Divisin de Ciencias Biolgicas y de la SaludLicenciatura Qumica Farmacutica Biolgica

Modulo VI: Evaluacin de materias primas para la elaboracin de medicamentos

Practica de laboratorio N 1Uso de la espectroscopa ultravioleta visible para la identificacin y cuantificacin de frmacos

Docente: Dra. Georgina Alarcn ngelesEquipo 5Edgar Francisco Flores de la CruzCristal Aidee Jimnez JurezJorge Antonio Jurez lvarezMiguel Snchez BarbaBrbara Varela Petrissans

Laboratorio: G-202

Trimestre: 15-Primavera Fecha: 28 de mayo de 2015

INTRODUCCINLa espectrofotometra se refiere a mtodos de anlisis qumico que utilizan un haz de luz para medir la concentracin de sustancias. Una de las tcnicas ms importantes es el UV-visible debido a su aplicacin en la industria farmacutica. (Barajas, 2011).La espectroscopia UV-visible es utilizada en laboratorios como instrumentos para anlisis cualitativos y cuantitativos de compuestos qumicos; y para la identificacin de frmacos los cuales tienden a absorber en las regiones Uv-visible, posibles, este efecto se lleva a cabo por la presencia de grupos cromforos en las molculas que se encuentran en la muestra. Utiliza una radiacin del espectro electromagntico con una longitud de onda comprendida entre los 100 y los 800 nm (Elmer, 2010).La espectroscopa UV-Visible (espectros electrnicos), en donde ocurre una transicin de los electrones ms externos de los tomos de las molculas, desde niveles fundamentales a niveles ms altos de energa. Esta metodologa no tiene selectividad y por esta razn se utilizan en frmacos que presentan absorcin en la misma regin del espectro. (Nieves, 2011).Mediante esta tcnica son posibles preparar curvas de calibracin, mediante patrones que muestran un cambio en la pendiente o el uso de un nuevo lote de reactivos, tambin, se utiliza para la determinacin de mezclas de diferentes tipos de compuestos en los frmacos. Sin embargo esto permite un mejor desarrollo para predecir la cantidad de sustancias sin la separacin de analitos. (Arvalo, 2006).Por consiguiente dos elementos muy importantes en este mtodo es la transmitancia T de una sustancia en solucin que es la relacin de la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, y la cantidad de luz que incidi sobre ella y la absorbancia A que nos indica la cantidad de luz absorbida por la muestra. (Caballero, 2011).

AntecedentesLa espectrofotometra, fue descubierta por la dispersin de la luz en 1704 por newton, por los cuales se desarrollaron tcnicas experimentales. Aos ms tarde fraunhofer cre un sistema ptico, con el uso de prismas y rendija lo cual permiti detectar el espectro de la luz solar las lneas de absorcin. Gracias a esto se obtuvieron conocimientos de que cada elemento qumico posee un espectro de emisin de lneas caractersticas. (Tllez, 2008).En 1859 bunsen y Kirchhoff se consideraron como los fundadores del anlisis espectral y los primeros que construyeron un equipo antecesor al espectrofotmetro. Aos despus el desarrollo de sistemas de deteccin fotoelctrica permiti en los aos 40 la sustitucin de equipos de deteccin fotogrfica poco eficientes. En ese momento la tcnica espectroscpica se empez a utilizar. (Applied, 2010).El desarrollo de sistemas de deteccin fotoelctrica permiti en los aos 40 la sustitucin de los equipos de deteccin fotogrfica, poco eficientes, y la generalizacin de esta tcnica espectroscpica. (Grisales, 2013).El cido Acetil saliclico (AAS) (conocido popularmente como aspirina), es un frmaco de la familia de los salicilatos, usado frecuentemente como antiinflamatorio, analgsico (para el alivio del dolor leve y moderado), antipirtico (para reducir la fiebre) y antiagregante. La accin de estos analgsicos se basa en la inhibicin de la sntesis de prostaglandinas (mediadores del dolor y de la inflamacin) en los tejidos perifricos. De ah que estas sustancias tengan una enorme importancia sanitaria, ya que comercializadas como medicamentos y administradas al cuerpo humano ayudan a atenuar distintas dolencias.

Estructura qumica de AAS

Objetivo: Aplicar la espectroscopia ultravioleta visible para la identificacin de frmacos Determinar el coeficiente de absortividad de frmacos como cido acetilsaliclico, cafena y acetaminofn Determinar la concentracin de una muestra problema a partir de una curva de calibracin

Material y Reactivos Espectrofotmetro de UV-VIS Celdas de cuarzo de 1 cm Piseta de agua destilada 5 Matraces aforados de 100 mL 5 Matraces aforados de 10 mL 5 Matraces aforados de 5 mL 3 Vasos de precipitado de 30 mL 3 Vasos de precipitado de 10 mL 3 Pipetas volumtricas de 1mL 2 Pipetas graduadas de 1 mL 1 Esptula

cido acetilsaliclico metanol Agua desionizada

MetodologaIdentificacin del frmaco.Prepare por triplicado una solucin del frmaco de estudio que contenga al 1mg/100mL en metanol. Obtenga el espectro de absorcin en la regin del Ultravioleta, y determine la longitud de onda mxima y el coeficiente de absortividad. Preparacin de la Curva de calibracinPreparar la solucin del frmaco, pesando 10 mg y disolver en metanol a 100ml, a partir de esta solucin preparar por triplicado 5 soluciones que contengan 10g/ml, 8g/ml, 6g/ml, 4g/ml, 2g/ml, en matraces aforados de 10 o 5 ml (segn convenga). Leer las absorbancias a la longitud de onda correspondiente.

Procedimiento1) Pese exactamente la cantidad que se requiere, anote el peso real con todos los decimales2) Prepare las soluciones a las concentraciones deseadas, sea exacto en el aforo3) Obtenga los espectros de absorcin4) El blanco (blanco se refiere al disolvente con el cual se disolvi el frmaco, se dice tambin que es todo lo que contiene la solucin sin el analito)5) El frmaco iniciando con la concentracin de 6) Seleccione la longitud de onda de estudio para la curva de calibracin7) Obtenga las absorbancias de: el blanco, posteriormente de las soluciones del frmaco de la ms diluida a la ms concentrada.8) Haga una Tabla de concentracin y Absorbancia9) Obtenga los siguientes parmetros: coeficiente de absortividad al 1%, coeficiente molar, la ecuacin de la recta10) Obtenga la absorbancia de las muestras problema y determine la concentracin.

DIAGRAMA DE FLUJO

PLAN DE TRABAJO ANALISTAACTIVIDAD

Edgar Lavado del rea de trabajo Preparacin de solucin de concentracin 14 g/mL Lectura del espectro Uv-Vis de las concentraciones 4g/mL Lavado de material para entrega

Antonio Lavado de material Pesada de AAS Preparacin de disolucin de concentracin 100 g/mL, 20g/mL y 10g/mL Lectura del espectro Uv-Vis de las concentraciones 20g/mL, 10g/mL, 8g/mL

Miguel Clculos de para preparar las soluciones Preparacin de solucin de concentracin 12 g/mL Lectura del espectro Uv-Vis de las concentraciones 12 g/mL Recoger el material con el laboratorista

Brbara Preparacin de solucin de concentracin 16 g/mL Lectura del espectro Uv-Vis de las concentraciones 16 g/mL, 4g/Ml Desecho de reactivos

PREPARACIN DE DISOLUCIONES

C1= 103 g/mLV1= 2mL = 20.6 g/mLC2= 20.6 g/mL V2= 10 mL

C1= 103 g/mLV1= 1.6 mLC2= 16.48 g/mL = 16.48 g/mLV2= 10 mL

C1= 103 g/mLV1= 1.4 mL = 14.42 g/mLC2= 14.42 g/mLV2= 10 mL

C1= 103 g/mLV1= 1.2 mL = 12.36 g/mLC2= 12.36 g/mLV2= 10 mL

C1 = 103 g/mLV1= 1 mL = 10.3 g/mLC2= 10.3 g/mLV2= 10 mL

C1 = 103 g/mLV1= 0.8 mL = 8.24 g/mLC2= 8.24 g/mLV2=10 mL

C1 = 103 g/mLV1= 0.4 mL = 4.12 g/mLC2= 4.12 g/mLV2=10 mL

RESULTADOS Conversin de concentraciones (De g a M)

Clculos de absorbancia tericos de mayor a menor concentracin (20 g/mL-4 g/mL)

Resultados de las mediciones en el espectrofotmetro UV-VisConcentracin (g/mL)210 nm225 nm230 nm

4.120.3070.1720.154

4.120.2780.160.151

4.120.2770.1440.131

8.240.5120.3790.352

8.240.4980.3490.324

8.240.4950.3450.323

10.30.5470.4740.44

12.360.6520.5480.526

12.360.6470.5430.523

12.360.660.550.532

16.480.7160.6760.639

16.480.7540.7020.666

16.480.7440.7410.706

20.60.8640.890.853

20.60.8830.9620.922

20.60.8620.8820.847

Tabla promedio de la medicin de las absorbancias y coeficiente de correlacin Concentracin (g/mL) Longitudes de onda ()

210 nm225 nm230 nm

4.12 g/Ml0.2870.1580.145

8.24 g/mL0.5010.3570.333

12.36 g/mL0.6530.5470.527

16.48 g/mL0.7380.7060.670

20.6 g/mL0.8690.9110.874

r0.9860.9990.998

COEFICIENTE DE ABSORTIVIDA MOLAR == 8291.061 cm-1Ecuacin de la recta para absorbancia a 225 nm:

COEFICIENTE DE ABSORTIVIDAD AL 1%== 0.0474 cm-1

CONCLUSINDebido a las limitaciones de algunos reactivo como el metanol y para tener un mejor ahorro del mismo la primera solucin indicada no se realiz como en el protocolo, se tom una va alterna, a partir de la segunda solucin se prepararon todas las disoluciones y concentraciones planteadas.De igual manera al momento de pesar el AAS se tuvo que realizar un ajuste a las concentraciones y por efectos del disolvente las mismas tuvieron que ser duplicadas para poder evitar la absorcin del disolvente y nos diera un resultado de absorbancia errneo. Con lo que respecta al anlisis espectrofotomtrico Uv-Vis calculando el coeficiente de correlacin podemos concluir que nuestra prueba se encuentra dentro de los lmites permisibles de acuerdo a la r= 0.999, esta es aproximada a uno por lo tanto la linealidad de nuestro anlisis es aceptable.La longitud de onda, , reportada en bibliografa nos indicaba que se encontraba en 210 nm con un E= 5980 cm-1 y 230 nm E=6890 cm-1, por esto decidimos hacer una lectura a tres distintas, en donde el aparato nos dio una mejor linealidad en 225 nm con un E= 8291.06 cm-1.

BIBLIOGRAFAApplied Analitic, espectrofotometra, 2010Arvalo h.; 2006. Evaluacin de un mtodo por espectroscopia Uv-vis para la deteccin de contaminantes orgnicos en agua. Trabajo de graduacin [tesis].san Carlos: universidad de san Carlos Guatemala. Facultad de ingeniera. Barajas G. 2011. Propuesta de mejora utilizando diseo de experimentos en el desarrollo de tcnicas analticas en un laboratorio farmacutico. Propuesta de un programa de divulgacin [tesis].CD de Mxico: Instituto Politcnico Nacional. Facultad de ingeniera industrial.Caballero R. 2011. Espectrofotometra. Universidad del valle de Mxico, qumico farmacutico biotecnologa, monterrey.Curso de Qumica Analtica 2007. Consultado en: http://www.cin.edu.uy/bqa/pdf/Parcial%202%20QA2007.pdf [Fecha 28 de mayo de 2015]Elmer B.; 2010. Estandarizacin de la tcnica espectrofotomtrica (Uv-vis) para la cuantificacin de antraquinonas presentes en productos a base de aloe vera. Requisito final para optar al ttulo de tecnlogo en Qumica [tesis].Pereira: universidad tecnolgica de Pereira. Facultad de qumica.Grisales C.; 2013. Espectrofotometra. Laboratorio de espectrofotometra. Universidad de Antioquia, Medelln. Nieves D.; 2011. Espectrofometra: Espectros de absorcin y cuantificacin colorimtrica de biomolculas. Departamento de bioqumica [tesis]. Crdoba: Universidad de Rabanales. Facultad de Medicina.Tllez O. espectrofotometra. Laboratorio de equilibrio y cinetica.2008

CUESTIONARIO:1.- Que disolvente utiliz para hacer la cuantificacin?Se utiliz metanol ya que es el disolvente que presenta el menor nmero de onda en la absorcin.2.- Cul fue la longitud de onda que usted seleccion?, explique su decisin.La longitud de onda que seleccionamos fue de 225 nm, porque nos dio una mejor linealidad de r=0.999, adems que el espectrofotmetro nos mostr una max de 225 nm.3.- Qu tipo de celda us y porque?Usamos celdas de cuarzo, las celdas de cuarzo no interfieren con la cuantificacin porque no absorben las longitudes de onda del UV y el UV.-vis.4.- Escriba los intervalos de concentracin de las disoluciones estndar empleadas en la curva patrn, para la Longitudes de onda de mxima absorcin y sus Absorbancias respectivas.La longitud de onda fue de 210, 225 y 230 nm, porque a estas longitudes de onda, el disolvente no afecta a la cuantificacin del analito (no hay interferencias). Ya que si elegimos las longitudes de ultravioleta lejano de 10 a 200 nm presenta el inconveniente que el oxgeno atmosfrico absorbe en esa regin. Adems de que el disolvente utilizado (metanol) absorbe en el espectro en longitudes de onda de 205 a 210 nmConcentracin (g/mL) Longitudes de onda ()

210 nm225 nm230 nm

4.12 g/mL0.2870.1580.145

8.24 g/mL0.5010.3570.333

12.36 g/mL0.6530.5470.527

16.48 g/mL0.7380.7060.670

20.6 g/mL0.8690.9110.874

5.- Relacione la estructura molecular con la longitud de onda, y el coeficiente de absorcinEl efecto fotoelctrico, que se entiende que un haz de luz es un flujo de partculas de energa llamada fotones. Cada una de estas partculas posee una energa que est relacionada con la frecuencia de la luz mediante la ecuacin:E=hvEn donde h es la constante de Planck. La luz de una cierta frecuencia est asociada con los fotones, cada uno de los cuales posee una cantidad de energa. Es la cantidad de energa que posee un fotn la que determina si una especie molecular absorber o emitir la luz de la longitud de onda correspondiente. Adems una molcula posee energa interna que son: la molcula puede rotar en varios ejes y poseer una cierta cantidad d energa rotacional.Los tomos o grupos de tomos que estn en la molcula pueden vibrar. Y por ltimo una molcula posee energa electrnica, la cual es el potencial asociado con la distribucin de las cargas elctricas negativas en los ncleos de los tomos con carga positiva.La absorbancia es directamente proporcional al coeficiente de absortividad por la concentracin y la longitud del paso ptico (Ley de Lambert- Beer)

6.- Identifique los grupos cromforos y auxocromosLa absorcin de radiacin UV o UV-vis proviene de la excitacin de los electrones enlazantes, y las longitudes de onda de los picos de absorcin pueden correlacionarse con los tipos de enlaces que existen en las especies de estudio.Los grupos cromforos son los que tienen enlaces conjugados como los grupos carbonilos, nitrilos, azidas en general los grupos que tengan dobles enlaces.Los auxocromos no absorben longitudes de onda pero si producen una interferencia con respecto al analito. 7.-Identifique las transiciones electrnicasTransiciones: -*. Un electrn de una molcula en un orbital enlazante es excitado al correspondiente orbital antienlazado *. Respecto a otras posibles transiciones, la energa necesaria para provocar una transicin -* es grande y corresponde a radiaciones de frecuencias en la regin del UV de vaco.Transiciones: n - *. Los compuestos saturados que contienen tomos con pares de electrones no enlazantes son capaces de dar transiciones n - *. Estas transiciones requieren menos energa que los tipo -* y pueden producirse por radiacin de la regin entre 150 y 250 nm, apareciendo la mayora de los picos de absorcin por debajo de los 250 nm.Transiciones: n * y *. La espectroscopia de absorcin a compuestos orgnicos se basa en transiciones de electrones n o al estado excitado *, ya que la energa que se requieren para estos procesos conducen a picos en una regin espectral de 200 a 700 nm. Ambas transiciones requieren la presencia de un grupo funcional que suministre los orbitales. .

6.-Como afectara un cambio del solventeEste puede aumentar el grado de conjugacin de y efectuar un desplazamiento batocrmico, por lo tanto la estabilizacin de los estados excitados producida por el disolvente es mayor en solutos con fuerte interaccin ncleo-substituyente.