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Estudio Sobre Algunos Elementos Traza en Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus y Ustilago maydis.

Alma Hortensia Serafín Muñoz1, Kazimierz Wrobel Zasada1, Felix Gutiérrez Corona2, Gerardo Martínez Soto3, Katarzyna Wrobel Kaczmarczyk1 1Instituto de Investigaciones Científicas, 2 Instituto de Investigaciones en Biología Experimental, 3 Instituto de Ciencias Agrícolas, Universidad de Guanajuato, L. De Retana N° 5, 36000 Guanajuato, Gto., katarzyn@quijote.ugto.mx Abstract

El objetivo de este trabajo ha sido conocer los contenidos totales de Al, Bi, Cd, Cr,

Cu, Fe, Mn, Ni y Pb en hongos comestibles (Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus e

Ustilago maydis) así como evaluar su distribución macroscópica (sobreros, tallos) y

subcelular (paredes y membranas celulares, citosol) para avanzar en el conocimiento sobre

la incorporación de estos elementos a los hongos. Después de la homogeneización de

muestra (nitrógeno líquido y/o choque balístico), se obtuvieron las fracciones subcelulares

(dos centrifugaciones, a diferente velocidad) y se llevó a cabo la digestión ácida (HNO3,

H2O2) de las muestras de hongos y de cada una de las fracciones obtenidas. Los metales de

interés fueron determinados por espectrometría de absorción atómica con horno de grafito.

En paralelo, los mismos elementos fueron determinados en el Material de Referencia (NIST

1571 – hojas de citrus). Para cada uno de los metales en champiñón y hongo ostra, el mayor

contenido se encontró en la fracción de citosol. En el caso de huitlacoche, se observó más

efectiva incorporación de los elementos a la fracción de paredes celulares.

Introducción Los macro hongos comestibles ocupan un lugar cada vez más importante en la dieta

del hombre. Su composición rica en proteínas vegetales (hasta 7% m/m), fibra (en 100 g del

producto seco hasta 32% de la recomendada ingesta diaria en forma de quitina), vitaminas y

minerales así como su bajo contenido energético (100 g proporciona 30 – 130 kcal) deciden

que los hongos se consideran componentes de una dieta sana. Por otro lado, el desarrollo

de la tecnología de cultivo comercial ha provocado un aumento de la oferta de hongos en el

mercado. Así, la producción anual de Agaricus bisporus es aproximadamente de 4 millones

de toneladas. En algunas regiones geográficas el consumo alcanza 7 – 10 kg de hongos por

persona durante un año[1]. Entre hongos silvestres, considerados como delicias regionales

hay que mencionar huitlacoche mexicano (Ustilago maydis) – un parásito de maíz.

Los resultados de estudios, realizados en diferentes regiones geográficas demuestran

que los hongos contienen relativamente altos niveles de los metales y/o metaloides, lo que

297

puede tener importantes implicaciones tanto para el ecosistema como para la salud del

hombre.[2-4] Existen evidencias que, algunas especies (incluyendo los de género Agaricus)

acumulan elementos tales como As, Cd, Cu, Hg, Ag, Pb, Se y Zn.[5-10] En consecuencia, la

investigación sobre los elementos traza en hongos comestibles ha sido enfocada a los

siguientes tópicos:

• Posible uso de los hongos silvestres en la evaluación de contaminación medio

ambiental con los metales pesados y/o radionuclidos en diferentes regiones

geográficas.

• Optimización del proceso de cultivo comercial para obtener un buen rendimiento con la

mínima posible ingesta de los elementos tóxicos.

• Estudios sobre la bioaccesibilidad, acumulación, distribución y especiación de los

elementos en hongos.

• Evaluación de los hongos como posible fuente dietética de bioelementos.

• El objetivo de este trabajo ha sido conocer los contenidos totales de Al, Bi, Cd, Cr, Cu,

Fe, Mn, Ni y Pb en tres especies de hongos comestibles (Agaricus Bisporus, Pleurotus

ostreatus y Ustilago maydis) así como evaluar su distribución en distintas fracciones

celulares (citosol, paredes y membranas celulares) para avanzar en el conocimiento

sobre la incorporación de estos elementos en los hongos.

Materoañes y Métodos Aparatos Para la determinación de los metales se utilizó el espectrómetro de absorción atómica,

modelo 3110 con el horno de grafito HGA 600 y automuestreador AS60. El fraccionamiento

subcelular se llevó a cabo en la muestra homogeneizada en nitrógeno líquido, utilizando una

centrífuga Beckman J2-21 y una ultracentrífuga Beckman XL-90.

Reactivos, disoluciones y muestras Las de Al, Bi, Cd, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni y Pb fueron los estándares para espectrometría de

absorción atómica de Sigma. Las soluciones de los modificadores de matriz para EAA-HG de

nitrato de paladio y nitrato de magnesio fueron de Perkin Elmer. Para control de calidad se

utilizó el material de referencia NIST 1571 “citrus leaves”. Además, se utilizaron las

disoluciones de los reactivos Sigma de ácido nítrico, ácido clorhídrico, agua oxigenada, TRIS

y hidróxido de sodio. Se analizaron tres especies de hongos: Agaricus bisporus, Pleurotus

ostreatus y Ustilago maydis, los que se adquirieron en el mercado local.

298

El agua desionizada (18.2 MΩ cm) se obtuvo de un sistema de purificación de agua

Labconco.

Procedimientos Fraccionamiento celular

Se utilizó aprox. 1 kg de biomasa de cada uno de los macro hongos. Los champiñones

fueron separados en sombreros y tallos. Para el análisis total (0.5 kg), el material fresco fue

secado en estufa (40-60°C, 24 hrs), molido y se llevó a cabo la digestión de tres

submuestras (0.1 g) de cada uno de los materiales secos (tallos, sombreros de Agaricus

bisporus, Pleurotus ostreatus, Ustilago maydis y material de referencia NIST 1571). Para el

fraccionamiento celular, las muestras de hongos frescos (0.5 kg) fueron homogeneizadas en

nitrógeno líquido. Las sub-muestras del material seco (10 g) fueron suspendidas en 50 ml de

tampón Tris/HCl (50 mmol l-1, pH 5.5) y centrifugadas (10 000 rpm, 10 min, 4°C). El

sobrenadante obtenido del extracto crudo fue separado en dos porciones: una para el

análisis de los metales y la otra para realizar una segunda centrifugación (40 000 rpm, 65

min, 4°C). El segundo sobrenadante (citosol) y las pastillas (paredes celulares y fracción

mixta de membranas) obtenidas en dos centrifugaciones también fueron digeridas para el

análisis de los elementos.

Determinación de Al, Cd, Cr, Cu, Fe, Ni, Mn y Pb por EAA con HG

Se llevó a cabo la digestión de todas las muestras (biomasa seca, dos sobrenadantes, dos

pastillas y NIST 1571) utilizando ataque por vía húmeda. Para ello, a 0.1- 0.5 g de la muestra

(3 réplicas ) se adicionaron 1 ml de HNO3 conc, y los tubos fueron colocados en un bloque

de calentamiento (65°C, 60 min y 120-140°C, 60 min). Finalmente, se agregaron 0.1-0.2 ml

de agua oxigenada y las muestras se dejaron por 30 min para completar la digestión. El

volumen final fue de 10 ml (con agua desionizada) y, después de una dilución apropiada (1:1

– 1:10 000), estas soluciones fueron introducidas al EAA con HG. Se utilizó la plataforma de

L´vov (excepto Cr) y dos modificadores-estabilizadores: nitrato de magnesio (5 µg Mg) para

Al, Cd, Cu, Fe y Mn y nitrato de palladio (0.2 µg de Pd) para Bi y Ni.

Resultados y Discusión

Los elementos seleccionados para el estudio incluyen algunos omnipresentes en

corteza terrestre (Al y Fe), micro nutrientes (Cu y Mn) y elementos considerados como

tóxicos (Bi, Cd, Ni, Pb). Para asegurar la exactitud de los resultados obtenidos en el análisis

de muestras reales, se llevó a cabo la determinación de todos los elementos seleccionados

299

en el Material biológico de Referencia (NIST 1571, hojas de citrus). Los resultados de este

análisis se presentan en la Tabla 1, donde se observa una buena concordancia con los

valores certificados, confirmando la validez del procedimiento analítico.

Tabla 1. Resultados obtenidos en la determinación de Al, Cd, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni y Pb en el

material NIST 1571 (en µg g-1) y sus correspondientes valores certificados (el Bi

no ha sido certificado en NIST 1571).

Elemento Resultado promedio ± DE* Valor certificado*

Al 84.5 ± 2.7 92 ± 15

Cd 0.04 ± 0.01 0.03 ± 0.01

Cr 1.1 ± 0.3 0.8 ± 0.2

Cu 18.4 ± 1.2 16.5 ± 1.3

Fe 101 ± 4 90 ± 10

Mn 21.5 ± 0.8 23 ± 3

Ni 0.9 ± 0.4 0.6 ± 0.3

Pb 11.8 ± 2.0 13.3 ± 2.4

Con el fin de evaluar la distribución de cada uno de los metales en diferentes partes

del hongo y sus fracciones celulares, se determinó su contenido total y se aplicó un sistema

de fraccionamiento basado en la centrifugación de la suspensión a diferentes

velocidades.[11] Para romper las células, la masa del hongo fresco fue homogenizada en

nitrógeno líquido, obteniéndose un polvo seco. Este polvo fue suspendido en tampón

Tris/HCl y sometido a una primera centrifugación a baja velocidad (10 000 rpm, 10 min). El

Sobrenadante 1 (extracto crudo) contenía el citosol y las membranas, mientras que las

paredes celulares y las células no rotas formaron la Pastilla 1. Posteriormente, el

Sobrenadante 1 fue centrifugado a alta velocidad (40 000 rpm, 65 min), obteniéndose el

Sobrenadante 2 (citosol) y la Pastilla 2 (fracción mixta de membranas). Como se indica en

los procedimientos, se llevó a cabo la digestión de cada una de las fracciones y la

determinación de los metales de interés. Para facilitar la evaluación de distribución de

metales entre las fracciones obtenidas, en cada caso el resultado fue calculado como la

masa del metal respecto a la masa del hongo seco.

En Tabla 2 se presentan los resultados obtenidos en la determinación de contenidos

totales de nueve metales en tres especies biológicas junto con los rangos de estos

300

elementos en hongos, reportados en la literatura. Generalmente, los datos obtenidos en este

trabajo para Agaricus bisporus y Pleurotas ostreatus concuerdan con los reportes

anteriores.[1,12] En cuanto a huitlacoche, no se han encontrado ningunos datos en la

bibliografía. Es importante resaltar que, los niveles de metales en huitlacoche, observados en

este trabajo, fueron significativamente inferiores respecto a los niveles en champiñón y ostra.

Estos resultados demuestran que, la bioaccesibilidad de los metales del sustrato es

diferente. En otras palabras, la planta de maíz funciona como un “filtro”, limitando el acceso

de los metales del suelo a hasta el hongo parásito. En consecuencia huitlacoche es la

especie menos contaminada con los metales respecto a los hongos que utilizan como

sustrato composta, paja o suelo.

Tabla 2 Contenidos totales de los elementos de interés en tres especies de hongos

comestibles (para Agaricus bisporus por separado se reportan niveles en tallo y

en sombrero) y los rangos de concentraciones reportados por otros autores.

Concentración total del elemento, µg/g , (peso

seco) Otros reportes

Agaricus bisporus Elemento

Pleurotus

ostreatus

Ustilago

maydis Sombrero Tallo Rango* Referencia

Al 44.3 10.5 19.5 20.8 14 – 85 [12-14]

Bi 2.01 0.19 0.53 5.65 1.9 – 9 [12]

Cd 5.39 <LC 0.54 0.20 <0.5 - 35 [1-4,8,12,15,16]

Cr 63.0 2.15 4.06 5.18 0.1 – 20 [4,12,13,17,18]

Cu 732 2.22 352 535 4.5 – 465 [1,2,4,6,12,13,19]

Fe 3285 19.0 1943 2456 33 – 170 [1-4,20]

Mn 18.3 0.37 9.42 8.47 5 – 60 [1-4,18]

Ni 31.5 0.43 9.02 4.32 0.4 – 145 [1,4,12,17,18]

Pb 0.91 2.47 0.41 0.88 <0.5 – 10 [1,2,4,12,13,16,19]

* El intervalo estimado en base a los resultados obtenidos en los análisis de diferentes

hongos comestibles, reportados en la literatura.

En el análisis de fracciones celulares, en primer lugar se determinaron las

recuperaciones de cada uno de los metales en dos etapas de centrifugación. La

301

recuperación de primera centrifugación (R1, %) fue calculada como razón entre suma de los

contenidos del metal en Sobrenadante 1 + Sedimiento 1 y el contenido total; el valor de

recuperación de la segunda centrifugación se obtuvo como la relación entre suma de los

contenidos en Sobrenadante 2 + Sedimiento 2 y el contenido en Sobrenadante 1 (R2, %).

Los valores R1 varían entre 80 y 94 % y los R2 entre 79 y 106 %, lo que indica incompleta

recuperación de los metales en el proceso de fraccionamiento celular. Esto podría deberse

en primer lugar a las pérdidas de los analitos y/o a la contaminación con hierro durante

algunas etapas del procedimiento, que por su naturaleza es difícil de controlar. Otra fuente

de error fue la diferencia en procedimientos aplicados para obtener la biomasa seca: en el

análisis del contenido total la biomasa fue secada a 60°C, mientras que para el

fraccionamiento se llevó a cabo la deshidratación en nitrógeno líquido.

Tabla 2. Resumen de los resultados de la distribución relativa de los elementos en

hongos: para cada uno de macro hongos estudiados (PO – Pleurotas ostreatus,

Ab-s – Agaricus bisporus sombrero, Ab-t – Agaricus bisporus tallo, UM – Ustilago

maydis) se presenta el valor mínimo, máximo y promedio de la contribución de

los elementos en tres fracciones celulares obtenidas.

Citosol Paredes celulares Fracción mixta de

membranas

Distribución

relativa

PO Ab-s Ab-t H PO Ab-s Ab-t H PO Ab-s Ab-t H

Min, % 50.1

(Fe)

26.0

(Cr)

44.4

(Cd)

11.9

(Al)

6.1

(Cd)

14.0

(Cd)

7.9

(Fe)

20.5

(Cu)

0.7

(Cd)

1.0

(Bi)

3.6

(Mn)

0.31

(Pb)

Max, % 93.2

(Cd)

79.1

(Cd)

66.0

(Ni)

78.6

(Cu)

40.4

(Bi)

52.0

(Mn, Cr)

47.2

(Cd)

87.1

(Al)

18.2

(Fe)

22.0

(Cr)

24.0

(Fe)

6.8

(Bi)

Promedio, % 73.6 57.1 58.6 38.5 22.0 32.4 32.1 57.0 4.4 10.3 9.3 4.5

La distribución relativa de los metales entre paredes celulares, citosol y membranas

se presenta en la Figura 1 y se resume en Tabla 3. En los resultados obtenidos para

Pleurotas ostreatus y Agaricus bisporus se observa claramente alta contribución de los

elementos en citosol, mientras que para huitlacoche la mayor contribución de los metales

existe en paredes celulares. En particular, los datos obtenidos sugieren que los metales se

acumulan en citosol de la especie Pleurotas con mayor preferencia respecto a otros tipos de

302

hongos. Por otro lado, independientemente de la especie biológica relativamente menor

contribución de los metales se observó en las membranas celulares.

Parece interesante que, la distribución relativa en fracciones celulares observada en

tallos y sombreros de Agaricus fue diferente para diferentes elementos. Como se puede

observar en Tabla 3, las contribuciones promedias (evaluadas para 9 elementos) en paredes

celulares y en membranas fueron similares (respectivamente 32.4 %, 10.3 % en tallos y 32.1

%, 9.3 % en sombreros). Sin embargo, se observa claramente en la Fig. 1 que para los

cuatro elementos (Al, Bi, Cd and Pb), su contenido en las estructuras insolubles en agua fue

mayor en sombreros que en tallos (valor promedio para paredes y membranas celulares 40.4

%, 7.2% en sombreros versus 21.3 %, 5.3 % en tallos). Al contrario, la contribución relativa

de Ni, Mn y Cr en paredes y membranas celulares fue mayor en tallos que en sombreros

(promedio para 3 elementos: 48.7 %, 16.8 % en tallos y 31.5%, 5.7 % en sombreros).

303

Fig. 1. Distribución relativa de los metales en las fracciones celulares de: (a) Ustilago

maydis; (b) Pleurotus ostreatus, (c) Agaricus bisporus (sombreros) y (d) Agaricus

bisporus (tallos).

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304

Conclusiones

Los resultados obtenidos en el análisis de los contenidos totales fueron dentro de los

intervalos reportados por otros autores en diferentes tipos de hongos. En este trabajo, se

encontraron significativamente inferiores niveles de los metales en huitlacoche respecto a

champiñón y hongo ostra, lo que se relacionó con más baja bioaccesibilidad de los

elementos en maíz respecto a otros tipos de sustratos. En cuanto a la distribución celular, los

resultados obtenidos para Pleurotus osteratus y Agaricus bisporus demuestran mayor

contribución de los elementos en citosol. Se puede deducir que las formas mayoritarias de

los metales en estos hongos son los compuestos solubles en agua. Se demostró también la

asociación de cantidades relativamente inferiores de estos metales con los compuestos

insolubles en agua, separados en fracciones de paredes y membranas celulares. Por otro

lado, en Ustilago maydis, se observó la mayor contribución de los elementos en la fracción

de paredes celulares, lo que sugiere su incorporación más efectiva a los compuestos

contenidos en esta fracción.

En conclusión, la distribución relativa de los metales en las fracciones celulares de

hongos depende de la especie biológica del hongo, su parte morfológica (sombrero, tallo) y

también de las propiedades de metal. Así, en Pleurotus ostreatus el contenido total de los

elementso y su acumulación en citosol fueron mayores respecto a otras dos tipos de hongos.

En Agaricus bisporus, los contenidos totales fueron inferiores con clara tendencia hacia más

eficiente incorporación de metales en paredes y membranas celulares. La asociación de Al,

Bi, Cd y Pb con las estructuras insolubles en agua fue más notoria en sombreros que en

tallos, mientras que la contribución de Cr, Cu y Ni en membranas y paredes celulares fue

mayor en tallos. Finalmente, el hongo huitlacoche contenía más bajos niveles de todos los

elementos y su incorporación preferente a la fracción de paredes celulares.

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