Detección del efecto tóxico de un fungicida mediante bioensayo sobre Artemia salina Linnaeus, 1758Cumpa, M; Díaz, O.; Tenicela, P.; Velezvilla, G.

Resumen

El objetivo fue aplicar un ensayo de toxicidad sobre Artemia salina mediante el uso del fungicida Clotrimazol (Roxfarma®) a distintas concentraciones (C1= 100 mg.L-1), (C2 = 50 mg.L-1), (C3= 25 mg.L-1), (C4= 12.5mg.L-1), (C5=6.25mg.L-1), (C6= 3.125mg.L-1), (C7= 1.563 m.L-1). Las distintas concentraciones del fungicida fueron clasificados según el porcentaje de mortalidad como: no tóxico (NT) (MR <25%), levemente tóxico (LT) (25%<MR <50%), tóxico (T) (50%<MR <75%), y muy tóxico (MT) (75%<MR <100%). A las 24 horas, las concentraciones a 100 mg/L son altamente toxicas (%MR=100%), a las 48 horas todas las concentraciones son altamente toxicas (%MR>75%).

Palabras clave: Artemia, bioensayo, clotrimazol, fungicida, antimicótico.

Abstract

The Objective was to apply a toxicity test on Artemia salina fungicide using the Clotrimazol (Roxfarma ®) at various concentrations (C1 = 100 mg.L-1), (C2 = 50 mg.L-1), (C3 = 25 mg.L-1), (C4 = 12.5mg.L-1), (C5 = 6.25mg.L-1), (C6 = 3.125mg.L-1), (C7 = 1563 mL -1). Different concentrations of the fungicide were ranked by the percentage of mortality as nontoxic (NT) (MR <25%), slightly toxic (LT) (25% <MR <50%), toxic (T) (50% <MR <75%) and very toxic (MT) (75% <MR <100%). At 24 hours, concentrations of 100 mg / L are highly toxic (% MR = 100%), at 48 hours all concentrations are highly toxic (% MR> 75%).

Keywords: Artemia, bioassay, clotrimazol, fungicide, antifungal.

INTRODUCCIÓN

Los antimicóticos incluyen una amplia variedad de sustancias con diferentes estructuras químicas y mecanismos de acción. (Susana y Valdés, 2005). La clasificación se realiza según criterios convencionales que atienden a su estructura en: polienos, azoles, alilaminas, entre otros; de acuerdo con su origen en sustancias producidas por organismos vivos o derivados de síntesis química; de acuerdo con su espectro de acción en: amplio o restringido y de acuerdo con el sitio de acción (Gregory, 2005).

Actualmente, el producto tópico más utilizado por su alto grado de efectividad es el Clotrimazol, antimicótico de amplio espectro, el cual es derivado de la alquilación de imidazol con cloruro de o-clorotritilo en acetona y con trietilamina como base.

El Clotrimazol es un antimicótico utilizado en el tratamiento de ciertos tipos de infecciones de la piel causadas por hongos (candidiasis, dermatofitosis, pie de atleta, etc.)

El efecto antimicótico de Clotrimazol actúa inhibiendo la división y crecimiento, mediante la alteración de la permeabilidad celular del hongo y la inhibición de actividad de enzimas dentro de la célula.

Artemia salina (Linnaeus, 1758) es un crustáceo sensible a un amplio rango de compuestos con actividad biológica y de muy diversas estructuras químicas (Michael et al). Se propuso su uso con

diversas modificaciones para diferentes pruebas de toxicidad. (Vanhaecke et al) debido a su fácil manejo en el laboratorio y su cultivo relativamente sencillo y barato.El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto toxico de Clotrimazol (solución Tópica) a diferentes concentraciones en “Artemia Salina”.

MATERIAL Y MÉTODOS

Los bioensayos ecotoxicológicos se realizaron en el Laboratorio de Ecofisiología Animal (LEFA) de la Facultad de Ciencias Naturales y Matemática (FCCNNM) de la Universidad Nacional Federico Villarreal (UNFV), El Agustino, Lima, Perú.

Eclosión de Artemia salina

Los huevos de A. salina de se obtuvieron en Zoofarma® ubicado en Santa Beatriz - Lima 1 Perú. Se procedió a preparar las condiciones para la eclosión de los huevos, con el fin de obtener los individuos en estadío nauplio II, los cuales serán usados en el presente experimento.

Se incorporaron los huevos en un vaso de precipitado de 500ml conteniendo agua destilada y se expuso a luz intensa por un periodo de tiempo de 1 hora. Luego, se utilizó hipoclorito de sodio (lejía Clorox®) que tenía una concentración de 5,25%. En proporción 100ml por 900ml de agua, se agitó constantemente por espacio de 30 minutos con el fin de facilitar el descascaramiento de los huevos; fue importante apreciar el cambio de

coloración de los huevos de una coloración marrón inicial a una

coloración naranja. Seguido de enjuagar bien los huevos con agua destilada, se trasladaron a un vaso de precipitado de 1000ml conteniendo agua de mar filtrada y 7.5 g de bicarbonato de sodio (NaHCO3), y luego llevado este a la incubadora a 27°C durante un periodo de 24 h. Pasado el tiempo de incubación se sometieron los huevos a fuerte aireación hasta su eclosión. Los cuales eclosionaron a temperatura ambiente (entre 19 °C a 22°C) 2 días después de haber comenzado la fase de aireación.

Instalación del bioensayo

Una vez obtenidos los nauplios II, dentro de las 24 h de eclosión, se procedió a realizar los bioensayos de toxicidad. Se utilizaron 7 concentraciones más un control con 4 repeticiones por concentración. No se utilizó un control con solvente pues se dispuso del antimicótico en solución tópica. Se utilizó un total de 320 individuos de A. salina; distribuyéndose al azar en cada envase diez formas inmaduras (nauplio II). Los nauplios no se alimentaron durante el bioensayo.

Al contar ya con los nauplios de segundo estadio de A. salina, se dejó pasar 20 h desde la eclosión, antes de ser utilizadas en los bioensayos. A continuación 10 nauplios de segundo estadio de A. salina fueron llevados a cada uno de los envases de 25 mL de capacidad con 20 mL de solución y en cada una de las cuatro réplicas.Se contó el número de nauplios vivos y muertos en cada una de las diluciones a

las 24 y 48 horas. Los ensayos fueron considerados válidos cuando la mortalidad en el control no fue mayor al 10% según el criterio estándar (Calow, 1993). Las diluciones calculadas usando un factor de 0,5, fueron: de 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.563 miligramos de Clotrimazol por Litro de agua. El agua de dilución empleada para todos los casos fue agua de mar filtrada.

Resultados y discusiones

El clotrimazol es un derivado imidazólico, que se administra como método de tratamiento de las infecciones fúngicas, tanto cutáneas como vaginales. Como derivado imidazólico, goza de un amplio espectro de actividad contra dermatofitos, levaduras y mohos. A diferencia de otros derivados de este tipo, tiene una propiedad añadida, su espectro alcanza también el patógeno del eritrasma y algunas bacterias gram-positivas como los estafilococos y los estreptococos, especies que pueden intervenir en sobreinfecciones y en infecciones vaginales. Con respecto a éstas últimas, Clotrimazol también cubre especies bacterianas gram-negativas (Proteus, Klebsiella, E. Coli y Pseudomonas) y bacterias anaerobias como Prevotella y la Gardnerella vaginalis. En concentraciones altas, incluso es eficaz frente a Trichomonas vaginalis.

Sin embargo no se encontró evidencias bibliográficas de anteriores bioensayos que demuestre su acción toxicológica sobre A. salina.

En la tabla 1 se precian los resultados obtenidos por la acción toxicológica del

clotrimazol a diferentes concentraciones, las cuales fueron sometidas para 10

individuos de estadio nauplio II por cada repetición.La concentración C0 fue la concentración blanco, constituida por agua de mar filtrada, a esta concentración solo se alcanzó el 10% de mortalidad, no sobrepasando el límite de mortalidad estándar para la concentración blanco (20%) para bioensayos. Para la concentración 1 (C1), se obtuvo el 100% de mortalidad para A. salina a las 24 h por lo que se catalogó a esta concentración como “muy tóxica”. Para la Concentración 2 (C2), a las 24 h, se obtuvo un 28% de mortalidad siendo considerado como “levemente toxico”; para la misma concentración, a las 48 h, el porcentaje de mortalidad (%MR) aumento a un 78% siendo considerado como “Toxico” a las 48 h de establecido el bioensayo.Las concentraciones C3, C4, C5, C6 Y C7, a las 24 horas, mostraron un porcentaje de mortandad menor al 20% por lo que las concentraciones a este intervalo de tiempo fueron consideradas como “no toxicas” sobre A. salina.A las 48 horas, las concentraciones C3, C4, C5, C6 Y C7, alcanzaron un porcentaje de mortalidad mayor e igual al 80% por lo que fueron consideradas como “muy toxicas” a las 48 horas de iniciado el bioensayo.

CONCLUSIONES:

Debido a que el porcentaje de mortalidad en el control es menor al 5 % consideramos que la calidad de los

huevos de Artemia salina y la del agua de mar tratada son apropiadas en la utilización de bioensayo. De los resultados de la evaluación en la población experimental de Artemia salina a las 24 horas las concentraciones mayores a 100 mg/L son altamente toxicas ya que el porcentaje de mortalidad es del 100% , para concentraciones menores del valor antes mencionado, dentro de este rango de tiempo, la población estudiada presenta resistencia al efecto del fungicida, sin embargo pasada las 48 horas de iniciado el bioensayo, la mortalidad asciende a más del 75 % en todas las concentraciones del fungicida, a partir de ello concluimos que el efecto del mismo es toxico.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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fúngicos con actividad tóxica mediante bioensayo sobre Artemia

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Estadio Nauplio II de A. salina (40x)

ANEXOS

Tabla 1. Número de individuos Nauplio II de Artemia salina sometido a diferentes concentraciones de Clotrimazol a las 24 y 48 horas.

24 HORAS 48 HORAS

V I VT M Total V I VT M Total

C0

A 9 0 9 1 10 9 0 9 1 10B 10 0 10 0 10 10 0 10 0 10C 9 0 9 1 10 9 0 9 1 10D 10 0 10 0 10 10 0 10 0 10

C1

A 0 0 0 10 10 0 0 0 10 10B 0 0 0 10 10 0 0 0 10 10C 0 0 0 10 10 0 0 0 10 10D 0 0 0 10 10 0 0 0 10 10

C2

A 3 3 6 4 10 2 2 4 6 10B 6 2 8 2 10 1 2 3 7 10C 4 5 9 1 10 1 1 2 8 10D 3 3 6 4 10 0 0 0 10 10

C3

A 7 1 8 2 10 1 2 3 7 10B 7 1 8 2 10 0 2 2 8 10C 8 2 10 0 10 0 2 2 8 10D 7 0 7 3 10 0 1 1 9 10

C4

A 8 0 8 2 10 0 0 0 10 10B 7 0 7 3 10 0 0 0 10 10C 8 1 9 1 10 0 1 1 9 10D 9 0 9 1 10 0 0 0 10 10

C5

A 9 1 10 0 10 0 0 0 10 10B 8 1 9 1 10 0 0 0 10 10C 9 1 10 0 10 0 0 0 10 10D 8 0 8 2 10 0 1 1 9 10

C6

A 8 1 9 1 10 0 1 1 9 10B 9 1 10 0 10 0 0 0 10 10C 8 1 9 1 10 0 0 0 10 10D 9 1 10 0 10 0 0 0 10 10

C7

A 9 1 10 0 10 0 0 0 10 10

B 9 1 10 0 10 0 0 0 10 10

C 8 1 9 1 10 0 0 0 10 10

D 9 1 10 0 10 0 0 0 10 10

V= Vivos con movimiento I = Vivos casi inmóviles (mueven algunos apéndices) VT = vivos totales M = muertos

Gráfico 1. Conteo de nauplios II de Artemia salina a las 24 h. de instalado el bioensayo a diferentes concentraciones de Clotrimazol.

C0 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C70

2

4

6

8

10

12

VIVAS MUERTAS

CONCETRACIONES

Nº

DE

INDI

VIDU

OS

Grafico 2. Conteo de nauplios II de Artemia salina a las 48 h. de instalado el bioensayo a diferentes concentraciones de Clotrimazol.

C0 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C70

2

4

6

8

10

12

VIVASMUERTAS

CONCETRACIONES (mg / L-1)

Nº

DE

IN

DIV

IDU

OS

Tabla 2. Porcentaje de mortalidad a las 24 horas.

%MR = Porcentaje de mortandad

Grafico 3. Variación del porcentaje de mortalidad a las 24 horas.

V M %MR

C0 9.5 0.5 5%

C1 0 10 100%

C2 7.25 2.75 28%

C3 8.25 1.75 18%

C4 8.25 1.75 18%

C5 9.25 0.75 8%

C6 9.5 0.5 5%

C7 9.75 0.25 3%

Tabla 3. Porcentaje de mortalidad a las 48 horas.

V M %MR

C0 9.5 0.5 5%

C1 0 10 100%

C2 2.25 7.75 78%

C3 2 8 80%

C4 0.25 9.75 98%

C5 0.25 9.75 98%

C6 0.25 9.75 98%

C7 0 10 100%

%MR = Porcentaje de mortandad

Grafico 4. Variación del porcentaje de mortalidad a las 48 horas.