EPR spektroskopija- osnovni principi i primene -

Univerzitet u Beogradu

Miloš Mojović, v.prof.

milos@ffh.bg.ac.rs

Fakultet za fizičku hemiju Centar za fizičku hemiju bioloških sistema

Elektronska ParamagnetnaRezonancija

Terminologija

• Elektronska Paramagnetna Rezonancija (EPR)• Elektronska Spinska Rezonancija (ESR)• Elektronska Magnetna Rezonancija (EMR)

EPR = ESR = EMR

Početak EPR priče - Zeman

Pieter Zeeman1865 - 1943

• Proučavao je uticaj magnetnog polja naatomske spektralne linije

• Njegov profesor Onnes nije želeo daZeman gubi vreme na ove eksperimente.

• Snimio je atomski spektar Na u jakommagnetnom polju.

• Primetio ja da su diskretne linije jako maloproširene.

• Ovo je danas poznato kao Zemanovefekat.

• Onnes je zbacio je Zemana saUniverziteta Lieden!

Heike Onnes1853-1926

Zemanovo cepanje• Zeman je našao novo mesto na Univerzitetu u

Amsterdamu.• Ovo otkriće je objavio u časopisu „Nature“ 55, 347

(1897), sa zahvalnicom:

• Zeman 1902. dobija Nobelovu nagradu za otkrićeuticaja magnetizma na zračenje.

Pieter Zeeman1865 - 1943

Zemanovo cepanje

Pieter Zeeman1865 - 1943

• Šta je to Zemanovocepanje?

• Razlika od 0.2 nm upolozaju spektralnih linijaje ...

• Ali dublete. tj. cepanje od0.015 nm nije bilo lakoobjasniti.

• Postojanje ugaonih (L) imagnetnih (Lz) momenatanije moglo objasnitipostojanje ovih dubleta.

• Pauli je predložio da sepostojanje ovih dubletaobjasni ukoliko elektroni saistim kvantnim brojevima: n,l, ml postoje u parovima.

L2=l(l+1)ћ; l=0,1,2..nLz=ml ћ; ml=-l…0…l

Wolfgang Pauli 1900-1958

Štern-Gerlahov eksperiment

• Atom srebra zbog svojeelektronske konfiguracije nemaugaoni ni magnetni moment (l=0).

• Ali snop atoma se pocepao na dvadela!?

Ag

Otto Stern Walther Gerlach

Bez magnetnog polja Sa magnetnim poljem

• Poslali su pismo Nilsu Boru.• Elektron mora da poseduje još

jedan stepen slobode, ugaonimoment, koji ima dve vrednosti.

Niels Bohr

• 1922. godine Stern i Gerlah izvode epohalni eksperinet.

Elektronski spin

George Uhlenbeck1900-1988

Samuel Goudsmit1902-1978

• Sva ova opažanja su probali daunifikuju Uhlenbeck i Goudsmit.

• To je spin, elektron se vrti okosebe!!!

• Ali, kada su ovo poslali Pauliju, onih je ismejao kao i HendrickLorentz.

Wolfgang Pauli 1900-1958

Hendrik Lorentz1853-1928

Ako se elektron stvarno vrti oko sebe, onda bi njegovapovršina morala da se kreće 10 x c !!! To je glupost,kaže Lorentz.

Elektronski spin

George Uhlenbeck1900-1988

Samuel Goudsmit1902-1978

• Ali, Uhlenbeck i Goudsmit su bili većposlali rad o „vrtecem elektonu“ zapublikovanje ...

• Molili su svog mentora Erenfesta dabrzo povuče rad sa publikacije.

• Erenfest im je rekao da su oni mladi,i da nemaju šta da izgube ....

• Ili su lupili glupost, ili će biti slavni.

Paul Ehrenfest(1880-1933)

• Danas znamo da elektron ima spin, ali ipak je ostalonerazjašnjeno pitanje o faktoru 10xc.

• Najnoviji dogovor je da se spin smatra kao intristična osobinaelektrona (kao npr. pojam mase ili elementarnognaelektrisanja), i da se on u realnosti ne vrti oko sebe.

• Zemanovo cepanje nivoa usled postojanja spina je konačnopotvrđeno.

Ener

gija

Ms

±½

B = 0

Magnetno polje (B)

∆Bpp

hν = gβB

EPR – opšti principi

Ms = +½

Ms = -½

h Plankova konstanta 6.626196 x 10-34 Jsν frekvencija (GHz)g g-faktor (približno 2.0)β Borov magneton (9.2741 x 10-24 J/T)B magnetno polje (Gauss ili T)

∆E=hν=gβB

B > 0

N

N

S

S

Kazan University: 1944, EPR, E. Zavoisky

Prvi EPR uređaj E. Zavoisky: 10 MHz (još radi)

Bruker Elexsys 580/680 (2006): X and W -bandsZavoisky LAB - Kazan

Klasični EPR instrument

EPR instrument na FFH

Shema EPR spektrometra

EPR cavity (rezonator)• Kao posledica rezonancije, u rezonatoru se stvara stojeći

EM talas.• Rezonatori se karakterišu pomoću tzv. Q-faktora koji

pokazuje koliko efikasno rezonator "čuva" mikrotalasnuenergiju.

• MT energija se gubi na zidovima rezonatora.• Mnogi uzorci imaju nerezonantnu apsorpciju mikrotalasa.• Magnetno polje je ono koje je odgovorno za "korisnu"

apsorpciju MT.

Q =2π (energija sačuvana)

energija izgubljena u toku ciklusa

Količina MT koja ulazi ikoja se reflektuje izrezonatora kontrolišese pomoću irisa

Tipovi rezonatora

Princip detekcije signala u EPR spektroskopiji modulacija magnetnog polja

ne

da

može

Modulacija magnetnog polja ‘skenira’ apsrorpcionu liniju i EPR spektar je prvi izvod apsorpcione linije

Na kom principu radi modulacija magnetnog polja?

Fazno osetljiva detekcija

• Magnetno polje koje "oseća uzorak" se moduliše (menja) primenomspecifične modulacione frekvencije (uobičajeno je 100 kHz).

• EPR signal, transformiše se u sinusoidni talas.• Modulisani EPR signal se zatim poredi sa referentnim signalom.• Uređaj koji ovo radi zove se fazno osetljivi detektor (lock-in-amplifier).

Pošto se se na ovaj način"gase" svi signali koji neispunjavaju gornji uslov, EPRsignal se čisti od šuma.

Modulacija signala i vremenska konstanta

Pažnja:

• Treba pažljivo birati mikrotalasnu frekvenciju, amplitudu i vremensku konstantu.

• Ukoliko isuviše povećamo modulacionu amplitudu gubimo finu strukturu EPR linija.

• Ukoliko isuviše povećamo vremensku konstantu dolazi do "preskoka" i šiftovanja EPR signala.

• Povećanjem modulacine frekvencije možemo izgubiti finu strukturu EPR signala.

Kako se može dobiti EPR signal?

Drži se konstantna mikrotalasna frekvencija a kontinualno semenja magnetno polje (starije CW mašine)Na konstantnom magnetnom polju primeni se pulselektromagnetnih talasa (novije mašine) – analogno FTNMRRazvoj pulsnih EPR spektrometara je dugo bio ograničennepostojanjem elektronike koja radi u nanosekundnimrežimima.

Pulsni EPR

FID

Spektar

Jedan od najpopularnijih pulsnih EPR tehnika je dvostrukaelektronsko-elektronska rezonanca (DEER), koja je takođepoznata kao dvostruka pulsirajuća elektrona-elektronskarezonanca (PELDOR).

Pitanje:

Čemu snimati spektar nesparenog elektrona i za to koristiti instrumente koji su jako skupi, ako se dobije samo ovo.. ?!

Odgovor:Pitanje ne uzima u obzir različite interakcije spinovau sistemu i mogućnosti da se iz toga izvukuinformacije o sistemu koji se istražuje.

• Pozicija pikova (g-faktor)• Multipletnost (hiperfina interakcija)• Oblik linije (širina linije, simetrija, itd.)• Intenzitet (amplituda/površina pika)

Sve ovo se koristi kao "otisak prsta" prilikom identifikacije vrste i količine ispitivane vrste

Šta se meri pomoću EPR-a?

ampl

ituda

širina linije cepanje linija

EPR HamiltonijanOpšti princip – čestice sa nesparenim spinovima rezonantno apsorbuju elektromagnetno zračenje kada se nalaze u magnetnom polju

Ukupni HamiltonijanHm= HBS + HBI + HSS + HIS magnetna spinska energija

He= HEe + HEk + HQ elektrostatička energija

HBS - Zemanova energija elektronskih spinova HBI - Zemanova energija nuklearnih spinovaHSS - interakcija elektronskih spinova sa elektronskim spinovimaHIS - interakcija elektronskih spinova sa nuklearnim spinovimaHEe - interakcija elektrona sa spoljašnjim električnim poljemHEk - interakcija jezgra sa spoljašnjim električnim poljem HQ - električna kvadrupolna interakcija

MS=±½

ElektronS (½)

JezgroI (1)

Izborna pravila∆MS = ±1 (elektron)∆MI = 0 (jezgro)

B

“triplet”

a

Hiperfino sprezanje

E = gβBSz + (hA0)SzIzE = gβBSz + (a)SzIz(hA0 (Hz) -> a (G) g-faktor)

-½

+½

Ms

∆E1 ∆E2 ∆E3

+1

-1

-1

+1

MI

+0

+0

∆E1 = gβB + a∆E2 = gβB∆E3 = gβB - a

Hiperfino cepanje EPR linija2I + 1 (14N, I=1)

EPR spektar Tempona (14N)

Strukturna formula molekulanitroksida = stabilni slobodni radikal

Tempon

MS=±½

ElektronS (½)

JezgroI (½)

Izborna pravila∆MS = ±1 (elektron)∆MI = 0 (jezgro)

B

“dublet”

a

Hiperfino sprezanjeDodatno cepanje linija usled interakcija

elektronskih i nuklearnih spinova

E = gβBSz + (hA0)SzIzE = gβBSz + (a)SzIz(hA0 (Hz) -> a (G) g-faktor)

+½

-½

-½

+½

MI

∆E1 = gβB + a/2∆E2 = gβB - a/2∆E1 – ∆E2 = a

∆E1 ∆E2

-½

+½

Ms

Da utvrdimo ...

Šta će se desiti ako 14N zamenimo sa 15N ???

15N-PDT

• 15N je I=1/2, tj. moguće vrednosti magnetnog momenta su -1/2 i 1/2). Postoje sada dva dozvoljana prelaza i samo 2 linije

• Zamenom običnog vodonika deuteronima, (manji gN -faktor) manje je super hiper fino cepanje (dodatno se smanjuje širina linija)

EPR spektar

Učili ste DPPH (a da li ste naučili)???Zašto je EPR spektar DPPH ovakav?

DPPH

• 5 oštrih pikova sa odnosom visina1:2:3:2:1

• Nesparen elektron je delokalizovanna dva jezgra azota (I=1 i n=2).

• Dva jezgra azota su ekvivalentna,te se broj linija računa kao 2nl+1=5.

EPR spektar DPPH i TEMPONE

Možemo detektovati i meriti slobodne radikale i paramagnetne vrste

• Visoka osetljivost (nanomolarne koncentracije)• Nema "pozadinskih" mešajućih signala• Kvalitativna & kvantitativna tehnika

Zašto EPR tehnika?

Načini detekcije

Vrste koje imaju nesparen elektron same po sebiPrimer: semihinoni, nitroksidi, prelazni metali ...

Vrste koje se mogu detektovati samo tehnikom spin-trapingaPrimer: superoksidni, hidroksilni, alkil, NO radikali ...

Spinske probe i spinski obeleživači

Spinske probe – stabilni (dugoživeći) slobodni radikali (nitroksidi)koji se ubacuju u sistem da bi se ispitala neka osobina

Spinski obeleživači (spin labels) – nitroksidi vezani za drugemolekule – praćenje ponašanja obeleženih molekula

Sterno zaklanjanje reaktivne grupe

Modifikacija osobina ‘ručka’

Ispitivanje ćelijskih membrana i lipozoma

vreme

1

0.5

Asc na 0oC

Asc na 30oC

5,7,12-DS u lipozomu

Ispitivanje flip-flop kretanja lipida

EPR spektar proteina-mutanata16 19

2325

29

34

42

4649

2Azz

• Koristi se DEER (Double ElectronElectron Resonance) tehnika

• Gustina pakovanja oko spin-labela koji jezakačen za protein, srazmerna je 2AZZ uEPR spektru.

• Upotrebom mutant-proteina (zamenomodređenih AK sa Cys i kačenjem spin-labela), može se dobiti korisnainformacija o okruženju.

Polarni region

EPR oksimetrija

Princip EPR oksimetrije:- Kiseonik je paramagnetik i menja (širi) EPR linije- Redukcija nitroksida je usporena u prisustvu kiseonika- EPR senzori: nitroksidi i partikule (ugalj, mastilo, LiPc-kristal litijumftalocijanina, tritil)

Zašto meriti kiseonik u biološkim sistemima?In vitro – metabolizam, slobodni radikaliIn vivo - radioterapija tumora, ishemija, inflamacije, reperfuzije

Kako?Klasičan pristup su elektrode ili merenje proizvodnje (gubitka)Teško ili nemoguće je ovako meriti unutarćelijski kiseonik

Kalibraciona kriva litijum ftalocianina (LiPc) na pO2. (A) Primer kako se širina EPRlinije LiPc menja sa pritiskom (0 mm Hg i 35.6 mm Hg O2). (B) Kalibraciona krivaLiPC za različite PO2 pokazuje linearnost.

EPR oksimetrija. Lokalizovane (implantirane) EPR oksimetrijske probe (pO2)

Simultano merenje pO2 na 2 mesta u mozgu korišćenjem LiPC kristala

T2* - nagnašena MRI slika mozga u koji su implantirani LiPC (po jedan u

stvaki rezanj mozga). Tamne regije su veće od veličine LiPC kristala(<100 µm) zbog namerno izazvanih artefakata susceptibilnosti

-Subjekat: Mongolski gerbils-Nekopletan Willisov krug dozvoljavaindukciju ishemije samo jedne strane mozgaunilateralnom karotidnom okluzijom-Metod za praćenje ishemije

EPR spektar dva LiPC kristala u dva režnja odražavarazliku pO2 nakon unilateralne karotidne okluzije.

Gradijant magnetnog polja

EPR spin-traping

Metoda koja se koristi za“hvatanje” katkoživećih radikalskih vrsta.Korste se substance koje zovemo spin-trapovi (hvatači spinova)S.T. u reakciji sa slobodnim radikalima prave stabilnije EPR aktivno jedinjenje koje se može detektovati standardnom EPR metodom.

Šta se može raditi metodom EPR kada su u pitanju kratkoživeći (μs) slobodni radikali?

Spin trap = zamka za kratkoživeće radikale

EPR spin-trapoviIma ih veliki broj i predstavljaju veoma unosan biznis0.5g = 1000€ Npr.: 0.5g Au ≈ 10€Svake godine na tržištu se pojavi novi trap koji jeneznatno bolji od prethodnog

Spin-trap(EPR neaktivna vrsta)

● OH

Spin-adukt(EPR aktivna vrsta)

+

Radikal

Princip rada spin-trapova

Spin-trapovi (EPR spektri)

DMPO/OH adukt

EPR spektarDMPO/OH adukta

Zašto je spektar baš ovakav?aN=14.9 G

aHβ=14.9 G

a = konstantahiperfinogcepanja

Nuklearni spinovi:

I (14N) = 1I (1H) = 1/2

Da! Ali postoji jedan "mali" problem!

Biološki uzorci su "vodeni" i zbog toga podležu nespecifičnoj (nerezonantnoj)apsorpciji mikrotalsne energije, zato je dubina prodiranja mikrotalasa u uzorakmala. Ako povećamo mikrotalasnu snagu, dubina prodiranja se povećava ali .......

Da li možemo koristiti EPR u biološkim sistemima"in vivo" ili "ex vivo" ?

Frekvencija ~300 MHz ~750 MHz 1-2 GHz ~3 GHz 9-10 GHz

Dubina prodiranja

> 10 cm 6-8 cm 1-1.5 cm 1-3 mm 1 mm

Biološki uzorar Ljudi, pacov Pacov, miš Miš, srce pacova

Mišiji rep, koža

Uzorci "in vitro"(~100 µl)

Problem dubine prodiranja se može rešiti i smanjenjem frekvencije mikrotalasa.

Da, ali smanjenje frekvencije smanjuje vrednost B0 a time i osetljivostNapravljen je prvi EPRI za ljude (Frapar et.al.)EM zračenje slabi zbog dielektričnih gubitaka (B prolazi ali ne E jer mi nismo čista voda)

hν = gβBo

Klinički EPR

Eksperimentalni EPR

Snimanje u L-oblasti:

1) Mogu se raditi i EPR spektroskopska i EPR imidžing (1D, 2D, 3D) merenja.2) Životinja se može termostatirati (tokom anestezije) i imamo joj pristup tokom merenja.3) Površinska zavojnica ima prodornost 1-3cm u tkivo.4) EPR imidžing snimanja traju minimalno 20min i za to vreme objekat mora da miruje

(toleriše se disanje i manja pomeranja tokom trajanja anestezije).

Snimanje pacova

Snimanje miševa

Snimanje pacova

Surface coil

EPRI(Electron Paramagnetic Resonance Imaging)• Dobijanje slika pomoću EPR-a ( Spectral-spatial CW-EPRI):

Kako saznati prostorni polozaj pramagnetnih vrsta?Princip je menjati orjentaciju gradijenta magnetnog polja uodnosu na uzorak i zatim uraditi rekonstrukciju slike.

Zavisnost oblika EPR signala iz 2rastvora nitroksida od smeragradijanta magnetnog polja B.

Kako napraviti sliku u više od 1 dimenzije?Praviti gradijente B duž svih osa (X,Y,Z).Problemi?Uzorci često nemaju samo 1 pik (kao H u NMR-u) a i širina signala utiče na preklapanje pikova.Sta je dobro?Može se praviti image biločega što utiče na EPRspektar (ne samo 3D imageveć + nova dimenzija kaoosobina sistema ). Spectral-spatial X-band CW-EPR image

Imidžing korišćenjem EPR-a- Direktna detekcija kontrastnog agensa pomoću EPR-a

- Korišćenje gradijenata magnetnog polja i generisanje (kolekcija) slike

- Imidžing distribucije spinske probe

- pO2 mape dobijaju se preko T2*W imidžinga

MRI v.s. EPRI Postoje bitne razlike u osobinama jezgara i elektrona (žiromagnetni odnosi, hiperfinekonstante cepanja, relaksaciona vremena).Zbog toga se MRI uvek izvodi u pulsnom režimu (RF-puls + frekventni, fazni i "slice"gradijenti magnetnog polja, uz razne sekvence tipa spin-eho.., 2D FT i rekonstrukcijeslike iz voksela.EPRI se često izvodi u CW režimu uz rotirajuće magnetne gradijente.MRI ima do 106 puta veću koncentraciju spinova u sistemu, kao i do 106 dužerelaksaciono vreme za te iste spinove.Prosečna širina EPR pikova je znatno veća u odnosu na raspoloživ opsegmagnetnog polja u odnosu na NMR signal H koji se posmatra u MRI.Pulsni EPRI zato zahteva vrlo preciznu i naprednu elektroniku uz brze računare kojiće zadavati sekvence i dešifrovati dobijene rezultate.