檢驗及品保雜誌 - creative-micro.com · 相關研究或其它論述文章以及學術研究或檢測單位之研發相關論文，來稿以未曾刊登其它雜誌或期刊者為限，且投稿作者群中至少有一位具台灣檢驗及品保協會會員資格，每篇投

1

檢驗及品保雜誌

Journal of Testing and Quality Assurance

投稿須知

本雜誌為社團法人台灣檢驗及品保協會(Taiwan Testing and Quality Assurance Association,

TTQAA)會內刊物，名稱為檢驗及品保雜誌(Journal of Testing and Quality Assurance，英文縮

寫為 JTQA)，主要刊載民生用品、生技產品與臨床檢驗相關之技術、研究、設計及學術評論等

專題。本雜誌為季刊，每年的三、六、九和十二月各發行一期。投稿須知如下：

一、邀稿對象：歡迎食品廠、藥廠、化妝品廠、醫療器材廠、生技廠等之品保單位與臨床檢驗

相關研究或其它論述文章以及學術研究或檢測單位之研發相關論文，來稿以未曾刊登其它

雜誌或期刊者為限，且投稿作者群中至少有一位具台灣檢驗及品保協會會員資格，每篇投

稿文章篇幅上限為 8頁或 6,000字內。

二、文稿內容：本會報內容包括：品管新知、檢驗新技術、研究新發現、特別報導、經驗分

享、回顧論文等類別，但編輯委員會有權按文稿性質，更改其分類。

三、版面設定：上：4.5 cm、下：2.5 cm、左：3 cm、右：3 cm、頁尾：2.3 cm。

四、文章格式：本雜誌以會員互相溝通獲取新知為主，來稿以中文撰寫為原則，但另外附標

題、作者及摘要之英文。中文字體以新細明體、英文以 Times New Roman字型大小 11，

標題字體、字型大小不拘，大綱的中文字體以標楷體、英文以 Times New Roman字型大

小 14。行距為單行間距。

五、專有名詞：專有名詞、菌名、化學品、或翻譯名詞等應於首次提及時以英文全名呈現，形

式為英文在前，然後括弧內附上中文，第二次始得以縮寫表示。常見縮寫名詞為例外，

如：PCR、DNA、RNA、UV等。SI單位應於文中全程以縮寫表示。

六、圖表：圖表應附於稿件內容之後，一頁一個圖或表，以便編輯與排版。圖表應註明其標題

與次序，圖標題請標示於圖下方，表標題請標示於表上方。因雜誌內容以黑白稿方式呈

現，故所附圖片、圖表請力求清晰，圖表備註說明以中文方式撰寫；原版影印、相片翻拍

引用，需附原著者同意書；圖片（例如：細胞、細菌型態、電泳圖片等）請附上光面

(Glossy)相片，以利製版作業。若文稿超頁或內容圖片以彩色印刷呈現，需自付相關費用。

七、參考資料：引用他人資料需註明出處附於文後；參考資料以文內引用者為限，並按引用

（參考）先後順序表列。參考資料的書寫方式，依照 CBE (Council of Biological Editors)

手冊原則。四位作者以上時可僅列出前三位作者，後加上 et al.（斜體字）。作者人數在

三位以內者，則全部列出。參考書目之期刊名稱採用縮寫，可查閱 CBE 手冊，另外，亦

可參考 Clinical Microbiology and Infection期刊之格式。

期刊：請按(a)作者姓名。(b)篇名。(c)期刊名稱。(d)發表年份及卷數及起訖頁數，不包

括號數，依序撰寫。

書籍：請按(a)作者姓名。(b)題目。(c)書名與版數。(d)出版年度及起訖頁數。(e)出版商

（發行所）與出版地，依序撰寫。

2

網路：請按(a)作者姓名。(b)題目。(c)網站名稱及摘自網址(d)西元年、月、日，依序撰

寫。

範例：

期刊文章：

Lee S, Romero R, Lee KA et al. The frequency and risk factors of funisitis and histologic

chorioamnionitis in pregnant women at term who delivered after the spontaneous onset

of labor. J Matern Fetal Neonatal Med 2011; 24:37-42.

書籍：

蔡文城，蔡岳廷。尿液培養。實用臨床微生物診斷學，第十版。2011:215-38。九州圖

書文物有限公司，台北。

書籍內章節：

Logan NA, Hoffmaster AR, Shadomy SV, Stauffer KE. Bacillus and other aerobic endospore-

forming bacteria. In Versalovic JV, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock

DW (eds). Manual of Clinical Microbiology. 10th ed. 2011:381-402. ASM press, Washington DC,

U.S.A.

政府公告方法：

行政院環境保護署。水中分離退伍軍人菌方法。2010。行政院環境保護署，台灣。

機構出版：

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference method for broth dilution

antifungal susceptibility testing of yeasts-Third Informational Supplement, M27-S3. 2008.

CLSI, Wayne, PA

八、投稿形式：請將稿件及所需的圖片(300 dpi)電子檔 E-mail 至編輯處，若未被接受刊登，

則原件退回並附上編輯小組退件原由。

九、授權及文責：本會雜誌編輯委員對來稿有刪修權及刊載決定權；一經投稿，即視同授權刊

載（包括電子檔）；來稿需自行創作或改寫，並請註明參考資料，若係直接翻譯或直接複

製圖表，需取得著作權所有人同意，並附原文，來稿如有著作權爭議，由作者自行負責。

十、稿件投遞：電子檔請 Email至『[email protected]』，作者必須附上聯絡電話、傳真或

網址以及投稿聲明書（須含全部作者之簽名）。協會地址：24890新北市新莊區新北產業

園區五工五路 21號。

十一、其他未盡詳細之投稿相關事宜，將再行修正。

1

目錄

2013 年第二卷第三號

原著

105 完整地分析台灣分枝桿菌類別及個別菌種的分離率與藥敏型式

陳姿瑜、吳曉萍、李秀霞、謝賢修、蔡文城

119 評估 Bio-kil運用於按鍵膠片之防疫效用

常傳訓、呂昀儒、薛樹清、敖曼冠、熊名琛、葉明陽、呂旭峯

129 利用 HPLC及電化學方法檢測市售飲料中咖啡因含量

藍景昭、張杏熙、蔡媛淳、蔡銘鳳、洪士奇、林錫斌

137 「樟芝元 Antro-Gem」之基因毒性試驗分析

邱怡禎、藍文傑、蔡岳廷、黃俊智

145 「樟芝元 Antro-Gem」之 28天重複劑量亞急性毒性評估

邱怡禎、藍文傑、蔡岳廷、黃俊智

154 評估口服不同乳酸菌株產品對於降低沙門氏菌侵入肉雞及其引發之發炎反應

陳志遠、林峻立、莊笠岑、曾浩洋、陳錦樹

2

Contents

Volume 2 August No. 3, 2013

Original Articles

105 Comprehensive Analysis of the Isolation Rate and Antibiograms of MycobacteriaIsolated from Taiwan

Zih-yu Chen, Hsiao-Ping Wu, Hsiu-Hsia Li, Shian-Shiou Shie, Wen-cherng Tsai

119 Epidemic Prevention on the Application of Button Film Coating Bio-kilChang Chuan-Hsun, LuYun-Ju, Hsueh Shu-Ching, Au Man-Kuan,Hsiung Ming-Chon,Yeh Ming-Yang, Lu Hsu-Feng

129 Determination of Caffeine Content in Commercial Beverages by HPLC andElectrochemical Methods

Jing-Jhao Lan, Hsing-Hsi Chang, Yuang-Chun Tsai, Ming-Feng Tsai,Shih-Chi Hong, Hsi-Pin Lin

137 Genotoxicity Tests for Freeze-Dried Antrodia cinnamomea Mycelium Culture (Antro-Gem)

Yi-Jen Chiu, Mun-Kit Nam, Yueh-Ting Tsai, Chun-Chi Huang

145 Subacute Oral Toxicity Assessment in Rats for Freeze-Dried Antrodia cinnamomeaMycelium Culture “Antro-Gem”

Yi-Jen Chiu, Mun-Kit Nam, Yueh-Ting Tsai, Chun-Chi Huang

154 Evaluation of the Oral Feeding Effects of Different Lactic Acid Bacteria Strains onthe Salmonella Invasion and the Induced Inflammation of Chicks

Chih-Yuan Chen, Chun-Li Lin, Li-Tsen Chuang, Hau-Yang Tsen, Chin-Shuh Chen

105

檢驗及品保雜誌 (J Testing Qual Assur) 2013; 2:105~118

完整地分析台灣分枝桿菌類別及個別菌種的

分離率與藥敏型式

陳姿瑜 1 吳曉萍 2 李秀霞 2 謝賢修 3 蔡文城 3,4*

慈濟大學醫學檢驗生物技術學系，花蓮縣 1; 台美檢驗所 2，台美檢驗科技有限公司，新北市 3，

國立陽明大學微免科所，台北市 4，台灣

摘要

結核分枝桿菌群(Mycobacterium tuberculosis complex , MTBC)以外的分枝桿菌統稱為非結核分枝桿菌

(non-tuberculous Mycobacteria , NTM)，NTM又根據生長速度分為快速生長NTM(rapid growers)及慢速生

長NTM(slow growers)兩種類別。NTM的傳統鑑定方法步驟繁瑣、耗時、且判讀時容易發生錯誤，因此許

多檢驗室並沒有進一步鑑定，僅以 NTM 統稱的方式提出報告，也沒有進行藥敏試驗，故鮮有分枝桿菌類

別及個別菌種分離率及藥敏型式的統計數據。本研究以台美醫事檢驗所（新北市，台灣）從 2012年 1月至

2013年 6月間所分離的的 7,905株分枝桿菌，利用生物晶片CMPTM MycoChip及新一代的CMPTM MycoCheck

（啟新生物科技有限公司，新北市，台灣）進行鑑定。結果發現 MTBC 佔比為 37.7%(2,981/7,905)，而

NTM 佔比為 62.3%(4,924/7,905)。快速生長 NTM 分離最多的菌種為 M. abscessus (57.79%)，其次為 M.

fortuitum group (29.95%)及M. chelonae (11.45%)；慢速生長 NTM最常分離的菌包括M. avium complex

(MAC，73.15%)、M. gordonae(13.27%)及M. kansasii(7.52%)。隨機選取快速生長NTM 1,914株，以瓊脂

紙錠釋出方法進行藥敏試驗，結果發現 M. abscessus 對 clarithromcyin CLR)、amikacin(AK)與 imipenem

(IMP)具有 95%以上的感受性，M. fortuitum group及 M. chelonae對 CLR、ciprofloxacin(CIP)、cefoxitin

(FOX)、AK、IMP與 levofloxacin (LEV)皆有 90%以上的感受性。另選取慢速生長 NTM3,371株與結核分

枝桿菌 2,725株以間接比例法進行藥敏試驗，結果發現 MTBC 對目前的第一線用藥 : isoniazid(INH)、

ethambutol (EMB)、streptomycin (SM)與 rifampin(RIF)大多呈高度感受性。慢速生長NTM中的M. kansasii

及M. gordonae對高濃度的 EMB與 SM以及 RIF大多呈高度感受性，對低濃度 EMB及 SM呈中等感受性，

至於MAC、M. scrofulaceum、M. terrae complex以及其它慢速生長 NTM大多顯示高度或中等抵抗性)。

另外發現 MTBC 對 INH(1.0 μg/mL)的抗藥性為 3.1%(85/2725)，對 INH(0.2 μg/mL)的抗藥性為 7.2%

(197/2725)，而對 RIF的抗藥性為 0.9%(24/2725)，多重抗藥性 MTBC(即對 INH及 RIF同時呈抗藥性，簡

稱 MDR-TB)為 0.2%(5/2725)。吾等從上述 NTM 的藥敏型式探討當前各類及個別 NTM 菌種藥敏試驗選用

測試藥物的合適性，進一步提出適合台灣檢驗環境與資源的 NTM 藥敏試驗方法、測試藥物及濃度。綜合

上述結果，以生物晶片快速鑑定之NTM，將可立即依據菌種類別操作治療藥物的藥敏試驗，而不會因為無

法知曉慢速生長 NTM菌名而錯誤地選用與 MTBC相同的測試藥物及測試方法，本研究將提出有系統的規

劃，建議檢驗人員選用藥敏試驗的正確藥物與濃度以及測試方法，如此，所得到的個別 NTM 藥敏型式將

有助於臨床醫師對該感染進行適當的治療。

關鍵字：分枝桿菌類別、分枝桿菌菌種、生物晶片、分離率、藥敏型式

前言

根據統計顯示，目前約有近 200種分枝

桿菌[1]，隨著科技的進步，許多新的分枝桿

菌菌種陸續被發現。大部分枝桿菌菌種屬於

*通訊地址：台美檢驗科技有限公司

24890新北市新莊區五工五路 21號蔡文城

電話:886-(02)2298-1887

E-mail address: [email protected]


106

腐生菌或伺機性病原菌，只有部份的菌種可

對人類造成致病性的危害。依照分枝桿菌的

培養及鑑定特性，可分為結核分枝桿菌群(My-

cobacterium tuberculosis complex, MTBC)和

非結核分枝桿菌(non-tuberculous Mycobacteria,

NTM)兩種類別。MTBC包含M. tuberculosis、

M. bovis、M. microti、M. africanum 及 M.

cantti[2]，其中以M. tuberculosis 為常見[1,2]。

NTM又可依據生長速度不同分為快速生

長NTM[3]及慢速生長NTM[2]。快速生長NTM

在培養後可七天之內可觀察到菌落的形成，

常見者包括 M. abscessus（易對免疫不全的

病患造成全身性的病變）、M. chelonae（易

造成術後感染或者結膜炎症狀）以及M. for-

tuitum（易造成術後感染及皮膚感染）[3]；而

慢速生長 NTM 在培養後須超過七天才可觀

察到菌落的產生，常見者為M. avium complex

（MAC，包括M. avium及M. intracelluare，

常引起人類肺部感染，尤其是AIDS病人）、

M. gordonae（常見的水及環境污染菌，偶而

引起人體肺部與軟組織感染或骨隨炎）以及

M. kansasii（主要引起人體肺部感染）[1,2]。

過去，鑑定臨床檢體分離的分枝桿菌係

利用傳統生化試驗方法，但其耗時、步驟繁

瑣、且部分的生化試驗結果不明顯，難以明

確判斷，易導致誤差。近年來，已開始利用

免疫色層試驗(immunochromatographic test,

ICT)鑑定 MTBC[4~6]及利用分子生物學方法

診斷分枝桿菌 [7~10]，其中以 Nested PCR、

real-time PCR[8,9]方法較常使用，但 ICT及分

子診斷方法操作時每次僅能針對一種分枝桿

菌（MTBC或NTM）進行鑑定，以實驗室而

言並不實用。有鑑於此，國內外一些生物科

技公司開始研發生物晶片(biochip)[11,12]，其

係利用 DNA 探針(probe)與檢體或其分離菌

落所萃取出的DNA序列進行專一性結合，此

檢測方式可同時偵測多個分枝桿菌菌種，有

效縮短鑑定時間，且提升菌種鑑定的準確度

及專一性[12]，尤其是可快速地根據菌種名稱

選擇適當的測試藥物及濃度進行藥敏試驗。

過去，國內外文獻對於人類常見NTM個

別菌種的分離率鮮有完整記載，因其等的傳

統鑑定試驗操作相當冗長、繁瑣、耗時，所

以僅能對個別NTM分離率作片面的報導[13~17]，

無法作系統性地紀錄與統計。若能透過生物

晶片將可快速地鑑定出 NTM 菌種，而有助

於檢驗室完整地統計出個別 NTM 菌種的分

離率。

對於MTBC的治療，已有較好的建議用

藥[18~20]，同時，CLSI(Clinical and Laboratory

Standards Institute)也建議藥敏試驗方法、藥

物種類及濃度 [20]，但測試第一線藥物中的

pyrazinamide (PZA)的技術仍有其困難性[19~22]。

雖然 CLSI對NTM的藥敏試驗方法以及針對

個別菌種的測試用藥也有所建議[20]，但以台

灣檢驗環境（包括菌種的快速鑑定能力、培

養基供應性、成本、檢驗人力、檢驗技術、

醫院重視性等）而言，藥敏試驗的操作有其

困難性。這也是為何目前台灣檢驗室沒有操

作 NTM 藥敏試驗的原因，即使操作，也可

能錯誤地利用MTBC的第一線測試藥物與濃

度以及測試方法。

NTM藥敏試驗常用的方法包括：(i)瓊脂

紙錠釋出方法(agar disk elution method)[23,24]，

(ii)微量肉湯稀釋方法 (broth microdilution

method)[20]及(iii) Etest方法（僅用於快速生

長NTM藥敏試驗） [25,26]，其中，微量肉湯稀

釋方法雖然為CLSI建議的「金標準方法」[20]，

但對台灣檢驗室而言，並不實際，因不易配

製、也無供應商、成本貴而不符合健保局給

付標準。至於 Etest 方法[25]，雖然其鑑定正

確性及不同實驗室比較的符合性可達到

80%~90%，但其成本非常昂貴，同樣地，不

符合健保給付費用。

以台灣的檢驗環境而言，瓊脂紙錠釋出

方法 [23,24]或精選大管肉湯稀釋方法 (limited

陳姿瑜吳曉萍李秀霞謝賢修蔡文城 107

107

macrobroth dilution method)測定MIC(minimal

inhibitory concentration)似乎是快速生長NTM

藥敏試驗的選擇方法，因為測試培養基的配

製較為容易，且可由 IVD-GMP 廠家取得，

成本亦符合健保給付。至於慢速生長NTM藥

敏試驗的測試藥物則可根據生物晶片的快速

鑑定結果選用個別菌種的測試藥物種類與濃

度以及操作方法（如與微量肉湯稀釋方法相

當的精選大管肉湯稀釋方法），如此，所獲

得的藥敏型式將可提供醫師用藥的參考。

本研究將根據MycoChip及 MycoCheck

生物晶片之鑑定結果有系統的統計出類別

（MTBC、快速生長NTM與慢速生長NTM）

及NTM個別菌種的分離率，並根據NTM的

藥敏試驗經驗及個別菌種的藥敏型式，探討

適合台灣本土檢驗室 NTM 分離菌的測試藥

物與濃度以及操作藥敏試驗的方法。

材料及方法

檢體來源

本研究係利用台美醫事檢驗所（新莊區，

新北市）TB檢驗室自 2012年 1月至 2013年

6月間所蒐集的菌株，進行分離率及藥敏型

式的分析，共計 7,905株，臨床檢體大多來

自全台中、小型醫院，測試的分枝桿菌生長

菌落主要分離自痰檢體，少數從體液、血液

等其它檢體分離。

生物晶片檢測套組[12]

本研究利用啟新生物科技有限公司（新

莊區，新北市）所研發的分枝桿菌生物晶片

套組檢測自臨床檢體接種培養基Lowenstein-

(a) (b)

圖 1. 分枝桿菌鑑定生物晶片套組呈色位置圖：(a)第一代鑑定套組 CMPTM MycoChip 及(b)新一代鑑定套組 CMPTM MycoCheck。縮寫：Abs, M. abscessus; Che, M. chelonae; Fort, M. fortuitum group; Neo, M. neoaurum; Pere,M. peregrinum; Sme, M. smegmatis; MAC, M. avium complex (MAC-1, M. avium; MAC-2, M.intracellulare; MAC-3, M. avium and/or M. intracellulare)); Gord, M. gordonae; Kan, M. kansasii;Scrof, M. scrofulaceum; Terrae, M. terrae complex; MTBC, M. tuberculosis complex; Xenopi,M. xenopi; Phlei, M. phlei; Mar, M. marinum; Szu, M. szugai; Sim, M. simiae; Tri, M. triviale，Haemophilum, M. haemophilum; Lentiflavum, M. lentiflavum.


108

Jensen medium 或Middlebrook 7H11 selective

agar 上的生長菌落，生物晶片套組依開發階

段分為第一代 (CMPTM MycoChip)及新一代

(CMPTM MycoCheck)。第一代鑑定套組是以

臨床上常檢出的分枝桿菌 MTBC 及八種

NTM為鑑定對象（圖 1a），包括 M. absces-

sus、M. chelonae、M. fortuitum group、MAC

（M. avium與M. intracellulare）、M. gordonae、

M. kansasii、M. scrofulaceum與M. terrae com-

plex，其鑑定效能良好[11]。新一代套組 My-

coCheck（圖 1b）則以第一代套組為基礎，

再增加M. phlei、M. peregrinum、M. marinum、

M. neoaurum、M. triviale、M. simiae、M.

smegmatis、M. xenopi、M. haemophilum、M.

lentiflavum 及 M. szugai，總共 21 種 NTM，

其中包括 15種慢速生長NTM、6種快速生長

NTM及MTBC（圖 1b）。

CMPTM MycoCheck 鑑定流程如圖 2所

示，係直接利用臨床的分枝桿菌菌落萃取出

DNA，再以聚合酶連鎖反應(polymerase chain

reaction，PCR)擴增特定的目標片段DNA序

列，再與晶片上的 DNA 探針進行雜交反應

(hybridization)，後利用呈色位置判斷菌名

（圖 2），再依據菌種特性進行後續的確認

以及藥敏試驗。

分枝桿菌分離率

自 2012年 1月至 2013年 6月台美醫事

檢驗所所分離的所有分枝桿菌進行統計分析，

首先將分枝桿菌區分為 MTBC 及 NTM 兩大

類，再進一步將 NTM 分為快速生長及慢速

生長 NTM 兩種類別，然後分別再細分為各

個 NTM 菌種，將各個類別或菌種的分離菌

數除以該類別或菌種的總菌數，再乘以

100%，即可算出其等之分離率。

分枝桿菌藥敏試驗[17~20]

藥敏試驗方法依照快速生長 NTM 與慢

速生長 NTM而有所差異。

DNA

PCR

Anti-DIG-A

圖 2. 分枝桿菌鑑定晶片CMPTM MycoCheck流程圖

一、快速生長 NTM 的藥敏試驗：

操作方法是根據agar elution method[23,24]，

此方法為MTBC比例方法之紙錠釋出技術的

改良。

藥敏試驗培養基：本研究所使用的快速

生長 NTM藥敏試驗成品培養基係購自 IVD-

GMP 廠家（啟新生物科技有限公司，新莊

區，新北市），各個藥物的測試培養基分別

置於四分格塑膠培養皿中的小格。配製時，


109

小格中的抗微生物劑紙錠(disk)先以 0.5 mL

之 10% OADC釋出，再分別取滅菌冷至 48℃

的 5 mL之M-H agar加至每一小格。此平板

放在 4℃之有效期為 7天。操作時，從冰箱

取出含測試藥物的四分格平板，若欲測 imi-

penem (IMP)，則在測試當天取 disk 放在四

分格平板中預留空白的一小格中，加入 0.5

mL OADC 釋出藥劑，然後倒入加熱溶解冷

至 48℃的 5 mL M-H agar，凝固後即可使用。

接種原：挑取Lowenstein-Jensen medium,

Middlebrook 7H11 agar生長菌落或加肉湯培

養基之生長菌至含有 4~6顆 0.5 mm直徑玻璃

珠之TSB (4.5 mL)肉湯培養基（不含Tween80）

中。搖動使細菌分散。應避免細菌集結成塊，

然後調成相當於 McFarland 0.5 混濁度之懸

浮液，再利用 4.5 mL 無菌去離子水做連續

兩次稀釋（即 1：100稀釋），使後濃度為

1.5x106 CFU/mL。

接種：取 0.01 mL (10 L)接種原接種每

一小格之表面然後塗劃。後接種原的濃度

為 1.5x104 CFU/小格。

培養：在 30℃一般培養箱培養 3~5天。

品管：生長對照品管菌為 M. fortuitum

ATCC 6814，其移種及操作如同試驗。

判讀：3天後檢查平板，若生長對照之

小格顯示分散一致之無連續菌落，則可進行

判讀。終點濃度(endpoint)為測試藥物之不生

長的濃度。而 sulfonamides（磺胺類藥物包

括 SXT）之終點則為比對照小格而呈現減少

80%生長者。

二、慢速生長 NTM[27]及 MTBC 藥敏試驗[19,20]：操作的方法為間接比例法。

藥敏試驗培養基：測試培養基購自啟新

生物科技有限公司，其為四分格平板，基礎

培養基 Middlebrook 7H10 agar 內所含的測

試藥物種類及濃度包括如下：isoniazid(INH,

0.2 g/mL與 INH, 1.0 g/mL)， ethambutol

(EMB,5.0 g/mL與EMB, 10.0 g/mL)，strep-

tomycin(SM,2.0 g/mL與 SM, 10.0 g/mL)

及 rifampin (RIF, 1.0 g/mL)，並包括不含藥

物的對照小格。

藥敏試驗的操作[20]：將分離出的MTBC

及慢速生長NTM菌株調菌液至相當於MacFar

land 1.0菌液，再次稀釋至 10-2和 10-4濃度，

利用巴斯德滴管滴種三滴的方式接種四分格

中的一格，然後封膜（因培養較久時間，避

免agar中的水分喪失，且具有生物安全性），

置於 35℃的CO2培養箱，培養 3~4周後再判

讀結果。

統計方法分析

利用台美醫事檢驗所從 2012年 1月至

2013年 6月分枝桿菌的菌種鑑定類別及各個

菌名進行分離率及藥敏型式分析，由於 2012

年整年度所使用的生物晶片套組為 CMPTM

MycoChip鑑定套組，而 2013年上半年度所

使用的鑑定套組為CMPTM MycoCheck套組，

故個別菌種分離率分為 2012年及 2013年上

半年度兩部分統計，而藥敏試驗則統合 2012

年至 2013年 6月之資料進行個別菌種的藥敏

型式分析。

結果

分枝桿菌類別及個別菌種的分離率

透過生物晶片套組快速地鑑定出分枝桿

菌菌名，再依快速生長NTM、慢速生長NTM

菌種及 MTBC 分別統計其等之分離率（表

1），結果指出分離率的類別中 MTBC 佔

37.71%，而 NTM 佔 62.29%(其中快速生長

NTM 佔 29.4%，慢速 NTM 佔(29.26%)。表

2指出快速生長NTM中常分離出的菌種為

M. abscessus (57.79%)，其次為M. fortuitum

(29.95%)及M. chelonae (11.45%)。而慢速生

長NTM 常分離的菌種為M. avium complex

(73.15%)，其次為 M. gordonae (13.27%)及


110

M. kansasii (7.52%)，另外，未能進一步區

分的其它 NTM 佔 3.63% (287/7,905)（表

3），此顯示 CMPTM MycoCheck鑑定 NTM

效能高達 96.37%（表 1）。

快速生長 NTM 的藥敏型式

隨機抽取快速生長NTM共 1,914株進行

紙錠釋出方法藥敏試驗，測試的藥物及濃度

(括弧內)如下：CLR (4.0 g/mL)、CIP (2.0

g/mL)、FOX (30 g/mL)、AK(30 g/mL)、

SXT(30 g/mL)、IPM(8.0 g/mL)、LEV(8

g/mL)、DO(6.0 g/mL)等八種藥物[18,20,23,24]。

由表 4可看出快速生長NTM菌種中，M. ab-

scessus對於 CLR4、AK30、IPM8具有 95%

以上的感受性，M. fortuitum group 及 M.

chelonae對於CLR4、CIP2、FOX30、AK30、

IPM8、LEV8皆有 90%以上的感受性; 快速

生長 NTM大多對 SXT及 DO呈抵抗性。

慢速生長 NTM 及 MTBC 藥敏形式

隨機選取慢速生長 NTM 及 MTBC 進行

藥敏試驗[20,21,27]，慢速生長NTM菌與快速生

長 NTM 測試的藥物不同，本研究中，慢速

生長菌使用與MTBC相同的測試藥物，其中

三種藥物包括高與低濃度，即 INH（0.2與

1.0 g/mL）、EMB（5.0與 10.0 g/mL）、

SM（2.0 與 10.0 g/mL），另一種為單一濃

度的 RIF(1.0 g/mL)，共四種第一線藥物。

表 5指出測試 2,725株 MTBC，發現 MTBC

對 INH、EMB與 SM的兩種高、低濃度以及

單一濃度的 RIF大多呈感受性，較值得注意

的是多重抗藥性之結核性分枝桿菌（MDR-

TB，指對第一線 INH及RIF藥物同時具有抗

藥性）[19]。此研究數據中可得知結核分枝桿

菌對 INH(1.0 μg/mL)具有抗藥性為 3.1%

(85/2,725)，INH(0.2 μg/mL)具有抗藥性為

7.2%(197/2,725)；對RIF具有抗藥性為 0.9%

(24/2,725)，MDR-TB為 0.2%(5/2,725)。

表 1. 快速生長 NTM、慢速生長 NTM 及 MTBC 對所有分離菌

（7,905 株）的個別分離率

菌名計數（株）分離率

快速生長 NTM(rapid growers) 2,324 29.4%

Mycobacterium abscessus 1,343 16.99%

Mycobacterium chelonae 266 3.36%

Mycobacterium fortuitum 696 8.80%

Mycobacterium neoaurum 13 0.16%

Mycobacterium peregrinum 5 0.06%

Mycobacterium smegmatis 1 0.01%

慢速生長 NTM(slow growers) 2,313 29.26%

Mycobacterium avium complex 1,692 21.40%

Mycobacterium gordonae 307 3.88%

Mycobacterium kansasii 174 2.20%

Mycobacterium scrofulaceum 66 0.83%

Mycobacterium terrae 72 0.91%

Mycobacterium xenopi 2 0.03%

MTBCa 2,981 37.71%

其它不屬於上述菌種之 NTM 287 3.63%

總計 7,905

a MTBC佔 37.71%(2,981/7,905)，NTM佔 62.29% (4,924/7,905)，其中快速生長NTM佔 29.4%，(2,324/7,905)，而慢速生長 NTM佔 29,26%(2,313/7,905)。


111

另外，對 1,457株慢速生長NTM進行藥

敏試驗，由表 5中可發現慢速生長NTM中的

M. kansasii（106株）及 M. gordonae（236

株）對高濃度的 EMB與 SM以及RIF大多呈

感受性，對低濃度 EMB及 SM則呈中~高等

程度感受性，至於MAC（958株），M. scrof-

ulaceum（49株），M. terrae complex（44

株）以及其它慢速生長 NTM（59株）大多

顯示高度或中等程度抵抗性。

討論

2010年，Gayathri等[28]透過PCR技術，

探討臨床NTM菌株（148株）菌株的分離率

及藥敏型式，統計出其等之分離率，其中M.

abscessus 為 52%、M. fortuitum 為 44.6%，

其餘包括 M. smegmatis、M. chelonae、M.

immunogenum、M. farcinogenes、M. fortuitum

III biovarian complex 各分離出一株菌株

(0.007%)。此研究顯示M. chelonae的分離率

偏低，根據其它研究報告[1~4]指出M. chelonae

應較其它 NTM 分離率高，由此可知，統計

數據時，母體數的多寡所造成的影響很大。

蔡 [29]統計 2002~2007年台灣臨床分離

MTBC與NTM的佔比趨勢。MTBC為 66.7%

(5,349/8,024)，而NTM為 33.3%(2,675/8,024)。

另外 Lai et al.[13] 亦指出MTBC及NTM分離

率在 2008年呈 1:1比例。本研究所統計的

MTBC分離率為 37.7% (2,981/7,905)，NTM

分離率為 62.3%（表 1），顯示台灣在 2008

年呈現「黃金交叉」後，NTM的分離率漸超

過 MTBC 分離率，目前 NTM 分離率幾乎增

加一倍，其它國家的 NTM 分離率也有相同

的增加趨勢[15]。一般而言，影響各類別分枝

桿菌分離率的因素非常多[13~16]，如：醫院的

表 2. 快速生長 NTM 個別菌種對所有快速生長 NTM 總數（2,324株）之個別分離率

菌名計數分離率

Mycobacterium abscessus 1,343 57.79%

Mycobacterium chelonae 266 11.45%

Mycobacterium fortuitum 696 29.95%

Mycobacterium neoaurum 13 0.56%

Mycobacterium peregrinum 5 0.22%

Mycobacterium smegmatis 1 0.04%

總計 2,324

表 3. 慢速生長 NTM 個別菌種對所有慢速生長 NTM 總數（2,313株）之個別分離率

菌名計數分離率

Mycobacterium avium complex 1,692 73.15%

Mycobacterium gordonae 307 13.27%

Mycobacterium kansasii 174 7.52%

Mycobacterium scrofulaceum 66 2.85%

Mycobacterium terrae 72 3.11%

Mycobacterium xenopi 2 0.09%

總計 2,313


112

類型、鑑定層次的深度、國家或地區、檢驗

室使用的培養基種類、檢體來源、鑑定依據

及技術等。另外，本研究亦探討季節是否會

影響 NTM 各個菌種及 MTBC 分離率，以每

季為一個單位，統計各個菌種分離率，由結

果發現季節對分離率並沒有太大的影響，不

同月份的個別菌種分離率差異皆無超過 10%

以上，進而排除季節對分枝桿菌分離率的影

響（資料未提供）。

台灣許多檢驗室並未進行 NTM 的藥敏

試驗，分析其可能原因可包括：疾病管制

署(CDC)與醫院的目標不同，CDC只注重結

核病的流行病學及控制，導致醫院實驗室誤

以為 NTM 不必鑑定，因此也不必操作藥敏

試驗；臨床醫師及醫檢師不了解 NTM 與

感染的關係，以為大多是污染菌；臨床醫

師沒有要求檢驗室操作 NTM 藥敏試驗；

檢驗人員不熟練 NTM 的藥敏試驗技術；

檢驗人員不知如何選擇藥敏試驗的測試藥物；

檢驗室認為配製藥敏試驗的培養基步驟繁

瑣；檢驗室不知從何處購買成品藥敏試驗

培養基；健保局的給付低而不符成本，導

致操作意願低；檢驗人員認為多一事不如

少一事，別家檢驗室也沒操作及其它因素

等而影響藥敏試驗的操作意願[13,16,18]。有些

檢驗室即使操作 NTM 藥敏試驗，但並沒有

依據快速生長或慢速生長 NTM 類別或根據

慢速生長 NTM 的菌種選取適當藥物與濃度

進行測試，常便宜行事地利用檢驗室容易取

得的MTBC藥敏試驗培養基，操作方法也是

使用與 MTBC 測試相同的間接比例法。因

此，台灣鮮有完整的 NTM 藥敏型式記載。

國外的文獻亦僅有少數的 NTM 藥敏型式報

告[13,14]，Gayathri 等[26]根據 CLSI 建議的一

般嗜氧性細菌藥敏試驗方法 - Kirby Bauer

method 進行快速生長 NTM 個別菌種之藥敏

試驗，指出 M. abscessus及 M. fortuitum對

AK感受性分別為 97% (75/77)及 100% (77/77)，

此與本研究室的發現（分別為 98.5%及

97.2%）甚為相近。

2011年美國微生物學會出版的 Manual

of Clinical Microbiology, 10th ed.說明緩慢生

長 NTM 及 MTBC 傳統表現型的鑑定方法包

括基本的生理特性如生長速率、菌落形態、

表 4. 快速生長 NTM 個別菌種之藥藥敏型式

SPECIES

DRUG(CONC.)

M.

abscessus

M.

chelonae

M.

fortuitumgroup

M.

neoaurum

M.

peregrinum

M.

smegm

atis

M.

mucogenicuxm

a

Other

RG

-NT

Mb

Total 1064 211 507 17 5 7 36 67

CLR 4 99 99 93.5 100 80 71.4 100 100

CIP 2 41 95.7 98.6 100 80 71.4 100 92.5

FOX 30 88.4 91 91.5 100 100 71.4 100 79.1

AK 30 98.5 98.6 97.2 100 100 85.7 100 100

SXT 30 3.1 21.8 46.9 100 80 71.4 72.2 61.2

IPM 8 99.8 97.2 100 100 100 100 100 100

LEV 8 43.1 98 100 100 100 85.7 100 92.5

DO 6 1.5 16.1 34.9 100 40 85.7 55.6 49.3

a以傳統方法鑑定。b縮寫：RG，rapid growers（快速生長菌）；藥名之全名如內文。


113

產色素與光反應(photoreactivity)以及生化試

驗如 niacin 產生及 nitrate 還原試驗[1]，此兩

種生化試驗陽性為MTBC的必要特性，為金

標準[1]，但也只能區分 MTBC 與 NTM 兩種

類別。近幾年來，台灣許多檢驗室利用免疫

色層試驗(ICT)鑑定MTBC，其使用的抗原為

MPT64[4~6]，雖然簡單、快速，也有一定程

度的正確性，然而其無法排除細菌-MTBC共

同生長的干擾，尤其是痰檢體常有污染菌的

棲息包括Staphylococcus aureus及一些NTM

如MAC與M. chelonae共同生長時，將導致

偽陽性。且當MPT64抗原基因發生突變時，

所得到的陰性結果無法排除MTBC的存在。

另外，此試劑無法偵測M. bovis BCG亞株，

因其缺乏分泌MPT64的能力，ICT的靈敏度

與MPT64在菌體內的量有關，若呈陰性，需

再將陽性的 MGIT培養管置入培養箱，培養

三日後再重複進行試驗，以便加以確認。另

外如果生長菌為M. marinum或M. flavescens

時，ICT 試劑將產生弱的陽性訊號。因此，

使用 ICT試劑診斷MTBC，應將 ICT測試結

果與病人臨床症狀及其它診斷方法（如固態

培養基菌落形態；液體培養基的菌液外觀，

若呈棉絮狀或顆粒狀為 MTBC，若為混濁則

為 NTM 或細菌的生長）合併考量作為臨床

診斷病人是否得到肺結核。應用 ICT試劑診

斷分枝桿菌僅能區分 MTBC 與 NTM 兩種類

別[4~6]，雖然符合疾病管制署(CDC)的流行病

學需求，但無法滿足醫師對個別 NTM 菌種

與疾病關聯性的暸解。

本研究使用本土研發之生物晶片操作分

枝桿菌的分子診斷，不僅成本低，能快速地

將常見的 NTM 菌種與 MTBC 區分，且能即

時地提供選擇藥敏試驗測試藥物與濃度，除

了少見NTM以Mycobacterium spp.呈現外，

其鑑定靈敏度及專一性達 100%，尤其是能

夠在 MTBC 與 NTM 共同生長的情況下將其

等加以區分[12]。從表 1的菌種鑑定範圍，即

可顯示其在分枝桿菌實驗診斷的應用性。本

研究之所以能夠完整地將 7,905株分枝桿菌

鑑定出菌名，也只有使用生物晶片才能夠達

到。

本研究發現使用MTBC同樣的測試藥物

(INH、EMB、SM及 RIF)操作慢速生長NTM

的間接比例法藥敏試驗，其中MAC、M. scrof-

ulaceum及 M. terrae complex 幾乎對於所有

表 5. 慢速生長菌個別菌種之藥物感受性百分比

SPECIES

DRUG(CONC.)

M.

aviumcom

plex

M.

gordonae

M.

kansasii

M.

marinum

M.

scrofulaceum

M.

simiae

M.

terraecom

plex

MT

BC

Other

SG

-NT

Ma

Total 958 236 106 1 49 1 44 2725 59

INH 0.2 0.1 32.6 35.9 0 0 0 0 92.8 8.5

INH 1.0 0.2 51.1 77.4 0 6.1 0 4.6 96.9 11.9

EMP 5.0 6.2 83.1 81.1 100 10.2 0 38.6 99.4 25.4

EMB 10 48.6 96.6 97.2 100 44.9 0 70.5 100 54.2

SM 2.0 0.7 88.1 57.6 0 0 0 25 93.8 23.7

SM 10 16.1 100 97.2 100 65.3 0 41 96.5 59.3

RIF 1.0 1.9 92.4 88.7 100 2 0 0 99.1 28.8

M.

xenopi

3

33.3

33.3

33.3

33.3

66.7

66.7

33.3

a縮寫：SG, slow growers（慢速生長菌）；藥名之全名如內文。


114

的用藥皆無效、而M. gordonae及M. kansasii

僅對 RIF及高濃度 EMB與 SM呈感受性。

本研究室以第一線測試藥物進行 MTBC

的藥敏試驗，結果發現本地區分離的 MTBC

大多對測試藥物呈感受性（表 5），MDR-TB

的比例也甚低，疾病管制署報告台灣初發病

患 MDR-TB的比率，由 1990年代的 0.2%上

升至 2000年的 2.1%。本研究統計出的結果，

2012年至 2013年上半年度所分離出的MDR-

TB 為 0.2%，相較於疾管署的數據，還低許

多，可能是因為台美醫事檢驗所的檢體是來

自較小的醫院、診所，所以較少出現更嚴重

的MDR-TB病例。值得一提的是由於PZA的

藥敏試驗需在BACTEC 12B培養基測試[9,30,31]，

因此本研究室並無利用間接比例法操作。吾

等建議可使用新的配方操作PZA比例法，Hei-

fets 及 Sanchez[22]建議使用測試培養基 M-H

agar + OADC（pH調至 6.15），PZA藥物濃

度為 900 g/mL，配製四分格的培養基，其

中兩小格含有 PZA，另外兩小格不含藥物作

為對照。接種相當於 McFarland 0.5菌液的

10-2及 10-4稀釋液及對照小格。

雖然快速生長NTM使用agar disk elution

方法，非CLSI建議的「金標準」-broth micro-

dilution方法[20]，但此方法為Clinical Micro-

biology Procedure Manual[23]與 CLSI早期推

薦的方法[24]及歐盟EUCAST建議的方法，尤

其具有理論及檢驗室實作依據，同時操作簡

便、快速、正確、且成本低，本研究的藥敏

試驗結果（表 4）亦顯示快速生長NTM對測

試藥物大多具有良好的感受性，因此值得台

灣檢驗室納入常規 NTM的藥敏試驗。

本研究對慢速生長 NTM 藥敏試驗使用

方法是與 MTBC 相同的間接比例方法與藥

物，由表 5可看出其實有改進的必要。吾等

根據成本、操作方法的簡單性、已發表的文

獻、病人的治療藥物、藥敏試驗培養基的方

便獲得性提出適合台灣地區檢測環境的分枝

桿菌藥敏試驗測試的藥物與濃度（表 6）及

實用檢測方法（精選大管肉湯稀釋方法）。

茲分別說明如下：

1. MAC天生對INH及PZA呈抗藥性[19,32]，

因此不要測試此兩種藥物，本研究建議測試

藥物包括CLA、moxifloxacin及 linezolid[18~20]。

配製含這些藥物的培養基是使用cation-supple-

mented Mueller-Hinton broth + 5%OADC（分

裝 1 mL/管），接種原的濃度為 104~105 CFU/

mL，接種量為 1 mL。調整菌液的培養基不

可以含有 Tween 80，因為會發生協同作用

(synergistic)[19]，培養在 35℃，7天後第一次

觀察，若無生長，再培養，於第 10~14天再

次觀察，以肉眼觀察混濁度，若生長，代表

抵抗性。MAC 藥敏試驗的品管菌種為 M.

avium ATCC 700898，CLA 之MIC為 0.5~2

μg/mL，moxifloxacin 之 MIC 為 0.25~2 μg/

mL，而 linezolid之MIC為 4~16 μg/mL。

2. M. kansasii藥敏試驗建議測試藥物[19,20]

為 RIF，INH 及 EMB，其它測試藥物包括

SM、CLA、AK、CIP 及 SXT。若檢體為

AIDS病人來源，則以 rifabutin代替RIF[34]。

配製含這些藥物的培養基量、接種原濃度與

調整菌液的培養基、培養環境及天數以及判

讀標準皆與MAC相同，品管菌種為M. kansasii

ATCC 12478，RIF之MIC為≦1 μg/mL。

3.其它慢速NTM如：M. xenopi, M. szulgai、

M. terrae、M. malmoense等之藥敏試驗測試藥

物及測試方法，則如同M. kansasii[19,20]。

4. M. gordonae 大多為污染菌，除非確

認與感染有關才操作藥敏試驗[18,20]，選擇的

藥物包括 INH、EMB及RIF。另外，M. scrof-

ulaceum 感染時，通常以外科手術切除，若

操作藥敏試驗，則選擇 CLA進行測試。

5. 由於本研究的分離菌來源主要為痰檢

體，較少分離出 M. marinum。M. marinum

主要引起的皮膚及軟組織慢性肉芽腫，可利

用外科手術去除以及使用藥物治療。雖然不


115

建議常規操作藥敏試驗，但若需操作[19,20]，

可將各種測試藥物（CLA、RIF、EMB、DO、

AK、CIP、moxifloxacin及SXT）配於cation-

supplemented Mueller-Hinton agar + 5%

OADC，配製量為 1 mL，種菌後，培養在

30℃，7天後判讀。此菌通常對RIF、EMB、

DO、SXT及 CLA呈感受性。

總之，利用生物晶片快速鑑定出分枝桿

菌類別(NTM及MTBC)以及各個NTM菌種，

然後，立即選用合適各個菌種的測試藥物進

行精選大管肉湯稀釋試驗（一種或三種藥物

濃度），依據生長與否決定其低抑菌濃度

(MIC)，再根據CLSI的標準MIC值判斷其為

感受性或抵抗性[19,20]。此種操作方式將適

合台灣檢驗環境（如需要符合健保給付標準，

操作簡單、快速且結果正確，容易獲得的生

物晶片及藥敏試驗測試培養基，售後的技術

支援良好等）需求，如此，將有助於臨床醫

師對 NTM感染的快速且正確地診療。

參考文獻

1. Pfyffern GE, Palicova F. Mycobacterium: general char-

acteristics, laboratory detection, and staining procedure.

In Versalovic JV, Carroll KC, Funke G, gensen JH,

Landry ML, Warnock DW (eds). Manual of Clinical

Microbiology, 10th ed. 2011:472-502. ASM Press,

Washington DC, U.S.A.

2. Richter, Brown-Elliott BA, Wallace RJ, Jr. Mycobacterium:

laboratory characteristics of slowly growing mycobacteria.

表 6. 操作非結合分枝桿菌(NTM)精選大管肉湯稀釋試驗

測定 MIC 時建議的藥物種類與濃度

菌名

藥物

MA

C

M.

mardonae

M.

terrae,M

.sulgai,

M.

xenopi,M

.kansasii,

M.

gordonae

M.

marinum

RG

Mb

Clarithromycin 32 32 8

Moxifloxacin 4 4 4 4

Linezolid 32 32 32 32

Rifampin 2 2 4

Rifabutin 4

Ethambutol 8 8 8

Streptomycin 20

Isoniazid 2 2

Amikacin 64 64 64

Ciprofloxacin 4 4 4

SXTb 4/76 4/76 4/76

Doxycycline 8 4

Cefoxitin 64

Imipenem 16

Tobramycin 8

a 數字為配製單管藥物濃度( g/mL)，若配製三管，則另外選擇減倍量(×1/2)及雙倍量(2×)的藥物濃度：選用的基礎培養基為cation adjustedMueller-Hinton broth(pH7.3)，分裝量為 1 mL/試管，接種量為 1 mL(菌量約為 1.5×105 CFU/mL)，因此各管後測試的藥物濃度將減半。

b MAC, M. avium-intracellulare complex; RGM，rapidly-growingmycobacteria （快速生長 NTM）接種後培養溫度為 30℃。SXT, sal-famethosulzole-trimethoprim。


116

In Versalovic JV, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH,




3. Brown-Elliott BA, Wallace RJ, Jr. Mycobacterium:

Clinical and laboratory characteristics of slowly growing

mycobacteria. In Versalovic JV, Carroll KC, Funke G,

Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW (eds). Manual

of Clinical Microbiology, 10th ed. 2011:525-38. ASM

Press, Washington DC, U.S.A.

4. Andersen P, Munk ME, Pollock JM, Doherty TM. Specific

immune-based diagnosis of tuberculosis. Lancet. 2000;

356:1099-104.

5. Brent AJ, Mugo, Musyimi R et al. Performance of the

MGIT TBc identification test and meta-analysis of

MPT64 assays for identification of the Mycobacterium

tuberculosis complex in liquid culture. J Clin Microbiol

2011; 49:4343-6.

6. WHO. New laboratory diagnosis tools for tuberculosis

control. 2008, WHO.

7. Nadine L, Sylvic, Anne V et al. Comparison of the real-

time PCR method and the Gen-Probe amplified Myco-

bacterium tuberculosis in pulmonary and nonpulmonary

specimens. J Clin Microbiol 2004; 42:4307-9.

8. 陳芃瑋黃玉君楊于慧李秀霞蔡岳廷。抗酸性染色

價數、含菌量以及肺結核菌Real-Time PCR檢出率之

相關性。檢驗及品保雜誌 2012; 1:34~9。

9. Chang HE, Heo SR, Yoo KC, Song SH, Kim SH, Kim

HB, Park KU, Song J, Lee JH, Park SS, Kim EC.

Detection of Mycobacterium tuberculosis complex using

real-time polymerase chain reaction. 2008; 28:103-8.

10. Li H, Turhan V, Chokhani L et al. Identification and

differentiation of clinically relevant Mycobacterium

species directly from acid-fast bacillus-itive culture

broth. J Clin Microbiol 2009; 47:3814-20.

11. Troesch A, Nguyen H et al. Mycobacterium species

identification and rifampin resistance testing with high-

density DNA probe arrays. J Clin Microbiol 1999; 37:49-55.

12. 楊士杰，謝賢修，何耿德，林函頤，陳芃瑋，吳曉

萍，黃玉君，羅晟展，邱彥昕，葉本芳，許萬枝。

評估分枝桿菌生物晶片─CMPTM MycoChip之鑑定效

能。檢驗及品保雜誌 2012; 1:45~58。

13. Lai CC, Tan CK, Chou CH, Hsu HL, Liao CH, Huang

YT et al. Increasing incidence of nontuberculous myco-

bacteria, Taiwan, 2000-2008. Emerg Infect Dis 2010;

16:294~6.

14. Arend SM, van Soolingen D, Ottenhoff THM. Diagnosis

and treatment of lung infection with nontuberculous my-

cobacteria. Curr Opin Pul Med 2009; 15:201-8.

15. Simons S, Ingen JV, Soolingen DV. Nontuberculous my-

cobacteria in respiratory tract infections. Eastern Asia

Emerg Infect Dis 2011; 17:343-9.

16. Wang CC, Lin MC, Liu JW, Wang YH. Nontuberculous

mycobacterial lung disease in southern Taiwan. Chang

Gung Medical Journal 2009; 32:499-508.

17. 蘇維鈞。非結核分枝桿菌肺部感染之診療。台灣醫

界 2006; 49(9)。

18. 蔡文城，蔡岳廷。分枝桿菌之鑑定及藥敏試驗。實

用臨床微生物診斷學，第十版。2011；739-90。九州

圖書文物有限公司，台北。

19. Woods GL, Lin SYG, Desmond EP. Susceptibility test

methods: mycobacteria, nocardia, and other actinomycetes.

In Versalovic JV, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH,




20. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Sus-

ceptibility testing of mycobacteria , nocardiae and other

aerobic Actinomycetes; approved standard , M24-2A.

2011. CLSI, Wayne, PA.

21. 行政院衛生署疾病管制局。結核菌檢驗手冊。2004。

行政院衛生署疾病管制局。台灣。

22. Heifets L, Sanchez T. New agar medfium for testing

susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to

pyrazinamide. J Clin Micrbiol 2000; 38:1498-501.

23. Brown BA, Swenson JM, Wallace RJ, Jr. 5.10. Agar

disk elution test for rapidly growing mycobacteria. In

Isenberg HD (ed.) Clinical Microbiology Procedures

Handbook. 1994. ASM, Washington DC, U.S.A.

24. Hawkins JE, Wallace RJ, Jr., Brown BA. Antibacterial

susceptibility: mycobacteria. In Balows A et al. (eds).

Manual of Clinical Microbiology 5th ed. 1991:1138-52.

ASM, Washington DC, U.S.A.

25. Biehle JR, Cavalieri SJ, Saubolle MA, Getsinger LJ.

Evaluation of Etest for susceptibility testing of rapidly

growing mycobacteria. J Clin Microbiol 1995; 33:1760-4.

26. Winn W, Jr., Allen S, Janda et al. Koneman’s color atlas

and textbook of diagnostic microbiology 6th ed. 2006:

1064-124. Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore,

MD, U.S.A.

27. Hacek D. 5.13. Modified proportion agar dilution test

for slowing growing mycobacteria. In Isenberg HD (ed).

Clinical Microbiology Procedures Handbook. 1994.

ASM, Washington DC.


117

28. Gayathri R, Therese KL, Deepa P, Mangai S, Madhavan

HN. Antibiotic susceptibility pattern of rapidly growing

mycobacteria. 2010; 56:76-8.

29. 蔡青峰。臺灣臨床上分離分枝桿菌株的趨勢研究。

2010。醫學研究所博士論文，中山醫學大學，台中，

台灣。

30. Roberts GD, Goodman NL, Heifets L et al. Evaluation

of radiometric method for recovery of mycobacteria and

drug susceptibility testing of Mycobacterium erculosis

from acid-fast smear positive specimens J Clin Microbiol

1983; 18:689-96.

31. Siddiqi SH. 5.14. Radiometric (BACTEC) tests for

slowly growing mycobacteria. In Isenberg HD (ed.).

Clinical Microbiology Procedures Handbook. 1994.

ASM, hington DC.

32. Interlied CB, Klemper CA, Bermudez LEM. The My-

cobacterium avium complex. Clin Microbiol Rev 1993;

6:266-310.

33. Kasperbauer SH, Daley CL. Diagnosis and treatment of

infection due to Mycobacterium avium complex. Semin

Respir Care Med 2008; 29:569-76.

34. Griffith DE, Aksamit T, Brown-Elliott B et al. An official

ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention

of nontuberculous mycobacterial diseases. J Respir Crit

Care Med 2007; 175:367-416.

Comprehensive Analysis of the Isolation Rate and Antibiogramsof Mycobacteria Isolated from Taiwan

Zih-yu Chen1, Hsiao-Ping Wu2, Hsiu-Hsia Li2, Shian-Shiou Shie3, Wen-cherng Tsai3,4

1Department of medical Technology, Tzu Chi University, Hualien; 2Timing Medical Laboratory;3Super Laboratory Company, Ltd. New Taipei City; nstitute of Microbiology and Immunology, National Yang-Ming University,

Taipei, Taiwan

Abstract

With the exception of Mycobacterium tub-

erculosis complex (MTBC), all other mycobacteria

are called non-tuberculous mycobacteria (NTM).

Based on their growth rates, NTM are further

divided into two categories: rapid growers are

those that grow within 7 days of incubation and

slow growers are those that grow after 7 days.

The conventional methods to identify NTM are

tedious, time-consuming, costly, and often lead

to incorrect identifications. Therefore, many lab-

oratories in Taiwan neither further identify NTM

into specific species nor perform antimycobacterial

susceptibility testing. So, there are few reports

on the antibiograms of either category or of in-

dividual species of NTM. The present study, how-

ever, applied a locally manufactured biochip,

CMPTM MycoChip and MycoCheck, to identify

7,905 isolates of mycobacteria isolated from

Timing Medical Laboratory (New Taipei City,

Taiwan) from January, 2012, to June, 2013.

Results indicated that the laboratory’s isolation

rate for MTBC was 37.7%, while the rate for

NTM was 62.3%. Among rapidly growing NTM,

the highest isolation rate was for M. abscessus

(57.79%), with the M. fortuitum group (29.95%)

and M. chelonae (11.45%) coming next. Among

slowly growing NTM, the most common isolation

was M. avium complex (MAC, 73.15%), followed

by M. gordonae (13.27%) and M. kansasii (7.52%).

We randomly selected 2,324 isolates rapidly

growing NTM upon which to perform drug sus-

ceptibility testing by the agar disk elution method.

Results indicated that the susceptibilities of M.

abscessus to clarithromycin (CLR), amikacin


118

(AK) and imipenem (IMP) were higher than 95%,

and that the susceptibilities of the M. fortuitum

group and M. chelonae to CLR, ciprofloxacin

(CIP), cefoxitin (FOX), AK, IMP and levofloxacin

(LEV) were higher than 90%. We also tested

2,725 isolates of MTBC by indirect proportion

method and found that they were highly susceptible

to the following primary testing drugs: isoniazid

(INH), ethambutol (EMB), streptomycin (SM)

and rifampin RIF). We also tested the slowly

growing NTM by using a testing drug panel for

MTBC and found that most of the M. kansasii

and M. gordonae isolates were highly susceptible

to high concentrations of EMB and SM, as well

as RIF, and were moderately susceptible to low

concentrations of EMB and SM. As for MAC,

M. scrofulaceum, M. terrae complex and other

slowly growing NTM, they showed high or

moderate resistance to the aforementioned drugs.

In addition, of the MTBC isolates, 3.1% (81/2,725)

were resistant to higher concentrated INH (1.0

g/mL), 7.2% (197/2725) were resistant to less

concentrated INH (0.2 g/mL), 0.9% (24/2725)

were resistant to RIF (1.0 g/mL). The prevalence

rate of multiple drug-resistance MTBC (those

resistant to both INH and RIF are abbreviated as

“MDR-TB”) was 0.2% (5/2725). Based on the

above findings, we will explore and recommend

the suitability of testing drugs, their centrations

and the testing method for each category of my-

cobacteria and each species of NTM. In summary,

the use of biochips to identify NTM can facilitate

rapid identification of mycobacteria into categories

and species. This rapid identification can in turn

allow a laboratory to quickly select a suitable

testing drug panel based on the identifications

while avoiding selection of an incorrect testing

drug panel, such as using those used for MTBC

to test slowly growing NTM. In this paper, we

recommend a systemic plan for local laboratories

to perform drug susceptibility testing correctly

by selecting appropriate drugs and concentrations

for the testing. In this way, the antibiogram results

obtained can be applied for the correct diagnosis

and treatment of mycobacterial infections by cli-

nicians.

Key words: Isolation rate, antibiogram, slowly

growing mycobacteria, rapidly gro-

wing mycobacteria, biochip

119


評估 Bio-kil 運用於按鍵膠片之防疫效用

呂旭峯 1 李慶孝 4 呂岱融 4 呂昀儒 5 賴珊湖 4 熊名琛 2 葉明陽 3

振興醫療財團法人振興醫院臨床病理科 1、安全衛生室 2、院本部 3，台北市；仁德醫護專科管理學校醫事檢驗科 4，

苗栗縣；彰化精誠高級中學 5，彰化市，台灣。

摘要

美國疾病控制預防中心(CDC)指出美國平均一年約有兩百萬病患為院內感染受害者，其中九萬名病患甚

至犧牲生命，因此醫院首重預防院內感染。本研究於週一至週三，每天六個時段，每個時段 1.5小時，分別

將鍍上 Bio-kil (Cargico Group Corp., Taiwan)的薄膜貼在六台電梯按鈕、三台負責院區導覽之電腦觸控螢幕、

三台提款機按鈕與三台停車繳費機按鈕。就鍍上 Bio-kil的電梯按鈕之薄膜與控制組比較，發現 Bio-Kil滅菌

率為 69%，且兩組都是週一的細菌數最高，應為週一病患數較多所致。當提供病患查詢交通資訊、院區導

覽、藥品查詢之電腦螢幕鍍上 Bio-kil，明顯觀察到細菌分離數目遠小於未鍍上 Bio-kil (p<0.05)，滅菌率為

71.3%。此外本研究發現 Bio-kil針對提款機與停車繳費機之平均滅菌率分別為 84%與 77%。因此 Bio-kil可運

用於電梯按鈕、院區導覽之電腦觸控螢幕、提款機按鈕與停車繳費機按鈕等防疫工程。

關鍵字：院內感染、滅菌率

前言

美國疾病控制預防中心指出，美國平均

一年約有兩百萬病患為院內感染受害者，其

中九萬名病患甚至犧牲生命[1]。僅管醫院預

防院內感染的不二法門包括空調與洗手[2]，

醫院亦想盡辦法改善空調與使用各種乾洗手

裝備，但院內感染的預防必須面面俱到，除

上述空調與洗手之外，其他尚包括個人防護

裝備如口罩與實驗衣的使用與品質、各種重

要疫苗的施打如 B型肝炎與流感疫苗、醫院

的清潔維護與經常消毒，甚至員工的教育訓

練，以及爆發大流行之疫情調查等。然而院

內感染並非單純針對員工，更困難的是住院

病患與看護，甚至擴及家屬與訪客，因此醫

院必需建立一套科學且非僅止於口號之機制，

好不能只是仰賴病患遵守，否則一旦病患

不遵守，危機立即四伏。

市售產品 Bio-Kil 其殺菌技術平台是一

種物理性的殺菌機制，一般殺菌劑是靠氧化

還原力或酸鹼性，在接觸殺菌後即被中和而

失效，而 Bio-Kil 分子具有對病原體的強親

和力結構與強電場，能有效吸引病原體後，

並以其強電荷破壞微生物的胞膜蛋白，進而

殺滅病原體。之後 Bio-Kil 分子能再度提高

電荷而恢復殺菌力，同時 Bio-Kil 分子能與

被處理材質以共價鍵穩固的結合，因此即使

處於液態或氣態的流體環境中也不致流失而

消耗，因此能夠持續的維持其殺菌效果，但

其使用在醫院中的情形，尚未有完整的評估。

過去呂等人曾經導入 Bio-Kil 於空調系統，

不僅可明顯降低空氣落菌數，還可降低更換

濾網的頻率 [3]。此外，呂等人 [4]亦將護士服

*聯絡地址：振興醫療財團法人振興醫院副院長室

112 台北市北投區振興街 45號葉明陽

電話：886-(02)28264400轉 5850或 8009

E-mail address：[email protected]


120

黏貼上一層 Bio-Kil 薄膜，發現可預防護士

服細菌孳生。

本研究針對員工、病患與其家屬或訪客

常接觸的電梯按鈕與查詢交通資訊、院區導

覽、藥品查詢之電腦螢幕、提款機按鍵以及

停車繳款機按鍵，貼上 Bio-kil半透明薄膜，

進行表面細菌監控，另外透過此次實驗設計，

了解 Bio-Kil 是否能改善電梯按鈕、電腦觸

控螢幕、查詢交通資訊、院區導覽、藥品查

詢之電腦螢幕、提款機按鍵以及停車繳款機

按鍵之表面落菌數，可做為改善醫院環境，

預防院內感染之參考。

材料與方法

BioKil 處理電梯按鈕膠片之滅菌效果

針對醫院第一醫療大樓大廳之六部電梯

進行電梯按鈕細菌菌落數檢測。首先以順時

針方向將六台電梯編號，靠近入口為 1與

6號，3與 4號遠離入口。於週一早上 08:

00將未鍍上 Bio-kil 的薄膜貼到六台電梯按

鈕，並同時針對六台按鈕位置立即採菌作為

控制組，之後每一小時針對六台電梯按鈕採

菌，分別於 09:00、10:00、11:00、12:00、

13:00、14:00及 15:00，共七次。結束時不將

薄膜移除。隔天早上 08:00繼續執行六台電

梯按鈕採菌，之後每一小時針對六台電梯按

鈕採菌，分別於 09:00、10:00、11:00、12:

00、13:00、14:00及 15:00，共八次。連續 3

天。下週週一，重複上述步驟，但使用已鍍

上 Bio-kil的薄膜，一天採八個時段，連續 3

天。

將無菌棉花拭子浸入含 2毫升生理食鹽

水之試管，至近飽和不滴落狀態，將沾濕的

無菌棉花拭子於按鈕位置之特定範圍的表面

平均擦拭取樣（圖 1左上），將取樣的棉花

拭子手握部位折斷後，放回試管密封即完成

採樣。完成的試管至於震盪器震盪 5分鐘，

以無菌滴管吸取 1毫升檢体滴入含直徑 15公

分的TSA(tryptic soy agar)培養基，並以無菌

棒均勻塗開，完成所有接種後，將培養基置

於 35℃培養箱培養 48小時，計測其菌落數。

將培養基菌落數乘以 2倍即可換算出電梯按

鈕含多少細菌量。

BioKil 處理電腦觸控螢幕膠片之滅菌效果

將醫院提供病患查詢交通資訊、院區導

覽、藥品查詢之電腦螢幕，於週一先以未鍍

上Bio-kil的薄膜（面積 110平方公分），於

早上 08:00貼上螢幕（圖 1右上），並於 09:

30撕下，同時再貼上另一張未鍍上Bio-kil的

薄膜，面積亦為 110平方公分，重複步驟於

11:00、12:30、14:00及 15:30，共六次，連

續 3天，且檢驗三台螢幕。下週週一，重複

上述步驟，但使用已鍍上Bio-kil的薄膜（面

積 110平方公分），一天採六個時段，連續

3天，且檢驗三台螢幕。

取無菌棉花拭子浸入含 5 毫升生理食鹽


無菌棉花拭子於所標示的面積 110平方公分

之特定範圍的表面環境平均擦拭取樣，將取

樣的棉花拭子手握部位折斷後，放回試管密

封即完成採樣。完成的試管至於震盪器震盪

5分鐘，以無菌滴管吸取 1毫升檢体滴入含

直徑 15公分的 TSA 培養基，並以無菌棒均

勻塗開，完成所有接種後，將培養基置於

35℃培養箱培養 48小時，計測其菌落數。將

培養基菌落數乘以 5倍再乘以 100/110，即可

換算出每 100平方公分的電腦觸控螢幕含多

少細菌量。

BioKil 處理提款機按鍵膠片之滅菌效果

將醫院提供病患提款之三台提款機（兩

台國泰世華、一台中國信託）按鍵，於週一

先以未鍍上Bio-kil的薄膜（面積分別為 78.5、

78.5及 105平方公分），於早上 08:00貼上

薄膜（圖 1左下），並於 09:30撕下，同時

呂旭峯李慶孝呂岱融呂昀儒賴珊湖熊名琛葉明陽 121

121

再貼上另一張相同面積未鍍上 Bio-kil 的薄

膜，重複步驟於 11:00、12:30、14:00及 15:

30，共六次，連續 3天，且檢驗三台提款機

按鍵。下週週一，重複上述步驟，但使用已

鍍上Bio-kil的薄膜，一天採六個時段，連續

3天，且檢驗三台提款機按鍵。

取無菌棉花拭子浸入含 5毫升生理食鹽


無菌棉花拭子於所標示的面積之特定範圍的

表面環境平均擦拭取樣，將取樣的棉花拭子

手握部位折斷後，放回試管密封即完成採樣。

完成的試管至於震盪器震盪 5分鐘，以無菌

滴管吸取 1毫升檢体滴入含直徑 15公分的

TSA培養基，並以無菌棒均勻塗開，完成所

有接種後，將培養基置於 35℃培養箱培養 48

小時，計測其菌落數。將培養基菌落數乘以

5倍再乘以 100/78.75（第一台或第二台）或

再乘以 100/105（第三台），即可換算出每

100平方公分的電腦觸控螢幕含多少細菌量。

BioKil處理的停車繳費機按鍵膠片之滅菌效果

將三台醫院提供的停車繳費機（圖 1右

下），於週一先以未鍍上Bio-kil的薄膜（面

積為 34平方公分），於早上 08:00貼上薄

膜，並於 09:30撕下，同時再貼上另一張相

同面積未鍍上 Bio-kil 的薄膜，重複步驟於

11:00、12:30、14:00及 15:30，共六次，連

續 3天，且檢驗三台繳費機按鍵。下週週一，

重複上述步驟，但使用已鍍上 Bio-kil 的薄

膜，一天採六個時段，連續 3天，且檢驗三

台繳費機按鍵。

取無菌棉花拭子浸入含 5毫升生理食鹽


無菌棉花拭子於所標示的面積之特定範圍的

表面環境平均擦拭取樣，將取樣的棉花拭子

手握部位折斷後，放回試管密封即完成採樣。

完成的試管至於震盪器震盪 5分鐘，以無菌

滴管吸取 1毫升檢体滴入含直徑 15公分的

TSA培養基，並以無菌棒均勻塗開，完成所

有接種後，將培養基置於 35℃培養箱培養 48

小時，計測其菌落數。將培養基菌落數乘以

5倍再乘以 100/34，即可換算出每 100平方

公分的電腦觸控螢幕含多少細菌量。

圖 1. 左上為電梯按鈕以具 Bio-kil 薄膜黏

貼。右上為醫院提供病患查詢交通資訊、院

區導覽、藥品查詢之電腦螢幕以具Bio-kil薄膜黏貼。左下為中國信託提款機按鈕以具Bio-kil 薄膜黏貼。右下為停車繳費機鍵盤。

結果

BioKil 處理的電梯按鈕膠片之滅菌效果

1-6部電梯未經Bio-Kil處理的分別平均

菌數為 525、366、150、383、289 及 709

cfu，經 Bio-Kil處理的分別平均菌數為 82、

290、52、86、66及 179 cfu，編號 1與 6號

電梯薄膜所分離的細菌數目多（表 1）。

兩組的第一天 09:00 的採樣值為開始使用並

滅菌後馬上採樣的數據，為控制組，所以未

列入細菌菌落數的平均值之統計。當未附著

Bio-kil時，每台電梯每個小時之三天細菌數

總平均數為 391 cfu，置換成 Bio-Kil薄膜，

可分離到每台電梯每個小時之三天細菌數總

平均數為 123 cfu。


122

BioKil 處理的電腦觸控螢幕膠片之滅菌效果

對照組一號電腦每天之平均每個時段分

離菌其 3 天分別為每 100 平方公分分別為

123、165及 167 cfu，二號電腦分離菌每 100

平方公分分別為 81、62及 108 cfu，三號電

腦分離菌每 100平方公分分別為 105、69及

72 cfu（表 2）。醫院提供病患查詢交通資

訊、院區導覽、藥品查詢之電腦螢幕菌落數

表 1. 使用 BioKil處理的電梯按鈕膠片之滅菌效果

電梯編號

08:00 09:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 平均合計菌量排名

對照組第一天

1 2 2540 174 1074 550 960 466 158 846 5924 2

2 2 2376 614 446 132 144 484 116 616 4314 4

3 10 128 284 22 236 238 214 152 182 1284 6

4 6 30 528 3108 458 176 80 16 628 4402 3

5 0 506 504 220 174 312 602 174 356 2492 5

6 12 1524 238 1824 822 928 898 1002 1034 7248 1

對照組第二天

1 840 562 218 260 236 110 82 168 310 2476 1

2 410 144 404 378 256 74 296 64 253 2026 3

3 580 44 124 266 156 68 16 6 158 1260 6

4 1022 190 266 28 100 12 70 28 215 1716 4

5 692 28 358 254 88 94 104 14 204 1632 5

6 524 720 112 212 340 354 82 82 303 2426 2

對照組第三天

1 256 356 116 120 72 2144 182 112 420 3358 2

2 504 182 178 456 190 180 52 80 228 1822 5

3 118 28 44 24 318 56 192 111 780 6

4 704 190 180 680 128 176 84 306 2142 3

5 496 110 204 896 150 368 178 42 306 2444 3

6 520 124 1120 162 218 2600 791 4744 1

Bio-Kil組

第一天

Bio-Kil組

第二天

1 0 232 92 18 356 74 38 18 118 828 3

2 8 3768 628 184 188 108 68 88 719 5040 1

3 2 10 44 74 56 34 40 8 38 268 5

4 6 4 8 4 72 72 10 2 25 178 6

5 0 46 64 120 12 42 24 6 45 314 4

6

1

0

68

118

14

874

106

424

14

308

12

142

36

136

22

84

42

298

39

2086

314

2

5

2 60 12 14 16 136 42 28 52 45 360 4

3 4 4 84 112 2 18 54 16 37 294 6

4 32 0 22 656 102 14 66 0 112 892 1

5 56 78 88 58 72 24 42 128 68 546 3

6 192 32 18 30 20 334 216 22 108 864 2

Bio-Kil組

第三天

1 92 86 38 42 128 114 90 116 88 706 4

2 42 292 194 16 18 118 38 126 106 844 3

3 62 2 146 22 50 212 82 494 6

4 98 170 52 10 42 56 430 123 858 2

5 28 18 42 52 346 78 22 84 586 5

6 16 24 412 76 132 528 1

註：“空白”代表培養基遭受汙垢污染，表面呈現模糊，細菌菌落數無法計數。


123

對照組高的是編號 1號(p<0.05)，編號 2與

3無差別(p＞ 0.05)。實驗組一號電腦每天之

平均每個時段分離菌其 3天分別為每 100平

方公分分別為 34、64及 49cfu，二號電腦分

離菌每 100平方公分分別為 12、27及 24 cfu，

三號電腦分離菌每 100平方公分分別為 7、

18及 36 cfu（表 3）。醫院提供病患查詢交

通資訊、院區導覽、藥品查詢之電腦螢幕菌

落數實驗組高的是編號 1號(p<0.05)，編號

2與 3無差別(p＞ 0.05)。當提供病患查詢交

通資訊、院區導覽、藥品查詢之電腦螢幕鍍

上Bio-kil，明顯觀察到細菌分離數目遠小於

未鍍上Bio-kil (p<0.05)。未經Bio-kil處理的

電腦觸控螢幕膠片，每天早上 08:00-09:30菌

落數多(p<0.05)，代表每天早上 08:00-09:

30電腦觸控螢幕細菌多。

BioKil 處理的提款機膠片之滅菌效果

對照組一號提款機鍵盤每天之平均每個

時段分離菌其 3天分別為每 100平方公分分

別為 572、781及 1037 cfu，二號分離菌每

100平方公分分別為 607、665及 1588 cfu，

三號分離菌每 100平方公分分別為 518、723

及 719 cfu（表 4）。實驗組一號提款機鍵盤

每天之平均每個時段分離菌其 3天分別為每

100平方公分分別為 38、134及 166 cfu，二

號分離菌每 100平方公分分別為 76、263及

124 cfu，三號分離菌每 100平方公分分別為

64、116及 158 cfu（表 5）。第一台提款機

三天 Bio-kil 的滅菌率分別為 93%、83%及

84%，平均滅菌率為 86%。第二台提款機三

天Bio-kil的滅菌率分別為 87%、60%及 92%，

平均滅菌率為 84%。第三台提款機三天Bio-

kil的滅菌率分別為 88%、84%及 78%，平均

滅菌率為 83%。因此Bio-kil針對提款機之平

表 2. 三台未經 Bio-kil處理的電腦觸控螢幕膠片，培養後菌落數與換算成每 100 cm2菌落數

開始採樣時間 1號觸控螢幕 2號觸控螢幕 3號觸控螢幕培養基菌落數

100 cm2

菌落數培養基菌落數

100 cm2


100 cm2

菌落數

第一天

0930 41 186 36 164 39 1771100 31 141 17 77 22 1001230 19 86 6 27 31 1411400 28 127 19 86 21 951530 17 77 11 50 7 321700 26 118 18 82 18 82平均 27 123 18 81 23 105

第二天

0930 56 255 23 105 43 1951100 39 177 18 82 18 821230 50 227 7 32 6 271400 23 105 18 82 5 231530 11 50 11 50 5 231700 38 173 5 23 14 64平均 36 165 14 62 15 69

第三天

0930 103 468 20 91 17 771100 39 177 12 55 19 861230 21 95 9 41 24 1091400 33 150 37 168 6 271530 11 50 26 118 10 451700 14 64 38 173 19 86平均 37 167 24 108 16 72

三天總平均 33 151 18 84 18 82


124

表 3. 三台經 Bio-kil處理的電腦觸控螢幕膠片，經培養後菌落數與換算成每 100 cm2菌落數


100 cm2


100 cm2


100 cm2

菌落數

第一天

0930 19 86 1 5 1 51100 1 5 5 23 3 141230 11 50 2 9 1 51400 1 5 2 9 污染污染

1530 7 32 3 14 0 01700 6 27 2 9 2 9平均 8 34 3 12 1 7

第二天

0930 8 36 5 23 3 141100 6 27 1 5 2 91230 10 45 10 45 3 141400 3 14 8 36 5 231530 46 209 9 41 10 451700 12 55 3 14 1 5平均 14 64 6 27 4 18

第三天

0930 8 36 5 23 5 231100 16 73 12 55 6 271230 8 36 1 5 2 91400 30 136 3 14 4 181530 1 5 0 0 11 501700 1 5 10 45 19 86平均 11 49 5 24 8 36

三天總平均 11 49 5 21 5 21

表 4. 表 4. 三台未經Bio-kil處理的提款機鍵盤，經培養後菌落數與換算成每 100 cm2菌落數


100 cm2


100 cm2


100 cm2

菌落數

第一天

0930 103 654 184 1168 121 5761100 99 629 64 406 70 3331230 107 679 103 654 200 9521400 49 311 87 552 76 3621530 134 851 43 273 97 4621700 48 305 93 590 89 424平均 90 572 96 607 109 518

第二天

0930 157 997 117 743 115 5481100 204 1295 36 229 48 2291230 168 1067 230 1460 154 7331400 47 298 污染污染 170 8101530 104 660 36 229 233 11101700 58 368 污染污染 191 910平均 123 781 105 665 152 723

第三天

0930 288 1829 132 838 134 6381100 157 997 36 229 157 7481230 251 1594 809 5137 81 3861400 75 476 203 1289 93 4431530 95 603 130 825 290 13811700 114 724 191 1213 污染污染

平均 163 1037 250 1588 151 719三天總平均 125 797 156 990 136 650


125

表 5. 三台經 Bio-kil處理的提款機鍵盤，經培養後菌落數與換算成每 100 cm2菌落數


100 cm2


100 cm2


100 cm2

菌落數

第一天

0930 1 6 2 13 8 381100 12 76 7 44 5 241230 10 63 17 108 6 291400 3 19 1 6 11 521530 6 38 9 57 38 1811700 4 25 36 229 13 62平均 6 38 12 76 14 64

第二天

0930 18 114 38 241 53 2521100 21 133 71 444 31 1481230 24 152 27 171 23 1101400 2 13 30 190 4 191530 37 235 47 298 20 951700 25 159 37 235 15 71平均 21 134 42 263 24 116

第三天

0930 39 248 37 235 44 2101100 27 171 10 63 16 761230 6 38 19 121 14 671400 31 197 20 127 14 671530 36 229 13 83 83 3951700 18 114 18 114 28 133平均 26 166 20 124 33 158

三天總平均 18 113 25 154 24 113

表 6. 三台未經 Bio-kil處理的停車繳費機鍵盤，經培養後菌落數與換算成每 100 cm2菌落數


100 cm2


100 cm2


100 cm2

菌落數

第一天

0930 21 309 11 162 污染污染

1100 13 191 13 191 9 1321230 20 294 15 221 11 1621400 19 279 7 103 13 1911530 25 368 90 1324 污染污染

1700 11 162 13 191 3 44平均 18 267 25 365 9 132

第二天

0930 42 618 19 279 16 2351100 15 221 7 103 7 1031230 22 324 4 59 6 881400 8 118 4 59 32 4711530 20 294 9 132 3 441700 6 88 80 1176 7 103平均 19 277 21 301 12 174

第三天

0930 14 206 20 294 26 3821100 33 485 5 74 10 1471230 7 103 11 162 3 441400 17 250 13 191 11 1621530 14 206 8 118 7 1031700 43 632 36 529 6 88平均 21 314 16 228 11 154

三天總平均 19 286 20 298 11 156


126

均滅菌率為 84%。詳細數據請參酌表 4與 5。

BioKil 處理的停車繳費機膠片之滅菌效果

對照組一號停車繳費機鍵盤每天之平均

每個時段分離菌其 3天分別為每 100平方公

分分別為 267、277及 314 cfu，二號分離菌

每 100平方公分分別為 365、301及 228 cfu，

三號分離菌每 100平方公分分別為 132、174、

154 cfu（表 4）。實驗組一號停車繳費機鍵

盤每天之平均每個時段分離菌其 3天分別為

每 100平方公分分別為 29、137及 61 cfu，

二號分離菌每 100平方公分分別為 25、25及

61 cfu，三號分離菌每 100平方公分分別為

17、39及 76 cfu（表 5）。第一台停車繳費

機三天Bio-kil的滅菌率分別為 89%、50%及

80%，平均滅菌率為 73%。第二台三天 Bio-


滅菌率為 88%。第三台停車繳費機三天Bio-


滅菌率為 71%。因此Bio-kil針對停車繳費機

之平均滅菌率為 77%。詳細數據請參酌表 6

與 7。

討論

1-6部電梯未經Bio-Kil處理的平均菌數

以第一和第六台電梯高，應是此兩部電梯

靠近出入口，使用較頻繁所致。1-6部電梯

經 Bio-Kil 處理的平均菌數無第一和第六台

電梯高現象，顯示實驗組抑菌的能力優良。

對照組第二天及第三天的第一次採樣細菌數

都較高，應為前一天晚上至早上所累計造成，

而實驗組並無此現象，顯示實驗組抑菌的能

力優良（表 1）。對照組與實驗組每台電梯

每個小時之三天細菌數總平均數分別為 391

與 123 cfu，推估 Bio-Kil運用在電梯按鈕之

滅菌率為 69%。針對電梯按鈕之研究，發現

兩組分別採樣週一到週三，發現兩組都是週

一的細菌數高，應為週一病患數較多所致。

表 7. 三台經 Bio-kil處理的停車繳費機鍵盤，經培養後菌落數與換算成每 100 cm2菌落數


100 cm2


100 cm2


100 cm2

菌落數

第一天

0930 1 15 1 15 1 151100 2 29 0 0 0 01230 2 29 2 29 4 591400 1 15 0 0 2 291530 4 59 6 88 0 01700 2 29 1 15 0 0平均 2 29 2 25 1 17

第二天

0930 7 103 5 74 2 291100 8 118 0 0 3 441230 9 132 0 0 0 01400 13 191 2 29 3 441530 13 191 0 0 3 441700 6 88 3 44 5 74平均 9 137 2 25 2 39

第三天

0930 6 88 1 15 12 1761100 6 88 3 44 10 1471230 2 29 1 15 0 01400 0 0 16 235 1 151530 3 44 2 29 2 291700 8 118 2 29 6 88平均 4 61 4 61 5 76

三天總平均 5 76 3 37 3 44


127

就BioKil處理的電腦觸控螢幕膠片之滅

菌效果而論，對照組與實驗組編號 1號螢幕

膠片細菌分離數遠大於編號 2與 3號，可能

是 1號螢幕位於新大樓正廳，較多民眾使用

所致。當提供病患查詢交通資訊、院區導覽、

藥品查詢之電腦螢幕鍍上Bio-kil，明顯觀察

到細菌分離數目遠小於未鍍上 Bio-kil

(p<0.05)，滅菌率為 71.3 %。未經Bio-kil處

理的電腦觸控螢幕膠片，每天早上 0800-0930

菌落數多，可能是經過一整晚 15小時長久

使用所致。

再就BioKil處理的提款機膠片之滅菌效

果而言，即使電梯按鈕較多人使用，對照組

與實驗組之提款機所分離的細菌數目遠多於

電梯按鈕、電腦查詢螢幕與停車繳費機，意

謂提款機按鈕比電梯按鈕、電腦查詢螢幕與

停車繳費機更不乾淨，也有可能是因為提款

機按鈕是橫躺著，但電梯按鈕、電腦查詢螢

幕與停車繳費機為直立式，因此細菌較不容

易黏附。Bio-kil針對提款機之平均滅菌率為

84%，遠高於電梯按鈕、電腦查詢螢幕與停

車繳費機之平均滅菌率。

參考文獻

1. Delaney LR, Gunderman RB. Hand Hygiene. Radiol

2008; 246:15-9.

2. Why is handwashing important? Centers for Disease Control

and Prevention Media Relations Web site. http://www.cdc.

gov/od/oc/media/pressrel/r2k0306c.htm. Published March

6, 2000. Accessed September 8, 2006.

3. 呂旭峰、白壽雄、周明淵、明仁、孫吉珍、劉榮宏、

葉明陽。某區域醫院門診環境空氣落菌數改善研究。

J Biomed Lab Sci 2007; 19:17-24。

4. 葉明陽、陳厚羽、莊穎瑩、莊玉綉、周明淵、鍾明

燈、廖年捷、高立珍、呂旭峰。Bio-kil 減少護士服

之細菌分離數。安泰醫護雜誌 2011; 17:29-36。

Epidemic Prevention on the Application ofButton Film Coating Bio-kil

1Lu Hsu-Feng, 4Lee Ching-Hsiao, 4Lu Tai-Jung, 5Lu Yun-Ju, 4Lai Shan-Hu,2Hsiung Ming-Chon, 3Yeh Ming-Yang

Departments of 1Clinical Pathology, 2Occupational Safety and Health, 3Office of director, Cheng Hsin General Hospital, Taipei,Taiwan, R.O.C.; 4Jen-The Junior College of Medicine, Nursing and Management, Miaoli County, Taiwan, R.O.C.;

5Ching Cheng High School, Changhua, Taiwan, R.O.C.

Abstract

The CDC (Center of Disease Control)

estimates that approximately 2 million nosocomial

infections occur every year, and approximately

90,000 patients die as a result. That is the reason

why the prevention of nosocomial infections is

considered to be prime target for hospitals.

The buttons of six elevators, three computer

monitor touch- screen for guide, the buttons of

three cash machines and the buttons of three

parking payment machines were coating with

Bio-kil (Cargico Group Corp., Taiwan) and the

untreated buttons and monitors were used as

controls. We collected six periods every day

from Monday to Wednesday and each sample

collection interval is composed of 1.5hr.

Comparison with experimental and untreated

groups for the buttons of six elevators, we found

that the mean bacterial eradication rate of Bio-


128

kil was 69%. We also found the high isolation

rate of bacteria counts on Monday on account

of more numbers of OPD patients on Monday.

The bacterial counts on the three computer

monitor touch- screen coated by Bio-kil decreased

by as much as 71.3%. The buttons of three cash

machines and the buttons of three parking

payment machines coating with Bio-kil had a

mean bacterial eradication rate of 84% and 77%

individually. Bio-Kil is effective in reducing

bacterial counts in the buttons of six elevators,

three computer monitor touch- screen for guide,

the buttons of three cash machines and the

buttons of three parking payment machines.

Key words: Nosocomial infection, bacterial er-

adication rate

129


利用 HPLC 及電化學方法檢測市售飲料中咖啡因含量

藍景昭 1 張杏熙 2 蔡媛淳 2 蔡銘鳳 2 洪士奇 2 林錫斌 1*

元培科技大學食品科學系（所）1；新竹市衛生局，新竹縣，台灣 2

摘要

為了瞭解台灣市售飲料中咖啡因含量是否符合標準，本研究於 2012年 4月至 11月間調查市售包裝及非

包裝飲料中咖啡因含量，依據中華民國國家標準 CNS-9432號檢驗法進行檢測，並將結果與電化學方法結果

進行比對。本次檢測市售包裝飲料檢體共 91件(其中咖啡飲料 41件、茶類飲料 39件和提神飲料 11件)及市售

非包裝飲料檢體 23件（包括咖啡飲料 8件及茶類飲料 15件）。以高效能液相層析儀(High Performance Liquid

Chromatography；HPLC)分析樣品結果顯示包裝咖啡飲料、茶類飲料和提神飲料中咖啡因含量分別介於 116－

863 ppm、0－ 264 ppm和 0－ 595 ppm及非包裝咖啡飲料和茶類飲料中咖啡因含量分別介於 378~1,287 ppm

和 154~333 ppm。市售包裝咖啡飲料、茶類飲料和提神飲料中咖啡因含量超過標示 10%以上的分別有 10件、

1件和 2件，其咖啡飲料最高超過包裝標示含量的 106%。市售包裝與非包裝的咖啡飲料其咖啡因含量相近，

而市售包裝與非包裝的茶類飲料相比，非包裝茶類飲料咖啡因平均的含量比包裝茶類飲料高。此外，本研究

電化學方法是利用奈米金修飾網版電極，以循環伏安法(Cyclic voltammetry，CV)進行上述檢體咖啡因含量之

檢測比對，所獲得的咖啡因含量與傳統方法比對結果顯示，其相對百分比達 92%以上，證實此方法可應用至

咖啡因濃度之檢測，未來可改良檢測條件，以提昇方法的敏感度，進而提高樣品檢測的精準度。

關鍵字：咖啡因、循環伏安法、電化學、奈米金修飾網版電極

前言

咖啡因(caffeine；1,3,7-trimethylxanthine)

是一種黃嘌呤生物鹼化合物，超過 60種植物

的果實、葉片和種子中能夠發現咖啡因[1]。

它常見的主要存在來源有可樂果(Cola ac-

uminate)、可可豆(Theobroma cacao)，瑪黛

茶 (Ilex paraguariensis)、瓜拿納 (Paullinia

cupana)等[2]。此外，也存在於常食用的咖啡

豆(Coffea Arabica and Coffea robusta)以及

茶葉(Camelia siniensis)中 [3,4]。咖啡因是一

種中樞神經興奮劑，可以暫時性驅走睡意並

提振精神，它能刺激中樞神經系統，升高血

壓以及促進心跳[5~7]。在日常生活中常攝食

到的含咖啡因飲料，以咖啡、茶及提神飲料

為主，常在不自覺中攝取過量的咖啡因，而

攝取太多咖啡因時可能會導致咖啡因中毒。

其症狀是煩躁、緊張、刺激感、失眠、心悸、

面紅、多尿和消化道不適。每天多於 1克可

以導致痙攣、思想和語言突然轉換、心跳不

穩、心動過速和精神運動性激越。而咖啡因

中毒的症狀類似恐慌症和全面化焦慮症[8,9]。

因此各國對於咖啡因的含量都有一定的規範，

2007年 7月 5日衛署授食字第 0960404584號

令發布「飲料類衛生標準」，明訂有容器或

包裝之液態飲料，其咖啡因含量應符合下列

之規定:一、咖啡飲料:標示低咖啡因者，其

咖啡因含量不得超過 2 mg/100 mL(20 ppm)。

二、茶類及可可飲料:咖啡因含量不得超過 50

mg/100 mL(500 ppm)，標示低咖啡因者，其

*通訊地址：元培科技大學

30015新竹市元培街 306號林錫斌

電話：886-3-5381183 #8478

E-mail：[email protected]


130

咖啡因含量不得超過 2 mg/100 mL(20 ppm)。

三、茶、咖啡及可可以外之飲料 :若含咖啡

因，其咖啡因含量不得超過 32 mg/100 mL

(320 ppm)[10]。我國對於市售容器或包裝之

飲料，其咖啡因含量雖有規定，但咖啡飲料

只有規定標示低咖啡因者，沒有規定其咖啡

因限制量，且亦未對市售飲料咖啡因含量進

行調查。循環伏安法主要是以循環升降電位

加予工作電極並觀察輔助電極與工作電極間

的電流，就電流對電位掃描速度，折返電位

等實驗參數的變化，所產生的反應來推斷反

應的電化學性質與反應機制。目前以電化學

檢測咖啡因含量，所使用的電極有Bare boron-

doped diamond electrode、Pseudo carbon

paste electrode及Graphene-based electrochemical

等 [11~13]，且有很低的偵測極限(S/N=3)，其

範圍介於 1.2×10-7 M~3.48×10-7 M，回收率可

達到 92%以上，而本研究所使用的電極片為

奈米金修飾電極，是一種低成本、簡便的拋

棄式電極片，可利用於咖啡因濃度之檢測。

因此本研究為了瞭解市售包裝飲料中咖啡因

含量是否符合標示，並進行檢測分析及調查

標示之合格率，並以現有的電化學設備，以

循環伏安法(cyclic voltammetry，CV)進行檢

測咖啡因含量並與傳統方法做比對。

材料與方法

檢體來源

本研究之樣品可分為市售包裝及非包裝

飲料兩類產品，購買期間為 2012年 4月至 11

月間，市售包裝飲料主要購買於新竹市區便

利商店、大賣場和超商等及新竹市衛生局抽

查之飲料樣品；非包裝飲料主要購買於新竹

市區知名連鎖飲料店。市售包裝飲料為包裝

完整且標示清楚之飲料，非包裝飲料為市面

上知名連鎖飲料店之手搖飲料和現泡飲料。

總計飲料採樣 114件，包括市售包裝咖啡飲

料 41件、茶類飲料 39件和提神飲料 11件以

及非包裝咖啡飲料 8件和茶類飲料 15件。

藥品

咖啡因(Caffeine；1,3,7-Trimethylxanthine，

純度：100.2%)和過氧化氫(hydrogen peroxide)

購自 Sigma，美國；鹽酸(hydrochloric acid)

和甲醇(methanol)購自 Merck，德國；氨水

(ammonia solution)購自Showa，日本；三氯

醋酸(trichloroacetic acid)購自Ferak，德國；

氯金酸 (gold chloride)購自 Alfa Aesar，美

國；氯化鉀(potassium chloride)和 Tris base

購自 J.T. Baker，美國。

器材及設備

前處理及檢測過程中使用的器材包括C18

固相萃取匣（C18 cartridge，J.T.Baker，美

國），層析管柱（ODS-3，Inertsil®，GL Scien-

ces Inc. 日本），三電極（TE100-IK Three

electrode SPE，Zensor，台灣），儀器設備為

超音波震盪機（DELTA，台灣），真空濃縮

離心機（Savant，美國），離心機和高效能

液相層析儀（High Performance Liquid Chro-

matography；HPLC，HITACHI，日本），電

化學分析儀器（CH Instrument 1000C，美

國）。

標準溶液之配製

秤取咖啡因 (1,3,7-Trimethylxanthine；

純度：100.2%，Sigma，美國)對照用標準品

100 mg，精確秤定，以去離子水溶解並定容

至 100 mL，作為標準原液，臨用時再以移動

相溶液（30%甲醇）稀釋成 1 g/mL~100

g/mL，供作標準溶液。

HPLC 及電化學標準品檢量線的製備

在以 HPLC 法製備檢量線方面，將已配

製的咖啡因標準溶液(1,000 ppm)，以移動相

（30%甲醇）稀釋成 2.5、10、25、50、75

藍景昭張杏熙蔡媛淳蔡銘鳳洪士奇林錫斌 131

131

和 100 ppm作為 HPLC檢測時所需的咖啡因

濃度範圍，各取 10 L 注入 HPLC，將所得

波鋒面積作圖，經回歸分析求出線性方程式，

製得檢量線。在以電化學法製備檢量線方面，

將咖啡因標準溶液(1,000 ppm)以 0.2 N鹽酸

稀釋成 500 ppm，再以 0.1 N 鹽酸分別稀釋

成 12.5、25、50、75、100、150和 200 ppm

作為電化學檢測時所需的咖啡因濃度範圍，

各取 3~4 L滴至電極片上，以所得電流訊號

作圖，經回歸分析求出線性方程式，製得檢

量線。

HPLC 法之檢液製備[14]

液態檢體可分為以下三類處理方法：

A.含碳酸飲料類：檢體以超音波震盪 15

分鐘後，取檢體 5 mL，以移動相溶液定容至

25 mL，再以濾膜過濾供做檢液。

B.不含蛋白質飲料類：取檢體 5 mL，以

移動相溶液定容至 25 mL，再以濾膜過濾供

做檢液。

C.含蛋白質飲料類：取檢體 5 mL，加入

5%三氯醋酸溶液 5 mL，混合均勻後，以移

動相溶液溶解並定容至 25 mL，檢液移至 50

mL塑膠離心管，1500 g離心 10分鐘後以濾

紙過濾，再以濾膜過濾供做檢液。

再將上述之檢液以固相萃取法進行萃取，

方法如下：

取上述已製備之檢液 5 mL，注入預先以

甲醇 5 mL，再以去離子水 5 mL潤洗之 C18

或HLB過濾層析匣，調整真空固相萃取裝置

(ChromTech)流速至每秒一滴（每滴體積約

0.04 mL），棄流出液。以 0.28%氨水 5 mL

流洗，棄洗液，再以甲醇溶液沖提，收集沖

提液，以去離子水定容至 5 mL，以濾膜過濾

供做檢液[14]。

電化學法之檢液製備

取上述固相萃取法之檢液 1 mL，以真空

濃縮離心機除去樣品中的甲醇，經由真空濃

縮後的樣品為白色粉末，並將樣品復溶於 0.1

N鹽酸 1 mL中，以超音波震盪機震盪 15分

鐘，並作為電化學之檢液。

HPLC 檢測方法及條件

本實驗依照中華民國國家標準(CNS)編

號 9432號（食品中咖啡因含量檢驗方法進行

檢測）[14]，以 HPLC進行檢測咖啡因。以下

為分析條件：層析管柱為ODS-3（5 m，內

徑 4.6 mm×150 mm，Inertsil®，GL Sciences

Inc., 日本），使用紫外光偵檢器(HITACHI

L-2455)波長設定為 280 nm。移動相溶液為

30%甲醇，流速設定為 1.0 mL/min。

電化學檢測方法及條件

本實驗是以現有的設備及方法進行檢測，

電化學分析儀器為 CH Instrument 1000C，

美國，利用奈米金修飾網版電極，以循環伏

安法(cyclic voltammetry，CV)進行檢測咖啡

因 [11~13]。以下為分析條件：掃描速率為 0.1

V/s，起始電位為-0.6 V，高電位為 1.5 V，

低電位為-0.6 V，靈敏度為 1e-004 A/V。

奈米金修飾電極之製備

將參考電極(Ag/AgCl)表面加 3~4 L的

過氧化氫反應 5分鐘，使參考電極表面氧化，

再加 3~4 L的氯化鉀反應 5分鐘，使陰離子

附著於電極表面，再以去離子水清洗電極表

面並以氮氣吹乾，再以Tris buffer進行掃描，

去除電極表面上的雜質，以去離子水清洗電

極表面並以氮氣吹乾，再以 0.01 M 氯金酸

（含 0.1 M氯化鉀）掃描，透過陰離子配位

基吸附金屬離子，並作為檢測咖啡因的奈米

金修飾網版電極。

結果

HPLC檢量線製備與檢出極限測定咖啡


132

圖 1. 以高效液相層析儀及紫外光檢測器檢

測咖啡因標準品(100 ppm)之層析圖譜。


測不同濃度之咖啡因標準品所得之檢量線、

線性回歸方程式及相關係數。

因標準品以高效液相層析儀進行分析，咖啡

因之滯留時間為 6分左右（圖 1）。依上述

之標準品檢量線的製備方法，將所得波鋒面

積與濃度作檢量線圖，得到迴歸係數為 0.9999

（圖 2）。再將咖啡因標準品依序稀釋成範

圍介於 0.01 ppm~0.1 ppm之濃度，並以HPLC

進行分析。此儀器靈敏度低為 0.05 ppm，

雜訊比（S/N 比）大於 10，但咖啡因濃度為

0.04 ppm時，雜訊比（S/N比）小於 10且偏

離線性，迴歸係數為 0.9863。咖啡因濃度範

圍 0.05 ppm~0.1 ppm有良好的線性關係，故

0.05 ppm為儀器的低檢出極限（圖 3）。


測不同濃度之咖啡因標準品 (0.01 ppm~0.1ppm)所得檢量線、線性回歸方程式及相關係

數。

HPLC 法添加回收率試驗

以確定無咖啡因含量之市售運動飲料做

為基質，添加適量之咖啡因標準品溶液，配

製成終濃度為 25 ppm，依所建立之方法進

行三重複回收試驗，同時作為空白試驗，以

HPLC 分析，求其回收率，結果外添加於運

動飲料中之咖啡因標準品溶液之平均回收率

為 98.76%，回收率標準差為 2.96%（表 1）。

以 HPLC 檢測各種飲料中咖啡因之含量

以 HPLC檢測各種飲料中咖啡因之含量

範圍其結果如圖 4所示，市售包裝咖啡飲料

41件，其咖啡因含量範圍介於 116~863 ppm，

市售非包裝飲料(美式黑咖啡)8件，其咖啡因

含量範圍介於 378~1287 ppm。市售包裝茶類

表 1. HPLC法添加回收率試驗的結果*

添加濃度

(ppm)檢測平均值

(ppm)標準偏差

(ppm)平均回收率

(%)回收率標準偏差

(%)

25 24.69 0.74 98.76 2.96

*此數值為檢測 13次添加回收試驗之結果平均值


133

飲料共 39件，分別有綠茶、紅茶、奶茶、烏

龍茶、綜合茶，其咖啡因含量範圍介於 0~264

ppm。非包裝茶類飲料 15件，其咖啡因含量

範圍介於 154~333 ppm。11件市售包裝提神

飲料中咖啡因含量範圍介於 0-595 ppm。

圖 4. 以 HPLC 測定市售包裝與非包裝飲料

中咖啡因含量分布圖，其樣品數分別為包裝

咖啡飲料 41 件、茶類飲料 39 件和提神飲料

11件及非包裝咖啡飲料8件和茶類飲料15件。

電化學檢量線製備

將咖啡因標準品原液，以 0.2 N 鹽酸稀

釋成 500 ppm，再以 0.1 N 鹽酸分別稀釋成

12.5、25、50、75、100、150和 200 ppm，

各取 4 L 滴至電極片上以電化學法進行檢

測，所得電化學之咖啡因電流訊號大小（圖

5），以咖啡因訊號起始處畫基線至 1.4 V時，

可得到該訊號之電流（圖 6），依咖啡因不同

濃度之電流訊號作檢量線，其回歸係數大於

0.99（圖 7），顯示其有良好之線性關係。

圖 5. 不同濃度之咖啡因標準品經循環伏安

法檢測，所得 CV 圖，其範圍介於 12.5~200ppm。

圖 6. 以電化學循環伏安法檢測咖啡因標準品

100 ppm 所得之CV圖，掃描速率為 0.1 V/s。（粗黑箭頭為咖啡因的電流訊號）

圖 7. 電化學檢測樣品時咖啡因標準品濃度

範圍之檢量線，其範圍介於 12.5~200 ppm。

HPLC 法與電化學法之檢測咖啡因濃度比對

HPLC檢測之各種飲料中隨機選取 10件

包裝咖啡飲料、10件包裝茶類飲料及 9件包

裝提神飲料，並以電化學循環伏安法進行檢

測，並與 HPLC 所檢測出的咖啡因含量作比

對。其結果如表 2所示，其咖啡因含量與

HPLC 法檢測濃度誤差值約±15 ppm，若與

HPLC 檢測濃度作為相對百分比，發現其範

圍介於 70.44%-120.49%之間。

討論

目前衛生署並未訂定咖啡飲料類之咖啡

因含量上限，本研究以咖啡因含量超過標示

10%即認為該產品的實際濃度明顯與標示不

符合。本研究調查市售包裝咖啡飲料 41件中


134

不符合標示含量者高達 10件產品，大多數高

出標示19.3%，其中高超出達標示的106%。

市售非包裝咖啡飲料雖未規定其需標示咖啡

因含量，此次檢驗 8件樣品中，咖啡因含量

大多與包裝咖啡飲料之含量相近，但有 1件

美式咖啡，其咖啡因含量高達 1,287 ppm（資

料未顯示）。衛生署規定茶類飲料中咖啡因

含量不得超過 500 ppm，此次調查結果包裝

茶飲料中咖啡因含量全部符合規範標準。但

其中有 1件含量與其包裝標示不符，超出約

10%。市售非包裝茶飲料與包裝茶飲料相比，

其咖啡因含量明顯高於包裝茶類飲料（圖

4）。此外，一般飲料店並無販售提神飲料之

飲品，因此本研究中提神飲料部分只針對市

售包裝產品做調查。衛生署規定茶、咖啡、

可可以外之飲料中咖啡因含量不得超過 320

ppm，在 11件市售包裝提神飲料中有 2件達

500 ppm以上，並超出其標示含量之 56%和

85%。以上結果顯示咖啡飲料及提神飲料中

仍有部分與標示不符合之現象，其中部分非

包裝咖啡飲料及包裝提神飲料有咖啡因濃度

過高之情形，消費者在不知情下可能造成咖

啡因之過度攝取。

以電化學法製備檢量線時，若咖啡因標

準品濃度範圍過於接近時，電流訊號無法明

確的做區隔，如 2.5~100 ppm之間的檢量線，

其迴歸係數只能達到 0.95。若將標準品濃度

提高至 200 ppm，則可以得到良好的線性關

係（迴歸係數 0.99以上）。電化學是非常靈

敏的儀器，但穩定性不夠，標準品檢量線的

標準偏差平均為 13.89 ppm，因此在低濃度

的範圍其迴歸係數無法達到 0.99。而 HPLC

檢測的咖啡因濃度低可達到 0.05 ppm，且

穩定性高，標準偏差在 1 ppm以下，可非常

準確的定量。

以電化學方法檢測咖啡因，目前常見的

電極材料有玻璃碳電極、含硼的碳電極、奈

米修飾電極等，陸續被開發作為檢測咖啡因

上的應用。其優點為可承受較高的電位，具

有較高的穩定性及靈敏度， vorc 等人[11]指

出咖啡因在高電位下會有一個氧化峰，且在

酸性條件下咖啡因的訊號較穩定，以 Bare

boron-doped diamond 電極檢測咖啡因，檢

測極限為 1.5×10-7 M，有很高的靈敏度，但

標準偏差卻達到 25 ppm，其靈敏度依電極材

料的不同而有所不同。本研究是以拋棄式的

網版印刷電極進行奈米金的修飾，並以 0.1 N

鹽酸作為電解液，咖啡因濃度低可檢測到

5.15×10-5 M (10 ppm)，較 Bare boron-doped

diamond 電極之靈敏度低，而樣品的標準偏

差大為 23 ppm。與HPLC方法檢測樣品中

咖啡因含量作比對，其平均相對百分比雖達

90%以上（表 2），但仍有部分樣品無法精

準的定量。未來可針對各個測定條件進行改

善，如電解液種類及酸鹼值對咖啡因訊號的

影響等，使此方法靈敏度提高，進而提高樣

品檢測的精準度。

致謝

感謝國立台灣大學生化科技學系何佳安

老師提供電化學之檢測儀器、三電極晶片與

實驗方法。

參考文獻

1. Andrews KW, Schweitzer A, Zhao C et al. The caffeine

contents of dietary supplements commonly purchased

in the US: analysis of 53 products with caffeine-containing

ingredients. Anal Bioanal Chem 2007; 389:231-9.

2. Martínez-Huitle CA, Fernandes NS, Ferro S et al.

Fabrication and application of Nafion®-modified boron-

doped diamond electrode as sensor for detecting caffeine.

Diamond & Related Mater 2010; 19:1188-93.

3. Ashihara H, Crozier A. Caffeine: a well known but little

mentioned compound in plant science. TRENDS in Plant

Sci 2001; 6:407-13.

4. Jeevagan AJ, John SA. Electrochemical determination

of caffeine in the presence of paracetamol using a self-

assembled monolayer of non-peripheral amine substituted

copper(II) phthalocyanine. Electrochimica Acta 2012;


135

77:137-42

5. Akyilmaz E, Turemis M. An inhibition type alkaline

phosphatase biosensor for amperometric determination

of caffeine. Electrochimica Acta 2010; 55:5195-9.

6. Alizadeh T, Ganjali MR, Zare M, Norouzi P. Development

of a voltammetric sensor based on a molecularly imprinted

polymer (MIP) for caffeine measurement. Electrochimica

Acta 2010; 55:1568-74.

7. Nurminen ML et al. Coffee, caffeine and blood pressure.

Eur J Clin Nutr 1999; 53:831-9.

8. Juliano LM, Griffiths RR. A critical review of caffeine

withdrawal: empirical validation of symptoms and signs,

incidence, severity, and associated features. Psychopharm

2004; 176:1-29.

表 2. 以電化學及 HPLC檢測市售各種包裝飲料中咖啡因含量之濃度比對

樣品種類代號* 咖啡因含量(ppm)

咖啡飲料電化學方法 HPLC方法相對百分比(%)**

CK-1 96.4 ± 16.8 110.1 ± 0.6 87.6

CK-2 81.5 ± 1.9 68.6 ± 0.0 118.7

CT 23.6 ± 6.1 23.2 ± 0.1 102.0

CU-1 81.2 ± 2.6 82.2 ± 1.6 98.8

CU-2 59.9 ± 11.7 49.7 ± 0.8 120.5

CU-3 109.4 ± 6.4 98.6 ± 1.2 110.9

CU-4 153.8 ± 19.5 162.0 ± 3.5 94.9

CU-5 57.0 ± 19.2 52.9 ± 0.7 107.8

CW-1 105.0 ± 6.9 110.7 ± 2.3 94.8

CW-2 88.78 ± 8.3 95.7 ± 0.9 92.7

平均 102.9

茶飲料

TA-1 24.0 ± 3.6 22.1 ± 0.3 108.4

TA-2 17.9 ± 7.6 20.0 ± 0.1 89.7

TC 13.3 ± 3.6 16.3 ± 0.2 81.5

TK-1 27.3 ± 7.2 27.4 ± 0.9 99.5

TK-2 18.9 ± 6.0 22.5 ± 0.6 84.1

TT-1 20.9 ± 19.3 20.4 ± 0.8 102.1

TT-2 15.5 ± 9.8 17.1 ± 0.1 90.6

TT-3 8.7 ± 5.9 12.1 ± 0.8 72.2

TU 16.3 ± 11.2 20.5 ± 0.3 79.6

TV 24.8 ± 18.1 21.3 ± 0.6 116.7

平均 92.4

提神飲料

ED ND 9.3 ± 0.3

EG-1 26.3 ± 4.0 37.3 ± 0.1 70.4

EG-2 28.1 ± 2.9 36.3 ± 0.4 77.5

EP 32.2 ± 13.5 32.6 ± 0.2 98.8

ER 71.7 ± 8.6 61.9 ± 0.3 115.7

ES-1 54.7 ± 23.2 57.0 ± 0.2 95.9

ES-2 102.7 ± 8.9 120.0 ± 0.2 85.5

ES-3 95.2 ± 11.0 100.7 ± 0.3 94.5

ET 42.6 ± 7.9 39.0 ± 0.6 109.1

平均 93.4

*樣品種類代號之英文第一字母 C、T 及 E 分別代表咖啡、茶及提神飲料，第二字母代表該飲料公司的英文縮寫代號，阿拉伯數字表示為不同之產品之編號。**相差百分比係指電化學法檢測濃度與 HPLC法檢測濃度之相對百分比。


136

9. Kerrigan S, Lindsey T. Fatal caffeine overdose: two case

reports. Foren Sci Internat 2005; 153:67-9.

10. 行政院衛生署食品藥物管理局。衛署食字第

0960404584號令發布: 飲料類衛生標準。2007年。

行政院衛生署食品藥物管理局，臺灣。

11. vorc L, Tomc ik P, Svitkova J et al. Voltammetric deter-

mination of caffeine in beverage samples on bare boron-

doped diamond electrode. Food Chem 2012; 135:1198-204.

12. Mersal GAM. Experimental and computational studies on

the electrochemical oxidation of caffeine at pseudo carbon

paste electrode and Its voltammetric determination in

different real samples. Food Anal Methods 2012; 5:520-9.

13. Sun JY, Huang KJ, Wei SY et al. A graphene-based elec-

trochemical sensor for sensitive determination of caffeine.

Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2011; 84:421-6.

14. 經濟部標準檢驗局。中華民國國家標準 CNS-9432

號：食品中咖啡因含量檢驗法。2009，經濟部標準

檢驗局，臺灣。

Determination of Caffeine Content in Commercial Beverages by HPLCand Electrochemical Methods

Jing-Jhao Lan1, Hsing-Hsi Chang2, Yuang-Chun Tsai1,2, Ming-Feng Tsai2,Shih-Chi Hong2, Hsi-Pin Lin1*

1 Institute of Food Science, Yuanpei University; 2 Public Health Bureau, Hsinchu City Government, Hsinchu,Taiwan

Abstract

To ensure that caffeine content of packaged

and unpackaged beverages comply with their

food labeling requirements, this study was to

investigate the caffeine content of 91 commercially

packaged beverages including 41 coffee drinks,

39 tea drinks, 11 energy drinks, and 23 unpackaged

drinks including 8 coffee drinks and 15 tea

drinks using the high performance liquid chro-

matography (HPLC) method in accordance with

the Chinese National Standard inspection

(CNS)-9432, as compared with the electrochemical

method during the period of April to November,

2012. The results showed that the caffeine

content of packaged coffee, tea and energy

drinks ranged from 116 to 863 ppm, 0 to 264

ppm and 0 to 595 ppm, respectively, and the

caffeine content of unpackaged coffee and tea

drinks ranged from 360 to 1,293 ppm and 154

to 333 ppm, respectively. The caffeine content

in 10 packaged coffee drinks, 1 tea drink and

2 energy drinks were found exceed 10% of their

caffeine content labeling in which one coffee

drink exceeded 106% labeled caffeine content.

The caffeine contents in commercially packaged

coffee drinks were similar to that of unpackaged

coffee drinks whereas the caffeine contents in

commercially unpackaged tea drinks were more

than that of packaged tea drinks. In addition,

the electrochemical method based on cyclic vol-

tammetry with gold-nanostructured screen-

printed electrode was used to detect the caffeine

content of those drinks above and compared the

accuracy to the HPLC method. The electrochemical

method showed above 92% relative percentage

as compared to the HPLC method. The electro-

chemical detection could be an alternative method

for determining the caffeine content. The

parameters of the detection conditions may be

required to revise in order to improve the accuracy

and sensitivity of the method in the further study.

Keywords: Caffeine, cyclic voltammetry, elec-

trochemical, gold-nanostructured

screen-printed electrode

137


「樟芝元 Antro-Gem」之基因毒性試驗分析

邱怡禎 1 藍文傑 2 蔡岳廷 2 黃俊智 1*

麗豐實業股份有限公司，台南市 1；台美檢驗科技有限公司，新北市 2，台灣

摘要

牛樟芝(Antrodia cinnamomea)是台灣特有的藥用真菌，其保健機能與醫療用途近年來已受到高度重視，

人工培育的樟芝與相關產品也因而越來越普遍。本研究目標是分析樟芝發酵凍乾粉(freeze-dried Antrodia cin-

namomea mycelium culture)－樟芝元(Antro-Gem)是否會對生物體造成基因變異性，以判斷此物質是否屬於安

全性健康食品。我們採用了沙門氏菌回復突變試驗、哺乳類細胞染色體異常試驗、與嚙齒動物周邊血液微核

試驗，所有劑量的試驗都與陰性對照組無明顯差異，但與陽性對照組引起的陽性反應有顯著差異。因此試驗

結果顯示樟芝元並不具有基因毒性。

關鍵字：牛樟芝、凍乾菌絲體粉、基因毒性、染色體變異、微核試驗

前言

牛樟芝(Antrodia cinnamomea)為台灣特

有種真菌，生長於台灣特有保育類樹種「牛

樟樹」(Cinnamomum kanehirai Hay)之中空

腐朽心材上。牛樟芝富含多醣體、類三萜化

合物、腺苷等機能性成分[1,2]，具有護肝、抗

癌、抗發炎等功能[3-6]，在民俗醫學中受到高

度重視的藥用真菌。但野生牛樟芝非常稀有，

過度開採的結果造成其唯一寄主牛樟樹也遭

到大量砍伐，破壞了自然生態。近年來已發

展出人工培育方法，包括椴木栽培、固態培

養、或菌絲體液態培養；其中液態培養的牛

樟芝菌絲體，已經能夠量產，不但品質較穩

定、含有活性成分，也被證實有多項近似野

生牛樟芝的生理機能[7-10]。

本研究的目的在於評估牛樟芝液態發酵

的凍乾粉是否具有基因毒性而間接造成遺傳

疾病及體細胞病變。傳統醫學將牛樟芝定義

為健康食品，因此本試驗依據 1999年公告的

「健康食品安全性評估方法」[11]，進行體內

(in vivo)與體外(in vitro)共三種基因毒性測

試，檢驗受試物質是否可能引發基因突變、

染色體缺失或重組、或染色體數量改變等直

接或間接的基因傷害。

本試驗包含微生物、體外哺乳類細胞、

與動物活體的測試。細菌回復突變試驗(Ames

test)為一個簡便又靈敏的方法[12]，測試物質

是否有導致基因突變的可能性；基因突變與

癌症的形成密不可分，而有高達 90%的已知

化學致癌物能以此方法測得[13]，顯見此方法

能有效辨識致癌物或致突變原。此測試是利

用數個帶有基因缺陷、無法自行製造組胺酸

(histidine)的沙門氏菌株，在缺少了組胺酸的

培養環境中就無法生長，但若受測物質容易

引發基因突變，這些菌株可能會產生回復突

變(reversion)，致使它們能在缺少組胺酸的

環境中繁殖。因此，經試驗物質處理、並在

實驗條件中生長的菌落數正比於此試驗物質

的致突變性。

*通訊地址：麗豐實業股份有限公司黃俊智

72042台南市官田區二鎮里工業路 48號

電話：886-6-6989025

Email：[email protected]


138

體外哺乳類細胞染色體異常試驗則是藉

由觀察細胞的分裂中期(metaphase), 評估試

驗物質是否造成染色體結構之變異，包括中

斷(gap)、斷裂(break)、雙著絲點(dicentric)、

無著絲點斷片(acentric fragment)等。在顯微

鏡下還可觀察此變異為染色體型（chromo-

some-type，即兩股染色分體皆發生變異）或

染色分體型（chromatid-type，即只有一股染

色體發生變異）。試驗結果可推算含染色體

變異細胞之頻率並評估試驗物質是否為致突

變原。

動物活體微核試驗是測量周邊血或骨髓

中血球細胞發生微核現象的頻率；此試驗簡

便且靈敏，觀察樣本為完成細胞分裂之細胞，

因此不受細胞週期限制。當染色體發生斷裂

或紡錘體功能不全，在細胞有絲分裂後，即

產生未包含於細胞核之染色體或無著絲點斷

片，其形狀、構造與染色性質皆與細胞核類

似，又比細胞核小，因此稱為微核(micronu-

cleus)；換句話說，微核產生率和染色體變異

有很好的相關性，且因其為細胞質中的染色

體或斷片，可用核酸特異性染劑來辨識。血

球細胞中以紅血球為佳樣品，因紅血球在

分化過程中會丟失細胞核，其胞漿內只殘留

少量核酸物質（類似網狀結構因此稱為網狀

紅血球，reticulocytes），因此背景值較低，

容易以染劑來辨識因試驗物質而產生的微核

與相對的基因毒性。

經過微生物、體外細胞與活體動物的測

試後，受試物質在每個實驗模型中都與陰性

對照組一樣不會引起陽性反應，此實驗結果

顯示牛樟芝培養凍乾粉並不具有基因毒性。

材料與方法

試驗物質

「樟芝元」膠囊（由麗豐實業股份有限

公司所製造）內含的橘黃色粉末為本試驗的

待測物質。大鼠肝臟萃取物混和液成分為 5%

(v/v) Aroclor-1253-induced rat liver S-9, 8 mM

MgCl2, 33 mM KCl, 5 mM glucose-6-phosphate,

2 mM NADP, 0.1 M phosphate buffer, pH7.4。

受試菌株與試驗法

本試驗使用 Salmonella typhimurium

TA97、TA98、TA100、TA102及 TA1535，

並以組胺酸需求性測試、rfa突變測定、uvrB

突變測定及ampicillin抗藥性確認基因型(geno-

type)無誤後才進行回復突變測試。

突變試驗採用平板混合測試 (plate incor-

poration assay)，取 100 L 試驗物質水溶液

(50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 mg/mL)與 100 L隔

夜培養的沙門氏菌菌液及 0.5 mL之 0.2 M磷

酸緩衝液或 S-9混合液。混合均勻後，加入

保存於 50 ± 1°C且含有histidine/biotin的液狀

軟性瓊脂中，再倒於 minimal glucose agar

(MA) plates上，凝固後倒置培養皿於 35 ± 1°

C定溫箱培養 48 ± 1小時後計算菌落數。

每一個菌株以五個劑量的樟芝元測試（試

驗組），並分為添加與不添加 S-9酵素混合

液，其相對應的陽性對照組（致變劑）如下：

試驗菌株陽性對照組及使用濃度( g/plate)

不添加 S-9 添加 S-9

TA97 4-nitroquinoline-N-oxide 0.5 2-aminofluorene 4.0

TA98 4-nitroquinoline-N-oxide 0.5 Benzo[a]pyrene 4.0

TA100 Sodium azide 0.4 2-aminofluorene 4.0

TA102 Mitomycin C 0.5 Benzo[a]pyrene 4.0

TA1535 Sodium azide 0.4 2-aminoanthracene 4.0

邱怡禎藍文傑蔡岳廷黃俊智 139

139

受試細胞株與試驗分組

CHO-K1 (Chinese hamster ovary cell)來

源自食品工業發展研究所生物資源與保存中

心。細胞培養基為 Ham F-12 medium 添加

10% Fetal bovine serum，置於 37°C 與 5%

CO2的恆溫箱中培養。

試驗物質溶於含有 0.1% DMSO (v/v)的

細胞培養液中，配置為五個劑量：5, 2.5, 1.25,

0.625及 0.3125 mg/mL。陰性對照組為含有

0.1% DMSO (v/v)的細胞培養液，陽性對照

組為 2 M mitomycin C（不加 S-9）與 80

M cyclophosphamide monohydrate（添加S-9）。

細胞的處理方式分為三組：不加 S-9，

以試驗物質處理 3小時；不加S-9，以試驗物

質處理 20小時；及添加 S-9，以試驗物質處

理 3小時。在加了試驗物質後第 20小時計算

細胞存活數。

染色體異常試驗

加試驗物質後第 18小時，加入colcemid

再培養 2小時，再用顯微鏡作其核型分析。

每試驗之細胞盤均採二重複，以代碼方式

(blind code)於 1,000倍顯微鏡下觀察 100個

分裂中期、染色體均勻散開、染色體數目在

18~22的細胞，並將染色體結構型態分類為:

chromosome gap (G)，chromosome break

(B)，dicentric (D)，ring (R)，chromatid gap

(g)，chromatid break (b)，multiple aberrations

(MA)及acentric fragment (AF)。試驗結果以

表格方式描述染色體變異之種類與數量，藉

以推算含染色體變異細胞之頻率。

受試動物

ICR 品系雄性小鼠（樂斯科生物科技股

份有限公司），體重約 29.9~34.0克(g)。飼

養環境為 22 ± 3°C、相對溼度 40~70%、照

明 12小時的動物房。每個飼育盒飼養五隻小

鼠。飼料為LabDiet® 5010 Rodent Diet (Purina

Mills LLC, St. Louis, MO, USA)，墊料為

Aspen Chip (Northeastern Products Corp,

USA)。每隻動物以打耳號方式進行標記，而

飼育籠以牌卡標示，分別記載籠號、案件編

號、IACUC編號、性別、劑量組別與動物號

碼。

微核試驗

試驗分為陰性對照組 (RO 水，20 mL/

kg)，陽性對照組(cyclophophamide, 0.05 g/

kg, 10 mL/kg), 與 20 mL/kg的低劑量(1.25 g/

kg)、中劑量(2.5 g/kg)、高劑量(5.0 g/kg)的

試驗物質。其中 cyclophosphamide以腹腔注

射方式投予，而 RO 水與試驗物質以餵食針

經口餵食。單次投予後每日觀察動物之臨床

症狀，並於投予前及投予後 72小時測量動物

體重。投予後 48與 72小時分別由小鼠尾靜

脈收集 3~4 L血液製備抹片標本。血液樣品

置於已預染 acridine orange的載玻片上，再

覆上蓋玻片，靜置於室溫 3~4小時以後以螢

光顯微鏡觀察血液中的網狀紅血球與微核。

首先觀察發出橘紅色螢光的網狀紅血球，計

算每 1,000個紅血球中網狀紅血球的數目；

其次觀察黃綠色螢光，計算每 1,000個網狀

紅血球中出現微核的頻率。

統計

各組動物之體重變化、網狀紅血球數及

發生微核網狀紅血球數皆採用 SPSS 生物統

計軟體中one-way ANOVA及Duncan’s multiple

range test 進行分析，當 p<0.05時表示組間

具有顯著性差異。

結果

沙門氏菌回復突變試驗

此試驗所使用的Salmonella typhimurium

TA97、TA98、TA100、TA102及 TA1535，

各自帶有數個突變基因，使它們成為篩選致


140

變異原的有效工具[14]。它們全帶有缺乏組胺

酸的突變，因此生長條件中如果不含有組胺

酸即無法生長（組胺酸需求性，表 1）。它

們也全部都帶有 rfa 突變，因此脂多醣層(li-

popolysaccharide layer)較薄弱，容易被外來

的化學物質侵入。除了TA102以外，這些測

試菌株帶有 uvrB缺失突變，造成 DNA修補

機制的缺陷。後，除了 TA1535之外，其

他菌株都帶有 pKM101質體，可增加易出錯

的 DNA 重組修復、提高 DNA 突變的可能

性，而且這個質體帶有 ampicillin 抗藥性，

因此可以用 ampicillin 來檢測這個質體的存

在。如表 1所示，經測試後，此五菌株的基

因型(genotype)皆確認無誤。

由於初步測試中試驗物質並沒有對測試

菌株產生明顯的毒性或殺傷力，因此高劑

量定為衛生署「健康食品安全性評估方法」

建議的 5 mg/plate[11]。在平板混和測試中，

當任何一個試驗組的劑量引發的回復突變數

達到陰性對照組的兩倍以上，且具有劑量反

應關係(dose-dependent response)時，即定義

為陽性反應。如圖 1所示，相對於陰性對照

組，所有的陽性對照組皆引發兩倍以上、顯

著差異的回復突變數，故為陽性反應。然而，

即使是試驗物質的高劑量(5 mg/plate)，仍

未引起顯著的突變數增加。

另外，為測試物質的代謝物是否有基因

毒性，富含各種分解代謝酵素的大鼠肝臟微

粒體混和液(S-9)也添加在試驗物質中，模擬

試驗物質的代謝過程，但在這樣的實驗條件

下仍然沒有引發陽性反應。因此實驗結果顯

示該試驗物質與其代謝後的物質對測試菌株

並不具有致變異性。

哺乳類細胞染色體異常試驗

由於初步測試發現試驗物質不會抑制

CHO 細胞生長或殺傷 CHO 細胞，因此訂定

以 5 mg/ml作為高劑量[11]。CHO細胞經試

驗物質處理 3小時（圖 2A）、20小時（圖

2B）、及添加代謝活化酵素 S-9與試驗物質

處理 3小時（圖 2C）之後，於顯微鏡下觀

察，並記錄每 100個細胞中具有染色體結構

變異的細胞數，如染色體或染色分體的中斷、

斷裂、雙著絲點、無著絲點斷片等。觀察結

果如圖 2所示，我們發現本試驗陰性對照組

之染色體異常細胞數低於 3%，劑量組之染色

體異常細胞數與陰性對照組經比較後並無顯

著差異，但顯著低於陽性對照組物質（不添

加 S-9組，mitomycin C；或添加 S-9組，

cyclophosphamide monohydrate）所引起的

染色體異常數。因此推論此試驗物質與其代

謝物對於哺乳類細胞的染色體並不具有致變

異性。

嚙齒類動物週邊血液微核試驗

本試驗以管餵方式對雄性小鼠投予試驗

物質，並觀察 48小時與 72小時後的染色體

變異反應。在試驗期間各組小鼠均無顯現任

表 1. 五種 Salmonella typhimurium試驗菌株之基因型鑑定結果

測試菌株Histidine

requirementuvrB

mutationrfa

mutationAmpicillinresistance

TA97 + + + +

TA98 + + + +

TA100 + + + +

TA102 + + +

TA1535 + + +

+具有此特性；不具有此特性


141

何毒性症狀，體重也無顯著性差異（圖

3A）。在投予試驗物質後 48小時，陰性對

照組小鼠網狀紅血球比例為 46.2 ± 2.3 ，

陽性對照組 (cyclophosphamide)為 18.8 ±

1.8 ，呈顯著性下降(p<0.05)，而試驗組之

低、中、高劑量所觀察到的網狀紅血球數目

與陰性對照組比較並無明顯差異（圖 3B）。

然而，含微核的網狀紅血球比例，在陰性對

照組中為 0.60 ± 0.55 ，陽性對照組為 20.40

± 2.88 ，顯示顯著性增加(p<0.05)；而試驗

組之低、中、高劑量所觀察到的含微核網狀

紅血球比例仍跟陰性對照組無明顯差異（圖

3C）。在投予試驗物質 72小時後的觀察與

48小時的觀察結果一致（圖 3B，3C）。綜

合以上結果，本試驗各劑量組對小鼠週邊血

液之網狀紅血球數目和微核網狀紅血球數目

皆與陰性對照組無顯著差異，試驗結果為陰

性，故可推知此試驗物質並不會對囓齒類動

物引發紅血球染色體或有絲分裂過程中的基

因變異與傷害。

圖 1. 試驗物質不具有引發沙門氏菌回復突變的致變異性。此圖表顯示在各實驗條件下沙門氏

菌回復突變的菌落數(Mean ± S.D., n=3)。測試菌株有TA97、TA98、TA100、TA102 及TA1535共五株，測試試驗物質代謝前（不添加 S-9）與模擬代謝後（添加 S-9）的致變異性。每一組

實驗各有陰性對照組、陽性對照組（見材料與方法）、與五個劑量的樟芝元試驗物質。


142

討論

本試驗探討牛樟芝液態發酵的凍乾粉－

「樟芝元Antro-Gem」是否具有基因致變性，

以細菌、體外細胞培養、及嚙齒類動物週邊

血液為實驗模型，測試樟芝元是否增加突變

的頻率、引發染色體結構異常、或導致功能

不全的有絲分裂。在初步測試中，樟芝元對

細菌、細胞、或動物都沒有造成明顯毒性反

應，顯示樟芝元為低毒性物質。而實際測試

結果也一致顯示樟芝元不會引發基因變異與

損害。

牛樟芝菌種寄生於台灣特有保育類樹種

牛樟木，而子實體生長於樹幹中空部位，雖

圖 2. 試驗物質與其代謝物對於哺乳類細胞染色體不具有致變異性。此圖表顯示在各實驗條件

下每一百個細胞中染色體產生變異的頻率(n=100)。每一組實驗各有陰性對照組、陽性對照組

（見材料與方法）、與五個劑量的樟芝元試驗物質。(A-B)試驗物質依劑量配置於 0.1% DMSO(v/v)的細胞培養液中，處理細胞 3 小時或 20 小時。(C)試驗物質依劑量配置於 0.1% DMSO (v/v)的細胞培養液中、並添加 S-9 共同處理細胞 3 小時。

AF：無著絲點斷片(acentric fragment)；MA：多重變異(multiple aberrations)；b：染色分體斷

裂 (chromatid break)；g：＝染色分體中斷 (chromatid gap)；R：環狀 (ring)；D：雙著絲點

(dicentric)；B：染色體斷裂(chromosome break)；G：染色體中斷(chromosome gap)。


143

然不會危害牛樟樹的生長，但由於近年來樟

芝的療效引起商界、學界、醫界的大量重視，

部分人士為取得稀少的牛樟芝子實體，大量

砍伐與盜採牛樟樹，使得曾經大量分布全台

的牛樟樹現已瀕臨絕種。

近年來微生物發酵技術的發展正好為牛

樟芝求過於供、牛樟木被濫採的困境提供了

解決方案。從篩選菌種、菌種鑑定、到建立

適化培養條件，牛樟芝菌種的培育已藉由

科學化製程達到品質穩定的目標。再輔以機

能成份分析、細胞活性與功能測試，樟芝產

品的生理機能也得以被確立。加上如「樟芝

元 Antro-Gem」已被證實無基因毒性、亦無

28天餵食毒性（實驗數據尚未發表），樟芝

產品的食用安全性無虞。在全球養生思維的

風潮下，國人、多數亞洲民眾、甚至部分西

方人都能認同「藥食同源」的觀念，科技化

微生物發酵正能提供安全有效、品質穩定的

保健藥用真菌產品給全球消費者，樟芝產品

也因此極有潛力在全球市場開出一片商機，

引領藥用真菌成為蓬勃發展的產業。

參考文獻

1. Cherng IH, Chiang HC, Cheng MC et al. Three new tri-

terpenoids from Antrodia cinnamomea. J Natural Products

1995; 58:365-71

2. Lu MK, Cheng JJ, Lai WL et al. Adenosine as an active

component of Antrodia cinnamomea that prevents rat

PC12 cells from serum deprivation-induced apoptosis

through the activation of adenosine A(2A) receptors.

Life Sci 2006; 79:252-8.

圖 3. 試驗物質對囓齒類週邊血球無基因變異或傷

害性。此圖表顯示(A)實驗小鼠的體重變化，(B)週邊血液每千個紅血球中網狀紅血球的數目，與(C)每千個網狀紅血球中含有微核的細胞數。試驗時間分

為 48 與 72 小時兩組。所有數據以 Mean ± S.D.表示

(n=5)。*p<0.05（與陰性對照組比較）。


144

3. Wen CL, Chang CC, Huang SS et al. Anti-inflammatory

effects of methanol extract of Antrodia cinnamomea

mycelia both in vitro and in vivo. J Ethnopharmacol

2011; 137:575-84.

4. Wu MT, Tzang BS, Chang YY et al. Effects of Antrodia

camphorata on alcohol clearance and antifibrosis in

livers of rats continuously fed alcohol. J Agric Food

Chem 2011; 59:4248-54.

5. Yang HL, Kuo YH, Tsai CT et al. Anti-metastatic

activities of Antrodia camphorata against human breast

cancer cells mediated through suppression of the MAPK

signaling pathway. Food Chem Toxicol 2011; 49:290-8.

6. Yue PY, Wong YY, Chan TY et al. Review of biological

and pharmacological activities of the endemic Taiwanese

bitter medicinal mushroom, Antrodia camphorata (M.

Zang et C. H. Su) Sh. H. Wu et al. (higher Basidiomycetes).

Int J Med Mushrooms 2012; 14:241-56.

7. Song TY, Yen GC.Antioxidant properties of Antrodia

camphorata in submerged culture. J Agric Food Chem 2002;

50:3322-7.

8. Yang HL, Hseu YC, Chen JY et al. Antrodia camphorata

in submerged culture protects low density lipoproteins

against oxidative modification. Am J Chin Med 2006;

34:217-31.

9. Kuo MC, Chang CY, Cheng TL et al.Immunomodulatory

effect of Antrodia camphorata mycelia and culture

filtrate. J Ethnopharmacol 2008; 120:196-203.

10. Lu ZM, Tao WY, Xu HY et al. Further studies on the

hepatoprotective effect of Antrodia camphorata in sub-

mergedculture on ethanol-induced acute liver injury in

rats. Nat Prod Res 2011; 25:684-95.

11. 行政院衛生署藥物食品檢驗局。健康食品安全性評

估方法。衛署食字第 88037803號公告，1999。行政

院衛生署，台灣。

12. Ames BN, Mccann J, Yamasaki E. Methods for detecting

carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian-

microsome mutagenicity test. Mutat Res 1975; 31:347-64.

13. McCann J, Choi E, Yamasaki E et al. Detection of

carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome

test: assay of 300 chemicals. Proc Natl Acad Sci U S

A 1975; 72:5135-9.

14. Mortelmans K, Zeiger E. The Ames Salmonella/microsome

mutagenicity assay. Mutat Res 2000; 455:29-60

Genotoxicity Tests for Freeze-Dried Antrodia cinnamomea MyceliumCulture (Antro-Gem)

Yi-Jen Chiu1, Mun-Kit Nam2, Yueh-Ting Tsai2, Chun-Chi Huang1

1 New Bellus Enterprises Co. Ltd, Tainan, 2 Super laboratory Co. Ltd., New Taipei City, Taiwan

Abstract

Antrodia cinnamomea is an endemic fungal

species of Taiwan containing multiple active com-

pounds such as triterpenoids, polysaccharides, and

adenosines. Given the rarity of wild species and

its well-known medicinal value, the fungal culture

products are more and more commonly available

in market. The current study is set out to investigate

the genotoxicity or mutagenicity of freeze-dried

Antrodia cinnamomea mycelium culture (Antro-

Gem). We have carried out bacterial reverse

mutation assay, in vitro chromosome aberration

assay, and mouse peripheral blood micronucleus

test. The results consistently indicate that the fre-

quency of mutations induced by the substance is

as little as that induced by negative controls, and

significantly lower than that evoked by positive

controls. Taken together, we conclude that Antro-

Gem carries no mutagenicity, fulfilling the safety

requirement by Taiwan Food and Drug Adminis-

tration.

Key words: Antrodia cinnamomea; freeze-driedmycelium culture; genotoxicity test;chromosome aberration; micronucleustest.

145


「樟芝元 Antro-Gem」之 28 天重複劑量亞急性毒性評估

邱怡禎 1 藍文傑 2 蔡岳廷 2 黃俊智 1*

麗豐實業股份有限公司，台南市 1；台美檢驗科技有限公司，新北市 2，台灣

摘要

牛樟芝(Antrodia cinnamomea)是寄生於牛樟木腐朽樹幹的藥用真菌，早期由原住民發現其具有提神、保

肝作用，近年來其醫療功效已獲得學界研究證實，具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等功能，市場的需求量於是

以倍速成長。但樟芝與相關產品來源複雜、鑑定不易，為確保食用樟芝相關產品的安全性，科學化、系統化

的毒理檢查有其必要性。本研究測試麗豐實業股份有限公司製造的牛樟芝發酵液凍乾粉「樟芝元 Antro-Gem」

之 28天餵食毒性，以對照組或 2,000、3,000、4,000 mg/kg B.W.劑量餵食每組 20隻、雌雄各半的 Sprague-

Dawley大鼠，觀察其亞急性毒性反應。試驗結果顯示，80隻大鼠全數存活，各劑量組的大鼠體重、攝食量、

血液、血清生化檢查、尿液檢查皆無異常，試驗結束後的病理解剖也與對照組沒有明顯差異；組織病理切片

檢查在心臟、腎臟、與雄鼠睪丸發現有極少數非特異性病變，但統計結果顯示這些病變與試驗物質並沒有正

相關性。綜合以上研究，我們發現餵食「樟芝元 Antro-Gem」沒有造成大鼠的任何中毒現象，而其無毒性顯

示劑量(No-Observed-Adverse-Effect Level, NOAEL)大於 4,000 mg/kg/day，為人體建議攝取量(2/60 kg/day)之

120倍，因此「樟芝元 Antro-Gem」是安全的膳食補充劑或營養食補(nutraceuticals)。

關鍵字：牛樟芝、凍乾菌絲體粉、亞急性毒性評估

前言

牛樟芝(Antrodia cinnamomea)富含多醣

體、類三萜化合物、腺苷等機能性成分[1,2]，

研究發現它具有護肝、抗癌、抗發炎等功能

[3-6]，其醫療用途與保健功能因此受到醫學界

與大眾的廣泛重視。由於野生牛樟芝生長緩

慢、所寄生的牛樟樹又為台灣特有保育類樹

木，因此開採野生牛樟芝不但無法供應龐大

需求，也嚴重破壞牛樟的自然生態。有賴於

近年微生物與分子生物科技的進步，牛樟芝

的人工培養技術漸趨成熟，經過嚴謹的菌種

鑑定、純化、到培育條件的佳化，人工培

養的樟芝不但有品質穩定、無雜菌污染的優

點，其活性成分與生理機能也漸漸獲得證實

[7-10]。

麗豐實業股份有限公司研發中心以深層

液態發酵的方式，進行牛樟芝的液態培養。

由於菇菌的生長受培育方式與培養基成分的

影響，菇菌發酵液所含成分也隨之變化，為

確保此培育方式產出的樟芝發酵液不含有毒

性，本研究的目的即在於評估食用樟芝發酵

液凍乾粉是否具有短期慢性毒性。傳統醫學

將牛樟芝定義為健康食品，因此本試驗依據

1999年公告的「健康食品安全性評估方法」[11]，以牛樟芝發酵液凍乾粉餵食大鼠 28天的

試驗，觀察大鼠是否有任何臨床症狀、或血

液、血清生化數值、尿液及組織病理的變化，

評估試驗物質經重覆給予 28天後對哺乳類動

物可能產生之毒性影響，了解毒性變化之產

*通訊地址：麗豐實業股份有限公司

72042台南市官田區二鎮里工業路 48號

電話：886-6-6989025

Email：[email protected]


146

生，同時初步估計大無毒性顯示之劑量(no-

observed-adverse-effect level, NOAEL)。

材料與方法

試驗物質

「樟芝元」膠囊(由麗豐實業股份有限公

司所製造)內含的橘黃色粉末為本試驗的待測

物質。試驗期間，每天秤取此物質粉末，以

逆滲透水溶之，攪拌均勻後配製成濃度 100，

150，及 200 mg/mL 之懸浮液，此溶液限於

當天使用。根據廠商建議，人體每日建議口

服量為 2 g/60 kg B.W.，因此本試驗共設置 4

組，分別為對照組、低、中及高劑量組，劑

量組之投予量為 2,000、3,000及 4,000 mg/

kg B.W.，分別為每日建議用量之 60、90、

及 120倍。

實驗動物

Sprague-Dawley (SD)品系大鼠（樂斯科

生物科技股份有限公司）共計雄性 40隻、雌

性 40隻，試驗開始為 8~9週齡，飼養於國立

陽明大學實驗動物中心。飼養環境為 22 ± 3°

C、相對濕度 40~70%、照明 12小時、換氣

頻率每小時 10-15次的動物房。飼養於高溫

高壓滅菌之塑膠製飼育籠，每籠兩隻、雌雄

分開飼養。飼料為 Laboratory Autoclavable

Rodent Diet 5010 (PMI Nutrition International,

U.S.A.)。每隻動物以打耳號方式進行標記，

而飼育籠以牌卡標示，分別記載室號、籠號、

品系、性別、試驗編號、試驗名稱及試驗期

間。

試驗物質的投予是以塑膠針筒套上餵食

針之方式進行管餵，每日管餵總體積為 20

mL/kg。

檢測項目

試驗期間每日進行臨床觀察，並記錄是

否顯現異常臨床症狀或死亡情形。在試驗前、

與試驗期間每周量測一次大鼠體重。攝食量

以每週定量給予的飼料消耗量決定、每週結

算一次。眼睛檢查在試驗前、與試驗結束前

一日進行，觀察眼睛外觀是否異常、並用檢

眼鏡(Ophthalmoscope)檢查眼睛內部構造。

試驗結束前一日收集動物的尿液，利用半定

量生化驗尿系統分析儀(Urisys 2400, Roche)

分析物理性質與生化指標。動物經隔夜進食

後，試驗結束當天以二氧化碳麻醉後經心臟

進行血液採樣，繼而行安樂死。採樣的一部

分血液置於含有EDTA抗凝血管中混合均勻，

以自動血液分析儀(Gen.STM, Beckman, USA)

進行檢測。另外一部分血液樣品則靜置於室

溫待其凝固後，離心分離血清、並以血清生

化儀(LX-20, Beckman, USA)進行檢測。

在對安樂死的試驗動物進行屍體解剖時，

以肉眼觀察外觀與體內所有器官組織，繼而

採取腦、心臟、腎臟、肝臟、脾臟、腎上腺、

睪丸或卵巢等組織，保存於 10%中性福馬林

緩衝固定液，其中睪丸先以modified Davidson’

s solution 固定 24小時、再用 10%福馬林液

保存。在去除各個主要臟器的周邊脂肪組織

後，分別秤重、記錄其絕對重量、並計算臟

器相對重量比率(%)（臟器重量/體重x100）。

組織病理學檢查只針對對照組與高劑量

組大鼠共 40隻。將以福馬林溶液固定之腎上

腺、腦、心臟、腎臟、肝臟、脾臟、睪丸或

卵巢組織，經脫水、澄清、石蠟浸潤及包埋

程序，製成石蠟組織塊，再以石蠟組織切片

機(Leica RM2145, Nussloch, Germany)切成

5 m厚度之組織切片。切片以 Hematoxylin

& Eosin 染色，於光學顯微鏡(Opticphot-2,

Nikon, Tokyo, Japan)下觀察各臟器之組織病

理變化。

數據分析

實驗數據以平均值(mean)及標準差(stan-

dard deviation, S.D.)表示。動物之體重、攝


147

食量、臟器重量、血液學分析及血清生化分

析等數據，皆利用 SPSS 生物統計軟體中單

因子變異數分析(one-way ANOVA)之Duncan

檢定法分析各組別間數據之差異性，以p<0.05

做為顯著性差異之標準。

結果

臨床觀察

試驗期間，對照組與劑量組大鼠全部存

活至試驗結束，每日由獸醫師對所有大鼠進

行 2次臨床症狀觀察，結果顯示大鼠皆未出

現任何異常之臨床症狀。

體重與攝食量

各組雄鼠與雌鼠平均體重如圖 1所示。

試驗結果顯示，與對照組相比，各劑量組大

鼠體重並無顯著性差異(p>0.05)，顯示試驗

物質不影響大鼠的正常增重。同時，由飼料

的消耗量（每籠每週）來觀察，劑量組與對

照組的大鼠攝食量也無顯著性差異（p>0.05，

圖 2）。

臨床病理檢驗

試驗動物的眼睛由獸醫師肉眼與使用檢

眼鏡檢查，比較投予試驗物質前及試驗結束

時，並未發現任何異常。在試驗結束時，解

剖並以肉眼觀察安樂死的大鼠，發現各劑量

組與對照組大鼠之心、肺、肝、腎、消化道、

脾臟、腦、及生殖系統等組織器官，皆無與

試驗物質有關之肉眼病變。

試驗結束後，試驗動物的主要臟器包括

腦、肝、腎、脾、心、腎上腺、睪丸或卵巢

皆取出秤重，其絕對重量如表 1所示。除了

低劑量組雄鼠脾臟重量顯著低於對照組外

(p<0.05)，其餘臟器各劑量組與對照組相比

較皆無顯著性差異(p>0.05)。

尿液在試驗結束前一日收集，以顯微鏡

觀察尿沈渣，並進行尿液常規檢查。結果顯

示大鼠尿液中之上皮細胞數(EP)、紅血球數

(RBC)、白血球數(WBC)及尿結晶，在對照

組和各劑量組之間並無明顯差異（表 2）。

進一步檢驗尿液之顏色、澄清度、酸鹼值與

比重，與尿液中之蛋白質、葡萄糖、酮類

(ketones)、膽紅素(bilirubin)、尿膽素原(ur-

ibilinogen)、亞硝酸鹽 (nitrite)、與尿潛血

(occult blood)等含量，也發現對照組和各劑

量組相比並無明顯差異（表 3）。

在試驗結束之時收集的血液樣本，檢驗

其血球容積比(hematocrit)、血紅素量(hemo-

globin)、紅血球數(RBC)、白血球數(WBC)、

血小板數(platelet count)、平均紅血球容積

(mean corpuscular volume, MCV)、平均紅

圖 1. 亞急性毒性測試之受試動物體重變化。以

試驗物質餵食大鼠 28 天期間，所有大鼠均能正常

增重。所有數據均以 Mean ± S.D. 表示，n=10。


148

血球血紅素 (mean corpuscular hemoglobin,

MCH)、平均紅血球血紅素濃度(mean corpus-

cular hemoglobin concentration, MCHC)、淋

巴球(lymphocyte)、嗜中性球(neutrophil)、

單核球(monocyte)、網織球數目(reticulocyte)

與凝血原時間(prothrombin time)。檢測結果

如表 4所示，我們發現雄鼠的紅血球數在中、

高劑量組與對照組比較呈顯著性下降

(p<0.05)，凝血原時間在三個劑量組也顯著

比對照組低(p<0.05)，而雌鼠的網織球數目

圖 2. 亞急性毒性測試之受試動物攝食量。以每週每籠飼料消耗量為記錄，與對照組相比較，

餵食試驗物質並沒有顯著改變大鼠的攝食量。所有數據均以 Mean ± S.D. 表示，n=5（共五個

飼育籠，每籠兩隻大鼠）。

表 1. 主要臟器相對體重比值

雄鼠試驗劑量(mg/kg) 雌鼠試驗劑量(mg/kg)

0 2,000 3,000 4,000 0 2,000 3,000 4,000

臟器臟器相對體重比值(%)

睪丸/卵巢 0.082±0.07 0.86±0.09 0.87±0.10 0.84±0.07 0.038±0.004 0.034±0.005 0.037±0.007 0.035±0.007

脾臟 0.20±0.03 0.17±0.02 0.19±0.03 0.20±0.03 0.20±0.02 0.21±0.03 0.21±0.03 0.21±0.03

腎臟 0.84±0.05 0.84±0.07 0.83±0.05 0.83±0.04 0.90±0.05 0.88±0.08 0.94±0.08 0.91±0.06

腎上腺 0.017±0.003 0.015±0.003 0016±0.002 0.017±0.003 0.031±0.004 0.028±0.005 0.033±0.005 0.029±0.003

肝臟 3.22±0.21 3.30±0.16 3.20±0.21 3.27±0.19 3.53±0.22 3.38±0.21 3.68±0.24 3.59±0.23

心臟 0.38±0.06 0.38±0.03 0.37±0.02 0.36±0.03 0.39±0.03 0.39±0.03 0.41±0.04 0.4000±0.02

腦 0.52±0.04 0.52±0.03 0.53±0.04 0.52±0.03 0.73±0.04 0.74±0.05 0.75±0.04 0.75±0.04

表 2. 尿沉渣檢驗異常紀錄

試驗劑量(mg/kg)

0 2,000 3,000 4,000

項目異常狀況說明尿液檢查異常數目（雄鼠/雌鼠）

紅血球數 >1 (hpf)* 0/0 0/0 1/0 0/1

白血球數 >1 (hpf) 2/0 0/2 1/0 0/1

上皮細胞數 >1 (hpf) 0/0 0/0 0/0 0/2

尿結晶三磷酸鹽結晶 5/2 4/5 7/3 8/5

*Hpf，高倍視野(high power field)。


149

在中、高劑量組比對照組顯著減少(p<0.05)。

然而，雖然與對照組相比有顯著性差異，這

些項目的平均值仍落在參考範圍內[12]，因此

可推測這並非試驗物質所引發的毒性反應。

除此以外，其餘項目各劑量組與對照組間皆

無發現明顯差異。

另外，受試動物的血清也被分離並進行

生化檢測（表 5），包括鹼性磷酸酶(alkaline

phosphatase，ALP)、麩胺酸草醯乙酸轉胺酶

(aspartate aminotransferase，AST)、麩胺酸

丙酮酸轉胺酶 (alanine aminotransferase，

ALT)、麩胺醯轉移酶-( -glutamyltranspep-

表 3. 尿液常規檢測異常數目

試驗劑量(mg/kg)

0 2,000 3,000 4,000

項目異常狀況說明尿液檢查異常數目（雄鼠/雌鼠）

顏色琥珀色或橘色 1/0 0/0 0/0 0/0

澄清度混濁 0/0 0/0 0/0 0/0

酸鹼值 <5或>8 0/0 0/0 0/0 0/0

比重 <1.015或>1.030 5/7 6/4 4/5 3/5

蛋白質 >100 mg/dL 1/0 4/1 2/0 0/0

葡萄糖微量 0/0 0/1 0/0 0/0

酮類陽性 0/0 0/1 0/0 0/0

膽紅素陽性 0/0 0/0 0/0 0/0

尿膽素原 >1.0 mg/dL 0/0 0/0 1/0 0/1

亞硝酸鹽陽性 0/0 0/0 0/0 0/0

尿潛血輕度(1+)以上 0/0 0/0 2/0 0/0

表 4. 餵食大鼠 28天亞急性毒性之血液學分析


項目 0 2,000 3,000 4,000 0 2,000 3,000 4,000

WBC (103/ L) 11.9±4.1 11.5±4.7 13.5±4.8 11.6±4.9 9.0±2.21 0.4±2.8 9.1±2.2 9.4±3.5

RBC (106/ L) 8.6±0.2 8.5±0.4 8.3±0.4# 8.2±0.4# 8.4±0.3 8.2±0.3 8.3±0.5 8.2±0.3

Hemoglobin (g/dL) 16.6±0.8 16.2±0.6 16.0±0.5 15.9±0.6 16.4±0.4 16.2±0.5 16.1±0.6 16.0±0.6

Hematocrit (%) 51.8±2.1 50.7±2.1 50.0±1.4 49.9±1.7 51.0±1.1 50.1±1.4 50.0±1.8 49.8±1.6

MCV* (fL) 59.9±1.5 59.7±1.4 60.6±1.7 60.7±2.4 60.6±1.6 61.2±1.5 60.7±1.8 60.7±1.0

MCH* (pg) 19.1±0.6 19.2±0.6 19.4±0.5 19.3±0.7 19.5±0.5 19.8±0.5 19.5±0.5 19.6±0.3

MCHC* (g/dL) 32.0±0.3 32.1±0.4 32.0±0.5 31.8±0.4 32.1±0.4 32.3±0.4 32.2±0.6 32.2±0.4

Platelet (103/ L) 752.4±141.3 763.8±116.3 796.9±99.5 715.4±184.3 875.3±168.5 883.2±96.9 916.3±111.6 926.5±136.9

Neutrophil (%) 14.0±3.9 15.4±4.9 14.2±4.0 13.6±3.2 10.5±3.5 12.1±6.0 10.7±1.3 11.6±2.3

Lymphocyte (%) 80.4±4.7 77.8±5.2 80.8±5.2 81.4±4.2 83.6±4.4 81.9±7.7 83.5±2.5 82.1±3.5

Monocyte (%) 4.4±1.5 5.5±1.6 4.0±1.3 3.6±1.1 4.6±1.8 4.7±1.8 4.6±1.8 5.0±1.3

Eosinophil (%) 1.0±0.2 1.1±0.6 0.8±0.2 1.1±0.3 1.0±0.3 1.1±0.3 1.0±0.3 1.1±0.3

Basophil (%) 0.2±0.1 0.3±0.1 0.2±0.1 0.3±0.2 0.4±0.2 0.3±0.1 0.3±0.2 0.3±0.1

Reticulocyte (%) 2.6±1.1 2.6±0.6 2.1±1.0 2.3±1.0 2.6±0.9 2.5±0.7 2.0±0.3# 1.9±0.5#

PT* (sec.) 13.2±1.5 11.0±0.4# 11.1±0.5# 11.4±1.8# 10.4±0.9 10.3±0.3 10.1±0.11 0.1±0.3

所有數據均以Mean ± S.D. 表示，n=10。*縮寫：MCV, Mean corpuscular volume; MCH, Mean corpuscular hemoglobin; MCHC, Mean corpuscular hemoglobinconcentration: PT, prothrombin time。#與對照組(0 mg/kg)比較具有顯著性差異(p<0.05)。


150

tidase， -GT)、白蛋白(albumin)、血總蛋白

質(total protein)、總膽紅素(total bilirubin)、

肌酸酐(creatinine)、血中尿素氮(blood urea

nitrogen，BUN)、葡萄糖(glucose)、膽固醇

(cholesterol)、三酸甘油酯(triglyceride)、磷

離子 (phosphorus)、鈣離子 (calcium)、氯離

子(chloride)、鉀離子(potassium)及鈉離子(so-

dium)。檢測結果顯示，各劑量組雄鼠或雌鼠

與對照組相比較皆無顯著性差異(p>0.05)。

組織病理檢驗

試驗結束後由對照組與高劑量組的受試

動物採取主要臟器做組織病理檢驗，其組織

切片以H&E染色後的結果如圖 3所示。我們

發現其腦、心臟、腎臟、腎上腺、肝臟、脾

臟、睪丸或卵巢均無明顯與試驗物質有關之

組織病理變化（圖 3），惟有少數非特異性

組織病理變化案例（圖 4）。對照組有一隻

雄鼠的心臟出現局部、極微、單核炎症細胞

浸潤（focal mononuclear cell infiltration，

圖 4A），發生率 1/10。此外，腎臟組織切片

顯示，對照組有一隻雄鼠出現局部、微小、

腎小管圓柱體（focal tubular cast，圖 4B），

發生率 1/10；對照組及高劑量組雄鼠有局部、

極微、腎小管囊腔形成（focal tubular cyst，

圖 4C），發生率各為 1/10；對照組與劑量組

雌鼠的腎臟皮質與髓質部出現局部、極微至

中度、腎小管內礦物質沉積（focal tubular

mineralization，圖 4D），發生率分別為 6/10

與 9/10；對照組與劑量組雌鼠出現局部、極

微、腎小管再生（focal tubular regeneration，

圖 4E），發生率各為 3/10與 5/10。後，

在生殖系統切片顯示，僅高劑量組一隻雄鼠

睪丸出現局部、中度、生精小管變性及壞死

（focal seminiferous tubular degeneration and

necrosis，圖 4F），發生率為 1/10。總結來

說，以上非特異性病理變化皆為少數案例，

統計結果顯示，對照組與高劑量組間並沒有

試驗物質與病變的正相關性。

討論

本試驗探討牛樟芝發酵液凍乾粉「樟芝

表 5. 餵食大鼠 28天亞急性毒性之血清生化分析


項目 0 2,000 3,000 4,000 0 2,000 3,000 4,000

AST (U/L) 132.0±23.5 152.7±60.8

ALT (U/L) 42.2±6.6 45.6±7.5

ALP (U/L) 146.4±22.8 144.2±28.3

T. bilirubin ( g/dL) 21.7±10.4 31.2±13.8

T. protein (g/dL) 6.6±0.2 6.6±0.3

Albumin (g/dL) 4.2±0.2 4.3±0.2

Globulin (g/dL) 2.3±0.1 2.3±0.1

BUN (mg/dL) 13.7±1.5 14.2±1.6

Creatinine (mg/dL) 0.44±0.06 0.44±0.06

Glucose (mg/dL) 178.1±37.5 184.0±29.3

Triglyceride (mg/dL) 36.5±11.4 35.9±6.6

Cholesterol (mg/dL) 55.5±9.2 57.1±14.0

Sodium (meq/L) 149.9±3.1 150.1±1.3

Potassium (meq/L) 7.3±0.6 6.9±0.5

Calcium (mg/dL) 11.8±0.4 11.8±0.3

136.8±25.1 160.9±63.3 145.0±100.7 119.8±19.3 110.7±17.7 104.3±16.0

45.4±9.4 49.8±15.4 36.3±7.7 35.2±5.8 34.5±6.6 33.2±3.4

148.9±27.6 150.8±42.4 85.9±26.5 87.7±21.2 91.4±19.2 82.1±17.1

36.5±12.6 31.5±12.4 63.6±16.9 66.4±12.5 67.4±15.0 63.2±13.8

6.4±0.2 6.5±0.2 7.1±0.2 7.1±0.3 7.2±0.3 7.2±0.4

4.2±0.2 4.1±0.1 4.6±0.2 4.6±0.2 4.7±0.2 4.7±0.3

2.3±0.1 2.3±0.1 2.5±0.1 2.5±0.1 2.5±0.2 2.5±0.2

14.6±0.6 14.9±1.7 15.4±3.6 15.1±1.9 16.3±3.1 15.4±3.0

0.46±0.05 0.44±0.07 0.39±0.04 0.36±0.07 0.40±0.05 0.38±0.05

167.5±24.9 163.8±46.8 145.9±22.3 153.7±29.2 148.3±29.3 164.0±34.3

35.6±6.0 33.7±7.4 44.3±5.5 46.3±5.9 44.0±5.2 47.6±12.0

55.6±11.0 58.0±10.6 84.8±15.1 84.6±11.6 86.1±12.5 96.8±19.3

150.4±2.0 150.3±4.4 148.2±1.4 148.1±1.2 148.4±1.0 147.9±1.4

7.2±0.6 7.5±0.8 7.4±0.7 7.6±0.4 7.0±0.5 7.3±0.7

11.6±0.4 11.5±0.3 11.9±0.3 12.1±0.3 11.9±0.3 12.0±0.4

Chloride (meq/L) 104.9±8.4 100.2±1.1 101.0±3.5 100.4±6.9 102.4±1.6 102.4±2.0 100.5±2.4 101.6±1.6

Phosphorus (mg/dL) 13.2±1.2 13.2±1.1 13.2±1.7 13.5±1.8 11.5±0.8 11.8±0.7 11.0±0.9 10.8±0.9

所有數據均以Mean ± S.D. 表示，n=10。


151

圖 3. 亞急性毒性測試之受試動物對大鼠臟器無明顯組織病理學變化。圖為對照組或高劑量組

的各組織切片以 Hemotoxylin & Eosin 染色做觀察(400 x)。

A B

C D

E F

圖 4. 亞急性毒性測試中少數非特異性之組織病理變化：(A)心臟局部、極微、單核炎症細胞

浸潤：(B)腎臟皮質部局部、極微、腎小管圓柱體及(C)局部、輕微、腎小管囊腔；(D)皮質與

髓質部局部、極微至中度、腎小管內礦物質沉積及(E)局部、極微、腎小管再生: (F)睪丸局部、

中度、生精小管變性及壞死。圖為以 Hemotoxylin & Eosin 染色的組織切片(400 x)。


152

元 Antro-Gem」之食用安全性，依據 1999年

公告的「健康食品安全性評估方法」，使用

同數量的雄、雌嚙齒類動物，以對照組或

2,000、3,000及 4,000 mg/kg B.W.劑量連續

餵食 28天，試驗期間每天臨床觀察動物至少

兩次，每週測量體重與攝食量，試驗結束後

為受試動物進行安樂死，並做臨床病理檢驗

與組織病理檢驗。試驗結果顯示，麗豐實業

所生產的「樟芝元 Antro-Gem」對受試動物

的增重、食物消耗量沒有影響，臨床觀察沒

有任何異於對照組的異常狀況，血液分析、

血清生化分析、尿液分析、病理解剖也無異

常。

在以病理組織切片染色觀察時，我們發

現幾個病變的案例，但其病變程度及發生率

與試驗物質並沒有正相關性，為非特異性病

變。部分鼠隻腎小管有局部輕微的腎小管再

生與礦物質沉積，可能為腎鈣化(nephrocal-

cinosis，或 renal mineralization，phosphate

crystal in tubules)的初期現象。腎鈣化的成

因複雜，有學者認為跟大鼠飼料中的磷(phos-

phorus)和鈣(calcium)含量、鈣磷比率小於 1.0

(Ca:P)、缺少鎂、缺少氯、或尿液的高pH值

有關[13]。另一文獻則指出，雌性的 Sprague-

Dawley, Wistar, F344等品種的大鼠發生腎鈣

化的比例明顯比雄性同品種的大鼠高，因此

雌性荷爾蒙可能也是促成腎鈣化的一個重要

因素[14]。本研究發現的腎小管再生與礦物質

堆積全部都在雌鼠的組織切片內，與文獻報

導的結果一致，而且在對照組與高劑量組無

明顯差異，顯示此病理現象應與試驗物質無

關。另外，對照組一隻雄鼠睪丸出現局部生

精小管變性及壞死，為先天性隱睪現象。綜

合以上實驗結果，麗豐實業所製造之「樟芝

元 Antro-Gem」對大鼠 28天重複劑量亞急性

毒性試驗之無毒性顯示劑量為大於 4,000 mg/

kg/day，為人體建議攝取量(2 g/60 kg/day)之

120倍，可視為安全的膳食補充或營養食補

來源。

參考文獻

1. Cherng IH, Chiang HC, Cheng MC et al. Three new tri-

terpenoids from Antrodia cinnamomea. J Natural Products

1995; 58:365-71

2. Lu MK, Cheng JJ, Lai WL et al. Adenosine as an active

component of Antrodia cinnamomea that prevents rat

PC12 cells from serum deprivation-induced apoptosis

through the activation of adenosine A(2A) receptors.

Life Sci 2006; 79:252-8.

3. Wen CL, Chang CC, Huang SS et al. Anti-inflammatory

effects of methanol extract of Antrodia cinnamomea

mycelia both in vitro and in vivo. J Ethnopharmacol 2011;

137:575-84.

4. Wu MT, Tzang BS, Chang YY et al. Effects of Antrodia

camphorata on alcohol clearance and antifibrosis in

livers of rats continuously fed alcohol. J Agric Food

Chem 2011; 59:4248-54.

5. Yang HL, Kuo YH, Tsai CT et al. Anti-metastatic

activities of Antrodia camphorata against human breast

cancer cells mediated through suppression of the MAPK

signaling pathway. Food Chem Toxicol 2011; 49:290-8.

6. Yue PY, Wong YY, Chan TY et al. Review of biological

and pharmacological activities of the endemic Taiwanese

bitter medicinal mushroom, Antrodia camphorata (M.

Zang et C. H. Su) Sh. H. Wu et al. (higher Basidiomycetes).

Int J Med Mushrooms 2012; 14:241-56.

7. Song TY, Yen GC.Antioxidant properties of Antrodia

camphorata in submerged culture. J Agric Food Chem 2002;

50:3322-7.

8. Yang HL, Hseu YC, Chen JY et al. Antrodia camphorata

in submerged culture protects low density lipoproteins

against oxidative modification. Am J Chin Med 2006;

34:217-31.

9. Kuo MC, Chang CY, Cheng TL et al.Immunomodulatory

effect of Antrodia camphorata mycelia and culture

filtrate. J Ethnopharmacol 2008; 120:196-203.

10. Lu ZM, Tao WY, Xu HY et al. Further studies on the

hepatoprotective effect of Antrodia camphorata in sub-

mergedculture on ethanol-induced acute liver injury in

rats. Nat Prod Res 2011; 25:684-95.

11. 行政院衛生署藥物食品檢驗局。健康食品安全性評

估方法。衛署食字第 88037803號公告，1999。行政

院衛生署，台灣。

12. Levine B.S. Animal Clinical Pathology. Handbook of

Toxicology, 2nd edition, 2001; 741-68. CRC Press LLC,


153

Florida, USA.

13. Rao, G.N. Diet and kidney diseases in rats. Toxicol

Pathol 2002; 30:651-6

14. National Research Council, Committee on Animal

Nutrition. Nutrient requirements of the laboratory rat.

Nutrient Requirements of Laboratory Animals. National

Academy Press, Washington, DC. 1995:27-38.

Subacute Oral Toxicity Assessment in Rats for Freeze-Dried Antrodiacinnamomea Mycelium Culture “Antro-Gem”

Yi-Jen Chiu1, Mun-Kit Nam2, Yueh-Ting Tsai2, Chun-Chi Huang1

1 New Bellus Enterprises Co. Ltd, Tainan, 2 Super laboratory Co. Ltd, New Taipei City, Taiwan

Abstract

Antrodia cinnamomea is an endemic fungal

species of Taiwan; the rare mushrooms have

been deemed as a multi-functional nutraceutical

by aborigines. With recent advances in microbial

technology, the fungal culture products of high

consistency and quality are commonly available

in market as substitutes of wild mushrooms.

The current study is set out to assess repeated

dose 28-day oral toxicity of Antro-Gem, the

freeze-dried Antrodia cinnamomea mycelium

culture provided by the New Bellus. Forty male

and forty female rats were divided into 4 groups,

including a control group and 2,000, 3,000,

4,000 mg/kg/day groups. We have carried out

daily clinical observations, as well as weekly

body weight and feed consumption measurement.

Animals have been sacrificed after 28 days,

and investigations on hematology, biochemistry,

electrolyte, urine, and histopathology have been

performed. The results indicate that all tested

parameters are comparable to their respective

control groups with no Antro-Gem-related

toxicity. The No-Observed-Adverse-Effect Level

is above 4,000 mg/kg/day, which is 120 times

over the suggested daily usage for human.

Therefore, our study suggests that freeze-dried

Antrodia cinnamomea mycelium culture manu-

factured by the New Bellus is safe to use as dietary

supplements or nutraceuticals.

Key words: Antrodia cinnamomea; freeze-dried

mycelium culture; subacute oral

toxicity assessment.

154


評估口服不同乳酸菌株產品對於降低沙門氏菌侵入肉雞

及其引發之發炎反應

陳志遠 1 林峻立 2 莊笠岑 2 曾浩洋 2* 陳錦樹 1#

國立中興大學食品暨應用生物科技系 1；弘光科技大學食品科技系，台中市 2，台灣

摘要

利用益生菌作為動物保健之訴求之飼料添加產品功能性日益增加，因此有效的產品評估方法愈顯示

其重要性。本研究以家禽動物試驗進行乳酸菌產品抑制沙門氏菌侵入及發炎，。探討雞隻對抗沙門氏菌侵入

及發炎的影響。一日齡雞隻口服餵食四株乳酸菌(Lactobacillus acidophilius LA01、L. plantarum LPL01、L.

fermentum LF03和 Enterococcus spp. EF03)第 1天到第 3天後，於第 4天感染沙門氏菌。感染後第 3天及第 6

天犧牲取其肝臟、脾臟、盲腸內容物及盲腸扁桃體並測定沙門氏菌數。另一方面使用即時定量聚合酶鏈鎖反

應(real-time quantitative PCR, RT-Q PCR)測定雞隻盲腸扁桃體中促發炎細胞激素(IL-1 、IL-6及 IFN- ) 和抗發

炎細胞激素(IL-10)的表現。在抑制沙門氏菌方面，所使用之乳酸菌株皆能抵抗沙門氏菌侵入約 1~2 log CFU/

g 器官值左右。在抗發炎結果中發現口服乳酸菌之處理組與沙門氏菌感染組相比較，在感染後三天其促發炎

細胞激素皆有較低的水平(p<0.05)。這些結果顯示以上述四株乳酸菌株能有效的抵抗沙門氏侵入在雞隻之臟

器、盲腸的定殖及維持腸道中的免疫平衡。本研究結果可提供相關產業及檢驗之參考。

關鍵字：乳酸菌、肉雞、沙門氏菌、發炎

前言

由於抗生素對抗病原菌之普遍化，近年

來也使各個畜牧業者及具相關管理機構紛紛

建議的降低或禁止抗生素之使用。也因此，

利用益生菌作為飼育動物保健之訴求之飼料

添加產品功能性日益增加，因此在有效的產

品評估方法愈為重要，本研究以實際之家禽

動物試驗進行抑制沙門氏菌侵入及發炎，以

提供相關產業及檢驗之參考。家禽沙門氏菌

症(Avian salmonellosis)中 S. typhimurium和

S. enteritidis造成之感染會造成家禽的下痢，

甚至死亡。其中S. typhimurium和S. enteritidis

為一重要的人畜共通傳染病，在美國，據估

計每年感染沙門氏菌約 140萬人、包括治療

及生產力的損失約 30億美元 (World Health

Organization, 2006)。每年光是家禽類沙門氏

菌的損失就約 966 萬美元[1]。

歐盟在 2006年一月全面禁止抗生素使用

至動物飼料中[2]。國內農政單位，亦將逐漸

降低禽畜飼料中抗生素之使用，所以尋找抗

生素的替代品是目前一個重要的議題[3-4]。益

生菌改善家禽生長表現的作用機制包括以競

爭排除或對抗之方式維持腸道正常菌相、改

變動物代謝、增加消化酵素活性或減少有害

微生物產生之酵素、降低氨的產生、增加動

*通訊作者：曾浩洋博士；43302台中市台灣大道六段 1018

號弘光科技大學食品科技系

Fax:04-26527731, Tel: 04-26318652 ext 5080,

e-mail: hytsenunrise.hk.edu.tw#共同通訊作者：陳錦樹博士; 40227台中市國光路 250號

國立中興大學食品暨應用生物科技系

Fax: 886-4-2287-6211, Tel: 886-4-2284385 ext 3140

e-mail: cschenail.nchu.edu.tw

陳志遠林峻立莊笠岑曾浩洋陳錦樹 155

155

物飼糧攝取與消化或中和腸內毒素[5]。本試

驗所使用的 4株的乳酸菌是在先前的研究中

分離自不同來源的乳酸菌之菌株，以小鼠

RAW 264.7巨噬細胞產生 TNF- 之能力是在

147株中排名在前 8名之菌株[6]。本試驗將探

討 4株具有益生菌劑特性之菌株包括，3株

Lactobacillus spp.及 1株Entercoccus spp. 做

為其引發腸道發炎之功能性; 以嘉惠於國內

之家禽產業者，而本研究另一目的則係提出

對於益生菌作為飼料添加物，抗病原菌感染

之功能性評估方法，以作為相關產品之品保

及檢驗方法之參考。

材料與方法

菌株、培養基及生長條件

本實驗所使用之 4株乳酸菌包括 Lacto-

bacillus acidophilius LA01、L. plantarum

LPL01、L. fermentum LF03及 Entercoccus

spp. EF03。菌株保存在含 25 %甘油之MRS

broth，保存於-70℃。細菌活化兩次，培養

基為含 0.05% L-cysteine之Lactobacilli MRS

broth (Difco, B-D Co., USA)，培養條件為

37℃培養 24小時。

本實驗所使用之病原菌為Salmonella ty-

phimurium ST70是分離自受感染之家禽。菌

株保存在含 25%甘油之 Tryptic soy broth

(TSB) (Difco, B-D Co., USA)，保存於-70℃。

細菌活化兩次，培養基為 TSB，培養條件為

37 ℃培養 12小時。

實驗動物

本實驗是以 1日齡雞隻進行實驗，品系

為愛拔益加白肉雞(Arbor Acres broiler chicks)，

購買自台中后里台一農牧場，實驗開始雞隻

之飲水及飼料採用任食方式飼養，另外所使

用的飼料為商業用之肉雞飼料其配方參考[7]，

動物實驗於標準動物房進行。

單株乳酸菌細菌製備

乳酸菌以 MRS broth 擴大培養前述之 4

株乳酸菌菌株，於 37℃、24小時培養後，以

轉速 7,000 xg，10分鐘離心收集菌體，以無

菌磷酸鹽緩衝溶液清洗兩次，去除上清液，

以無菌磷酸鹽緩衝溶液使菌體混合均勻懸浮。

實驗設計

本次試驗使用的雞隻數量為 60隻，雞隻

於 1日齡至 3日齡以口服方式分別餵食前述

LAB菌株連續三天，餵食劑量為每隻雞(200

L, 109 CFU mL-1)，4日齡時以口服攻毒 S.

typhimurium ST70，感染劑量為每隻雞(200

L, 106 CFU mL-1)。

雞隻隨意分成 6組每組 10隻小雞，分組

如下：

a. 餵食L. acidophilius LA01 加上以 4日

齡時口服攻毒S. typhimurium ST70之處理組。

b. 餵食 L. plantarum LPL01加上以 4日

齡時口服攻毒S. typhimurium ST70之處理組。

c. 餵食L. fermentum LF03加上以 4日齡

時口服攻毒S. typhimurium ST70之處理組。

d. 餵食 Entercoccus spp EF03加上以 4

日齡時口服攻毒S. typhimurium ST70之處理

組。

e. 不餵食乳酸菌，在 4日齡時口服攻毒

S. typhimurium ST70之感染組。

f. 不餵食乳酸菌亦不攻毒S. typhimurium

ST70 之空白組。

雞隻臟器中 S. typhimurium 菌分析

在 Salmonella感染後第 3日（此時小雞

為 7日齡）及第 6日（此時小雞為 10日齡），

分批將實驗組和控制組小雞以麻醉方式將小

雞犧牲，每組犧牲 5隻。於無菌操作下，取

出小雞之肝臟、脾臟及盲腸內容物，肝臟及

脾臟則立刻將分別裝入無菌鐵胃袋(stomacher

bags)，利用試管將臟器研碎，使器官之組織


156

細胞完全破碎，再加入 5 mL 之無菌磷酸鹽

緩衝溶液，混和均勻，而盲腸內容物則裝至

無菌之eppendorf tube以準備續列稀釋之用。

而肝臟及脾臟利用無菌鐵胃袋內之過濾膜濾

出澄清之細胞破碎液，分別取出 1 mL 肝臟

或脾臟之細胞破碎液，以磷酸鹽緩衝溶液進

行序列稀釋，取出 1 mL 細胞破碎稀釋液，

以傾注平板計數法於 Brilliant green agar

(Difco, B-D Co., USA)培養基培養。培養基

置於 37℃下培養 48小時後，進行菌落計數。

Total RNA 之萃取

雞隻之盲腸扁桃體(cecal tonsils)於在Sal-

monella攻毒後第 3日及第 6日將小雞犠牲時

收集取得，然後立即冰至-80℃冰箱，以便後

續之 RNA之萃取。而 total RNA之萃取方式

是以商業套組 PureLink RNA Mini Kit (In-

vitrogen Co.)之方法進行。萃取方法：

將每組雞隻之盲腸扁桃體以RNAse free

之剪刀剪取一小塊，每隻取其重量均為 30

mg，放入 RNAse free 之 eppendorf tube中，

再加入 300 L lysis buffer (prepared with 2-

mercaptoethanol)，再利用 RNase free pestle

上下扭轉直到組織溶解接著加入等量(300

L) 之 70 % 酒精 (DEPC-EtOH) 混合均勻後，

取 600 L混合液至含有矽膠的離心管柱 (min-

ispin column)上，靜置室溫 5分鐘後離心（室

溫，>10,000 rpm，15 sec），此時 total RNA

即已吸附於管柱上，再取 600 L Wash Buffer

I 加到離心管中以清洗管柱，並離心（室

溫，>12,000 rpm，15 sec.），將廢液移除

後，接著加入 500 L含有酒精的Wash Buffer

II，同樣置於管柱上，離心 15 sec.重複 2次，

主要是在去除管柱中RNA的雜質，廢液移除

後再離心一次（室溫，12000 rpm，1分鐘），

以確保完全的去除管柱中殘液體。將離心

管柱置於新的 1.5 mL微量離心管上，加入

含 RNase 的去離子水(DEPC-H2O)於離心管

柱上並離心（室溫，12000 rpm，2分鐘），

利用水分子極性回溶 total RNA，並收集於

RNase free 1.5 mL微量離心管中。

為了消除使 RNA 樣本中有 DNA 的汙

染，利用DNase I (deoxyribonuclease I)將當

中的 DNA去除，然後 RNA濃度之測定：取

2 L完全溶解之RNA，利用核酸測定儀，分

別以 260 nm 波長偵測其吸光值，並換算成

RNA濃度與純度，之後將 RNA sample保存

於-80℃冰箱備用。

反轉錄-即時聚合?ｸ鏈鎖反應(Reverse tran-

scription real-time quantitative PCR, RT-QPCR)

反轉錄反應：取 1 g 已定量好之 RNA

置於 PCR tube 中，加入 10 L 的 cDNA

synthesis Mix (With 10X buffer, 25 mM Mgcl2,

0.1 M DTT, RNaseOUT and SuperScript

III RT (Invitrogen Co.)，混合均勻後放入 PCR

machine (Applied Biosystems 2700, USA)先

進行 25℃ 10分鐘的 Oligo (dT)12-18 primer

之黏合作用，再進行 50℃ 50分鐘的 cDNA

合成作用，接下來再進行 85℃ 5分鐘終止反

應，後再加入 1 L 的 RNase H 反應 20分

鐘以去除多餘沒有作用的RNA，以合成完成

的 cDNA放入-20℃冰箱備用。

Real-time PCR為定量 internal strandard

glyceraldehyed-3-phosphate dehydrogenase

(GAPDH)及 cytokine gene之 cDNA。而PCR

反應總共體積為 20 L，包括 10 L的KAPA

FAST SYBR green I master mix (KAPA bio-

system)、1 L的cDNA與 0.25 mM的primer。

雞隻用之 cytokine gene primer sequence 顯

示在（表 1）。將反應物試管放置於ABI 7500

system real-time PCR機器中，其 PCR條件

如下：1 cycle的 95℃ 3分鐘、40 cycles的

95℃ 30秒、60℃ 30秒及 72℃ 40秒。為了

確認PCR產物是否為專一性產物使用了解離

曲線模式（1 cycle的 95℃ 10秒、60℃ 15


157

秒及 95℃ 10秒）將 PCR產物放大。而 real-

time quantitative PCR數據分析是使用Livak

和Schmittgen[8]於 2001所使用的 2-△△Ct的方

法。簡單地說每個基因mRNA的相對表現量

以 house keeping 基因 GAPDH gene 之標準

化計算使用下列的公式計算之：倍數的變

化=2Ct target (control)–Ct target (treatment)/2Ct GAPDH (control)-

Ct GAPDH (treatment)。

統計方法

將以上實驗結果經過單因子變數分析(one

way ANOVA, analysis of variance)[9]以確認

是否有顯著差異，再以鄧肯氏多變域測驗

(Duncan’s multiple range test)測定各組間之

差異顯著性，顯著性差異之判斷標準為

p<0.05，以 SPSS 17.0套裝軟體於電腦中進

行統計分析。以 SigmaPlot 10.0軟體作圖和

進行統計及標準偏差分析。

結果

本試驗使雞隻口服不同乳酸菌三天後攻

毒沙門氏菌，攻毒後第三天及第六天犧牲取

其肝臟、脾臟、盲腸內容物進行沙門氏菌檢

測。在第三天的肝臟中，LPL01組明顯的使

沙門氏菌數量降低(p<0.05)，由 4.16 log CFU/

g 降至 3.11 log CFU/g，其他組別約在 3.33

至 3.54 log CFU/g 之間（表 2），到達第六

天時，EF03組明顯的使沙門氏菌數量由 4.31

log CFU/g下降至 3.18 log CFU/g (p<0.01)，

其他組別約在 3.4至 3.73 log CFU/g之間（表

3）。在第三天的脾臟中，LF03組使沙門氏

菌量由 3.65 log CFU/g 降至 2.79 log CFU/

g，其他組別在 3.11至 3.35 log CFU/g 之間

（表 2），到第六天時，脾臟中所有組別使

沙門氏菌數量由 3.84 log CFU/g 下降至

3.15~3.53 log CFU/g之間（表 3），但在統

計上並無明顯差異(p>0.05)。在第三天的盲

腸內容物中，LA01組明顯的使沙門氏菌數

量由 8.31 log CFU/g 降至 6.15 log CFU/g

(p<0.01)，其他組別在 6.37至 7.23 log CFU/

g之間（表 2），到第六天時，LF03組和EF03

組明顯的使沙門氏菌數量由 8.64 log CFU/g

下降至 7.1及 7.25 log CFU/g (p<0.05)，而

LPL01及 LA01組別在 7.3及 7.92 log CFU/

g（表 3）。另外雞隻的肝臟、脾臟及盲腸內

容物在經過餵食不同之乳酸活菌之後於沙門

氏菌攻毒後第三天可有減少沙門氏菌之感染

率的效果（表 2），但到了沙門氏菌攻毒後

表 1、本實驗 RT-RT qPCR所使用的引子組(Primers and sequences for real-time PCR1)

Type Target cDNA2 PrimerSequence (5'– 3')GenBank

accession no.Reference

Reference GAPDH Forward GTCAGCAATGCATCGTGCA K01458 [22]

Reverse GGCATGGACAGTGGTCATAAGA

Proinflammatory IL-1 Forward GCTCTACATGTCGTGTGTGATGAG AJ245728 [21]

Reverse TGTCGATGTCCCGCATGA

IL-6 Forward GCTCGCCGGCTTCGA AJ250838 [21]

Reverse GGTAGGTCTGAAAGGCGAACAG

Th-13 IFN- Forward GCCGCACATCAAACACATATCT NM_205149 [22]

Reverse TGAGACTGGCTCCTTTTCCTT

Th-23 IL-10 Forward CATGCTGCTGGGCCTGAA AJ621614 [21]

Reverse CGTCTCCTTGATCTGCTTGATG

1The experimental conditions were as those described in Materials and Methods.2GAPDH = glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; IFN = interferon.#Dth 7 ! 3Th = T helper cell.3Th = T helper cell.


158

第六天，各乳酸菌處理組感染率並沒有明顯

的減少（表 3）。這些結果顯示此四株乳酸

菌株，皆能有效降低沙門氏菌侵入雞隻之臟

器及盲腸的定殖。

另外在沙門氏菌侵入後所引發的發炎反

應方面，本試驗使雞隻口服不同乳酸菌三天

之後，能有效的降低發炎反應如降低促發炎

細胞激素的指標 IL-1 、IL-6、IFN- （圖

1~3），以及提升抗發炎細胞激素指標 IL-10

（圖 4）等效果。首先在 IL-1 表現部分，4

組乳酸菌處理組的表現量與沙門氏菌感染組

相比皆有降低的效果，LPL01和 LF03組皆

有明顯的降低 (p<0.01)，分別為 4.66與 5.8

倍，而 LA01及 EF03兩組別降低約 2與 3.5

倍（圖 1A），到第六天時，各處理組的表現

量與沙門氏菌感染組相比明顯的降低約約 1.5

至 4.7倍（圖 1B）。IL-6表現方面，沙門氏

菌感染組的表現量與空白組相比在第三天即

有明顯的升高，LPL01和 LF03組與沙門氏

菌感染組相比較有明顯的降低約 4.4及 5.5倍

(p<0.01)，而 LA01及 EF03分別降低約 1.6

至 3.1倍（圖 2A），到第六天時，4個乳酸

菌處理組分別降低約 1.1至 2.9倍（圖 2B）。

IFN- 表現方面，在我們的研究中可以發現，

表 2、口服不同乳酸菌對於沙門氏菌侵入小雞 3天後之肝臟、脾臟及定殖在盲腸的影響 (Effectof oral administration of different lactic acid bacteria (LAB) on the reduction of Salmonella cellsrecovered from the in livers, spleens and cecal content of chicks at 3 days post-challenge)

3 Days post infection

Group Bacteria count (log10 CFU/g)

LiverNumber of

chick infectedSpleen

Number ofchick infected

Cecumcontent


Control 0.00±0.0 0/5 0.00±0.0 0/5 .00±0.0 0/5

Salmonella only 4.16±0.34a 5/5 3.65±0.49a 5/5 8.31±0.37a 5/5

LPL01 +Salmonella 3.11±0.17b 3/5 3.11±0.95a 3/5 7.23±0.23b 4/5

LF03 + Salmonella 3.45±0.21b 3/5 3.35±0.50a 3/5 6.37±0.14c 4/5

LA01+ Salmonella 3.33±0.57b 4/5 2.79±0.50a 4/5 6.15±0.21c 4/5

EF03 + Salmonella 3.54±0.33ab 4/5 3.23±0.33a 3/5 6.73±0.80c 4/5

a,b,c Different superscripts indicate significant differences between treatments (p<0.05)

表 3、口服不同乳酸菌對於沙門氏菌侵入小雞 6天後之肝臟、脾臟及定殖在盲腸的影響 (Effectof oral administration of different lactic acid bacteria (LAB) on the reduction of Salmonellacells recovered from the in livers, spleens and cecal content of chicks at 6 days post-challenge)

6 Days post infection

Group Bacteria count (log10 CFU/g)

LiverNumber of

chick infectedSpleen


Cecumcontent


Control 0.00±0.0 0/5 0.00±0.0 0/5 .00±0.0 0/5

Salmonella only 4.31±0.15a 5/5 3.84±0.21a 5/5 8.64±0.12a 5/5

LPL01 +Salmonella 3.73±1.04ab 4/5 3.33±0.04a 4/5 7.3±0.42b 5/5

LF03 + Salmonella 3.4±0.39b 5/5 3.53±0.20a 4/5 7.1±1.010b 5/5

LA01+ Salmonella 3.8±0.14ab 4/5 3.48±0.43a 4/5 7.92±0.47ab 5/5

EF03 + Salmonella 3.18±0.25b 4/5 3.15±0.77a 4/5 7.25±0.67b 5/5

a,b,c Different superscripts indicate significant differences between treatments (p<0.05)


159

LF03組的表現量與沙門氏菌組相比明顯的降

低約 6.2倍 (p<0.01)，其他組分別則降低約

1.6至 4.2倍（圖 3A），到第六天時，除了

EF03組與沙門氏菌感染組相比並無明顯差異

外(p>0.05)，其餘 3組降低約 3.5至 7.5倍（圖

3B）。另外在抗發炎細胞激素指標 IL-10方

面，在我們的研究中可以發現，在第三天時

的 LPL01和 LF03組與沙門氏菌感染組相比

明顯的提升 3.5及 4倍(p<0.05)，而 LA01及

EF03亦提升的約 1.8至 3倍（圖 4A），到第

六天時則是除了 EF03與沙門氏菌感染組相

比有明顯的提升 9.4倍外(p<0.05)，其餘 3組

A B

圖 1、定量沙門氏菌感染後第 3 天(A)及第 6 天(B)之細胞激素 IL-1 基因在雞隻盲腸扁桃體(cecaltonsil)的表現測定。實驗中組別如下：沙門氏菌感染組(Salmonella only group)：沒有經過乳酸

菌的預處理但在小雞 4 日齡時口服感染 S. typhimurium；不同乳酸菌株+沙門氏菌組(LPL01、LF03、LA01 和EF03 +Salmonella group)：小雞連續口服餵食不同乳酸菌三天，並 4 日齡時口

服感染 S. typhimurium。數據以mRNA表現 N倍的變化來呈現，N倍的基因表現變化是相對於

沒有經過任何處理的空白組進行計算之。

A B


菌的預處理但在小雞 4 日齡時口服感 S. typhimurium；不同乳酸菌株+沙門氏菌組(LPL01、LF03、LA01 和EF03 +Salmonella group)：小雞連續口服餵食不同乳酸菌三天，並 4 日齡時口

服感染 S. typhimurium。數據以 mRNA 表現 N 倍的變化來呈現，N 倍的基因表現變化是相對

於沒有經過任何處理的空白組進行計算之。


160

提升約 1.1至 3.4倍（圖 4B）。

討論

儘管全球對傳染病、病原性微生物（包

括沙門氏菌）的治療有所進步，但對於人類

和動物的健康仍然是個重大的威脅[10]。其中

S. typhimurium和S. enteritidis為一重要的人

畜共通傳染病菌，而家禽和家禽產品往往成

為人類沙門氏菌症的傳播媒介 [11-12]。自從

Nurmi 與 Rantala[13]在 1973年首次提出細菌

間會互相爭奪空間及養份的競爭排除概念後，

即有許多研究活菌[14-15]及益生菌物質[16-17]的

A B

圖 3、定量沙門氏菌感染後第 3 天(A)及第 6 天(B)之細胞激素 IFN- 基因在雞隻盲腸扁桃體(cecaltonsil)的表現測定。實驗中組別如下：沙門氏菌感染組(Salmonella only group)：沒有經過乳酸

菌的預處理但在小雞 4 日齡時口服感 S. typhimurium；不同乳酸菌株+沙門氏菌組(LPL01、LF03、LA01 和EF03 +Salmonella group)：小雞連續口服餵食不同乳酸菌三天，並 4 日齡時口

服感染 S. typhimurium。數據以 mRNA 表現 N 倍的變化來呈現，N 倍的基因表現變化是相對

於沒有經過任何處理的空白組進行計算之。

A B


菌的預處理但在小雞 4 日齡時口服感S. typhimurium；不同乳酸菌株+沙門氏菌組(LPL01、LF03、LA01 和 EF03 +Salmonella group)：小雞連續口服餵食不同乳酸菌三天，並 4 日齡時口服感

染 S. typhimurium。數據以 mRNA 表現 N 倍的變化來呈現，N 倍的基因表現變化是相對於沒

有經過任何處理的空白組進行計算之。


161

報告顯示其也能藉由胃腸道的受體結合位點

以競爭排除其他微生物的定殖。本實驗顯示，

口服不同乳酸菌三天之後，在沙門氏菌感染

後第 3天及第 6天皆能有效明顯的降低沙門

氏菌侵入雞隻之肝臟(P<0.05)，然而在脾臟

方面雖然有些微的降低但並沒有明顯的差異

(P>0.05)（表 2及表 3）。另外沙門氏菌感染

後在雞隻盲腸內容物方面，感染後第 3天時

乳酸菌處理皆能有效降低在雞隻盲腸沙門氏

菌的數量（表 2），然後到了沙門氏菌感染

後第 6天，4個乳酸菌處理組與沙門氏菌感

染組相比較時，雖然在雞隻肝臟、脾臟、盲

腸的沙門氏菌之菌數及感染率皆有明顯的增

加的趨勢（表 3），但在觀察 4組乳酸菌處

理組的雞隻之活動力及精神狀況有比沙門氏

菌感染組的雞隻較好，而在雞隻在感染沙門

氏菌第 3~6天之間，各組的雞隻有下痢的情

形，而乳酸菌處理組之雞隻下痢情況也有比

沙門氏菌感染組降低改善的效果。

發炎是抵抗沙門氏菌感染時早的反應

之一，當組織或器官受到感染時會藉由分泌

IL-1及 IL-6等促發炎細胞激素引起急性發炎

反應，進而活化 T細胞與 B細胞。然而當這

些細胞激素反應過度時會導致相關組織和器

官的功能失常。另一方面亦有些文獻指出益

生菌也會引起宿主之細胞激素表現之反應

[18-19]，而 Haghighi et al.[20]的實驗結果中，

益生菌處理組及沙門氏菌感染組之雞隻細胞

激素表現量相較之下，益生菌對細胞激素之

影響是低於沙門氏菌感染組，而且在益生菌

餵食及沙門氏菌感染組與沙門氏菌感染組的

相比較也能降低雞隻發炎之細胞激素 IFN-

及 IL-12的表現，故本試驗來探討經餵食乳

酸菌及熱致死乳酸菌再攻毒沙門氏菌之後對

於雞隻之細胞激素反應影響。本試驗使雞隻

口服不同乳酸菌三天後攻毒沙門氏菌，攻毒

後第三天及第六天犧牲取其盲腸扁桃體抽取

mRNA進行促發炎細胞激素和抗發炎細胞激

素檢測。測定的細胞激素為 IL-1 、IL-6、

IFN- 及 IL-10，它們代表的是 Th1和 Th2的

細胞因子並為會參與雞隻感染沙門氏菌的免

疫表現[21-22]。

IL-1為哺乳類及鳥類一個重要的發炎介

質，主要由單核白血球、組織間巨噬細胞、

腸道細胞或其他細胞產生[23]。Withanage et

al.[24]指出 IL-1 為一個早期發炎反應的細胞

激素。以沙門氏菌攻毒後，發現一日齡無菌

紅肉雞沙門氏菌數達 108 CFU後 6~48小時發

現盲腸扁桃體中 IL-1 與空白組相比高出許

多。本試驗中的雞隻沙門氏菌染組表現出類

似的結果，而 4組乳酸菌處理組的表現量與

沙門氏菌感染組相比皆有降低的效果（圖

1）。

IL-6為一種多功能細胞因子，其可以活

化巨噬細胞，促進 B淋巴球產生抗體使細胞

分化及活化 T淋巴球[25-26]。但由類風溼性關

節炎病人的關節滑液中分離出來的 T細胞及

B 細胞中，皆分泌相當量的 IL-6，顯示不正

常分泌 IL-6也是導致某些自體免疫疾病的因

素之一。有研究顯示禽類受到沙門氏菌感染

後，IL-6為一種急性反應的表示[21]。然而，

在Withanage et al.[27]的研究中則顯示一周齡

雞隻感染沙門氏菌 1×104 CFU後第 21天，盲

腸扁桃體的 IL-6才有表現。而 Haghighi et

al.[20]攻毒 2日齡雞隻的盲腸扁桃體中並無發

現 IL-6。所以，沙門氏菌劑量與品種使用的

不同都可能會影響免疫反應。其他研究資料

亦顯示沙門氏菌侵入之動物的類型、品種及

年齡的不同，其免疫反應也會受影響[28-29]。

我們的結果比較屬於早期的表現，沙門氏菌

感染組的表現量與空白組相比在第三天即有

明顯的升高，而在乳酸菌處理組與沙門氏菌

感染組相比時除了第六天之 EF03處理組沒

有明顯降低效果(p>0.05)之外（圖 2），其餘

各組具有明顯的降低效果(p<0.05)（圖 2）。

IFN- 為Th1型細胞激素，主要由自然殺


162

手細胞與 T淋巴球生產，其會刺激巨噬細胞

分泌些抗菌物質[30]。在小鼠中對於清除沙門

氏菌是非常重要的[31]。而雞隻感染沙門氏菌

會有明顯的提升反應[27,32]。Withanage et al.[27]感染一周齡雞隻 1×108 CFU of S. typhimurium

發現 IFN- 的增加。而Beal et al.[33]感染 6周

齡 1.6×108 CFU of S. typhimurium後第 10天

才發現 IFN- 。據推測雞隻感染沙門氏菌的

免疫表現可能與雞隻的年齡有關。Withanage

et al.[27]指出沙門氏菌的感染可能只會引起雛

雞的疾病，成雞並不影響。雞隻隨著年齡的

增長，會由於其腸道免疫系統的健全發展而

使對於沙門氏菌的抵抗力越來越高[32-34]。目

前並己發現沙門氏菌在腸道上定殖的減少與

益生菌調節雞隻之盲腸扁桃腺體細胞激素

IFN- 與 IL-12有相關[20]。另外文獻也指出益

生菌能使免疫細胞藉由減少 IFN- 的產生發

揮了抗發炎機能，這種的細胞激素的減少可

能是保護對抗沙門氏菌感染的重要因素[35]。

在我們的研究中可以發現，乳酸菌處理組的

表現量與沙門氏菌組相比有明顯的降低（圖

3），到第六天時，除了EF03 組與沙門氏菌

感染組相比並無明顯差異外 (p>0.05)（圖

3B）。

IL-10為一種具強大免疫調節與抗發炎

性的細胞激素，由巨噬細胞及 T 細胞產生[36-37]。早發現為Th2細胞所分泌能抑制Th1

細胞活化的一種物質，其可抑制細胞分泌

IL-1、TNF- 、IL-6、IL-8、IL-12及 INF- ，

故為一種免疫反應抑制因子，在細胞激素平

衡中扮演著重要的調節因子。有報告指出，

益生菌能控制此細胞激素表現[19,38]。而基因

剔除 IL-10的小鼠易產生腸道感染、前發炎

細胞激素分泌過量、虛弱、體重偏低及生長

遲緩等現象。在我們的研究中可以發現，在

第三天時乳酸菌處理組與沙門氏菌感染組相

比明顯的提升(p<0.05)（圖 4A），到第六天

時則是除了 EF03與沙門氏菌感染組相比有

明顯的提升(p<0.05)，其餘 3組雖然提升效

果，但是並沒有明顯的效果（圖 4B）。這些

結果顯示此四株乳酸菌株皆具有良好的免疫

調節能力。但唯有 EF03 這一株菌在雞隻受

到沙門氏菌感染後第六天時，促發炎細胞激

素 INF- 及抗發炎細胞激素 IL-10等這兩種指

標都是處理組中基因表現量高的，這可能

的原因是雞隻受到沙門氏菌感染後，其在腸

道持續有發炎反應，而且抗發炎反應同時也

是其他處理組中有較高的表現量（圖 3B 與

圖 4B），與其他三株乳酸菌免疫調節上有所

差異，在文獻上也有報導不同乳酸菌株在宿

主腸道免疫調節功能上會有不同的結果[39]。

綜和所有實驗結果，顯示本研究所用之

4株乳酸菌株，對於雞隻能有效的抵抗沙門

氏菌侵入雞隻之臟器、定殖在盲腸中及維持

雞隻腸道中的免疫平衡。歐盟在 2006年一月

全面禁止抗生素使用至動物飼料中[2]。所以

尋找抗生素的替代品是目前一個重要的議題

[3-4]。由於這原因，可允許用於動物飼料中的

新乳酸菌產品的研發得到相當大的興趣[40]。

然而，由於市面上目前做為抗病原菌感染之

訴求的益生菌株，以及做為飼料添加物訴求

之乳酸菌產品，缺乏產品評估機制，本研究

以日齡雞隻進行動物實驗將可直接提供相關

產品之有效性之用，而實驗結果顯示 4株乳

酸菌擁有這方面發展的潛能。

致謝

我們要感謝行政院農業委員會支持這項

的工作，計畫編號為 101農科-6.1.1-科-aB。

參考文獻

1. Callaway TR, Edringon TS, Anderson RC et al. Gas-

trointestinal microbial ecology and the safety of our

food supply as related to Salmonella. J Anim Sci 2008;

86:163-72.

2. Anadón, A, Martinez-Larranaga MR, Aranzazu Martinez

M. Probiotics for animal nutrition in the European Union.


163

Regulation and safety assessment. Regul Toxicol

Pharmacol 2006; 45:91-5.

3. Dutil L, Irwin R, Finley R et al. Ceftiofur resistance in

Salmonella enterica serovar. heidelberg from chicken

meat and humans, Canada. Emerg Infect Dis 2010; 16:

48-54.

4. Vaz CS, Streck AF, Michael GB et al. Antimicrobial

resistance and subtyping of Salmonella enterica subspecies

enterica serovar. enteritidis isolated from human outbreaks

and poultry in southern Brazil. Poult Sci 2010; 89:1530-6.

5. Jin LZ, Ho YW, Abdullah N, Jalaludin S. Probiotics in

poultry: modes of action. World Poult Sci J 1997; 53: 351-68.

6. Tsai CC, Liang HW, Yu B et al. The relative efficacy

of different strain combinations of lactic acid bacteria

in the reduction of populations of Salmonella enterica

typhimurium in the livers and spleens of mice. FEMS

Immunol Med Microbiol 2011; 63:44-53.

7. Washington DC. Nutrient Requirements of Poultry: 9th

revised ed., 1994.

8. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene

expression data using real-time quantitative PCR and

the 2(-Delta Delta C(T)). Methods 2001; 25:402-8.

9. Talebi A, Amirzadeh B, Mokhtari B et al. Effects of a

multi-strain probiotic (PrimaLac) on performance and

antibody responses to Newcastle disease virus and

infectious bursal disease virus vaccination in broiler

chickens. Avian Pathol 2008; 37:509-12.

10. Kim A, Lee YJ, Kang MS et al. Dissemination and

tracking of Salmonella spp. in integrated broiler operation.

J Vet Sci 2007; 8:155-61.

11. Kimura AC, Reddy V, Marcus R et al. Chicken consumption

is a newly identified risk factor for sporadic Salmonella

enterica serotype enteritidis infections in the United

States: A case-control study in FoodNet site. Clin Infect

Dis 2004; 38:244-52.

12. Marcus R, Varma JK, Medus C et al. Re-assessment of

risk factors for sporadic Salmonella serotype enteritidis

infections: A case-control study in five FoodNet sites,

2002– 2003. Epidemiol Infect 2007; 135:84-92.

13. Nurmi E, Rantala M. New aspects in Salmonella infection

in broiler production. Nature 1973; 241:210-1.

14. Nisbet D. Defined competitive exclusion cultures in the

prevention of enteropathogen colonization in poultry

and swine. Antonie Van Leeuwenhoek 2000; 81:481-6.

15. Bielke LR, Elwood AL, Donoghue DJ et al. Approach

for selection of individual enteric bacteria for competitive

exclusion in turkey poults. Poult Sci 2003; 82:1378-82.

16. Tellez G, Petrone VM, Escorcia M et al. Evaluation of

avian-specific probiotic and Salmonella enteritidis-, Sal-

monella typhimurium-, and Salmonella heidelberg-

specific antibodies on cecal colonization and organ

invasion of Salmonella enteritidis in broilers. J Food

Prot 2001; 64:287-91.

17. Casey PG, Casey GD, Gardiner GE et al. Isolation and

characterization of anti-Salmonella lactic acid bacteria

from the porcine gastrointestinal tract. Lett Appl Microbiol

2004; 39:431-8.

18. O’Hara AM, O’Regan P, Fanning A et al. Functional

modulation of human intestinal epithelial cell responses

by Bifidobacterium infantis and Lactobacillus salivarius.

Immunol 2006; 118: 202-15.

19. Chen CC, Louie S, Shi HN et al. Preinoculation with

the probiotic Lactobacillus acidophilus early in life

effectively inhibits murine Citrobacter rodentium colitis.

Pediatr Res 2005; 58:1185-91.

20. Haghighi HR, Abdul-Careem MF, Dara RA et al. Cytokine

gene expression in chicken cecal tonsils following

treatment with probiotics and Salmonella infection. Vet

Microbiol 2008; 126:225-33.

21. Kaiser P, Rothwell EE, Galyov P▲et al▲. Differential

cytokine expression in avian cells in response to invasion

by Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, and

Salmonella gallinarum. Microbiol 2000; 146:3217-26.

22. Berndt A, Wilhelm A, Jugert C et al. Chicken cecum

immune response to Salmonella enterica serovars of

different levels of invasiveness. Infect Immun 2007; 75:

5993-6007.

23. Bar-Shira E, Friedman A. Development and adaptations

of innate immunity in the gastrointestinal tract of the

newly hatched chick. Dev Comp Immunol 2006; 30:930-41.

24. Withanage GS, Kaiser P, Wigley P, et al. Rapid expression

of chemokines and proinflammatory cytokines in newly

hatched chickens infected with Salmonella enteric

serovar. typhimurium. Infect Immun 2004; 72:2152-9.

25. Hideshima T, Podar K, Chauhan D et al. Cytokines and

signal transduction. Best Pract Res Clin Haematol 2005;

18:509-24.

26. Jones SA. Directing transition from innate to acquired

immunity: defining a role for IL-6. J Immunol 2005;

175:3463-8.

27. Withanage GS, Wigley P, Kaiser P et al. Cytokine and

chemokine responses associated with clearance of a

primary Salmonella enterica serovar. typhimurium

infection in the chicken and in protective immunity to


164

rechallenge. Infect Immun 2005; 73:5173-82.

28. Sadeyen JR, Trotereau J, Velge P et al. Salmonella

carrier state in chicken: Comparison of expression of

immune response genes between susceptible and resistant

animals. Microbes Infect 2004; 6:1278-86.

29. Cheeseman JH, Kaiser MG, Ciraci C et al. Breed effect

on early cytokine mRNA expression in spleen and cecum

of chickens with and without Salmonella enteritidis

infection. Dev Comp Immunol 2007; 31:52-60.

30. Alam MS, Akaike T, Okamoto S et al. Role of nitric

oxide in host defense in murine salmonellosis as a

function of its antibacterial and antiapoptotic activities.

Infect Immun 2002; 70:3130-42.

31. Bao S, Beagley KW, France MP et al. Interferon-gamma

plays a critical role in intestinal immunity against

Salmonella typhimurium infection. Immunol 2000; 99:464-72.

32. Beal RK, Powers C, Wigley P et al. Temporal dynamics

of the cellular, humoral and cytokine responses in

chickens during primary and secondary infection with

Salmonella enterica serovar. typhimurium. Avian Pathol

2004; 33:25-33.

33. Beal RK, Wigley P, Powers CP et al. Age at primary

infection with Salmonella enterica serovar. typhimurium

in the chicken influences persistence of infection and

subsequent immunity to rechallenge. Vet Immunol Im-

munopathol 2004; 100:151-64.

34. Bjerrum L, Engberg RM, Pederson K. Infection models

for Salmonella typhimurium DT110 in day-old and 14-

dayold broiler chickens kept in isolators. Avian Dis

2003; 47:1474-80.

35. Silva AM, Barbosa FH, DuarteR, et al. Effect of Bifi-

dobacterium longum ingestion on experimental salmonellosis

in mice. J Appl Microbiol 2004; 97:29-37.

36. Hammer M, Mages J, Dietrich H et al. Control of dual

specificity phosphatase-1 expression in activated

macrophages by IL-10. Eur. J Immunol 2005; 35:2991-3001.

37. Fife MS, Gutierrez AE, Ogilvie M et al. Novel IL-10

gene family associations with systemic juvenile idiopathic

arthritis. Arthritis Res Ther 2006; 8:R148.

38. Christensen HR, Frokiaer H et al. Lactobacilli differentially

modulate expression of cytokines and maturation surface

markers in murine dendritic cells. J Immunol 2002; 168:

171-8.

39. Delcenserie V, Martel D, Lamoureux M et al. Immuno-

modulatory effects of probiotics in the intestinal tract.

Curr Issues Mol Biol 2008; 10:37-54.

40. Hong HA, Duc LH et al. The use of bacterial spore

formers as probiotics. FEMS Microbiol Rev 2005; 29:813-35.

Evaluation of the Oral Feeding Effects of Different Lactic Acid Bacteria Strainson the Invasion and the Induced Inflammation of Chicks

Chih-Yuan Chen1, Chun-Li Lin2, Li-Tsen Chuang2, Hau-Yang Tsen2, Chin-Shuh Chen1

1Department of Food Science and Biotechnology, National Chung Hsing University, Taichung;2Department of Food Science and Technology, Hung-Kuang University, Taichung, Taiwan.

Abstract

Many probiotic products, which are claimed

to be able to improve protect the health of

livestock animals, have been commercialized.

Accordingly, the evaluation of probiotic properties

of these products is important. In this study, we

used chicks as experimental animals and evaluate

antagonistic effects of lactic acid bacteria (LAB)

against Salmonella infection. One day old chicks

were fed with different LAB, i.e., Lactobacillus

acidophilius LA01, L. plantarum LPL01, L. fer-

mentum LF03 and Enterococcus spp. EF03 from

day 1 to day 3. On day 4, chicks were challenged

with Salmonella. The livers, spleens, cecal

tonsils and cecal contents of chicks were then

removed and the numbers of Salmonella cells

on day 3 and 6 post-infection were determined.


165

On the other hand, the levels of proinflammatory

cytokines, i.e., interleukin IL-1 , IL-6, interferon

IFN- and anti-inflmmatory cytokine, i.e., IL-10,

in cecal tonsils were measured by reverse tran-

scription real-time quantitative PCR (RT-Q PC

R). Regarding the effects of LAB cells against

Salmonella invasion of these organs, all LAB

strains used in this study were able to reduce

the numbers of Salmonella per gram organ by

one to two orders of magnitude. For the anti-

inflammatory effects, chicks fed with LAB

showed lower levels of proinflammatory cytokines

as compared to those of the controls on day 3

post-infection (P<0.05). These results suggest

that these LAB strains exert immunomodulatory

effects on chicks and could be used to protect

the chicks against Salmonella invasion. Such

results may be used as references for livestock

industries and inspection agencies.

Key words: lactic acid bacteria, broiler chicks,

Salmonella, inflammation

TTQAA 社團法人台灣檢驗及品保協會第一屆理監事

職別姓名現職學歷經歷

理事長蔡文城

台美檢驗科技有限公司董

事長及國立陽明大學教授

美國南達克達州大學微生

物學系博士

國立陽明大學教授、主

任、館長及台北榮總微生

物科主任

副理事長陳景川美和科技大學副校長美國康乃爾大學食品科技

博士

屏東科技大學教授及副校

長

常務理事郭瑛玉

群翔企業顧問公司負責

人；明生生物科技公司董

事長；台北醫學大學董事

台灣大學動物科技系學

士；美國加州州立大學動

物科學碩士

新光醫院創院行政副院

長；精益準生物科技公司

董事長兼執行長

常務理事呂旭峯振興醫院技術長及輔仁大

學兼任教授

紐約聖若望大學醫技研究

所

中國醫藥大學附設醫院微

生物與生化組組長

常務理事闕宗熙

三總臨床病理科主任美國科羅拉多州大學微生

物學博士及國防醫學院醫

學士

國防醫學院病理學系副教

授

常務理事李金木

中臺科技大學藥物科技研

究所所長

美國賓州大學生物博士國立陽明大學寄生蟲科所

主任及所長，中台科技大

學生醫研究所教授兼所長

常務理事曾浩洋

弘光科技大學民生學院院

長及食科系教授

美國肯特州立大學生物化

學博士

美國麻省理工學院生物系

博士後研究；中興大學食

科系教授、主任

理事張勝祺國立陽明大學生化所兼任

副教授

國立中興大學植物病理研

究所

國立陽明大學生化所副教

授

理事張懿欣

國立陽明大學醫技系教授/系主任

國立陽明大學微免所博士中山醫學大學教授 /系主任、中台科技大學副教

授、元培科技大學副教授

理事郭金龍

台北市立聯合醫院林森中

醫院區檢驗科組長

台北醫學大學生藥技術學

系理學士

台北市立慢性病院檢驗科

副主任；市立聯合醫院林

森院區檢驗科副主任

理事王志傑

輔英科技大學保健營養系

教授

台灣大學微生物與生化學

研究所博士

大仁科技大學生科系教授

兼系所主任；輔英科技大

學保健營養系教授

理事紀永昌

中華科技大學健康科技研

究所及食品科學系助理教

授

台灣大學農業化學研究所

博士

標檢局科長、簡任技正；

消基會檢驗委員、食品組

召集人

理事

理事

理事

理事

理事

理事

林宜賢

黃怡超

李詩益

李秀霞

余家琛

張谷昇

振興醫療財團法人振興醫

院放射治療科主治醫師

國立中國醫藥研究所所長

台北榮總微生物科細菌組

組長

奇基有限公司負責人

醫信有限公司

元培科技大學食科系系主

任

國立陽明大學傳統醫藥研

究所博士；國立陽明大學

醫學系醫學士

英國格拉斯哥大學臨床藥

理所博士及國立陽明大學

醫學院醫學系學士

台大醫技系學士，國防大

學病理所碩士

國立陽明大學寄生蟲研究

所碩士

國立成功大學 EMBA 在職高階管理專班

國立中興大學食科系；國

立中興大學食科所碩士；

台灣大學微生物與生化所

博士

台北榮總癌症中心主治醫

師；陽明大學醫學系兼任

講師

國立陽明大學教授、所長

三軍總醫院細菌組組長

台大醫院研究助理及進階

有限公司專員

醫信有限公司

元培科技大學教授

職別

理事

姓名

何耿德

現職

啟新生技公司研發部主任

學歷

國立中興大學生物科技研

究所博士

經歷

崧華基因研發專案經理

常務監事許萬枝

國立陽明大學教授兼教務

長及副校長

美國威斯康辛大學麥迪遜

分校生理化學博士及台灣

大學生化科學碩士

國立陽明大學教授、生科

院院長、大學主任秘書、

教務長、副校長

監事曾義雄

慈濟大學講座教授美國北卡羅萊納州立大學

微生物學系博士及博士後

研究

國立中興大學教授、所

長、中心主任、院長；中

台科技大學院長

監事劉文雄

新新憶企業股份有限公司

董事長；台灣遠距醫療器

材股份有限公司董事長

日本東京大學醫學博士高雄市立民生醫院主治醫

師兼科主任

監事施宗雄

約克貝爾生技股份有限公

司及酪多精生物科技股份

有限公司董事長

日本國立北海道大學應用

微生物學博士

國立中興大學教授、主

任；東海大學教授、主

任、廠長；農學院院長

監事林茂勇

國立屏東科技大學獸醫學

系教授

美國喬治亞大學獸醫學院

醫學微生物系及禽病系碩

士及博士；國立屏東農專

獸醫科

教授、系主任、獸醫師、

技佐、技士

監事

監事

柯耀筆

黃文瑛

弘光科技大學食科系主任

美和科技大學教授兼主任

台大農化所博士

國立台灣大學農業化學所

博士

弘光科技大學食科系副教

授；弘光科技大學公關室

主任

國立屏東科技大學教授

理事

理事

蕭炎昆

林函頤

凱記科技股份有限公司技

術總監

醫療器材產品經理

逢甲大學水利系

國立台灣大學農業化學研

究所生物工業化學組

凱記及北瑞董事長

綠色四季研發部主任

TTQAA 社團法人台灣檢驗及品保協會

第一屆正副秘書長名單

職別姓名現職學歷經歷

秘書長林錫斌

元培科技大學食品科學系

副教授

日本東北大學生命科學研

究所博士；日本東北大學

食糧化學研究所碩士

元培科技大學食品科學系

（所）主任兼所長

副秘書長王紹鴻嘉義大學微生物免疫及生

物藥學系助理教授

國立陽明大學微生物免疫

學研究所碩士及博士

義大醫院醫研部副研究員

副秘書長蔡岳廷台美醫事檢驗所負責人國立台灣大學生命科學院

生化科技學系博士

中央研究院生醫所助理

檢驗及品保雜誌(Journal of Testing and Quality Assurance)

發行人：蔡文城

編輯委員會：

總編輯：呂旭峯

編輯委員：王志傑林茂勇郭瑛玉何耿德施宗雄

陳景川余家琛柯耀筆曾浩洋紀永昌

曾義雄李秀霞張谷昇黃文瑛李金木

張勝祺黃怡超李詩益張懿欣劉文雄

林函頤許萬枝蕭炎昆林宜賢郭金龍

闕宗熙

出版者：TTQAA社團法人台灣檢驗及品保協會地址：新北市新莊區五工五路 21號電話：02-2298-9459傳真：02-2290-2510Email：[email protected]網站：http://www.ttqaa.org.twISSN 2227-815X承印者：瑞明彩色印刷有限公司

地址：新北市化成路 267巷 13號電話：02-2991-7945傳真：02-2991-9113Email：[email protected]中華郵政三重雜字第 84號執照登記為雜誌交寄

Documents

檢驗及品保雜誌 - creative-micro.com · 相關研究或其它論述文章以及學術研究或檢測單位之研發相關論文，來稿以未曾刊登其它 雜誌或期刊者為限，且投稿作者群中至少有一位具台灣檢驗及品保協會會員資格，每篇投

檢驗及品保雜誌 - creative-micro.com · 相關研究或其它論述文章以及學術研究或檢測單位之研發相關論文，來稿以未曾刊登其它雜誌或期刊者為限，且投稿作者群中至少有一位具台灣檢驗及品保協會會員資格，每篇投