Judul : Penapisan Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Kemangi, Daun Tespong dan Daun Cincau Hijau dengan Metode Spektrofotometri UV-Visible Menggunakan Pereaksi Difenil Pikrilhidrazil (DPPH)

Pembimbing : 1. Ami Tjitraresmi, S.Si., M.Si., Apt.

2. Rini Hendriani, S.Si., M.Si., Apt.

Nama/NPM : Dea Gilang Kancanawatie / 260110070089

1

PENAPISAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DARI EKSTRAK DAUN KEMANGI, DAUN TESPONG DAN DAUN CINCAU HIJAU DENGAN

METODE SPETROFOTOMETRI UV-VISIBLE MENGGUNAKAN PEREAKSI DIFENIL PIKRILHIDRAZIL (DPPH)

Dea Gilang, Ami Tjitraresmi, dan Rini Hendriani Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran, Jatinangor - Sumedang

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari ekstrak daun kemangi, daun tespong dan daun cincau hijau, mengetahui tumbuhan yang mempunyai aktivitas antioksidan terbaik serta mengetahui nilai IC50 dari masing-masing ekstrak terhadap aktivitas antioksidan dengan metode spektrofotometri UV-visible menggunakan radikal DPPH dengan vitamin C sebagai pembanding. Ekstrak etanol ketiga tanaman diperoleh dengan metode maserasi. Konsentrasi sampel yang digunakan untuk daun kemangi adalah 10, 20, 30, 40, 50 dan 60 ppm, untuk daun tespong adalah 25,50,75,100,125 dan 150 ppm sedangkan daun cincau hijau adalah 5,10,15,20,25 ppm. Pengukuran dilakukan pada panjag gelombang 517nm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak cincau hijau memberikan aktivitas antioksidan tertinggi dengan nilai IC50 sebesar 35,895, ekstrak etanol daun kemangi memberikan nilai IC50 sebesar 54,5358 ppm dan ekstrak etanol daun tespong memberikan nilai IC50 sebesar 153,614 ppm. Kata kunci : Antioksidan, DPPH, Kemangi, Tespong, Cincau Hijau

ABSTRACT

This research was aimed to identify the antioxidant activity of ethanol extract from Ocimum sanctum leaves, Oenanthe javanica leaves and Premna oblongifolian leaves with spectrophotometry method by using 1,1-diphenyl 2-picrylhidrazyl with vitamin C as comparasion. Ethanol extract obtained by maceration method using ethanol 70% as solvent. Ocimum sanctum concentration were 10, 20, 30,40, 50 and 60 ppm, Oenanthe javanica were 25, 50, 75, 100, 125 and 150 ppm whereas Prema oblongifolia were 5, 10, 15, 20 and 25 ppm. The measurment were taken ata wavelength 517nm. The result showed that Premna oblongifolia extract gave the highest antioxidant activity with IC50 value of 35,895 ppm, followed by Ocimum sanctum exctract with IC50 values of 54,5358 ppm and Oenanthe javanica exctract with IC50 values of 153,614 ppm. Keywords : Antioxidant, DPPH, Ocimum sanctum, Oenanthe javanica, Premna oblongifolia

2

PENDAHULUAN

Pencemaran lingkungan yang sudah banyak terjadi dan perkembangan pola hidup masyarakat yang semakin kompleks berdampak pada munculnya berbagai penyakit degeneratif akibat terbentuknya radikal bebas dalam tubuh. Bahkan sejak hipotesis radikal bebas mulai berkembang pesat, telah muncul dugaan bahwa radikal bebas mempunyai hubungan dengan terjadinya berbagai macam penyakit, seperti aterosklerosis , katarak, stroke, serta termasuk proses penuaan dini. Sepanjang makhluk hidup terpapar radikal bebas maka diperlukan suatu antioksidan (Limantara,et.,al,2009). Antioksidan merupakan zat yang dapat menetralkan radikal bebas, atau suatu bahan yang berfungsi mencegah sistem biologi tubuh dari efek yang merugikan yang timbul dari proses ataupun reaksi yang menyebabkan oksidasi yang berlebihan (Hariyatmi, 2004). Senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami kebanyakan berasal dari tumbuhan. Senyawa antioksidan alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang dapat berupa golongan flavonoid, turunan asam sinamat, kumarin, tokoferol dan asam-asam organik polifungsional (Kumalaningsih, 2006).

Kemangi (Ocimum sanctum L.) adalah terna kecil yang daunnya biasa dimakan sebagai lalap. Tanaman ini mengandung senyawa flavanoid yang bermanfaat sebagai antiradikal bebas (Wijayakusuma, 1991).

Tespong (Oenanthe javanica (Bl.) DC.) merupakan terna semusim yang ujung batang, daun dan kuncup bunga yang masih muda dapat dimakan sebagai lalap. Tespong juga mengandung flavanoid, senyawa polifenolat dan monoterpena serta sesquiterpen (Heyne, 1987).

Cincau hijau (Premna oblongifolia Merr.) merupakan tanaman obat yang dapat dikonsumsi dalam bentuk pangan

fungsional. Beberapa komponen yang berperan aktif dalam cincau adalah karotenoid, flavonoid, dan klorofil (Mardiah, et.al., 2007).

BAHAN DAN METODE Bahan Bahan tumbuhan : Daun kemangi (Ocimum sanctum L.), daun tespong (Oenanthe javanica (Bl.) DC.) dan daun cincau hijau (Premna oblongifolia Merr.) yang telah dikeringkan dan diperoleh dari daerah Lembang Jawa Barat pada bulan Maret 2011 dan diterminasi di Jurusan Biologi FMIPA-Universitas Padjadjaran. Bahan Kimia : asam hidroklorida 2N, aquadest, amil alkohol, ammonia 10%, DPPH(1,1-difenil 2-pikrilhidrazil), etanol 70% (Bratachem) , etanol 95% (Bratachem), eter, larutan besi (III) klorida, etil asetat, gelatin 1%, kloroform, kalium hidroksida 5%, pereaksi Mayer (mengandung kalium iodida dan raksa (II) klorida), Pereaksi Dragendorff (mengandung bismuth subnitrat dan raksa (II) klorida), Pereaksi Liebermen-Burchard (20 bagian asam asetat anhidrat dengan 1 bagian asam sulfat pekat), serbuk magnesium, pereaksi vanillin-sulfat, vitamin C. Alat Rotary evaporator Laborta 4000 (Heidolph), spektrofotometer UV-visible SPECORD 200 (Analytic Jena®), timbangan analitik (Sartorius®), sonikator (NEY®), plat silica gel GF254 (Merck) dan alat gelas yang biasa digunakan di Laboratorium Bahan Alam Farmasi dan Laboratorium Penelitian. Metode Pembuatan Ekstrak : Daun kemangi, daun tespong dan daun cincau hijau ditimbang, lalu diekstraksi dengan cara maserasi selama 3x24 jam menggunakan pelarut etanol 70%, kemudian diuapkan

3

dengan menggunakan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental.

Penapisan Fitokimia Ekstrak : Penapisan fitokimia dilakukan terhadap ekstrak etanol. Penapisan fitokimia yang dilakukan meliputi penapisan senyawa alkaloid, polifenolat, tanin, flavanoid, monoterpenoid dan sekuiterpenoid, kuinon dan saponin. Penetapan Kadar Air Ekstrak : Penentuan kadar air dilakukan terhadap ekstrak etanol. Penetapan kadar air dilakukan dengan menambahkan toluen sebanyak 200 mL ke dalam labu yang telah berisi 2 mg ekstrak kemudian dipanaskan.

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) : Masing-masing ekstrak ditutulkan pada plat silika yang berukuran 1 x 10 cm. Plat silika diberi batas atas dan batas bawah 1cm sehingga pengembangannya berjarak 8cm. Campuran dari butanol : asam asetat : air (4:1:5) disiapkan sebanyak 10 mL sebagai eluen. Euen dimasukkan ke dalam chamber dan dibiarkan hingga jenuh. Setelah jenuh, plat silika dimasukkan dan dibiarkan hingga eluen menyentuh batas akhir. Plat silika diamati pada sinar tampak, sinar UV 254nm, sinar UV 366nm dan dengan penampak bercak DPPH. Pengujian Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH : Larutan DPPH dibuat dengan konsentrasi 40 ppm dan dientukan operating time DPPH dalam etanol. DPPH : etanol (3:2) di running dengan menggunakan spektrofotometri UV-visible setiap 5 menit selama 3 jam, kemudian dibuat grafik absorbansinya dan dilihat waktu yang stabil. Setelah mendapatkan operating time dari DPPH dalam etanol, operating time DPPH dalam esktrak juga harus ditentukan. Jika operating time sudah ditentukan, pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan. Larutan uji (ekstrak) dibuat

dalam 5 variasi konsentrasi sesuai dengan orientasi yang telah dilakukan. Esktrak etanol daun kemangi dibuat denga konsentrasi 10,20,30,40,50 dan 60 ppm, ekstrak etanol daun tespong dibuat dengan konsentrasi 25,50,75,100,125 dan 150 ppm sedangkan daun cincau hijau dibuat dengan konsentrasi 5,10,15,20 dan 25 ppm.Vitamin C sebagai pembanding juga dibuat dalam 5 konsentrasi yaitu 2, 4, 6, 8 dan 10 ppm. Masing-masing tanaman dan Vtamin C dengan masing-masing konsentrasi dicampurkan dengan DPPH dengan perbandingan DPPH : ekstrak (3 : 2). Setelah dicampurkan, diamkan campuran tersebut selama masa operating time DPPH dalam larutan uji, kemudian campuran di running menggunakan spektrofotometri UV-visible pada panjang gelombang 517nm. Dari absorbansi yang diperoleh, dapat dihitung %inhibisi dan kurva regresi linear. Persamaan garis linear dapat digunakan untuk menghitung nilai IC50. Analisis Data Analisis data uji disolusi digunakan metode statistik ANAVA (analysis of varians) dimana perlakuan antar kelompok dan dalam kelompok di bandingkan serta melihat hasil signifikan atau tidak signifikan . Bila data signifikan dilakukan uji lanjut menggunakan uji LSD (Least Significant Difference). HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi

Hasil ekstraksi daun kemangi (150 g), daun tespong (120 g) dan daun cincau hijau (100 g) secara maserasi dengan etanol 70 % diperoleh ekstrak kental daun kemangi 27,19 g, dauntespong 16,66 g dan daun cincau hijau 19,47 g. Penapisan Fitokimia Hasil penapisan fitokimia ekstrak dapat dilihat pada tabel 1.

Tabel 1. Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak

4

Golongan Senyawa Ekstrak Etanol Daun

Kemangi Ekstrak Etanol Daun Tespong

Ekstrak Etanol Daun Cincau

Alkaloid + - +

Polifenolat + + +

Tanin - - -

Flavonoid + + +

Monoterpenoid dan Sesquiterpenoid + - -

Steroid + - +

Triterpenoid - - -

Kuinon + + +

Saponin + - +

Dari hasil penapisan fitokimia yang dilakukan terhadap ekstrak etanol daun kemangi, ekstrak etanol daun tespong dan ekstrak etanol daun cincau hijau diketahui bahwa pada ekstrak etanol daun kemangi terdapat metabolit sekunder golongan alkaloid, polifenolat, flavonoid, monoterpenoid dan sesquiterpenoid, steroid, kuinon dan saponin. Pada ekstrak etanol daun tespong terdapat metabolit

sekunder golongan flavonoid, polifenolat dan kuinon, sedangkan pada ekstrak etanol daun cincau terdapat metabolit sekunder golongan alkaloid, polifenolat, flavonoid, steroid, kuinon dan saponin. Ketiga ekstrak etanol tanaman tersebut mengandung metabolit sekunder golongan flavonoid dan polifenolat yang dapat berpotensi sebagai antioksidan.

Penetapan Kadar Air Ekstrak Hasil penetapan kadar air ekstrak dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Hasil Penetapan kadar Air Ekstrak

Ekstrak Jumlah air

(mL) Jumlah ekstrak

(gram) % Kadar air

Cincau Hijau Kemangi Tespong

0,1 mL 0,2 mL 0,2 mL

2,24 gr 2,00 gr 2,00 gr

4,46 % 10 % 10%

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Hasil kromatografi lapis tipis dengan menggunakan pengembang butanol:asam asetat:air (4:1:5) menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun kemangi memiliki tujuh bercak, ekstrak etanol daun tespong memiliki lima bercak dan ekstrak etanol

daun cincau hijau pohon memiliki tiga bercak. Pada hasil kromatografi lapis tipis dengan penampak bercak larutan DPPH (40 ppm), adanya perubahan warna menjadi kuning dengan latar belakang berwarna ungu menunjukkan keberadaan senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan.

5

Tabel 3. Hasil kromatografi Lapis Tipis

Tumbuhan

No

bercak

Harga Rf

Sinar Tampak

Sinar UV 254 nm

Sinar UV 366 nm

Penampak Bercak DPPH

Kemangi

1 2 3 4 5 6 7

0,075 0,3

0,5875 0,7 0,85 0,9 0,95

- Kuning

- - - -

Hijau

- Cokelat Cokelat

- Cokelat

- Cokelat

Hijau Hijau Biru Biru Biru

Oranye Merah muda

- Kuning Kuning

- Kuning

- Kuning

Tespong

1 2 3 4 5

0,3

0,5 0,725 0,8875 0,95

Kuning - - - -

Cokelat

Cokelat - -

Cokelat

Hijau-cokelat

Biru Biru Biru

Merah muda

Kuning

Kuning - - -

Cincau hijau

1 2 3

0,05 0,3 0,95

Kuning Kuning Hijau

Cokelat Cokelat Cokelat

- Oranye Merah muda

Kuning -

Hijau

Hasil Pengujian Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH Pengujian aktivitas antoksidan terhadap ekstrak daun kemangi, tespong dan cincau hijau dilakukan dengan menggunakan pereaksi 1,1 difenil-2-pikril-hidrazil (DPPH) dengan metode spektrofotometri uv-visible. Senyawa 1,1-difenil-2-pikril-hidrazil (DPPH) merupakan molekul radikal bebas yang stabil dengan adanya delokalisasi elektron di sekitar

molekulnya. Sebelum pengujian aktivitas antioksidan dilakukan terlebih dahulu penentuan operating time arutan DPPH dalam etanol yang bertujuan untuk mengetahui waktu kerja paling baik atau paling stabil dari larutan DPPH. Dari hasil pengukuran diperoleh waktu kerja yang terbaik mulai dari menit ke -15 sampai menitke-30. Kurva operating time DPPH dalam etanol dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Kurva Operating Time DPPH dalam Etanol

0,62

0,63

0,64

0,65

0,66

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190

abso

rban

si

menit

6

Dalam pengujian aktivitas antioksidan dengan menggunakan DPPH, parameter yang digunakan untuk menginterpretasikan hasil uji adalah IC50. Nilai IC50 dihitung dari persamaan regresi linear yang menyatakan hubungan antara konsentrasi ekstrak (pada sumbu x) dan persen inhibisi (pada sumbu y) yang menunjukkan aktivitas peredaman DPPH. Persen inhibisi dihitung dari

pengurangan absorban hitung DPPH blanko dengan absorban hitung bahan uji.

% ��ℎ����� = 1 − � ��� �������� � 100%

Hasil pengujian aktivitas antioksidan ekstrak etanol daun kemangi, daun tespong dan daun cincau hijau dapat dilihat pada tabel 4.

Tabel 4. Data Persentase Inhibisi Larutan Uji terhadap DPPH

Tanaman No Konsentrasi

(ppm) Persen Inhibisi

(%)

Kemangi

1 2 3 4 5 6

10 20 30 40 50 60

11,284 % 19,498 % 28,662 % 37,159 % 45,529 % 55,255 %

Tespong

1 2 3 4 5 6

25 50 75 100 125 150

8,801 % 17,522 % 26,541 % 33,234 % 41,134 % 48,219 %

Cincau hijau

1 2 3 4 5

5 10 15 20 25

7,382 % 13,730 % 18,942 % 28,806 % 34,848 %

Hasil pengukuran daya antioksidan ekstrak etanol daun kemangi, daun tespong dan daun cincau hijau pohon selanjutnya dibandingkan dengan vitamin C. Sebagai antioksidan, vitamin C berkerja dengan memberikan atom hidrogen untuk menangkap elektron yang tidak

berpasangan pada radikal bebas. Vitamin C juga mempunyai kelarutan yang baik dalam pelarut yang polar. Hasil pengujian aktivitas antioksidan dari larutan pembanding dengan berbagai konsentrasi dapat dilihat pada tabel 5.

Tabel 5. Data Inhibisi dari Larutan Pembanding (Vitamin C) terhadap DPPH

No Konsentrasi

(ppm) Persen Inhibisi (%)

1 2 3 4 5

2 4 6 8 10

15,621 % 30,855 % 45,585 % 63,965 % 74,799 %

7

Nilai persen inhibisi untuk masing-masing lautan uji dan larutan pembanding dengan berbagai konsentrasi digunakan untuk membuat persamaan regresi linier. Hasil

pengukuran aktivitas antioksidan larutan uji dengan larutan pembanding dapat dilihat di Tabel 6.

Tabel 6. Hasil Pengukuran Antioksidan

Sampel uji Konsentrasi (µg/mL)

Persen inhibisi (%)

Persamaan Regresi Linier IC50 (µg/mL)

Ekstrak etanol daun kemangi

10 11,2848 y = 0,8755x + 2,2539 54,5358

20 19,4980 R² = 0,9995

30 28,6625

40 37,1590

50 45,5290

60 55,2553

Ekstrak etanol daun tespong

25 8,8014 y = 0,3139x + 1,7804 153,614

50 17,5227 R² = 0,9976

75 26,5412

100 33,2342

125 41,1348

150 48,2194

Ekstrak etanol daun cincau hijau

5 7,3820 y = 1,4002x – 0,2606 35,895

10 13,7303 R² = 0,9903

15 18,9424

20 28,8068

25 34,8481

Vitamin C

2 14.3241 y = 7.965x - 0.595 6.3522

4 31.3445 R² = 0.994

6 47.7077

8 65.9230

10 76.6909

Hasil uji menunjukkan nilai IC50 untuk masing-masing ekstrak etanol daun kemangi, tespong, dan cincau hijau secara berturut-turut adalah 54,5358 ppm, 153,614

ppm, dan 35,895 ppm. Nilai IC50 terkecil dimiliki oleh ekstrak etanol daun cincau hijau, yang menunjukkan bahwa

ekstrak tersebut memiliki aktivitas antioksidan yang paling kuat kuat dibandingkan dengan ekstrak lain yang diuji.

8

Analisis Data Hasil analisis statistik menggunakan

SPSS 17.0 (Statistical Package for Social Science)

terhadap aktivitas antioksidan tiga sampel uji dapat dilihat pada Tabel 7.

Tabel 7. Tabel Anava Kombinasi Sampel dan Konsentrasi

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups 37166.692 3 12388.897 5026.836 .000

Within Groups 19.716 8 2.465

Total 37186.408 11

Tabel ANAVA menunjukkan pada tingkat kepercayaan 99% faktor jenis sampel memberikan pengaruh signifikan terhadap daya inhibisi berdasarkan perbandingan nilai signifikan 0,000 < α = 0,01. Oleh karena itu diperlukan uji lanjut untuk

mengetahui faktor yang memberikan pengaruh lebih besar menggunakan uji LSD (Least Significant Difference). Hasil uji lanjut terhadap pengaruh sampel dan konsentrasi dapat dilihat pada Tabel 8.

Tabel 8. Uji Lanjut Pengaruh Sampel

(I) tumbuhan (J) tumbuhan Mean Difference

(I-J) Std. Error Sig.

kemangi

tespong -101.68388* 1.28181 .000

cincau 12.45143* 1.28181 .000

Vitamin c 48.13088* 1.28181 .000

tespong

kemangi 101.68388* 1.28181 .000

cincau 114.13531* 1.28181 .000

Vitamin c 149.81477* 1.28181 .000

cincau

kemangi -12.45143* 1.28181 .000

tespong -114.13531* 1.28181 .000

Vitamin c 35.67946* 1.28181 .000

Vitamin c

kemangi -48.13088* 1.28181 .000

tespong -149.81477* 1.28181 .000

cincau -35.67946* 1.28181 .000

Dari tabel di atas diketahui bahwa terdapat perbedaan bermakna secara statistik antara nilai IC50 ekstrak etanol ketiga tanaman dengan nilai IC50 vitamin C.

KESIMPULAN DAN SARAN Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun kemangi, daun tespong dan daun cincau hijau mempunyai aktivitas antioksidan dengan kemampuannya

9

menangkap radikal bebas DPPH. Ekstrak etanol daun cincau hijau memberikan aktivitas antioksidan tertinggi dengan nilai IC50 sebesar 35,895 ppm 6 kali lebih lemah dibandingkan vitamin c, ekstrak etanol daun kemangi memberikan nilai IC50 sebesar 54,5358 ppm 9 kali lebih lemah dibandingkan vitamin c dan ekstrak etanol daun tespong memberikan nilai IC50 sebesar 153,614 ppm lebih lemah 24 kali dibanding vitamin c.

Disarankan dapat dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai penelusuran senyawa aktif antioksidan yang terkandung dalam ekstrakdan fraksi-fraksi atau isolat yang mempunyai aktivitas antioksidan yang terbaik atau aktivitas antioksidan yang kuat..

DAFTAR PUSTAKA Hariyatmi. 2004. Kemampuan Vitamin E

Sebagai Antioksidan Terhadap Radikal

Bebas pada Lanjut Usia. MIPA. 14(1):52-60.

Heyne,K. 1987. Tumbuhan berguna Indonesia. Terjemahan Badan Litbang Kehutanan Jakarta. Jilid III. Yayasan Sarana Wana Jaya. Jakarta.

Kumalaningsih,S.2006. Antioksidan Alami. Cetakan Pertama.Trubus Agrisaranan. Surabaya.hal 24-25.

Limantara, L., M.Silitonga., dan Y.Hana. 2009. Antioksidan Dalam Sediaan Obat, Kosmetik , Makanan dan Minuman. Tersedia di: http://www.stifar.ac.id/seminar-nasional-30-mei-2009.php (Diakses tanggal : 7 Januari 2011).

Mardiah, et.al. 2007. Makanan Anti Kanker. Kawan pustaka. Jakarta Selatan.

Wijayakusuma, H., S. Dalimartha, A.S. Wirian.1992-1996.Tanaman Berkhasiat Obat Di Indonesia. Jilid 1-4. Pustaka Kartini,Jakarta.

10