이용하여 수행했음conductimetry .

은 검침 기준으로 분당 의 전도도의 변화를 이용했고 의 경Bolton 6 20 S , Sherryμ–

우 시간당 를 이용했음 우리의 실험에서 임피던스 곡선은 로의 점100 S . Z/ tμ Δ Δ–

근선적인 분석결과에 이름.35)

그림 은 네 가지 케이스의 초기 박테리아 농도인3.14 105, 104, 103 그리고, 102

으로 얻어진 박테리아의 성장곡선을 보여줌 그림 을 기반으로 우리는 검침 시. 3.12

간(td 을 결정했음 그것은 각각 그리고 시간이었음) . 3.4, 3.7, 5.2, 9.1 . 102의 샘플

에서는 약간 근소하게 늦어진 것 같이 보임 이론적인 분석에 따르면 초기의 세포. ,

농도 와 검침시간은 서로 연관이 있음 그리고 그것의 관계는 다름의 공식에서(Co) .

표현이 됨.

와 는 어떤 미생물과 배지와 그리고 성장하는 조건등과 관련된 불변하( >0)α α β

는 값임 측정된 와. Co td의 값을 이 공식에 넣으면 선형상관 계수로 대략 에 가0.9

까웠고 우리는 그리고 를 얻어낼 수 있었음 에 의해 우=1.86 =11.93 . Edenα β

선적으로 보고된 값은 그리고 임 그리고 에 의해 보고된=0.96 =7.75 Dupontα β

값은 그리고 이었음=1.08 =11.33 .α β 36)

초기 미생물 농도 102~10

5에 대해 본 고체 배지 센서는 의 검침 시간을3.4~9.1h

보여주었음 이 결과는 기존의 액체 배지의 임피던스를 측정하여 미생물을 검침하.

는 연구결과와 비교하여 결코 뒤지지 않는 검침 시간이며 고체 배지의 활용도를 고

려할 때 이 검침 시간은 앞으로도 더 단축될 수 있는 가능성을 보여줌.

B. subtilis은 고체배지 표면에서 초기농도 102 ( · ), 10– – 3 ( ), 10– – – 4 ( ·–

그리고·), 105 개로 자랐음 화살은 검침 시간인( ) . t— d를 보여줌.

보고된 값에 의하면 각각의, td 값은 초기 박테리아 개체수인 102에서 105개에서

각각 의 상수를 기반하여 과 시간을 얻었음Eden 6.0 2.9 .37)

그리고 의 상수를 사용하여 그리고 시간을 얻었음Eupont 8.6 5.9 . 고체배지센서를

사용함으로써 얻어진 td 값은 이전에 보고된 값과 매우 유사함 그리고 고체배지센.

서의 민감도는 액체배지에 뒤지지 않음.

고체배지센서의 민감도는 센서의 전극사이의 간격 배지의 두께 그리고 배지의 조, ,

성과 같은 물리화학적 파라미터에 영향을 받음 이런 관점의 연구는 고체배지 센서.

의 민감도 향상에 필요할 것임.

그림 3.14 박테리아의 개체수의 다양한 초기 값에 의한 고체배지에서의 검침 시간.

마( ) 임피던스 변화에 대한 고체배지의 다양한 효과

미생물 검침 센서의 중요한 요소로 미생물의 선별적 검침을 들 수 있음 따라서 본.

고체 배지 센서를 이용하여 여러 종류의 미생물 검침 연구를 수행하였음 그림(

3.15).

표 3.1 그림 에서 보여지는 세가지 샘플의 측정된3.15 Z, ODΔ Δ 600 그리고,

값.η

그림 세 가지 다른 타입의 배지에서 임피던스 값과 광학적 방법을 이용한 박3.15

테리아의 성장곡선.

배지 위에서의NA B. subtilis 배지 위에서의( ), LA— S. aureus 그리( · ·),–

고 배지 위에서의TSA P. aeruginosa 광학적 방법을 이용하여 파악한 성(. . .).

장 곡선 배지 위에서의: NA B. subtilis 배지 위에서의( ), LA● S. aureus (×),

그리고 배지 위에서의TSA P. aeruginosa ( ).▲

우리는 세 가지 다른 고체배지를 이용하여 각각의 배지의 임피던스의 변화를 조사

하였음 각각의 임피던스 곡선은 광학적 밀도 곡선인 흡광도 와 비교하여. 600nm

정하였음.

그림 로부터 우리는 임피던스가 감소하기 시작하는 시간이 약 시간 시간3.15 2 , 6 ,

시간 후임을 발견할 수 있었음 또한 위의8 . , NA B. subtilis의 경우 다른 물질 보다

상당하게 높게 임피던스가