Ministerio de Educacin,Cultura, Ciencia y Tecnologa

Instituto de Educacin Superior

Domingo Faustino Sarmiento

PROFESORADO PARA

LA EDUCACIN SECUNDARIA EN QUIMICA

-2014-

ELECTROFORESIS

La electroforesis. es la migracin de iones en un campo elctrico, se utiliza ampliamente para la separacin analtica de molculas, biolgicas.

El uso de la electroforesis para separar protenas lo inform por primera vez en 1937 el bioqumico sueco Arne Tiselius. La tcnica que l introdujo, electroforesis de entorno mvil, fue una de las pocas tcnicas analticas poderosas disponibles en los primeros aos de la qumica de protenas. Sin embargo, dado que el mtodo tiene lugar por completo en solucin, la prevencin de la mezcla convectiva de las protenas migrantes requera un aparato complicado y un gran volumen de muestra. Por ello la electroforesis de entorno mvil se reemplaz por electroforesis zonal, una tcnica en la que el desplazamiento de una protena est limitado a un soporte slido como el papel de filtro, el acetato de celulosa o, ms a menudo, un gel. Esto elimina en gran medida la mezcla por convexin de la muestra que limita la resolucin en la electroforesis de entorno mvil. Adems, en la modalidad zonal los componentes de la muestra migran como bandas discretas (zonas), por lo que solo se requieren pequeas cantidades de material.A. Electroforesis en papel En la electroforesis en papel la muestra se coloca en un punto sobre una tira de papel de filtro o de acetato de celulosa embebida en buffer. Los extremos de la tira se sumergen en reservorios separados de buffer en los que se colocan los electrodos (fig. 1). Al aplicar una corriente directa los iones de la muestra migran hacia los electrodos de polaridad opuesta a velocidades caractersticas. Al completarse el electroforetograma, se seca la tira y se localizan los componentes de la muestra usando los mtodos de deteccin empleados en la cromatografa de papel.

La electroforesis y la cromatografa en papel son similares, la primera separa los iones en mayor medida sobre la base de sus cargas inicas, mientras que la segunda separa las molculas en funcin de sus polaridades. Los dos mtodos pueden combinarse en una tcnica bidimensional denominada huella digital. Por lo tanto, las molculas se separan tanto en funcin de su carga como de su polaridad.

B. Electroforesis en gel

Mtodo ms conveniente para la separacin de macromolculas, suplant a la electroforesis en papel. Los geles ms usados, poliacrilamida y agarosa, tienen poros de dimensiones moleculares cuyos tamaos pueden especificarse. Por ello, las separaciones moleculares se basan en la filtracin en geles y en las movilidades electroforticas de las molculas que se intentan separar. Los geles utilizados retardan las molculas grandes en comparacin con las de menor tamao. Dado que las molculas de una muestra no pueden abandonar el gel, el movimiento electrofortico de las ms grandes se ve impedido en comparacin con el de las ms pequeas.En la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) los geles se forman por polimerizacin de la acrilamida y la N,N-metileno bisacrilamida inducida por radicales libres en un buffer (fig. 2). Por lo general en gel se arma como una plancha rectangular delgada en la que pueden analizarse varias muestras en calles paralelas en forma simultnea (fig. 3), lo que permite comparar muestras similares. El buffer, que es el mismo en ambos reservorios y en el gel, tiene un pH tal (en general alrededor de 9 para las protenas) que las macromolculas tienen carga negativa, por lo que migran hacia el nodo ubicado en el reservorio inferior. Cada muestra, que puede contener no ms de 10 g de material macromolecular, se disuelve en una cantidad mnima de una solucin relativamente densa de glicerol o sacarosa que previene la mezcla con el buffer del reservorio superior. La muestra se coloca en fosas preformadas en la parte superior del gel como se muestra en la figura 3. Como alternativa, puede estar corto de gel para muestra, cuyos poros son demasiados grandes como para impedir la migracin de las macromolculas. A continuacin se aplica al gel una corriente directa alrededor de 300 V por un tiempo suficiente para separar a los componentes macromoleculares en una serie de bandas discretas. El gel se retira de su compartimiento y se le aplica un mtodo adecuado para visualizar las bandas de macromolculas. Mediante esta tcnica, una mezcla proteica de 0,1 a 0,2 mg puede resolverse en hasta 20 bandas discretas.

Fig. 2

Fig. 3: aparato para electroforesis en gel en forma de lmina.

a. La electroforesis en disco mejoro la resolucin

La estrechez de las bandas en el mtodo anterior y, por lo tanto, la resolucin de las separaciones, est limitada por la longitud de la columna de muestra al ingresar en el gel. Las bandas pueden definirse mejor mediante una tcnica ingeniosa conocida como electroforesis de pH discontinuo o electroforesis en disco, que requiere un sistema de 2 geles y varios buffers diferentes (fig. 4). El gel de resolucin, en el que tiene lugar la separacin de los componentes de la muestra, se prepara como se describiera antes y sobre l se coloca luego un gel corto (1 cm) de poros grandes denominado "espaciador" o "de apilamiento".

Los buffers del reservorio inferior y del gel de resolucin son como se describi antes, mientras que el que contiene a la muestra y el del gel espaciador tiene un pH 2 unidades menor que el del reservorio Inferior. El pH del buffer del reservorio superior, que debe contener un cido dbil (por Io general glicina) Se ajusta a un valor cercanoal del reservorio inferior. Cuando se conecta la corriente los iones del buffer del reservorio superior migran dentro del gel espaciador a medida que los iones del buffer de este gel migran por delante. Cuando esto ocurre, los iones del buffer del reservorio superior encuentran un pH mucho menor que su pK. por Io tanto, asumen su forma no cargada (o, en el caso de la glicina, zwitterinica) y carecen de movilidad electrofortica. Los aniones macromoleculares migran con rapidez hasta alcanzar la regin que contiene los iones del buffer del gel espaciador, donde se frenan por no haber all deficiencia de iones. Este efecto hacen que los iones macromoleculares se aproximen al gel de resolucin como apilamientos de bandas o discos muy estrechos (alrededor de 0.01 mm) ordenados de acuerdo movilidades y que se ubiquen entre los iones migrantes del reservorio superior y los del gel espaciador. A medida que los iones macromoleculares ingresan en el gel de resolucin reducen su velocidad de migracin como resultado del efecto de filtracin por gel. Esto permite que los iones del buffer del reservorio superior alcancen las bandas macromoleculares y, debido al mayor pH del gel de resolucin, asuman su forma cargada por completo a medida que entran en el gel. En ese momento desaparece la deficiencia de portadores de carga y a partir de all procede normalmente la separacin electrofortica.

Fig. 4: diagrama de una electroforesis en discob. Los geles de agarosa se usan para separar por electroforesis grandes molculas

Los poros muy grandes necesarios para las separacin por PAGE de compuestos de masas moleculares grandes (> a 200 KDa) requieren que geles tengan una concentracin de poliacrilamida tan baja (< a 2,5 %) que son demasiado blandos para manipularse. Esta dificultad se soluciona por el uso de agarosa. Por ejemplo, para la separacin electrofortica de cidos nucleicos con masas moleculares de hasta 50000 kDa se usa un gel de agarosa al 0,8 %. c. Las bandas en el gel pueden detectarse por tincin, conteo radiactivo o inmunoblot Las bandas resultantes de la separacin electrofortica pueden localizarse por distintas tcnicas. Con frecuencia las protenas se visualizan por tincin. El azul brillante de Coomasie.

Que es el colorante ms usado para este propsito, se aplica al sumergir al gel con solucin alcohlica acdica del colorante. Esto fija a la protena en el gel al desnaturalizarla y forma un complejo con el colorante. El exceso de colorante se retira mediante el lavado repetido del gel con una solucin acdica o por decoloracin electrofortica. Con este procedimiento pueden detectarse bandas que contienen 0,1 g de protena. Si Se dispone de un anticuerpo contra la protena de inters es posible detectar de manera especfica esa protena en el gel entre medio de otras protenas mediante una tcnica de inmunotransferencia (tambin conocida como Western blot). Este procedimiento es una variante del Southern blot y utiliza una tcnica similar al ELISA para detectar la protena de inters (fig.): 1. Se transfiere un electroforetograma en gel a una hoja de nitrocelulosa, que une protenas con firmeza y en forma no especfica (tambin pueden utilizarse membranas de nailon o difluoruro de polivinilidina (PVDF).

2. Los sitios de adsorcin de la nitrocelulosa no ocupados por protenas del gel se bloquean con una protena no especfica como casena (protena de la leche; en general se emplea leche descremada) para prevenir la adsorcin no especfica de los anticuerpos usados en los pasos 3 y 4 (que tambin son protenas.

3. La membrana se incuba con el anticuerpo contra la protena de inters (anticuerpo primario), que por lo general se obtiene en el conejo.

4. Luego de eliminar por lavado el exceso anticuerpo primario, la membrana se incuba con un anticuerpo de cabra dirigido contra el anticuerpo de conejo, al que se le acopl de manera covalente una enzima detectable con facilidad (anticuerpo secundario).

5. Luego de eliminar el exceso de anticuerpo secundarlo, la enzima acoplada al anticuerpo unido se detecta mediante una reaccin cromognica, lo que hace que aparezcan bandas coloradas sobre la nitrocelulosa en el lugar donde estaba la protena de inters.

Fig. 5: deteccin de protenas por Western blotD. Isoelectroenfoque Una protena tiene grupos cargados de ambas polaridades, por lo que presenta un punto isoelctrico, pI, el pH al que es inmvil en un campo elctrico. Si se somete a electroforesis una mezcla de protenas a travs de una solucin que tenga un gradiente estable de pH en el que ste se incrementa en forma paulatina desde el nodo hacia el ctodo, cada protena migrara a la posicin en el gradiente de pH que corresponda a su punto isoelctrico. Si una protena se difunde fuera de esa posicin, su carga neta cambiar medida que Se mueve a una regin de distinto pH, y las fuerzas electroforticas resultantes la forzaran a moverse de nuevo a la posicin isoelctrica. De esta manera, cada protena se "enfoca" en una banda estrecha alrededor de su punto isoelctrico, que puede ser tan delgada como 0,01 unidades de pH. Este proceso se denomina isoelectroenfoque (IEF).

La capacidad del IEF de separar las protenas en bandas definidas lo hace til como herramienta analtica y preparativa. De hecho, varias preparaciones proteicas que se crean homogneas se separaron en varios componentes mediante IEF. ste puede combinarse con la electroforesis en una tcnica de separacin bidimensional en extremo poderosa denominada electroforesis bidimensional.

Formula general de los anfolitos usados en isoelectroenfoque

E. Electroforesis capilar Aunque la electroforesis en gel en sus distintos formatos es un mtodo comn y muy eficaz para la separacin de molculas cargadas, suele requerir corridas de 1 hora o ms y es difcil de cuantificar o automatizar. Estas desventajas Se superan en gran medida por el uso de la electroforesis capilar (EC), una tcnica en la que la electroforesis se realiza en tubos capilares muy delgados (20 a 100 m de dimetro interno) hechos de cuarzo, vidrio o plstico. Estos tubos capilares disipan el calor con rapidez y por lo tanto permiten el uso de grandes campos elctricos (por lo general 100 a 300 V/ cm unas 10 veces superior al de la mayora de las otras tcnicas electroforticas), lo que reduce los tiempos de separacin a unos pocos minutos. Estas separaciones rpidas, a su vez, minimizan el ensanchamiento de las bandas debido a la difusin, con lo que se logran separaciones en extremo definidas. Estas tcnicas de EC tienen una resolucin en extremo elevada y pueden automatizarse de manera similar a la CLAR, esto es con carga automtica de la muestra y deteccin de la muestra en lnea. Dado que la EC solo puede separar pequeas cantidades de material, se la utiliza nicamente con tcnica analtica.

BibliografaVoet, D. y Voet, J.bioquimica. Tercera edicin. Editorial medica panamericana. Bs. As. 2006.

http://books.google.com.ar/books?id=r5bedH_aST0C&pg=PA152&dq=electroforesis&hl=es&sa=X&ei=6qVjVIDMLubvigLE84GIAQ&ved=0CCYQ6AEwAg#v=onepage&q=electroforesis&f=false [visto el 9/11/2014] Fig. 1: electroforesis en papel.