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中南大学学报（医学版）
J Cent South Univ (Med Sci) 2013, 38(4) http://www.csumed.org; http://xbyx.xysm.net347
骨髓间充质干细胞不同移植方式治疗 大鼠糖尿病足溃疡的疗效观察
万江波，蔡黔，刘毅
( 兰州军区兰州总医院全军烧伤整形外科中心，兰州 730050)
[ 摘要 ] 目的：探索骨髓间充质干细胞 (bone-marrow derived mesenchymal stem cells，BM-MSCs) 经创缘皮下和小腿
肌肉移植对大鼠糖尿病足溃疡 (diabetic foot ulcers，DFUs) 的治疗效果。方法：全骨髓贴壁法体外培养雄性 Wistar 大鼠
BM-MSCs 至第 3 代，经 4, 6- 联脒 -2- 苯基吲哚 (4,6-diamino-2-phenylindole，DAPI) 标记。48 只雄性 Wistar 大鼠随机分
成 A 组 (BM-MSCs 创缘皮下移植组，n=12)、B 组 (BM-MSCs 小腿肌肉移植组，n=12)、C 组 ( 正常大鼠对照组，n=12)
和 D 组 (DFUs 对照组，n=12)。大鼠糖尿病经腹腔注射链脲佐菌素 (streptozotocin，STZ) 诱导，在其双后足背切取一
3 mm×7 mm 矩形全层皮肤制成大鼠 DFUs 模型。于移植后第 2，5，8，11 天评估各组大鼠的创面愈合率，冰冻切片观
察 DAPI 标记的 BM-MSCs 在创伤组织中的示踪，肉芽组织的厚度采用 HE 染色法检测，CD31 和 Ki-67 的表达采用免
疫组织化学法检测，血管内皮细胞生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF) 在创伤组织中的表达采用 ELISA
和 RT-PCR 检测。结果：C 组的创面愈合最快 (P<0.05)，第 11 天 B 组的创面愈合率大于 A 组 (P<0.05)。第 2 天和第
5 天的冰冻切片观察发现 B 组的荧光强度及区域均大于 A 组。HE 染色显示第 5 天 B 组的肉芽厚于 A 组。CD31 的免
疫组织化学显示第 5 天和第 8 天 B 组的小血管数目多于 A 组 (P<0.05)，而 Ki-67 的免疫组织化学结果显示两组无差异
(P>0.05)。ELISA 和 RT-PCR 的结果均显示第 8 天和第 11 天 B 组的 VEGF 表达水平高于 A 组 ( 分别 P<0.05，P<0.01)。
结论：两种移植方式均促进了大鼠 DFUs 的愈合，但在愈合的后期，小腿肌肉内的移植方式体现出更好的持续性及高
表达的 VEGF，疗效更优。
[ 关键词 ] 骨髓间充质干细胞；糖尿病足；创面修复；血管内皮细胞生长因子
Effect of different transplantions with bone-marrow derived mesenchymal stem cells on diabetic foot ulcers in rats
WAN Jiangbo, CAI Qian, LIU Yi
(Department of Burns and Plastic Surgery, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Command, Lanzhou 730050, China)
ABSTRACT Objective: To assess the therapeutic effect of treating diabetic foot ulcers (DFUs) in rats by subcutaneously transplanting around the wounds and intramuscularly into the leg with bone marrow derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs).
收稿日期 (Date of reception)：2012-07-12
作者简介 (Biography)： 万江波，硕士，医师，主要从事糖尿病足溃疡的干细胞治疗及相关基础研究。
通信作者 (Corresponding author)：蔡黔，Email: [email protected]
基金项目 (Foundation item)：兰州军区面上项目 (CLZ11JB07)。 This work was supported by the program from Lanzhou Military Command, P. R. China
(CLZ11JB07).
DOI:10.3969/j.issn.1672-7347.2013.04.003
http://xbyx.xysm.net/xbwk/fileup/PDF/201304347.pdf
中南大学学报 ( 医学版 ), 2013, 38(4) http://www.csumed.org; http://xbyx.xysm.net348
研究 [1] 报道：糖尿病患者一生中有高达 25%的 概 率 发 生 糖 尿 病 足 溃 疡 (diabetic foot ulcers，
DFUs)，这些患者之中有 14%~24% 的人群最终需要
接受截肢治疗 [2]。DFUs 的相关并发症已经成为下
肢非创伤性截肢的首要原因 [3]，而这些截肢患者的
5 年生存率仅为 31%[4]。治疗 DFUs 一直是个困扰
全世界医学工作者的难题之一。正常创面愈合需要
经历相互重叠的 3 个过程：炎症反应、细胞移行增
殖和组织重建 [5]。以上任何一个环节停滞或被抑制
将导致局部组织的缺血、再灌注损伤、细菌感染及
组织反复损伤等，进而导致创面迁延不愈 [6]。长期
高血糖损伤了角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细
胞、巨噬细胞及血小板分泌细胞因子及参与创伤修
复的整个过程 [7]，而生长因子的相对或绝对减少也
是导致 DFUs 难以愈合的重要因素之一 [8]。目前国
内外治疗 DFUs 的传统疗法效果不佳，虽然创面愈
合技术在不断发展，但是仍有近 50% 的患者未能治
愈 [9]。干细胞疗法作为一种极具前途的治疗手段已经
在各种创伤修复及组织再生的研究中广泛开展，同样
在糖尿病创面的基础研究和临床治疗 DFUs 中得到
应用，前者多采取创缘皮下的移植方式 [10-11]，而后
者的移植方式主要包括经动脉和小腿肌肉 [12-15]，但何
种移植方式最具疗效尚无报道。因此，本实验在建
立 DFUs 大鼠模型的基础上应用骨髓间充质干细胞
(BM-MSCs) 分析对比经创缘皮下和小腿肌肉移植对
大鼠 DFUs 的治疗效果及其相关促愈机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SPF 级 雄 性 Wistar 大 鼠，3~4 周 龄 3 只 和
Methods: BM-MSCs from male Wistar rats were cultured by the whole bone marrow adherence method until the third generation. The BM-MSCs were labeled by 4,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) in vitro. Forty-eight male Wistar rats were randomly divided into 4 groups: group A (n=12), rats with DFUs receiving BM-MSCs subcutaneous transplantation; group B (n=12), rats with DFUs receiving BM-MSCs intramuscular transplantation; group C (n=12), nondiabetic rats with foot ulcers; and group D (n=12), rats with DFUs receiving no BM-MSCs. A diabetic rat model was induced by intraperitoneally injecting streptozotocin (STZ). Then DFU model was established by removing a 3 mm×7 mm rectangular full-thickness skin on the 2 back dorsum pedis surfaces. On day 2, 5, 8 and 11 after the transplantation, the rate of wound closure was raised; trace of DAPI labeled-BM-MSCs in the wound tissues was observed on frozen sections and the thickness of granulation tissues was detected by HE stain. Immunohistochemistry was performed to detect the expression of CD31 and Ki-67. The expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in the wound tissues was detected by ELISA and RT-PCR.
Results: The wound closure in group C was faster than in other groups (P<0.05). The rate of wound healing in group B was higher than group A on day 11 (P<0.05). The intensity and area of the fluorescence in group B were higher than group A on day 2 and 5 on the frozen sections. HE stain showed that the granulation tissue formation in group B was thicker than group A on day 5. Immunohistochemistry of CD31 demonstrated that the mean number of small blood vessels in group B was more than in group A on day 5 and 8 (P<0.05). Immunohistochemistry of Ki-67 showed it had no difference between group A and group B. ELISA and RT-PCR revealed that the expression level of VEGF in the wound tissues in group B was higher than in group A on day 8 and 11 (P<0.05, P<0.001, respectively).
Conclusion: Both transplantations promote the wound healing of DFUs in rats. The intramuscular transplantation into the leg shows a better persistence and a higher expression level of VEGF in the wound tissues at later stages.
KEY WORDS bone-marrow derived mesenchymal stem cell; diabetic foot; wound healing; vascular endothelial growth factor
骨髓间充质干细胞不同移植方式治疗大鼠糖尿病足溃疡的疗效观察 万江波，等 349
4 月龄 48 只，由甘肃省中医学院提供，其 SPF 级大
鼠的生产许可证为 SCXK( 甘 )-2011-0001。
1.2 主要材料与仪器
DMEM-F12 干 粉 培 养 基、 胰 酶、 链 脲 佐 菌 素
(STZ) 和 DAPI 购自美国 Sigma 公司；胎牛血清购自
杭州四季青生物工程材料有限公司；血糖试剂盒购
自四川迈克生物科技股份有限公司；兔抗鼠 CD31多克隆抗体 ( 克隆号：M-20，稀释倍数：1:50) 购
自德国 Santa Cruz 公司；兔抗鼠 Ki-67 单克隆抗体( 克隆号：SP6，稀释倍数：1:100) 购自英国 Abcam公司；大鼠 VEGF 的 ELISA 试剂盒购自上海博迈生
物科技有限公司；蛋白酶抑制剂、即用型 SABC 羊
抗兔试剂盒和 DAB 显色试剂盒购自武汉博士德生物
工程有限公司；RNAiso Plus，PrimeScript RT reagent kit，SYBR Premix Ex TaqTM II 购 自 日 本 TaKaRa 公
司；其余化学分析纯均为国产。10 cm 细胞培养皿
购自美国 Corning 公司；CO2 恒温培养箱购自美国
Thermo 公司；医用净化工作台购自吴江市通达空
调设备厂；荧光倒置相差显微镜购自日本 Olympus公司；酶标仪购自荷兰 Labsysems 公司；冰冻切片
机、石蜡包埋机和石蜡切片机购自德国 Leica 公司；
Real-time PCR 仪购自美国 Applied Biosystems 公司。
1.3 方法
1.3.1 大鼠 BM-MSCs 的体外分离及培养
3 只 SPF 级 雄 性 Wistar 大 鼠 (3~4 周 龄 )， 颈
椎脱臼处死后，在无菌条件下分离双下肢股骨、胫
骨，用含 10% 胎牛血清的 DMEM-F12 培养液冲出
骨髓，采用全骨髓贴壁法，置于 37 ℃，5% CO2 恒
温培养箱中培养，3 d 后首次换液，以后每 3 d 换液
1 次，待贴壁细胞生长至 80% 融合时，用 0.25% 胰
酶 -0.04% EDTA 混合液消化，按 1:3 比例传代。
1.3.2 DAPI 体外标记大鼠 BM-MSCs待 BM-MSCs 传 至 第 3 代 且 80% 融 合 时， 弃
去培养皿中的旧培养基，加入无胎牛血清的新培
养液，向新培养液中加入 DAPI 液，使其终浓度为 20 μg/mL[16]，培养箱中避光培养 2 h 后在荧光显微
镜下经紫外光激发观察其细胞核的荧光标记情况。
1.3.3 DFUs 大鼠模型的制备
48 只 4 月龄 SPF 级雄性 Wistar 大鼠，按随机
数字表法随机分为 A 组 (BM-MSCs 创缘皮下移植组，n=12)、B 组 (BM-MSCs 小腿肌肉移植组，n=12)、
C 组 ( 正常大鼠对照组，n=12) 和 D 组 (DFUs 对照组，n=12)。A，B，D 三组大鼠按 50 mg/kg 空腹腹腔注
射 STZ 溶液 ( 配方：用 pH4.4、浓度为 0.1 mol/L 的
柠檬酸 - 柠檬酸三钠缓冲液溶解 STZ，其终浓度为
10 mg/mL)1 次，正常大鼠对照组空腹腹腔注射等量
的柠檬酸 - 柠檬酸三钠缓冲液，1 周后测外周空腹
血糖≥ 16.7 mmol/L[17]，即为大鼠糖尿病造模成功。
将各组大鼠按 0.3 mL/kg 腹腔注射 10% 的水合氯醛
麻醉，根据目前对大鼠 DFUs 模型的报道 [11,18]，本
实验在糖尿病大鼠的双后足背部做一 3 mm×7 mm的全层矩形皮肤缺损，视为足部溃疡造模成功，并
记为第 0 天。每天用 0.5% 的碘伏对足部溃疡消毒 1 次。
1.3.4 BM-MSCs 的移植
弃去含 DAPI 的无胎牛血清培养液，用 PBS 洗
5 次，将 DAPI 标记的 BM-MSCs 用无菌 PBS 制成单
细胞悬液，其细胞浓度为 8.0×106 个 /mL。造模后
当天 ( 第 0 天 )，A 组于双侧后足背皮下 ( 距创缘 5 mm 处、等距 6 点 ) 每个注射点注射 50 μL 细胞悬
液，B 组于双侧小腿肌肉内 (6 点，深度 1 cm，间距
5 mm) 每个注射点注射 50 μL 细胞悬液，C，D 两组
注射等量的无菌 PBS 溶液。
1.3.5 采集样本
于细胞移植后第 2，5，8 和 11 天对足部创面
进行数码拍照，颈椎脱臼处死大鼠，收集足背部创
伤组织标本。将组织标本在创面中部一分为二，
一半用于组织学及免疫组织化学检测，另一半用于
ELISA 及 RT-PCR 的检测，并液氮保存直至检测。
1.3.6 检测指标
1) 创面的愈合率：创面愈合率 =( 原始创面面
积 - 当前测量面积 )÷ 原始创面面积 ×100%。2) 组
织学检测：于各时间点将 A，B 两组的组织标本做
冰冻切片后，立即在荧光显微镜 ( 紫外光激发 ) 下
观察局部蓝光强度及区域大小；其余标本浸入 10%的 中 性 多 聚 甲 醛 /PBS 中 固 定、 石 蜡 包 埋、 切 片 (5 μm 厚 ) 和脱蜡至水，进行 HE 染色，观察各组
创面肉芽组织生成情况，对比其厚度。3) 免疫组
织 化 学 检 测 CD31 和 Ki-67 的 表 达： 组 织 切 片 (5 μm 厚 ) 经脱蜡至水、抗原修复和封闭后，切片上
分别滴加兔抗鼠 CD31 多克隆抗体和兔抗鼠 Ki-67单 克 隆 抗 体，37 ℃ 孵 育 1 h， 随 后 按 照 二 抗 试 剂
盒 说 明 书 进 行， 最 后 用 DAB 显 色、 苏 木 素 轻 度
复 染、 脱 水、 透 明 和 封 片。 分 别 在 10 个 高 倍 视
野 (×400) 下 记 录 CD31 阳 性 血 管 数 目 和 Ki-67 阳
性 细 胞 数 目， 取 其 平 均 值。4)ELISA 检 测 创 伤 组
织 中 VEGF 的 蛋 白 浓 度： 将 标 本 和 PBS 液 ( 含 有
适 量 蛋 白 酶 抑 制 剂 ) 按 100 mg:1 mL 的 比 例 冰 上
匀 浆， 将 匀 浆 液 经 2500 r/min 离 心 20 min 后 收 集
上 清 液， 检 测 步 骤 参 照 ELISA 试 剂 盒 说 明 书。5)RT-PCR 检测 VEGF 在创伤组织中 mRNA 的表达：
按 照 说 明 书 将 组 织 中 总 RNA 经 RNAiso Plus 抽 提
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后，取 1 μg 的总 RNA 反转录成 cDNA，之后采用 20 μL 反应体系进行 PCR 反应。大鼠 VEGF 的引物
序 列： 上 游 5'-GTCCTCACTTGGATCCCGACA-3'，下游 5'-CCTGGCAGGCAAACAGACTTC-3'，扩增产 物 99 bp； 大 鼠 GAPDH 的 引 物 序 列： 上 游 5'-GG- CACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'， 下 游 5'- ATGGTG- GTGAAGACGCCAGTA -3'，扩增产物 143 bp。PCR 具
体 参 数：95 ℃ 预 变 性 30 s，95 ℃ 变 性 5 s，60 ℃扩增 31 s，共 40 个循环。各组数据分别用 D 组第 2 天的数据标准化后，采用 2 －△△ Ct 法 [19] 比较各组
之间 mRNA 的表达量。
1.4 统计学处理
采用 SPSS13.0 统计软件包进行分析，数据用
均数 ± 标准差 (x±s) 表示，组间比较采用单因素方
差分析 (ANOVA)，两两比较采用 LSD-t 法。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 大鼠 BM-MSCs 的体外培养
原代细胞培养 6~7 d 后呈漩涡状、集落生长，
同向排列，逐渐融合成片。经消化传代后，在显微
镜下 (×100) 可见细胞呈梭形、星形、成纤维细胞形
及不规则形生长，胞浆丰富 ( 图 1A)。
2.2 大鼠 BM-MSCs 的体外 DAPI 标记
培养皿中 DAPI 标记 2 h 后，在紫外光激发下，
第 3 代的 BM-MSCs 的细胞核呈梭形或椭圆形，发
出明亮蓝色荧光，有的细胞核格外明亮，有时甚至
可观察到一个细胞中有 2 个微核 ( 图 1B)。
2.3 创面愈合率
足背部原始创面大小为 3 mm×7 mm。创面大
体观显示，第 2 天各组创面已经形成黄褐色或黑色
干痂，痂皮较薄，创周稍红肿，且有少许脓性分泌物。
从第 5 天开始，创面炎症反应明显减轻，痂皮干燥，
面积逐渐缩小，第 8 天时有的干痂已脱落，露出部
分新生表皮，但新生表皮无毛发覆盖 ( 图 2)。第 2，5，
8 和 11 天，C 组的愈合率高于其余 3 组 (P<0.05)，
第 8 天 B 组的愈合率高于 D 组 (P<0.05)，第 11 天
B 组的愈合率高于 A，D 组 (P<0.05，表 1)。
2.4 冰冻切片和 HE 染色结果
在紫外光激发下，冰冻切片结果显示：第 2 天
和第 5 天 A 组的蓝光强度及区域大小均不如 B 组，
而在第 8 天和第 11 天两组没有显著区别。两组切
片的蓝光强度第 5 天均达到最强，并逐渐减弱，蓝
光区域也在第 5 天最大，之后逐渐缩小 ( 图 3)。
HE 染色结果显示：第 2 天各组肉芽组织的厚度无
明显差异。第 5 天 B，C 组之间的肉芽厚度无明显
差异，但比 A，D 组厚，而 A 组肉芽厚度大于 D 组
( 图 4)。伤后第 8 天，各组大鼠的创周新生表皮在
干痂下已大量形成，有的创面干痂已部分脱落，露
出部分新生表皮，但此时的新生表皮和周围正常表
皮相比，其厚度更厚，皮下缺少毛囊和腺管等组织，
属不成熟表皮。
2.5 免疫组织化学检测 CD31 和 Ki-67
CD31 的免疫组织化学染色将小血管的内皮细
胞膜染成棕色 ( 图 5A)。计数每个高倍镜 (×400) 视
野下的小血管数，结果显示：各个时间点的平均小
血管数目 B 组均比 A 组多，但只有第 5 天和第 8 天
有 差 异 (P<0.05)，A，B，C 组 在 第 8 天 和 第 11 天
与 D 组比较均有差异 (P<0.05，表 2)。同样，在早
期的创面边缘和后期的新生表皮下的基底细胞、成
纤维细胞、毛囊上皮细胞和血管内皮细胞均检测到
Ki-67 的表达 ( 图 5B，5C)。计数每个高倍镜 (×400)
视野下的阳性细胞数，A，B 两组的 Ki-67 表达量始
终比对照组高，但与 C 组比较无差异，而与 D 组
比较有显著差异 (P<0.01，表 3)。
2.6 创伤组织中 VEGF 浓度
A，C，D 三组的 VEGF 蛋白浓度随着时间的延
长逐渐增加，第 8 天达到高峰，以后逐渐降低。但
B 组的 VEGF 浓度却一直在增加，第 11 天达到最高。
第 2 天，A，B 两组与对照组之间无差异；第 5 天，A，
B 两组的 VEGF 蛋白浓度高于 D 组 (P<0.01)，而与
C 组相比无差异；第 8 天，B，C 两组的 VEGF 浓度
高于 A 组 (P<0.05)，而 A 组仍高于 D 组 (P<0.01)；
第 11 天，B 组 高 于 其 余 3 组 (P<0.001)， 而 A，C两组高于 D 组 (P<0.05，表 4)。
2.7 RT-PCR 检测创伤组织中 mRNA 的表达
A，C，D 三组的 mRNA 表达量在第 8 天达到
高峰，以后逐渐降低。但 B 组 mRNA 的表达在第
11 天 达 到 最 高。 第 2 天，C 组 与 其 余 3 组 比 较 有
差 异 (P<0.05)； 第 5 天，A，B，C 三 组 之 间 相 比
无差异，但均高于 D 组 (P<0.01)；第 8 天，B 组的
表达量高于 A 组 (P<0.05)，而后者的表达量高于 D组 (P<0.01)； 第 11 天，B 组 与 其 余 3 组 比 较 有 差
异 (P<0.001)， 而 A，C 两 组 的 表 达 量 仍 高 于 D 组(P<0.01，表 5)。RT-PCR 的检测结果和 ELISA 的检
测结果基本吻合。
骨髓间充质干细胞不同移植方式治疗大鼠糖尿病足溃疡的疗效观察 万江波，等 351
表 1 各时间点各组大鼠的创面愈合率 (n=6，x±s，%)
Table 1 Rates of wound contraction on different time points (n=6, x±s, %)组别 第 2 天 第 5 天 第 8 天 第 11 天
A 组 13.38±2.66* 40.68±4.17* 69.11±4.68* 76.36±4.09*#
B 组 13.78±2.40* 45.45±5.72* 72.02±3.59* 83.49±4.02*
C 组 18.70±3.36 53.12±5.46 79.01±3.39 91.27±3.60
D 组 12.85±2.86* 38.73±3.78* 64.44±4.55*# 72.31±5.65*#
与 B 组比较，#P<0.05；与 C 组比较，*P<0.05。
图 2 各组大鼠各时间点的创面照片。
Figure 2 Typical pictures from animals in different groups at different days.
第 2 天 第 5 天 第 8 天 第 11 天
A 组
B 组
C 组
D 组
图 1 第 3 代大鼠 BM-MSCs (×100)。A：未标记；B：DAPI 标记。
Figure 1 The third generation BM-MSCs of rat (×100). A: Unlabel cells; B: Labeled cells by DAPI.
A B
表 2 创伤组织中的小血管数目 (n=10，x±s，个 /HPF)
Table 2 Number of the small blood vessels in wound tissues (n=10, x±s, No./HPF)组别 第 2 天 第 5 天 第 8 天 第 11 天
A 组 10.8±2.2 18.5±3.3 23.7±3.6# 18.2±3.4#
B 组 11.5±2.0 21.9±3.4*# 27.7±4.2*# 19.8±3.3#
C 组 11.9±2.1 23.6±3.7*# 25.5±3.6# 18.3±4.3#
D 组 10.3±2.1 16.4±2.5 20.2±3.3 13.6±3.4
与 A 组比较，*P<0.05；与 D 组比较，#P<0.05。
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图 3 冰冻切片的荧光观察结果 (×100)。第 2 天和第 5 天的 B 组的荧光强度和区域均大于 A 组，而第 8 天和第 11 天没有
明显区别。
Figure 3 Results of fluorescence detection on frozen sections (×100). The intensity and area of the fluorescence in group B are higher
than those in group A on day 2 and 5, but there are no differences between them on day 8 and 11.
第 2 天
第 5 天
第 8 天
第 11 天
A 组 B 组
图 4 HE 染色显示第 5 天各组肉芽组织厚度对比 (×100)。“—”所示为肉芽组织的厚度。
Figure 4 Comparison of the thickness of granulation tissue formation on day 5 by HE staining (×100). “—” represents the
thickness of granulation tissue formation in the pictures.
A
C D
B
骨髓间充质干细胞不同移植方式治疗大鼠糖尿病足溃疡的疗效观察 万江波，等 353
图 5 免疫组织化学检测 CD31 和 Ki-67 (×400)。A：CD31阳性小血管，“ ↑”所示为小血管，阳性染色在细胞膜上；B，C：
Ki-67 阳性的细胞，“↑”所示为毛囊上皮细胞；“↑”所示为基底细胞；“↑”所示为成纤维细胞；“↑”所示为血管内
皮细胞，阳性染色在细胞核上。
Figure 5 Expression of CD31 and Ki-67 detected by immunohistochemistry (×400). A: CD31 positive small blood vessels. " ↑ "
indicates the small blood vessels in the pictures and the positive stain is on the membranes; B, C: Ki-67 positive cells. “ ↑ ” indicates the
hair follicle epithelial cells; “↑”indicates the basal cells; “↑”indicates the fibroblasts; “↑”indicates the vascular endothelial cells, the
positive stain is on the nuclei.
表 3 创伤组织中 Ki-67 阳性细胞数 (n=10，x±s，个 /HPF)
Table 3 Number of Ki-67-positive cells in wound tissues (n=10, x±s, No./HPF)组别 第 2 天 第 5 天 第 8 天 第 11 天
A 组 118.7±16.9** 128.2±18.7** 128.6±14.0** 104.8±14.6**
B 组 114.4±16.9** 123.1±17.5** 126.3±17.2** 106.3±12.6**
C 组 104.1±12.2 114.8±18.7* 119.6±14.6* 97.0±12.7
D 组 94.1±13.5 98.8±14.1 103.5±16.9 85.5±13.3
与 D 组比较，*P<0.05，**P<0.01。
A CB
表 4 VEGF 的表达浓度 (n=6，x±s，pg/mg)
Table 4 Content of VEGF (n=6, x±s, pg/mg)组别 第 2 天 第 5 天 第 8 天 第 11 天
A 组 0.37±0.05 0.77±0.07 △△ 0.90±0.06 △△ 0.81±0.06 △
B 组 0.35±0.04 0.79±0.07 △△ 1.03±0.04* △△ 1.38±0.06** △△
C 组 0.44±0.05 △ 0.85±0.07 △△ 1.02±0.05* △△ 0.84±0.05## △
D 组 0.31±0.05 0.47±0.07 0.69±0.05 0.66±0.05
与 A 组比较，*P<0.05，**P<0.01；与 B 组比较，# #P<0.01；与 D 组比较，△ P<0.05，△△ P<0.01。
表 5 编码 VEGF 的 mRNA 的表达 (n=6，x±s，拷贝数 )
Table 5 Relative mRNA expression levels of VEGF (n=6, x±s, fold changes)组别 第 2 天 第 5 天 第 8 天 第 11 天
A 组 1.49±0.13 2.23±0.20 △△ 3.31±0.30 △△ 2.27±0.19 △△
B 组 1.43±0.14 2.31±0.19 △△ 3.99±0.39* △△ 5.76±0.52** △△
C 组 2.30±0.16*# △ 2.45±0.19 △△ 3.57±0.32 △△ 2.44±0.24## △△
D 组 1.00±0.08 1.41±0.14 1.93±0.19 1.30±0.12
与 A 组比较，*P<0.05，**P<0.01；与 B 组比较，#P<0.05，##P<0.01；与 D 组比较，△ P<0.05，△△ P<0.01。
中南大学学报 ( 医学版 ), 2013, 38(4) http://www.csumed.org; http://xbyx.xysm.net354
3 讨 论
正常创伤愈合是一个具有活力且复杂的过程，它包括血管的闭合、血块的凝固、急性炎症反应、细胞迁移、增殖、分化、血管生成、上皮形成和细胞外基质的合成及重建 [20]。然而，众多因素导致了DFUs 难愈的结果，包括持续的感染、组织缺氧、坏死、渗出液和炎症细胞因子的过度表达等使上述愈合过程停滞或延长了 [20]。而 DFUs 理想的愈合方式应该是减少炎症反应、生成有活力的肉芽组织、增强细胞增殖和血管生成。
BM-MSCs 能够向创伤或炎症病灶中迁移，通过旁分泌生长因子、基质重塑、免疫调节和抗炎等参与受损组织的再生，刺激细胞的增殖和分化，促进受损组织的修复 [17,21]。本实验中采用雄性 Wistar大鼠作为 DFUs 的造模对象，方法简单、实用，并证明了无论是经创缘皮下还是经小腿肌肉内移植DAPI 标记的 BM-MSCs 都能促进大鼠 DFUs 的愈合，但是后者的疗效优于前者。
本实验发现移植 BM-MSCs 可以提高创伤组织中的 VEGF 含量，尤其是经小腿肌肉内移植，在创面愈合的后期 ( 第 11 天 )，VEGF 表达水平显著高于其它各组大鼠。BM-MSCs 能够分泌可溶性、具有促血管增生及细胞保护性作用的因子。VEGF 就是其中的一种，而 VEGF 是目前已知的一种最强的血管生成因子，能增加微静脉和小静脉的通透性，促进血管内皮细胞分裂、移行与增殖，诱导血管生成，促进微血管网的形成，从而为创面修复带来介质及充足的营养并带走局部代谢产物，此外，VEGF 还能刺激肉芽组织及上皮的形成、角质形成细胞和成纤维细胞的移行。抑制血管生成会明显阻碍细胞的浸润、肉芽组织的沉积和上皮化，进而阻碍创面的修复。有研究 [22] 显示：糖尿病慢性创面难以愈合主要取决于缺乏血管生成。而本实验也同样发现小腿肌肉内移植 BM-MSCs 不仅可以提高 VEGF 的表达水平，也能提高创伤组织中的小血管数目 ( 第 5天和第 8 天 )，并加速创面的愈合。此外，高血糖也能损害血管内皮细胞的功能，导致一氧化氮和前列腺素合成下降，而内皮素 -I 和血管紧张素 -II 合成增加 [23]，并降低对 VEGF 的敏感性，损害内皮祖细胞的移行和分化功能 [24]，从而导致局部组织缺血缺氧。而肉芽沉积和上皮化是人类所有慢性溃疡愈合最常见和最主要的机制。因此，细胞再生能力不足、促愈的细胞因子缺乏及血管化减少是影响DFUs 修复的关键因素，而有效地补充缺损部位干细胞的细胞疗法可能成为促进创面修复的新策略。
虽然，干细胞疗法被广大患者及医疗工作者所青睐，但仍有众多未解之谜。基于本实验，未来需
要解决的问题有以下几点：第一，完善在末梢神经病变及微循环病变的基础上的 DFUs 动物模型，从而更加符合临床 DFUs 的病理生理改变；第二，本实验发现：被 DAPI 体外标记的 BM-MSCs 出现在肉芽组织中，推测 BM-MSCs 可能分化成了组织细胞，参与了再生新生组织。应进一步探索再生组织中的何种细胞类型及其数量是由干细胞分化或转化而来，有多少移植的干细胞参与了再生过程，从而揭秘干细胞再生之谜；第三，Lobmann 等 [25] 指出，由于 DFUs 创面的微环境中存在大量的细胞毒物及炎症介质，具有蛋白水解的生物学作用，干细胞很难在创面基底部定位及生长，因而容易导致干细胞在局部创伤组织中的死亡，只有少数的干细胞存活，因此，干细胞疗法缺少一个保护性的传输系统使其发挥最大的再生和旁分泌能力；第四，虽然目前还没有干细胞治疗人类疾病时发生癌变的报道，但Mishra 等 [26] 和 Tolar 等 [27] 分别发现 BM-MSCs 能够分化为癌相关肌成纤维细胞和肉瘤，因此，应用于临床时，应注重干细胞治疗的安全性。
此外，VEGF 的基因疗法也已部分在临床上开展了试验研究，但主要针对的人群是严重冠状动脉疾病的患者，主要研究方向是 VEGF 的基因载体注射后对上述患者缺血心肌的灌注，发现在一定程度上能够改善患者的临床症状 [28-29]。因此，基因疗法也可能成为未来研究治疗 DFUs 的新选择。
志谢
向为本实验提供帮助的兰州军区兰州总医院创
伤骨科研究所的各位老师表示感谢。同时，感谢兰
州军区兰州总医院病理科董亮老师在病理方面对我
的大力帮助。
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(本文编辑 彭敏宁)
本文引用： 万江波 , 蔡黔 , 刘毅 . 骨髓间充质干细胞不同移植方
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Cite this article as: WAN Jiangbo, CAI Qian, LIU Yi. Effect of
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stem cells on diabetic foot ulcers in rats[ J]. Journal of Central South
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