ESPECTROFOTOMETRIA E CURVASPADRO PARA ANALLISES BIOQUMICAS

GRUPO 1

2002

GRUPO 1

ESPECTROFOTOMETRIA E CURVAS- PADRO PARA ANLISES BIOQUMICAS

Luiz Edson

LAVRAS MINAS GERAIS - BRASIL 2002

SUMRIO 1 introduo..............................................................................................................................1 OBJETIVO..............................................................................................................................2 2 referencial terico..................................................................................................................4 2. Carboidratos:.......................................................................................................................7 3. Protenas:...........................................................................................................................11 material e mtodos................................................................................................................16 Procedimento para obteno da curva padro de aminocidos (aa) a partir de uma soluo de glicina (0,1 mol/mL):..........................................................................................................16 3 resultados e discusso..........................................................................................................22 1- Curva Padro Para Acares Redutores Pelo Mtodo Do cido Dinitrosaliclico ..........23 Grfico1: repetio 1 .................................................................24 Grfico 2 : repetio 2...........................................................................................................24 Grfico 3 : repetio 3...........................................................................................................25 Grfico 4 : repetio 4...........................................................................................................25 2- Curva Padro Para Aminocidos (-NH2) Pelo Mtodo da Ninhidrina............................26 Grfico 1 : repetio 1 .............................................................27 Grfico 3 : repetio 3 ..........................................................................................................28 Grfico 4 : repetio 4...........................................................................................................28 3- Curva Padro Para Protena Pelo Mtodo de Bradford ...................................................29 Grfico 1 : repetio 1 ...........................................................30 Grfico 2 : repetio 2...........................................................................................................30 ..............................................................................................................................................30 Grfico 3 : repetio 3 ..........................................................................................................31 Grfico 4 : repetio 4...........................................................................................................31 4- Curva Padro Para Acares Totais Pelo Mtodo da Antrona .........................................32 Grfico 1 : repetio 1 ..........33 Grfico 2 : repetio 2...........................................................................................................33 Grfico 3 : repetio 3...........................................................................................................34 Grfico 4 : repetio 4...........................................................................................................34

RefernciaS bibliogrficaS....................................................................................................36

1 INTRODUO

Todos tecidos vivos, animais e vegetais, so constitudos por substancias qumicas que podem ser classificadas em duas categorias: macromolculas e micromolculas de acordo com deu peso molecular. A categoria das macromolculas inclui as protenas, os cidos nuclicos e os polissacardeos. J a categoria das micromolculas inclui os aminocidos, lipdeos e cidos orgnicos. Estas substncias podem variar quantitativamente, refletindo alteraes de estado metablico da planta. E estas variaes podem ser detectadas, sendo est uma ferramenta para estudo de plantas em diferentes condies como estresse hdrico, nveis de luz, etc. Para a deteco e quantificao destas substancias, so usados mtodos baseados na fotometria, o qual mede o resultado das reaes qumicas especficas, as quais produzem colorao ou turvao do meio de reao. Os mtodos fotomtricos so analticos, pois realizam medidas absolutas ou comparativa da energia radiante transmitida, emitida ou absorvida pelas solues. As curvas padro sero obtidas com o uso de solues de concentraes conhecidas, submetidas s reaes colorimtricas especficas, lendo-se a absorbncia em espectrofotmetro. As curvas sero utilizadas para determinar a concentrao de uma substancia especfica em amostras de tecido vegetal.

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OBJETIVO As aulas prticas de Laboratrio de Bioqumica e Metabolismo de Plantas visam mostrar aos alunos desta disciplina os experimentos que os ajudem a compreender os princpios bsicos e fundamentais da qumica, dentro da programao do curso. Para cada assunto da prtica h parte terica, que resumidamente d ao aluno algumas informaes sobre a teoria e parte prtica, contendo o roteiro das atividades. Antes de cada aula o aluno deve estar preparado(ter lido a teoria) para melhor compreender as explicaes do professor sobre os objetivos da aula. Outros objetivos: Familiarizar-se com os reagentes e mtodos necessrios para a elaborao das curvas padro; Familiarizar-se com os mtodos de Antrona, DNS, Bradford e Ninhidirna, os quais so de uso rotineiro no laboratrio de bioqumica e metabolismo e podem ser posteriormente empregados em avaliaes bioqumicas em nossas dissertaes; Entender os clculos de concentrao e volume necessrios para o preparo dos reagentes; Treinar o uso de pipetas e vidrarias necessrias para as reaes; Treinar o uso do espectrofotmetro; Entender e interpretar os resultados experimentais;

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Elaborar as curvas padro a partir das medies realizadas e verificar o grau de ajuste das mesmas.

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2 REFERENCIAL TERICO

1. Aminocidos: Os aminocidos apresentam em sua cadeia um grupamento carboxil e um grupamento amino ligados ao mesmo carbono (carbono ). Neste carbono esto ligadas as cadeias laterais, as quais proporcionam as diferenas entre um aminocido e outro. Todos os aminocidos, com exceo da glicina, apresentam ligados a seu carbono grupamentos distintos. As cadeias laterais ou grupamentos R diferem em estrutura, tamanho e carga eltrica, portanto, lhes conferem caractersticas diferentes influenciando em sua solubilidade na gua e reatividade qumica. Essas caractersticas tambm conferem propriedades diferentes molcula protica que integram. Podem ser agrupados em aminocidos bsicos, cidos ou neutros (Nelson & Cox, 2000). Alm dos vinte aminocidos padres, existem alguns formados a partir de modificaes deles, os quais podem fazer parte de estruturas celulares como a parede celular ou alguns tipos de tecido, exemplos: 4hidroxiprolina, derivado da prolina e 5-hidroxiglicina, derivado da glicina (Nelson & Cox, 2000). Os aminocidos so molculas anfteras, isso quer dizer que eles podem agir como tampes em solues, porm cada aminocido difere em sua propriedade cido-base, possuindo pK1 ( COOH), pK2 ( NH3+) e pKR (grupo R) distintos (Nelson & Cox, 2000).

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A unio de aminocidos forma os polipeptdeos com peso molecular abaixo de 10.000 daltons e as protenas. Esta unio ocorre por desidratao, formando a ligao peptdica entre o grupo amino de um aminocido e o grupo carboxil de outro. A ionizao de polipeptdeos depende de seus grupos -amino e carboxil livre em cada extremidade e do nmero de seus grupos R ionizveis. Mtodos de quantificao de aminocidos A anlise quantitativa de aminocidos importante para a determinao da estrutura das protenas e dos complexos peptdicos similares, que so elementares para a determinao qumica de amostras de molculas orgnicas (Spackamn, Stein e Moore, 1958). A quantificao de aminocidos determinada pelo mtodo da Ninidrina (Hidrato de tricetohidrindeno): A ninhidrina (Figura 1) ocasiona a reao de desaminao oxidativa dos aminocidos, produzindo amnia (NH3) e a reduo da ninhidrina a hidrindantina. Esta reage com a amnia liberada, formando um complexo azul, com absoro mxima em luz de comprimento de onda de 570 nm. A intensidade da cor azul produzida em condies padronizadas serve de base para um teste quantitativo para aminocidos, podendo detectar at 1 g de aminocido. Outras aminas alm dos aminocidos, tambm reagem com a ninhidrina, formando uma cor azul, mas sem ocorrer liberao de CO2, a qual indicativa de um aminocido. A amnia (NH3) e peptdeos tambm reagem, porm, mais lentamente que os -aminocidos. A prolina e a 4-hidroxiprolina produzem um complexo de cor amarela quando reagem com a ninhidrina.5

Figura 1. Molcula de Ninidrina

O mtodo da fluorescamina tambm utilizado. A fluorescamina um reagente mais sensvel que a ninhidrina, sendo capaz de detectar nanogramas de aminocidos. Semelhante a ninhidrina, a fluorescamina forma um complexo com outras aminas que no aminocidos (Murray, 1994). Outros mtodos utilizados para determinao de aminocidos especficos so: Reao de Pauly: O cido sulfnico reage com o aminocido histidina produzindo um composto de colorao vermelha; Reao de Sakuguchi: O -naftil e Hipoclorito de Sdio reagem com a arginina, produzindo um composto avermelhado; Reao de Folin-Ciocalteau e Millon: Especfica para o aminocido tirosina; Reao de Holkins-Call: Especfica para o aminocido triptofano; Reao do Nitroprusiato: Especfica para o aminocido cistena (Oliveira, 1992).

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2. Carboidratos: Os carboidratos podem ser classificados como poliidroxialdedos ou poliidroxicetonas, ou ainda que por hidrlise produza-se esses compostos. Existem trs grupos de carboidratos de acordo com o nmero de monmeros componentes da molcula. Os monossacardeos so os acares simples, que no podem ser hidrolisados em unidades menores; neste grupo incluem-se as pentoses e hexoses, sendo a glicose provavelmente o monossacardeo mais conhecido. Os oligossacardeos so polmeros hidrolisveis de monossacardeos, contendo de duas a seis molculas de aucares simples ligados entre si; um exemplo a sacarose, formada por uma molcula de glicose e uma de frutose. Em geral, os mono- e oligossacardeos so compostos cristalinos, solveis em gua e com sabor adocicado. Os polissacardeos so grandes molculas que podem apresentar cadeias ramificadas complexas ou lineares, geralmente so insolveis em gua e no apresentam sabor; podem ser formados por um s monmero ou por uma combinao de dois ou mais monossacardeos. Os monossacardeos apresentam reaes de enolizao quando tratados com lcali diludo durante vrias horas. No caso da glicose, a mistura resultante contm frutose e manose. Se por sua vez a frutose for submetida ao mesmo tratamento, resultar em uma mistura de manose e

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glicose, pois nessas condies os monossacardeos so instveis, sofrendo oxidao, degradao e polimerizao. Os monossacardeos so estveis quando tratados em solues de cidos minerais diludos, mesmo sob aquecimento; entretanto, as aldoses sofrem desidratao quando so aquecidas em presena de cidos minerais fortes, formando furfural no caso das pentoses ou hidroximetilfurfural no caso das hexoses. Esta reao constitui a base de alguns testes qualitativos de acares, pois os furfurais reagem com determinados compostos aromticos, formando produtos coloridos caractersticos (Conn e Stump, 1993).

2.1. Acares solveis totais: Esta classe inclui vrios monossacardeos e oligossacardeos metabolicamente ativos, entre os quais j foram citados: glicose, frutose e sacarose. A determinao quantitativa desses acares feita pelo mtodo da antrona. Esse composto um hidroxiantraceno, trata-se de uma substncia estvel, slida, incolor, com ponto de fuso a 154 C e peso8

molecular de 194,23. A reao realizada em meio fortemente cido, onde h hidrlise dos dissacardeos e formao de furfurais, os quais reagem com a antrona formando um produto de colorao azulesverdeada, que quantificada colorimetricamente. No presente trabalho dosou-se os acares solveis totais pelo mtodo proposto por Yemm e Willis (1954).

Figura 3. Reao da antrona com cido sulfrico e depois com o acar solvel.

2.2. Acares Redutores: Os acares redutores participam de diversas rotas metablicas nas plantas, tais como a rota das pentoses, o ciclo de Krebs e a gliclise.

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A quantificao de monossacardeos pode dar uma indicao indireta da capacidade fotossinttica da planta. Esses acares tem carter redutor devido presena de um grupo aldedo ou cetona livre na molcula. Eles so capazes de reduzir diversos ons metlicos e a partir dessa propriedade foram desenvolvidos vrios mtodos de identificao e quantificao desses aucares. A seguir apresenta-se alguns desses mtodos:

Reao de Benedict: O reagente contm ons de cobre na forma oxidada (Cu 2+), os quais so mantidos em soluo formando um complexo alcalino de citrato. Em presena de aucares redutores o cobre reduzido formando um precipitado de colorao amarela ou vermelha (Cu2O). O acar por sua vez oxidado, quebrado e polimerizado na soluo alcalina (Conn e Stumph, 1993);

Outras reaes de reduo: reduo da ferricianida, reao com cido para-hidroxibenzico hidrazida (PHABAH) e 3,4 dinitrobenzico, reao com trifenil tetrazolium, mtodo do cido ctrico, do fenolsulfrico, do ferro reduzido e azul de metileno;

Mtodo de Somogy e Nelson: baseado na reao de um composto contendo cobre em meio alcalino, sendo a reao quantificada por colorimetria;

Mtodo do cido dinitrosaliclico (DNS), esse mtodo foi desenvolvido por Sumner e colaboradores (1921-44 citados por Miller, 1959). Utiliza-se alem do DNS, sais de Rochelle, fenis, bissulfito de sdio e hidrxido de sdio. A qumica do DNS foi muito discutida, mas na reao ocorre a reduo do cido 3,5

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dinitrosaliclico para 3-amino-5nitroslico, o qual um produto de cor laranja, enquanto o grupo aldedo dos aucares redutores oxidado para carbonila. No presente trabalho usou-se o mtodo do DNS para dosagem dos acares redutores, segundo Miller (1959).

Figura 1. Reao do DNS com o acar redutor.

3. Protenas: Existem diversos mtodos para determinao de protenas, mas nenhum inteiramente satisfatrio, pois todos apresentam limitaes. A escolha baseia-se na natureza das protenas e de outros

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componentes da amostra, no tempo da reao, na preciso desejada e na sensibilidade da anlise. A seguir alguns mtodos so citados:

Mtodo do biureto: a reao ocorre em soluo alcalina em presena de soluo de sulfato de cobre diluda, ocorrendo a formao de um composto de cor prpura. A cor deve-se ligao do tomo de cobre com quatro tomos de nitrognio das cadeias peptdicas. Este mtodo simples para medir protenas totais, mas requer de 20 a 40 mg de protena e tem a desvantagem de sofrer interferncia pela presena de NH4 na amostra.

Mtodo de Kjeldhal (1998): baseia-se na digesto da protena, sob alta temperatura, com cido sulfrico. Adiciona-se pequena quantidade de xido de mercrio para acelerar a reao e de sulfato de potssio ou sdio anidro para aumentar a temperatura e acelerar a reao. Esta reao deve ser feita em capela com exaustor ligado devido aos vapores de mercrio. Aps a completa transformao dos compostos nitrogenados em sais de amnio, a mistura fortemente alcalinizada com NH4OH, sendo que a amnia reage com um volume conhecido de cido brico e titulada com cido clordrico. A quantidade calculada de N encontrada por esta titulao multiplicada por um fator mdio de 6,25 para fornecer a quantidade de protena total da amostra. Segundo Oliveira (1992), este mtodo apresenta a desvantagem de ocorrer12

muito erro se a quantidade de N for muito pequena e tambm depende de fator de converso mdio para cada espcie. Este mtodo pouco til para estudos em metabolismo vegetal, pois as mudanas de composio protica ocorre principalmente em termos qualitativos. Mtodo turbidimtrico: baseia-se na precipitao de protenas em presena de um cido. o mais rpido, demorando apenas 10 a 15 minutos. Tem a limitao de que nem todas as protenas se precipitam da mesma forma em presena de cidos e os cidos nuclicos tambm podem se precipitar nessas condies; Mtodo de Folin-ciocalteal (1969): uma modificao do mtodo de Lowry (1951), onde o cobre em meio alcalino reage com as protenas, formando um complexo (reao de Piotrowsky ou biureto). Este complexo apresenta aminocidos fenlicos que reduzem o reagente de Folin, dando uma cor azul. A intensidade da cor mxima em pH 10 e medida em espectrofotmetro a 660 nm aps 30 a 120 minutos. A proporo de aminocidos fenlicos mais ou menos constante na estrutura primria das protenas. Comparando-se o teor destes aminocidos no padro com os existentes nas amostras pode-se calcular o teor de protenas nas amostras. Trata-se de um mtodo muito sensvel, podendo analisar amostras com 5g de protenas, mas a amostra no pode conter fenis ( Pinto, 1992);13

Mtodo de Bradford (1976): utilizado na determinao do contedo de protenas totais que se ligam ao corante de um modo proporcional concentrao. O corante utilizado o Comassie Brilliant Blue G- 250, o qual existe em duas formas coloridas diferentes, a vermelha e a azul. A forma vermelha convertida na forma azul aps a ligao do corante com a protena. Esta colorao ocorre rapidamente (2min.) e estvel por at uma hora. O mtodo tem sensibilidade para detectar at 5g/mL de protena;

Mtodo de Lowry: o mais utilizado, entretanto muitas substncias tem sido descritas por interferirem na determinao de protenas por este mtodo. O mtodo de Bradford simples e mais sensvel do que o

de Lowry, no qual o desenvolvimento da cor menos estvel para a precipitao de protenas com cidos (Peterson, 1979 citado por Pinto, 1982). Comparando os mtodos, Bradford (1976) verificou que o mtodo de Lowry indicava menos protena e a parte linear da curva para Lowry inclua uma faixa mais estreita de concentraes. Alm disso, h um espalhamento maior dos pontos, o que dificulta o estabelecimento de uma curva padro para o Lowry.

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Neste trabalho utilizou-se o mtodo de Bradford para determinao da curva padro de protena.

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MATERIAL E MTODOS

Determinao De Aminocidos ( -NH2) Pelo Mtodo Da Ninhidrina: Preparo dos Reagentes:A) Tampo citrato de sdio 0,2 M pH 5,0 B) Reagente ninhidrina 5% dissolvida em Metil Celosolve (2,5g de ninhidrina em 50mL de Metil Celosolve) C) KCN (2% em Metil Celosolve) 2mL de KCN 0,01M (65mg KCN/ 100mL de gua destilada) em 100mL de Metil Celosolve D) Etanol 60% (v/v) Observao: quando guardados separadamente e de modo adequado podem ser armazenados por at 30 dias. Procedimento para obteno da curva padro de aminocidos (aa) a partir de uma soluo de glicina (0,1 mol/mL): - pode ser utilizado outro aminocido ou outra mistura de aminocidos, desde que nesta concentrao final***. Aps a adio do padro de aminocidos e dos reagentes A, B e C, agitar e levar ao banho-maria 100C por 20 minutos para desenvolver a colorao. Posteriormente, completar com etanol 60% (1,3 mL) e agitar novamente (o volume final da reao de 4,0mL).

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Tabela 1. Procedimento para obteno da curva padro de aminocidos GLY (0,1 mol/mL) gua Reagentes A+B+C Tubos (mL) (mL) mol de aa (mL)** 01 0,0 1,0 0,00 1,7 02 0,2 0,8 0,02 1,7 03 0,4 0,6 0,04 1,7 04 0,6 0,4 0,06 1,7 05 0,8 0,2 0,06 1,7 06 1,0 0,0 0,10 1,7 ** 0,5 mL de A + 0,2mL de B + 1,0mL de C Fazer a leitura a 570nm aps o resfriamento. Para quantificar os aminocidos em tecidos vegetais seguir o procedimento de extrao mais indicado para cada tecido e posteriormente usar at 1,0mL de extrato (mximo), adicionando os reagentes e seguir as recomendaes como esto indicadas na tabela 1. Etanol 60% (mL)*** 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3

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Determinao De Protenas Pelo Mtodo De Bradford (Comassie Blue G-250): Preparo do reagente:

Dissolver 100 mg de Comassie blue G-250 em 50 mL de etanol 95%. A esta soluo adicionar 100 mL de cido fosfrico 85%. A soluo resultante diluda para 1 litro com gua. As concentraes finais so: 0,01% de Comassie, 8,5% de cido fosfrico e 4,7% de etanol (Deixar 12 horas agitando em overnight).Ateno: cido fosfrico tem que ser adicionado ao Comassie dissolvido em etanol, nunca o contrrio. reagente de Comassie deve ser filtrado antes de ser usado. Procedimento para obteno da curva padro de protenas a partir de uma soluo de Soro Albumina Bovina (BSA) (1mg/mL ou 10 g/0,1mL): Tabela 2. Procedimento para obteno da curva padro de protenas BSA (1mg/mL) Tubos (mL) 01 0,00 02 0,02 03 0,04 04 0,06 05 0,08 06 0,10 Observao: para minimizar os erros de PROTENA gua COMASSIE (mL) g/0,1mL (mL) 0,10 0 5,0 0,08 20 5,0 0,06 40 5,0 0,04 60 5,0 0,02 80 5,0 0,00 100 5,0 pipetagem pode-se preparar solues de 20,

40, 60, 80 e 100 g de BSA/0,1mL e retirar uma alquota de 0,1mL de cada uma e adicionar os 5,0 mL do reagente Comassie Blue.

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A quantificao de protenas em extratos vegetais pode ser feita usando-se volumes iguais do extrato e de TCA (10%) resultando em uma concentrao final de TCA igual a 5%. Este extrato deve ser centrifugado e o precipitado ressuspendido com NaOH 0,1N. Posteriormente, retirar uma alquota de 0,1mL da protena ressuspendida, adicionar 5mL do reagente de Comassie, agitar e fazer a leitura a 595nm. Determinao Dinitrosaliclico (DNS) Preparo dos reagentes: De Acares Redutores Pelo Mtodo Do cido

A DNS (Dissolver 2,5g de cido dinitrosaliclico (DNS) e adicionar 50mL de NaOH 2N (utilizar um bequer de 500 mL).B - Dissolver 75g de Tartarato duplo de Sdio e Potssio (Sal de Rochelle), adicionar 125mL de gua e agitar sob aquecimento at a dissoluo total Posteriormente, adicionar o reagente B sobre o A, misturando-o sob aquecimento at dissolver completamente. Depois de resfriada, completar o volume da soluo para 250mL. Procedimento para obteno da curva padro de acares redutores (AR) a partir de uma soluo de glicose (10mM): - pode ser utilizada uma mistura de frutose e glicose desde que dem a mesma concentrao final. Tabela 3. Procedimento para obteno da curva padro de acares redutores Tubos 01 02 03 04 Glicose (10mM) (mL) 0,0 0,2 0,4 0,6 gua (mL) 1,5 1,3 1,1 0,9

moles de AR 0,0 2,0 4,0 6,0

DNS (A+B) (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0

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Aps adicionar o reagente de DNS, agitar a mistura e levar os tubos para banho-maria 100C por 5 minutos. Deixar esfriar a temperatura ambiente e completar o volume para 10mL com gua destilada ou no (conforme o caso). Fazer a leitura a 540nm. Para quantificar os AR de um extrato de tecidos convenientemente preparado, pode-se usar at 1,5 mL de alquota e adicionar o reagente de DNS e posteriormente seguir as mesmas recomendaes para a obteno da curva padro.

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Determinao De Acares Solveis Totais Pelo Mtodo Da Antrona: Preparo do reagente: Pesar 40mg de Antrona, colocar em um bequer e adicionar 1,0mL de gua destilada e depois 20mL de cido sulfrico concentrado (H2SO4). Este reagente deve ser preparado na hora do uso. Antes de colocar a antrona, manter os tubos de ensaio em gelo. Procedimento para obteno da curva padro de acares solveis totais (AST) a partir de uma soluo de glicose (60 g/mL ou 0,333 mM de glicose): Tabela 4. Procedimento para obteno da curva padro de acares solveis totais Tubos 01 02 03 04 05 06 07 Glicose (60mg/mL) (mL) 0,0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 gua (mL) 1,0 0,9 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

g/mL de AST 0,0 6,0 12,0 24,0 36,0 48,0 60,0

ANTRONA (mL) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

Primeiro adicionar a soluo de glicose e depois o reagente Antrona. Agitar os tubos e lev-los ao banho-maria 100C por 3 minutos. Resfriar temperatura ambiente ou no gelo e fazer a leitura a 620nm. Para quantificao de AST em extrato de tecidos vegetais pode-se usar alquotas de at 1,0mL.

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3 RESULTADOS E DISCUSSO

Para se estudar o teor das biomolculas (aminocidos, protenas, acares redutores e acares solveis totais) dos tecidos vegetais necessita-se de uma curva padro. Esta, por possuir quantidades conhecidas da molcula em questo, permite estimar a quantidade dela no tecido vegetal. Cada ponto das curvas padres foi obtido com uma concentrao conhecida da substncia desejada, ou seja, para aminocidos usou-se glicina, para protenas, soro albumina bovina (BSA) e para acares redutores e solveis, glicose. Sendo que cada componente do grupo realizou duas pipetagens, totalizando oito repeties por ponto. Aps a leitura no espectrofotmetro, montou-se o grfico de disperso, onde os pontos em cada concentrao correspondem a mdia de cada componente. Aplicou-se, ento, regresso linear, sendo que a frmula y = ax + b serve para determinar a concentrao das substncias extradas de um tecido vegetal, onde y o valor da absorbncia e x a concentrao a ser determinada. O R2 avalia a variao dos resultados obtidos na curva. Quanto menor a variao, o resultado de R2 estar mais prximo de 1 (resultado ideal), que pode ser alcanado se a variao for uniforme. Sendo assim, quanto mais prximo de 1, mais precisas sero as determinaes do teor da substncia no tecido vegetal.

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Nos trabalhos realizados, cada participante do grupo era responsvel por duas repeties de cada ponto das curvas, totalizando oito repeties por ponto. Mrcio foi repetio I, Daniela repetio II, Ednabel repetio III e Anne repetio IV. As curvas padres foram determinadas no Windows Exel com o uso do grfico de disperso, sobre o qual aplicou-se regresso linear, cujo modelo y = ax + b. Como critrio de qualidade de ajuste foi utilizado o R2. Os resultados obtidos nas atividades realizadas foram apresentados na forma de tabelas e grficos.

1- Curva Padro Para Acares Redutores Pelo Mtodo Do cido DinitrosaliclicoTabela 1. Valor de absorbncia de acares redutores (A540 nm) de cada um dos participantes do grupo em cada ponto da curva e sua mdia.

TUBO 01 02 03 04

Repetio I 0,0000 0,2309 0,3866 0,5795

Repetio II 0,0000 0,1897 0,4809 0,5607

Repetio III 0,0000 0,1788 0,4060 0,5507

Repetio IV 0,0000 0,1941 0,3873 0,5831

Mdia 0,0000 0,1983 0,4152 0,5675

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Grfico1: repetio 1y = 0,0074x - 0,0012 R2 = 0,903

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

abs

20 ug/m l de ast

40

60

Grfico 2 : repetio 20,4 0,3 abs 0,2 0,1 0 0 20 ug/m l de ast 40 60 y = 0,0056x + 0,0324 R2 = 0,8533

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Grfico 3 : repetio 30,5 0,4 abs 0,3 0,2 0,1 0 0 20 ug/ml de ast 40 60 y = 0,0066x + 0,0191 R 2 = 0,8727

Grfico 4 : repetio 40,4 0,3 abs 0,2 0,1 0 0 10 20 30 40 50 60 u g/m l d e as t y = 0,0055x - 0,0041 R2 = 0,8125

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Grfico 5 : Mdia dos grficos 1, 2, 3, 40,6 0,4 abs 0,2 0 0 2 4 6 u m oles de ar y = 0,0932x + 0,0024 R2 = 0,9982

2- Curva Padro Para Aminocidos (-NH2) Pelo Mtodo da NinhidrinaTabela 1. Valor de absorbncia de aminocidos (A570 nm) de cada um dos participantes do grupo em cada ponto da curva e sua mdia.

TUBO 01 02 03 04 05 06

Repetio I 0,0000 0,1609 0,2075 0,2770 0,3544 0,3953

Repetio II 0,0000 0,1217 0,2138 0,2438 0,3406 0,3877

Repetio III 0,0000 0,1556 0,2048 0,2529 0,3490 0,5504

Repetio IV 0,0000 0,1222 0,2551 0,2433 0,3890 0,4909

Mdia 0,0000 0,1401 0,2203 0,2542 0,3582 0,4560

26

Grfico 1 : repetio 10,8 0,6 abs 0,4 0,2 0 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 u m ol de aa y = 5,0886x + 0,0182 R2 = 0,9207

Grfico 2: repetio 20,6 abs 0,4 0,2 0 0 0,05 u m ol de aa 0,1 y = 3,8657x + 0,0254 R2 = 0,9751

27

Grfico 3 : repetio 30,8 0,6 abs 0,4 0,2 0 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 u m ol de aa y = 5,52x - 0,0127 R2 = 0,9672

Grfico 4 : repetio 40,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 y = 4,3843x + 0,032 R2 = 0,9417

abs

0,05 u m ol de aa

0,1

28

Grfico 5 : Mdia dos grficos 1, 2, 3, 40 ,6 0 ,4 abs 0 ,2 0 0 0 ,0 2 0 ,0 4 0 ,0 6 0 ,0 8 0 ,1 u m ol de a a y = 4 ,6 9 1 4 x + 0 ,0 0 7 1 R2 = 0 ,9 8

3- Curva Padro Para Protena Pelo Mtodo de Bradford

Tabela 1. Valor de absorbncia de protenas (A595 nm) de cada um dos participantes do grupo em cada ponto da curva e sua mdia.Mdia 0,0000 0,0401 0,1129 0,1838 0,2594 0,3363

TUBO 01 02 03 04 05 06

Repetio I 0,0000 0,0641 0,1380 0,2429 0,3145 0,4086

Repetio II 0,0000 0,0397 0,0993 0,1661 0,2456 0,2961

Repetio III 0,0000 0,0136 0,1114 0,1558 0,2240 0,3367

Repetio IV 0,0000 0,0432 0,1029 0,1705 0,2583 0,3038

29

Grfico 1 : repetio 10,5 abs 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 50 ug/0,1ml proteina 100 y = 0,0041x - 0,0135 R2 = 0,9941

Grfico 2 : repetio 20,4 0,3abs

y = 0,0031x - 0,016 2 R = 0,9899

0,2 0,1 0 0 20 40 60 80 100ug/0,1ml proteina

30

Grfico 3 : repetio 3

0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

abs

y = 0,0033x - 0,0283 R2 = 0,9714

50 ug/0,1ml proteina

100

Grfico 4 : repetio 40 ,4 0 ,3 abs 0 ,2 0 ,1 0 0 5 0 u 0 mp g/ ,1 l roteina 10 0 y =0 0 1 - 0 1 9 ,0 3 x ,0 1 R2 =0 9 1 ,9 2

31

Grfico 5 : Mdia dos grficos 1, 2, 3, 40,4 0,3 abs 0,2 0,1 0 0 20 40 60 80 100 ug/0,1ml proteina

y = 0,0034x - 0,0174 R 2 = 0,9919

4- Curva Padro Para Acares Totais Pelo Mtodo da AntronaTabela 1. Valor de absorbncia de acares solveis totais (A620 nm) de cada um dos participantes do grupo em cada ponto da curva e sua mdia.

TUBO 01 02 03 04 05 06

Repetio I 0,0000 0,1947 0,3529 0,5682 0,7280 0,9290

Repetio II 0,0000 0,2816 0,4485 0,6509 0,8495 0,9728

Repetio III 0,0000 0,1795 0,3519 0,5589 0,8907 0,9974

Repetio IV 0,0000 0,2186 0,3844 0,5927 0,8227 0,9664

Mdia 0,0000 0,2186 0,3844 0,5926 0,8227 0,9664

32

Grfico 1 : repetio 10,4 0,3 abs 0,2 0,1 0 0 20 40 ug/m l de as t 60 y = 0,0053x + 0,0052 R2 = 0,7383

Grfico 2 : repetio 2

0,6 abs 0,4 0,2 0 0

y = 0,0074x - 0,0012 R2 = 0,903

20

40 u g/m l de as t

60

33

Grfico 3 : repetio 30,4 0,3 abs 0,2 0,1 0 0 20 40 ug/m l de as t 60 y = 0,0056x + 0,0324 R2 = 0,8533

Grfico 4 : repetio 40,4 0,3 abs 0,2 0,1 0 0 10 20 30 40 50 60 u g/m l d e as t y = 0,0055x - 0,0041 R2 = 0,8125

34

Grfico 5 : Mdia dos grficos 1, 2, 3, 40,5 0,4 abs 0,3 0,2 0,1 0 0 20 40 ug/ml de ast 60 y = 0,0066x + 0,0191 R2 = 0,8727

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72, 248-254, 1976. DUBOIS, M; et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substance. Analytical Biochemistry, 28 (3), 350-356, 1956. JEFFERY, G.H. et al. Anlise qumica quantitativa. Vogel, 1992. 712p. MILLER, G.L. Use of dinitrosalicylic reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, 31: 426-428, 1959. MURRAY, R.K.; GRANNER, D.K.; MAYES, P.A.; RODWELL, V.W. Harper: Bioqumica. 7.ed. So Paulo: Ateneu editora, 1994. 763p. NELSON, D.L.; COX, M.M. Lehninger: Principles of Biochemstry. 3ed. New York: Worth Publishers, 2000. 1152p. OLIVEIRA, L.E.M. Utilizao de laboratrios e preparo de solues e reagentes para anlise bioqumicas (apostila). 1992. Relatrio de Laboratrio de Bioqumica e Metabolismo de Plantas. UFLA. Roteiros de aulas prticas de Laboratrio de Bioqumica e Metabolismo de Plantas. Curvas padres. Lavras, UFLA.

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