tiempo (h) Densidad óptica (Promedio)

0 0.0116.05 0.02759.58 0.0425

24 0.153527 0.138530 0.12133 0.204548 0.21151 0.215554 0.2275

Metodologia de Bradford

Una alícuota de 800 µL de cada estándar en un tubo eppendor 1.5 mL. Los ensayos son por duplicado o triplicado.

Añadir 200 µL del reactivo de Bradford en cada tubo y vortexear

Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos. La absorbancia va aumentando con el tiempo por lo que no debe incubarse a temperatura ambiente por mas de 1 hora

Leer la absorbancia a 595 nm

La electroforesis es una técnica que se utiliza para analizar y determinar el peso molecular de diferentes tipos de biomoleculas, pero es mas común utilizarla para proteínas y acidos nucleicos. Existen diversos tipos de electroforesis cuya diferencia radica en los distintos tipos de medios de soporte; los geles de celulosa son usados para moléculas de bajo peso molecular como los aminoácidos y los carbohidratos, los geles de poliacrilamida y agarosa se utilizan para moléculas de mayor peso molecular (DNA, RNA y proteínas). Los geles de electroforesis pueden ser horizontales, verticales o cilíndricos (capilares). Las condiciones electroferitcas pueden variar; por ejemplo, la electroforesis de “zona” utiliza un amortiguador a pH constante durante todo el tiempo de separación. En la electroforesis de gel discontinuo se utilizan dos diferentes geles, uno concentrador y uno separador. Estos geles son preparados con amortiguadores de diferentes fuerza ionica, pH y tamaño de poro El isoelectroenfoque utiliza un gel con gradiente de pH y se utiliza para sustancias anfotericas, sirve para conocer el punto isoeléctrico.

En la electroforesis en gel de poliacrilamida, el soporte esta constituido por una red tridimensional formada por la polimerización de la acrilamida con N,N’ metilen bis acrilamida controlada por un sistema d catálisis con el persulfato de amonio y N,N,N’,N’ tetrametiletilendiamina (TEMED. La concentración de poliacrilamida puede variar de acuerdo al tamaño de la molecula que se desea separar, por ejemplo, 7.5% de poliacrilamida para separar proteínas de peso molecular mediano, en cambio si se utiliza una concentración baja de poliacrilamida 5% se separan proteínas de alto peso molecular; en contraste si la concentración de poliacrilamida es alta el poro es pequeño y sirve para analizar proteínas de bajo peso molecular. Las ventajas de utilizar la poliacrilamida son

Alta resolución (1x10^6 daltons)

Acepta moléculas relativamente grandes

Hay una interaccion minima de la molecula que migra con la matriz del gel

El gel tiene una estabilidad física, la desventaja es que el monómero de la acrilamida es altamente neurotóxico por lo tanto debe de manejarse con mucha precaución.

Para proteínas se pueden utilizar geles en condiciones nativas, en los que las proteínas mantienen su conformación y geles desnaturalizantes, en los que se agrega un detergente: (SDS) y un agente reductor 2 mercaptoetanol (rompe enlaces disulfuro) lo que provoca que las proteínas pierdan su estructura secundaria, terciaria y cuaternaria produciendo un polipeptido de cadena lineal y el SDS le confiere una carga negativa