Etapa 3: Studii complexe privind tratamentul plagilor ... · PDF fileEtapa 3: Studii complexe ... P4 - S.C. Biosintex SRL ... ce analiza chimica s-a facut prin ICP. Suprafata pansamentelor

1

RAPORTARE STIINTIFICA

RST - Raport stiintific si tehnic in extenso

Etapa 3: Studii complexe privind tratamentul plagilor cutanate

utilizand biomateriale.

Perioada de raportare: 21.12.2015-20.12.2016

Participanti: CO - Institutul National de Cercetare Dezvoltare pentru Fizica Materialelor RA

P1 - Universitatea Politehnica din Bucuresti

P2 – Spitalul Clinic de Urgenta

P3 - Universitatea din Bucuresti

P4 - S.C. Biosintex SRL

Obiectivele fazei de executie:

Actualizarea site-ului web al proiectului;

Realizarea compozitelor de tip colagen/hidroxiapatita dopata cu argint si studiul

suprafetei specifice a biomaterialelor compozite de tip colagen/ hidroxiapatita dopate

cu argint.

Studiul proprietatilor structurale, morfologice si vibrationale ale biomaterialelor

compozite de tip colagen/ hidroxiapatita dopate cu argint.

Studii de difuzie a luminii DLS si ICP ale biomaterialelor compozite de tip colagen/

hidroxiapatita dopate cu argint.

Caracterizarea într-un mod non-distructiv și non-invaziv, folosind ultrasunete a

biomaterialelor compozite cu diferite concentratii de argint.

Studii in vitro si in vivo ale compozitelor de tip colagen/ hidroxiapatita dopate cu

argint.

Realizarea unui pansament pe baza de nanoparticule bioceramice inglobate intr-o

matrice de colagen.

Studii morfo-structurale ale pansamentului pe baza de nanoaparticule bioceramice

inglobate intr-o matrice de colagen.

Studii in vitro si in vivo privind eficienta pansamentului pe baza de nanoparticule

bioceramice inglobate intr-o matrice de colagen.

Vizite de lucru si stagii de perfectionare in laboratoarele colaboratorilor straini pentru

buna desfasurare a proiectului.

Diseminare rezultatelor prin participarea la conferinte nationale si internationale.

Diseminarea rezultatelor stiintifice obtinute prin trimiterea spre publicare a unui

articol intr-un jurnal cotat ISI.

2

Rezumat

Dupa cum se stie, crearea unui pansament cu actiune antimicrobiana in tratamentul

plagilor este de importanta majora cu atat mai mult cu cat tot mai multe tulpini microbiene au

capatat o tezistenta tot mai mare. In cadrul acestei etape s-au realizat pansamente pe baza de

hidroxiapatita dopata cu argint in matrice de colagen (AgHAp-Coll). Pansamentele obtinute

au fost caracterizate atat din punct de vedere fizico-chimic cat si din punct de vedere biologic.

Rezultatele DLS si de ultrasunte obtinute pe solutiile de AgHAp-Coll ne-au permis realizarea

unor pansamente uniforme. Studii elementale au fost realizate prin GDOES si EDAX in timp

ce analiza chimica s-a facut prin ICP. Suprafata pansamentelor obtinute a fost investigata prin

SEM in timp ce porozitatea si suprafata specifica a fost analizata prin metoda BET.Studiile

structurale efectuate prin DRX au evidentiat o structura specifica hidroxiapatitei si au aratat

ca o parte a ionilor de calciu au fost substituiti cu ioni de argint fara a modifica structura

hidroxiapatitei. Strudiile in vitro si in vivo realizate au aratat ca pansamentele obtinute in

laborator prezinta activitate antimicrobiana asupra tulpinilor rezistente la antibiotic cum ar fi

Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter

baumannii (Figura 21). Tulpinile de Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae,

Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii.

1. INTRODUCERE

Unul dintre riscurile majore asociate interventiilor chirurgicale ortopedice si dentare este

reprezentat de aparitia infectiilor postoperatorii [1-2]. In acest context, gasirea unui nou

biomaterial cu proprietati antimicrobiene imbunatatite este un aspect important. Unul dintre

biomaterialele des utilizate in domeniul biomedical este hidroxiapatita (HAp,

Ca10(PO4)6(OH)2) [3]. HAp a atras atentia cercetatorilor din intreaga lume, datorita faptului

ca este principalul component anorganic al tesutului osos si este utilizat in diverse aplicatii,

cum sunt implanturi, reconstructia osoasa, transportor de medicamente, etc. [4].

Mai mult, studii recente raportate in literatura de specialitate au aratat ca HAp poseda

proprietati biologice deosebite cum ar fi biocompatibilitate, bioactivitate, non-toxicitate,

osteoinductivitate, etc. [3]. Pe de altă parte, hidroxiapatita prezinta o structura unica care

permite substitutia cu diversi ioni metalici, cum ar fi: Ag, Zn, Cu, Eu, etc, elemente ce sunt

de interes pentru aplicatii medicale [5].

Acest tip de substitutii sunt, de asemenea, utile pentru imbunatatirea proprietatilor

biologice (antimicrobiene) precum si a proprietatilor fizico-chimice ale HAp [6]. Datorita

lipsei de activitate antimicrobiana, utilizarea HAp în implantologie este redusa [5]. In acest

context am ales sa dopam hidroxiapatita cu argint deoarece acesta este cunoscut si utilizat

inca din cele mai vechi timpuri pentru activitatea sa antimicrobiana impotriva diferitelor

tulpini bacteriene [2,7].

Studii recente au aratat ca proprietatile microbiostatice şi microbicide ale hidroxiapatitei

dopate cu argint depind de conținutul (cantitatea) de argint din probe [5, 8-10]. Printre

tulpinile cele mai des implicate in infectiile postoperatorii se numara Staphylococcus aureus

si Escherichia coli, tulpini care in general devin rezistente la tratamentul cu antibiotice [2].

Asadar, este de preferat utilizarea argintului ca agent antimicrobian in locul antibioticelor,

deoarece in general tulpinile bacteriene nu dezvolta rezistenta in acest caz [2].

Pe de alta parte, principala componenta organica a tesutului osos este colagenul (tip I), un

polimer natural, cu proprietati biologice deosebite [11]. Datorita proprietatilor sale, colagenul

a fost folosit in cosmetica, farmacologie si in aplicatii medicale [12-13]. Compozitele de tip

colagen/hidroxiapatita pot fi obtinute prin diferite metode, inclusiv prin liofilizare, separare

3

de faza indusa termic, etc. [14-21]. Dar metoda cea mai utilizata este liofilizarea fibrelor de

colagen impreuna cu pulberea de HAp [22-23].

Asadar, prezenta matricei de colagen poate imbunatati porozitatea pulberilor de

hidroxiapatita dopata cu argint, proprietate esentiala in ingineria tisulara [24-25]. Totodata,

acest tip de material actioneaza ca suport pentru proliferarea celulelor, contribuind astfel la

regenerarea tesutului osos [24, 26]. Prin urmare, acest nou tip de biomateriale compozite de

tip colagen/hidroxiapatita dopate cu argint pot fi de interes pentru aplicatii biomedicale,

datorita similaritatii lor din punct de vedere biologic si fizico-chimic cu tesutul osos natural

[27-31].

Pe de alta parte obtinerea de pansamente pe baza de nanoaparticule bioceramice

(hidroxiapatita dopata cu argint) inglobate intr-o matrice de colagen este de interes pentru

domeniul biomedical in special pentru tratarea infectiilor postoperatorii.

2. Sinteza biomaterialor compozite de tip colagen/hidroxiapatita dopate cu argint

Biomaterialele compozite de tip colagen/hidroxiapatita dopate cu argint au fost obtinute

in doua etape, descrise in cele ce urmeaza. Mai intai sau obtinut pulberi de hidroxiapatita

dopata cu argint (Ca10-xAgx(PO4)6(OH)2, xAg=0.05; 0.1 ; 0.2) in diverse concentratii prin

coprecipitare la 100 oC. Pentru aceasta sau utilizat ca precursori nitratul de argint, nitratul de

calciu si diamoniu hidrogen fosfat. Materialele astfel obtinute au fost uscate la 80 oC timp de

72 h intr-o etuva, in aer [32].

In cea de-a doua etapa, pulberea de hidroxiapatita dopata cu argint obtinuta anterior a

fost adaugata in 100 ml de solutie care contine colagen. Amestecul astfel obtinut a fost agitat

continuu timp de 48 de ore, fiind in final liofilizat cu un liofilizator Christ Model Delta 2–24

(Germania). Materialele astfel obtinute au fost notate cu 5AgHApColl, 10AgHApColl si

20AgHApColl.

3. METODE DE CARACTERIZARE

Materialele folosite in cadrul acestui studiu au fost caracterizate din punct de vedere

fizico-chimic prin de difractie de raze X, studii de adsorbtie/desorbtie de gaz (N2),

miscroscopie electronica de baleiaj, spectroscopie in infrarosu cu transformata Fourier, studii

de difuzia liminii si ICP-MS. Studiile de difractie de raze X sau realizat cu un difractometru

de tip D8 Advance (Bruker-AXS) utilizând radiatia CuK (=1,5405 Å), echipat cu un filtru

de Ni si un detector de tip Lynx Eye. Difractogramele au fost inregistrate intre 20° si 70° (2θ)

utilizand un pas de 0.02° si 34 s timp de masura per pas. Informatii privind suprafata

specifica precum si despre porozitatea compozitelor de tip colagen/ hidroxiapatita dopate cu

argint au fost obtinute prin metoda BET. Studiile au fost realizate cu un aparat ASAP2020 de

la Micrometrics. Pentru aceasta probele (0.2g) au fost degazate la 3500C. Masuratorile de

adsorbtie/desorbtie de gaz sau realizat in prezenta N2, la o temperature de 77K. Determinarea

suprafatei specifice a probelor s-a realizat prin metodele Bruaauer-Emmett-Teller (BET),

Langmuir şi t-plot. De asemenea, volumul porilor a fost calculat cu ajutorul modelului

Barrett-Joyner-Halenda (BJH). Pentru studiile de miscroscopie electronica de baleiaj sa

utilizat un microscop Quanta Inspect F50 cuplat cu un dispozitiv EDAX/2001 pentru analiza

elementala. Studii elementale au fost realizata prin intermediul Spectroscopiei de emisie

optica in descarcare incandescenta (GDOES) folosind un spectroscop GD Profiler 2 de la

Horiba/Jobin-Yvon. Studiile de spectroscopie in infrarosu cu transformata Fourier sau realizat

cu un spectrometru SP 100 Perkin Elmer (ATR). Domeniul de spectral utilizat a fost intre 400

si 4000 cm-1. Studiile privind diamentrul hydrodinamic si distributia de dimensiuni au fost

realizate utilizand un ONU SZ-100 Analizor pentru nanoparticuler Horiba/Jobin-Yvon. ICP-

4

MS este o metoda extrem de sensibila prin care se pot masura o gama larga de metale si

nemetale la concentratii foarte mici (de ordinul parti per trillion- ppt). Masuratorile au fost

efectuate cu un aparat tip LA-ICP-MS.

Pe de alta parte, materialele utilizate (solutiile utilizate la realizarea pansamentelor) in

cadrul acestui studiu au fost caracterizate prin studii noninvazive ultrasonore. Echipamentul

utilizat pentru pentru determinarile experimentale necesare calculararii vitezei undelor in

lichidul de referinta (apa bidistilata), cat si a vitezei mediate si atenuarii in probelor de

hidroxiapatita dopata cu argint (xAg = 5 si xAg = 20) dispersate in solutie de apa si solutie de

collagen (5AgHAp, 5 AgHapColl, 20AgHAp si 20AgHApColl) este format din recipientul

termo-controlat, blocul electronic de măsurare şi control a temperaturii (care afișează

temperatura cu eroare de 0,1 °C şi comadă după un program adaptiv încălzirea în recipient)

aparatul puser-receiver si traductorul ultrasonor. Osciloscopul Tektronix DPO 4014B (produs

de Tektronix solutions- http://www.tek.com Tektronix, Inc., Beaverton, USA) a fost folosit

pentru afişarea şi stocarea semnalelor de la pulser-receiver.

Mai mult decat atat, in adrul acestui studiu au fost realizate studii in vitro (studii

antimicrobiene pe tulpini rezistente la antibiotice) si in vivo (pe şobolani albi de sex feminin

din rasă Wistar). Pentru testarea proprietatilor antimicrobiene au fost utilizate patru tulpini

rezistente la antibiotice (Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas

aeruginosa, Acinetobacter baumanni). Protocolul utilizat pentru izolarea celor patru tulpini

folosite in acest studiu a constat in recoltarea produsului patologic pe tampon steril cu mediu

de transport Amies. A urmat insamantarea pe mediile tip geloza sange si CLED. Dupa aceea

probele au fost puse in incubator la temperatura constanta de 37 oC timp de 48 de ore. Dupa

incubare a urmat selectarea si identificarea germenilor patogeni iar la sfarsit testarea

rezistentei la antibiotice. Pentru experimentele in vivo au fost folositi şobolani albi de sex

feminin (n=3 per grup) din rasă Wistar (având o greutate de ~ 50 ± 10g). Acesti soareci au

fost achizitionati de la Biobaza Institutului Oncologic Bucuresti. Sobolanii au fost tinuti într-

un mediu cu temperatură constanta (22 ± 20C), lumină (cicluri de 12 h lumina/întuneric) şi

umiditate (60 ± 10%) controlate. Animalele au fost mentinute într-un mediu fără agenti

patogeni în concordantă cu Ghidul NIH pentru Îngrijirea şi Utilizarea Animalelor de

Laborator.

4. REZULTATE

In Figura 1 sunt prezentate difractogramele probelor 5AgHApColl, 10AgHApColl si

20AgHApColl. Acestea pun in evidenta faptul ca probele sunt formate dintr-o singura faza si

anume hidroxiapatita hexagonala (fișa ICDD nr. 9-432).

Figura 1. Difractogramele obtinute pe probele 5AgHApColl, 10AgHApColl si

20AgHApColl.

http://www.tek.com/

5

Relative Pressure (p/p°)

0.000.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00

Qu

an

tity

Ad

so

rbe

d (

cm

³/g

ST

P)

00

50

100

150

200

250

300

350

Isotherm Linear Plot

HAG20COL - Adsorption

HAG20COL - Desorption

De asemenea, se mai poate observa ca toate probele prezinta o structura slab

cristalizata, cel mai probabil datorita prezentei colagenului. Mai mult, in difractogramele

obtinute pe compozitele de tip colagen/hidroxiapatita dopata cu diferite concentratii de argint

nu s-a observat formarea de noi faze cristaline sau prezenta impuritatilor.

Suprafata specifica ale probelor analizate a fost determinata din izotermele de

adsorbtie. In Figurile 2-4 sunt prezentate izotermele de adsorbtie-desorbtie de gaz ale

probelor 5AgHApColl, 10AgHApColl si 20AgHApColl.


0.000.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00

Qu

an

tity

Ad

so

rb

ed

(cm

³/g

ST

P)

00

200




Figura 2: Izotermele de adsorbtie si desorbtie de gaz ale probei 5AgHApColl.


0.000.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00

Qu

an

tity

Ad

so

rb

ed

(cm

³/g

ST

P)

00

200






6

Pore Diameter (nm)

2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10 15 20 25

dV

/dlo

g(D

) P

ore

Vo

lum

e (

cm

³/g

·Å)

0.00.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

BJH Desorption dV/dlog(D) Pore Volume

Halsey : Faas Correction

HAG5COL

Izotermele obtinute pentru cele trei probe sunt de tip IV conform clasificării IUPAC

[33] acestea fiind caracteristice unei adsorbtii in mezopori. In acest caz condensarea capilară

domina umplerea mezoporilor, procesul de desorbtie fiind ireversibil. De asemenea, se

observa efectul de histerezis intre curba de adsorbtie si cea de desorbtie. Se mai poate

observa ca pentru valori ale p/p0 mai mici de 0.70 izotermele de adsorbtie si de desorbtie nu

se mai pot distinge.

Tabelul 1: Suprafata specifica si volumulul de pori obtinute pentru compozitele de tip

colagen/hidroxiapatita dopate cu diferite concentratii de argint.

Proba 5AgHApColl 10AgHApColl 20AgHApColl

Suprafaţa specifică BET

(m2/g)

116.7170 109.1578 92.4192

Langmuir (m2/g) 123.8967 116.1475 98.3123

t-plot (m2/g) 103.1041 107.8533 94.0182

Pore Volume (cm³/g) 0.467312 0.535712 0.488589

Rezultatele din Tabelul 1 pun în evidenta influenta concentratiei de argint asupra

suprafetei specifice si a volumului de pori. Se poate observa ca acesti parametrii nu se

modifica semnificativ o data cu cresterea concentratiei de argint din probe.

In Figurile 5-7 sunt prezentate distributiile volumului de pori obtinute pentru

compozitele de tip colagen/hidroxiapatita dopata cu diferite concentratii de argint. In figurile

5-7 se poate observa ca probele prezinta o distributie larga a dimensiunilor porilor cu

diametre ce variaza intre 10-20 nm.

Figura 5: Distributia volumului porilor pentru proba 5AgHApColl.

Pore Diameter (nm)

3 4 5 6 7 8 9 10 20

Po

re V

olu

me

(cm

³/g

·nm

)

0.000.00

0.02

BJH Desorption dV/dD Pore Volume


HAG10COL


7

Pore Diameter (nm)

2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10 15 20 25

Po

re V

olu

me

(cm

³/g

·nm

)

0.0000.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

0.035

BJH Desorption dV/dD Pore Volume


HAG20COL


Studiile ICP-AES realizate pe probele 5AgHApColl, 10AgHApColl si 20AgHApColl

au permis determinarea concentratiei de argint (% wt). Astfel, pentru proba 5AgHApColl a

fost determinata o concentratie de argint egala cu 0.458±0.12 in timp ce pentru proba

10AgHApColl concentratie de argint determinata a fost egala cu 0.938±0.11. Concentratie de

argint determinata pentru proba 20AgHApColl a fost egala cu 1,978±0.20.

Morfologia compozitelor de tip colagen/hidroxiapatita dopata cu diferite concentratii

de argint a fost investigata prin microscopie electronica de baleiaj, rezultatele obtinute fiind

prezentate in Figura 8. In imaginile MEB pun in evidenta faptul ca morfologia probelor se

modifica usor o data cu cresterea cantitatii de argint din probe. De asemenea, se poate

observa ca particulele de 10AgHApColl (Figura 8A) precum si cele de 20AgHApColl (Figura

8B) au o morfologie aciculara, avand tendinta de a se aglomera cel mai probabil datorita

prezentei matricei de colagen in care sunt inglobate. Mai mult se poate observa ca probele

sunt poroase.

Figura 8. Imagini MEB obtinute pe probele 10AgHApColl (A) si 20AgHApColl (B).

In Figura 9 este prezentat spectrul EDAX obtinut pe proba 20AgHApColl. Asadar in

spectrul EDAX se observa prezenta principalelor elemente constituente ale hidroxiapatitei

dopate cu argint in matrice de colagen (C, Ca, P, Ag, O).

Figura 9. Spectrul EDAX si cartografia obtinuta pe proba 20AgHApColl.

8

Mai mult, cartografia obtinuta pe proba 20AgHApColl (Figura 9) evidentiaza

distributia omogena si uniforma a elementelor constituente C, Ca, P, Ag, O in proba.

Spectrele FTIR obtinute pentru probele 10AgHApColl si 20AgHApColl sunt

prezentate in figura 10. In ambele spectre se poate observa prezenta benzilor de vibratie

atribuite gruparilor functionale prezente in structura hidroxiapatitei si anume : fosfat,

carbonat si hidroxil. Astfel, benzile vibrationale de la ⁓ 471 cm-1, ⁓ 562 cm-1 si ⁓ 603 cm-1

sunt atribuite modurilor de vibratie fundamentale (ν2) si respectiv (ν4) PO43-. Pe de alta parte

Mai mult decat atat, benda de vibratie de la 961 cm-1 este asociata modului de vibratie (ν1)

PO43- iar cea de la 1024 cm-1 este caracteristica modului de vibratie (ν3) PO4

3-. Prezenta

maximului de la 631 cm-1 pune in evidenta prezenta gruparilor functionale hidroxil in

structura probei. De asemenea, banda de vibratie de la ⁓ 874 cm-1 poate fi asociata gruparii

(ν3) CO32. Mai mult prezenta apei adsorbita la suprafata este subliniata prin prezenta

maximelor foarte largi in regiunea spectrala 1600-1700 cm-1. In spectrele FTIR (Figura 10)

nu se observa aparitia unor benzi de vibratie suplimentare.

Figura 10: Spectrele de FTIR ale probelor 10AgHApColl si 20AgHApColl.

Morfologia pansamentelor pe baza de nanoparticule bioceramice inglobate

intr-o matrice de colagen a fost studiata cu ajutorul microscopiei electronice de baleiaj.

Micrografiile MEB obtinute pe pansamentele 10AgHApColl si 20AgHApColl sunt

prezentate in Figura 11 (a-b). Imaginile MEB obtinute pe pansamentele 10AgHApColl si

20AgHApColl pun in evidenta atat prezenta pulberii de hidroxiapatita dopata cu argint cat si

a fibrelor de colagen. De asemenea, se poate observa ca fibrele de colagen sunt inglobate in

pulberea de hidroxiapatita dopata cu argint.

Figura 11: Microgafii MEB ale pansamentelor 10AgHApColl (A) si 20AgHApColl (B).

9

Figura 12. Spectrul EDAX si cartografia obtinute pe pansamentul 20AgHApColl.

In Figura 12 sunt prezentate spectrul EDAX si cartografia obtinute pe pansamentul

20AgHApColl. Pe de o parte, spectrul EDAX evidentiaza prezenta C, Ca, N, P, O si Ag

(elementele constituente ale pansamentului 20AgHApColl) in proba iar pe de alta parte

cartografia confirma distribtia uniforma si omogena a acestor elemente in pansament.

Studii complementare privind analiza elementala a probelor 10AgHApColl si

20AgHApColl au fost realizate si prin masuratori de GDOES. Spectroscopia de emisie optica

in descarcare incandescenta (GDOES) este o tehnica esentiala atat pentru analiza directa a

materialelor solide cat si pentru analiza elementala a materialelor. Dupa cum se poate observa

in Figura 13, elementele constitutive ale probelor de hidroxiapatita dopata cu argint in

matrice de colagen sunt Ca, P, Ag, C, O, N. Rezultatele obtinute prin GDOES sunt in perfect

acord cu cele obtinute prin EDAX.

Figura 13: Analiza elementala a pansamentului 10AgHApColl.

Dimensiunea hidrodinalica medie a particulelor de 5AgHApColl, 10AgHApColl si

20AgHApColl si distributia de dimensiuni a probelor studiate au fost determinate prin studii

de difuzia luminii (DLS). Semnalul obținut de la lumina împrăștiată este colectat într-un

corelator multi-canal care generează o funcție utilizată pentru determinarea coeficientului de

difuzie translationala a particulelor analizate. Pentru calculul dimensiunii medii a particulelor

a fost utilizata ecuatia Stokes-Einstein. In Figura 14 sunt prezentate distributiile de

dimensiune pentru cele trei probe analizate.

10

Figura 14 : Distributia de dimensiuni a probelor 5AgHApColl (xAg = 5),

10AgHApColl (xAg = 10) si 20AgHApColl (xAg = 20) determinata prin DLS.

Masuratorile de ultrasunete au fost realizate pentru caracterizarea într-un mod non-

distructiv si non-invaziv a biomaterialelor compozite cu diferite concentrații de argint (xAg =

5 si xAg = 20). Pentru calcularea vitezei undelor in lichidul de referinta (apa bidistilata) cat si

a vitezei mediate si a atenuarii in probele de hidroxiapatita dopata cu argint (xAg = 5 si xAg =

20) dispersate in solutie de apa si solutie de collagen (5AgHAp, 5 AgHapColl, 20AgHAp si

20AgHApColl) s-a folosit apa bi-distilată ca lichid etalon. S-a ales, de asemenea, traductorul

ultrasonor de 5 MHz pentru semnalul său scurt și frecvența ridicată. In timpul experimentului

aparatul pulser-receiver trimite periodic pulsuri reglabile de tensiune de 100- 300 V.

Traductorul produce prin răspunsul său dinamic la pulsul electric, un puls de presiune, prin

efect piezoelectric, devinenind, dupa generare, prin efect piezo-electric invers, receptor de

semnal. Pentru a reduce zgomotul electric, semnalele au fost mediate. In cazul

experiementelor noastre semnalul afisat este rezultatul medierii a 32 semnale achiziționate.

Temperatura probei masurate a fost masurata cu o precizie de 0,1 C. Prelucrarea semnalelor

s-a relizat cu ajutorul unui program adecvat acestui tip de probe. Viteza undelor ultrasonore

prin lichidul analizat reprezintă o caracteristică a acestuia și poate servi la caracterizarea

eventualelor abateri de la concentrație în cazul preparării altor eșantioane de același tip.

Semnalele obtinute in cazul probelor de hidroxiapatita dopata cu argint (xAg = 5 si xAg = 20)

dispersate in solutie de apa (5AgHAp-H2O, 20AgHAp-H2O) au fost obtinute la 5 MHz.

Astfel, in Figura 15 sunt prezentate primele trei ecouri pentru apa bi-distilată la 5 MH in timp

ce Figura 16 prezinta primele trei ecouri pentru hidroxiapatita dopata cu argint (xAg = 5)

(5AgHAp5-H2O) dispesata in apa deionizata la 5 MHz.

Figura 15 : Primele trei ecouri pentru lichidul de referință (apa bi-distilată) la 5 MHz: grupate

(sus) și separate în următoarele trei ferestre ale figurii.

11

Figura 16 : Primele trei ecouri pentru 5HApAg-H2O la 5 MHz: grupate (sus) și separate în

următoarele trei ferestre ale figurii.

In urma calculelor realizate s-a constata ca viteza undelor in apa la o temperature a

fluidului de 26 oC a fost de 1492.07 m/s. Astfel, s-a constat ca pentru:

Ecoul 1 => Dif. timp relativ la ref. = 0.284 (microsecunde)



Tinand cont de parametrii calculati mai sus s-a putut calcula si viteza mediata a 5AgHAp-

H2O a carei valoare a fost egala cu 1484.78 +/- 1.03 (m/s). Atenuarea calculate in lichidul de

referinta (apa bidistilata) a fost egala cu 2.35198 Np/m ceea ce este echivalentul a 0.270781

dB/m (din rms). Atenuarea calculate in cazul solutie de hidroxiapatita dopata cu argint unde

xAg=5, (5HApAg-H2O) a fost egala cu 7.28932 Np/m ceeace este echivalent cu 0.839214

dB/m (din rms).

In Figura 17 sunt prezentate primele trei ecouri pentru pentru 20HApAg-H2O la 5

MHz. Cele trei ecouri grupate pot fi observate in partea de sus a imaginii. In urmatoarele trei

ferestre ale figurii sunt prezentate cele trei ecouri separate.

Figura 17: Primele trei ecouri pentru 20HApAg-H2O la 5 MHz: grupate (sus) și separate în

următoarele trei ferestre ale figurii.

Mai jos sunt prezentate dif de timp relativ la referinta (apa deionizata) pentru fiecare din cele

trei ecouri. Aceste valori sunt prezentate mai jos:




12

Viteza mediata calculate pentru proba 20HApAg-H2O a fost egala cu 1486.12 +/- 1.55 (m/s).

Atenuarea calculate in cazul solutie de hidroxiapatita dopata cu argint unde xAg=20,

(20HApAg-H2O) a fost egala cu 6.81768 Np/m ceea ce este echivalent cu 0.784914 dB/m

(din rms).

In cazul probelor de hidroxiapatita dopata cu argint (xAg = 5 si xAg = 20) si dispersate

in solutie de collagen (5AgHapColl si 20AgHApColl) ecourile au fost obtinute la 1MHz. Mai

jos sunt prezentate primele 2 ecouri ale lichidului de referinta (collagen) la 1 MHz cat si cele

doua ecouri ale 5AgHapColl. In Figurile 18 si 19 sunt prezentate atat cele doua ecouri

grupate (in partea de sus a figurii) cat si separate in urmatoarele doua ferestre (in partea de jos

a figurilor). Figura 18 prezinta primele două ecouri pentru lichidul de referință (collagen) la 1

MHz in timp ce Figura 19 prezinta primele două ecouri pentru 5AgHapColl.

Figura 18:Primele două ecouri pentru lichidul de referință (apa bi-distilată) la 1 MHz: grupate

(sus) și separate în următoarele două ferestre ale figurii.

Figura 19: Primele două ecouri pentru HApAg5-Colagen la 1 MHz: grupate (sus) și separate

în următoarele două ferestre ale figurii.

Studiile ultrasonore pentru HApAg5-Colagen la 1 MHz s-au realizat la temperatura de

26 oC. Viteza undelor in collagen la temperatura de 26 oC a fost de 1492.07 m/s. Distanta

traductor-reflector masurata a fost egala cu 42.427 (mm). Mai mult, s-a constat ca pentru:

Ecoul 1 => Dif. timp relativ la ref. = -0.25 (microsecunde)

Ecoul 2 => Dif. timp relativ la ref. = -0.26 (microsecunde)

Tinand cont de paramentrii de mai sus, a fost calculata viteza mediata a HApAg5-

Colagen. Valoarea obtinuta in urma calculelor realizate pentru viteza mediata a HApAg5-

13

Colagen a fost 1498.66 +/- 0.16 (m/s). Atenuarea calculate in collagen a fost egala cu

3.11333 Np/m ceeace este echivalent cu 0.358436 dB/m (din rms). Pe de alta parte, atenuarea

calculata pentru HApAg5-Colagen a fost egala cu 11.9723 Np/m cee ace este echivalent cu

1.37837 dB/m (din rms). Pe baza datelor măsurate s-au determinat constantele elastice de

compresiune ale eșantioanelor. Valoarea constantei elastic calculate pentru apa bidistilata a

fost de 2,226 MPa. Pentru probele 5HApAg-H2O și 5HApAg-Colagen s-au obtinut valori

practic identice (2,227 MPa). Valoarea constantei elastic calculate pentru proba 20HApAg-

H2O a fost egala cu 2.593 MPa.

Rezultatele obtinute in urma analizelor DLS si de ultrasunte realizate pe solutiile de

AgHAp-Coll ne-au permis obtinerea unor pansamente uniforme.

Avand in vedere rezistenta crescuta a microbilor fata de terapiile existente la ora

actuala s-a dorit dezvoltarea unor noi agenti antimicrobieni eficienti, dar care sa nu prezinte

efectele adverse ale terapiilor clasice. S-a incercat dezvoltarea unor biomateriale compozite

pe baza de hidroxiapatita dopata cu argint intr-o matrice de collagen. Pansamentul astfel

obtinut a fost testat pentru a-i putea evalua efectul antimicrobian impotriva tulpinilor de


baumannii. Figurile 20-21 prezinta efectul antimicrobian al pansamentelor create asupra celor

4 tulpini studiate.

Figura 20 : Efectul antimicrobian al pansamentelor pe baza hidroxiapatita doata cu argint in

matrice de colagen asupra Enterococcus faecalis (A) si Klebsiella pneumoniae (B).

Figura 21 : Efectul antimicrobian al pansamentelor pe baza hidroxiapatita doata cu argint in

matrice de colagen asupra Pseudomonas aeruginosa (A) si Acinetobacter baumannii (B).

Studiile realizate pe pansamentele cu argint tip Mepilex Ag (pansament antimicrobian

spongios cu silicon moale) furnizate de partenerul P4 (S.C. Biosintex SRL) privint activitatea

antimicrobiana asupra Pseudomonas aeruginosa (A) si Acinetobacter baumannii (B) sunt

prezentate in Figura 22. Dupa cum se poate observa acest tip de pansamente nu au prezentat

activitate antimicrobiana la tulpini rezistente la antibiotice. Cu toate acestea, in cazul

analizelor in vivo acest tip de pansament a mentinut mediul umed pentru plaga. Pe de alta

parte, se stie ca acest tip de pansament este recomandat in tratamentul plagilor cu exudat

moderat, cum sunt ulcerele de picior, ulcere de laba a piciorului, ulcere de presiune si arsuri

de profunzime medie si poate fi folosit ca bandaj compresiv.

14

Figura 22 : Efectul antimicrobian al pansamentelor cu argint tip Mepilex Ag asupra

Pseudomonas aeruginosa (A) si Acinetobacter baumannii (B).

Pentru experimentele in vivo a fost necesara realizarea unor plagi in regiunea dorsala a

şobolanilor albi de sex feminin din rasa Wistar. Aceste plagi au fost contaminate cu tulpini de


baumannii (Figura 23). Tulpinile de Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae,

Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii au fost obținute din plagile

postoperatorii infectate cu aceste tulpini ale pacientilor din cadrul Spitalului Clinic de

Urgenta Bucuresti. In Tabelul 2 este prezentat rezultatul antibiogramei tulpinilor de de


baumannii.

Figura 23: Cultura cu Acinetobacter baumannii (A) si Pseudomonas aeruginosa (B) din care

s-a realizat contaminarea plagilor sobolanilor Wistar.

Tabelul 2. Antibiograma tulpinilor de Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae,

Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii.

Klebsiella

Pseudomonas

Aeruginosa

Acinetobacter

Enterococcus

Faecalis

Trimethoprim/Sulphametoxazol rezistent - rezistent -

Ampicilina rezistent - - sensibil

Ciprofloxacin rezistent rezistent rezistent rezistent

Levofloxacin rezistent rezistent rezistent rezistent

Cefotaxim rezistent - - -

Imipenem rezistent rezistent rezistent -

Meropenem rezistent rezistent rezistent -

Piperacilina-Tazobactam rezistent rezistent rezistent -

Gentamicina rezistent rezistent rezistent rezistent

Colistin Sensibil sensibil Sensibil -

Testarea la antibiotice a fost facuta si interpretata conform ghidului CLSI varianta din

2016. Pentru inocularea sobolanilor s-au folosit culturi proaspete de 24 de ore. Cele patru

tulpini folosite în acest studiu sunt considerate ca fiind reprezentative pentru infectiile

15

nozocomiale. Bacteriile prelevate au fost cultivate pe mediile geloza sange, CLED si mediu

cromogen (CHROMagar Orientation) si au fost incubate la 37 0C timp de 24 de ore.

Identificarea a fost facuta cu teste biochimice clasice si pe aparatul Microscan (producator

Siemens) de identificare si testare la antibiotice. Pentru testarea la antibiotice fost utilizat

mediul Mueller Hinton si metoda de testare a antibioticelor Kirby–Bauer, iar interpretarea a

fost facuta folosind ghidul CLSI Ed. 2016.

Infectiile de plaga reprezinta o patologie des intalnita in spitalele din Romania.

Acestea sunt cauzate de agenti microbieni ce prezinta rezistenta mare fata de terapiile

existente la ora actuala pe piata. Infectiile de plaga reprezinta complicatii redutabile, ele

crescand atat morbiditatea cat si mortalitatea in randul pacientilor care prezinta aceste

complicatii, fapt ce duce la cresterea cheltuielilor de spitalizare si la scaderea calitatii vietii

pacientilor. Hidroxiapatita dopata cu argint elibereaza in mod continuu argintul din

pansament astfel incat concentrația ionilor de argint este menținută timp de cateva zile la

nivelul plagii.

Studiul in vivo al efectului pansamentelor pe baza de hidroxiapatita dopata cu argint in

matrice de collagen a fost realizat la diferite intervale de timp (24, 48 si 96 h) după ce plagile

produse in regiunea cervicala a sobolanilor Wistar au fost infectate cu tulpini de


baumannii. Plaga infectata a fost pansata la 24 de ore, 48 ore si respectiv 96 ore. La fiecare

analiza au fost prelevate probe, respectand conditiile de asepsie. In Figura 24 este prezentata

plaga infectata cu tulpini de Pseudomonas aeruginosa la 24 si 48h de la inoculare.

Figura 24 : Plaga infectata cu tulpini de Pseudomonas aeruginosa la 24h (stanga) si

48h (dreapta) de la inoculare.

În urma acestor experimente, au supravietuit toate animalele de laborator carora le-au

fost aplicate pansamente cu hidroxiapatita dopata cu argint in matrice de collagen. De

asemenea, pe întreaga durată a desfăşurării experimentului, şobolanii nu au prezentat efecte

secundare cum ar fi letargie, vărsături sau diaree.

Prin aceste studii s-a demonstrat ca incorporarea ionilor de Ag în structura

hidroxiapatitei imbunatateste proprietățile chimice și biologice ale acesteia. Prin incorporarea

ionilor de argint in structura hidroxiapatitei prin substitutia ionilor de Ca2+ se obtine un nou

material ce combina proprietatile biologice ale hidroxiapatitei cu cele antimicrobiene ale

argintului fara efecte secundare ce ar putea aparea din cauza excesului de argint. Pe de alta

parte, ionii de argint legati in reteaua hidroxiapatitei devin mult mai stabili iar efectul

antimicrobian se observa pe intervale mai lungi de timp ca urmare a eliberarii constante in

timp.

5. Concluzii

Pansamentele pe baza de hidroxiapatita dopata cu argint in matrice de collagen

obtinute in cadrul grupului au prezentat o structura hexagonala specifica hidroxiapatitei

16

avand o suprafata specifica cuprinsa intre 90 si 120 m2/g si izoterme de tip IV caracteristice

materialelor mezoporoase. Investigatiile de MEB realizate pe compozitelor de tip

colagen/hidroxiapatita dopata cu diferite concentratii de argint au aratat ca morfologia se

modifica usor in functie de cantitatea de argint si cea de colagen. Studiile elementale realizate

prin EDAX si GDOES au aratat ca elementele constituente ale pansamentelor realizate sunt

C, Ca, P, Ag, O in toate probele analizate. Dimensiunea hidrodinalica medie a particulelor de

5AgHApColl, 10AgHApColl si 20AgHApColl si distributia de dimensiuni a probelor

studiate determinate prin studii de difuzia luminii au aratat ca materialele ca in solutie avem

particule uniform distribuite intr-o zona restransa de dimensiuni. Masuratorile de ultrasunete

realizate pe solutiile utilizate la realizarea pansamentului ne-au permis determinarea

constantei elastice a materialului si au pus, de asemenea, in evidenta omogenitatea

particulelor in solutiile analizate. Astfel, prin corelarea rezultatelor obtinute in urma

analizelor DLS si de ultrasunte realizate pe solutiile de AgHAp-Coll am putut obtine

pansamente uniforme.

Studiile in vitro privind efectul antimicrobian al pansamentelor realizate in cadrul

grupului au fost realizate pe tulpini de Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae,

Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii. S-a observat ca noul pansament obtinut

prezinta proprietati antimicrobiene foarte bune. Efectul antimicrobian foarte bun se poate

explica prin faptul ca prin doparea hidroxiapatitei cu argint si inglobarea in matricea de

collagen ionii de argint devin mult mai stabili iar efectul antimicrobian se observa pe

intervale mai lungi de timp ca urmare a eliberarii constante in timp.

Mai mult decat atat, studiile in vivo al efectului pansamentelor pe baza de

hidroxiapatita dopata cu argint in matrice de collagen realizate la diferite intervale de timp

(24, 48 si 96 h) după ce plagile produse in regiunea cervicala a sobolanilor Wistar au fost

infectate (cu tulpini de Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas

aeruginosa, Acinetobacter baumannii) au aratat ca aceste plagi se vindeca mult mai repede

atunci cand sunt tratate cu pansamentele realizate de noi decat cu pansamentele comerciale.

De asemenea, animalele de laborator pe care s-au realizat aceste teste au supravietuit

experimentelor si nu au prezentat efecte secundare in timpul acestor experimente.

6. Diseminarea rezultatelor cercetarilor realizate in cadrul acestei etape s-a facut dupa

cum urmeaza (in conformitate cu planul de realizare al proiectului)

6.1. CONFERINTE:

1. “5th Zing Polymer Chemistry Conference”, 04.08.2016 – 11.08.2016, Dublin (Irlanda). In

cadrul acestei conferinte a fost prezentata lucrarea (poster) “Antifungal activity of enamel

based composite layers deposited on titanium substrate” autori: S.L. Iconaru, A.M. Prodan,

M. Beuran, C.S. Ciobanu, C.L. Popa, C.S. Turculet, D. Predoi.

2. “8th Conference on "Times of Polymers (TOP) & Composites" 2016”, 19.06.2016-

23.06.2016, Roma (Italia). In cadrul acestei conferinte a fost prezentata lucrarea:

“Characterisations of collagen-silver-hydroxyapatite nanocomposites", autori: C. S. Ciobanu,

C. L. Popa, C. C. Petre, G. Jiga, R. Trusca, D. Predoi.

3. “GD DAY”, 15.09.2016-16.09.2016, Paris (Franta). In cadrul acestei conferinte a fost

prezentata lucrarea (prezentare orala): “Antifungal Activity Against Candida Albicans

Biofilm Of Composite Layers Based On Silver Doped Hydroxyapatite-

Polydimethylsiloxanes”, autori: C.S. Ciobanu, C. L. Popa, S.L. Iconaru, S. Gaiaschi, P.

Chapon, A.M. Prodan, A. Groza, M. Ganciu, D. Predoi.

4. “GD DAY”, 15.09.2016-16.09.2016, Paris (Franta). In cadrul acestei conferinte a fost

prezentata lucrarea (prezentare orala): “Structural And Antimicrobial Properties Of Silver

17

Doped Hydroxyapatite Thin Films Deposited On PDMS/Si”, autori:C. L. Popa, C.S.

Ciobanu, S.L. Iconaru, S. Gaiaschi, P. Chapon, A.M. Prodan , R. Ghita, A. Groza, M. Ganciu,

D. Predoi.

6.2. ARTICOLE PUBLICATE IN JURNALE COTATE ISI

1. Predoi Daniela, Popa Cristina-Liana, Chapon Patrick, Groza Andreea, Iconaru Simona-

Liliana, “Evaluation of the Antimicrobial Activity of Different Antibiotics Enhanced with

Silver-Doped Hydroxyapatite Thin Films”, Materials 2016, 9(9), 778.

2. Cristina Liana Popa, Carmen Steluta Ciobanu, Georgeta Voicu, Eugenia Vasile, Mariana

Carmen Chifiriuc, Simona Liliana Iconaru, Daniela Predoi, " Influence of thermal

treatment on the antimicrobial activity of silver doped biological apatite", Nanoscale

Research letters- Nanoscale Res Lett (2015) 10: 502.

3. C.L. Popa, S. Antohe, F. Saftiuc, M. Ech Cherif El Kettani, D. Leduc, F. Antohe, M.V.

Predoi, Preliminary structural and ultrasonic characterization of hydroxyapatite, Digest

Journal of Nanomaterials and Biostructures Vol. 11, No. 3, July - September 2016, p. 997

– 1006

4. Iconaru Simona-Liliana, Prodan Alina Mihaela, Turculet Claudiu Stefan, Beuran Mircea,

Ghita Rodica, Costescu Adrian, Groza Andreea, Chifiriuc Mariana-Carmen, Chapon

Patrick, Gaiaschi Sofia, Hristu Radu, Stanciu George A., Trusca Roxana, Ganciu Mihai,

Raita Stefania Mariana, Vineticu Nicoleta, Ciobanu Carmen Steluta, “Enamel based

composite layers deposited on titanium substrate with antifungal activity”, Journal of

Spectroscopy- in press

5. Ecaterina Andronescu, Alina Surugiu, Monica Luminita Badea, Alin Iosif, Carmen

Steluta Ciobanu Antimicrobial Activity Of Europium Doped Hydroxyapatite Powders

After Immersion In Sbf Solution, U.P.B. Sci. Bull., Series B,- acceptat

Un alt obiectiv atins a fost acela de a actualiza site-ul web al proiectului:

http://www.infim.ro/ro/projects/compozite-bioceramice-cu-aplicatii-locale-terapia-

antibacteriana.

Mai mult decat atat, pentru o caracterizare complexa a materialelor sintetizate in

cadrul acestei etape, studii complementare au fost realizate in laboratoarele colaboratorilor

straini (DLS, ICP si masuratori de ultrasunete). Rezultatele obtinute in cadrul stagiilor de

lucru vor fi valorificate prin publicarea unui articol intr-un jurnal cotat ISI impreuna cu

colaboratorii straini. Pe de alta parte, rezultatele rezultatele studiilor de ultrasunete obtinute in

urma masuartorilor efectuate de terti au fost valorificate prin publicarea unui articol cotat ISI

(pozitia 3 in lista de articole publicate in jurnale cotate ISI)

Bibliografie

1. J.F. Agassant, A. Fortin, and Y. Demay, Polym. Eng. Sci. , 34 , 110 (1994).

2. M. Sygnatowicz, K. Keyshar, and A. Tiwari, JOM - J. Min. Met. Mat. S. , 62, 65

(2010).

3. A. Ewald, D. Hösel, S. Patel, L.M. Grover, J.E. Barralet, and U. Gbureck, Acta

Biomater. ,7(11), 4064 (2011).

4. S.V. Dorozhkin, J. Funct. Biomater. , 6, 708 (2015).

5. D. Gopia, N. Bhuvaneshwari, L. Kavitha, and S. Ramya, Ceram. Int. , 41, 3116

(2015).

6. M. Supova, Ceram. Int. , 41, 9203 (2015).

http://www.infim.ro/ro/projects/compozite-bioceramice-cu-aplicatii-locale-terapia-antibacteriana

http://www.infim.ro/ro/projects/compozite-bioceramice-cu-aplicatii-locale-terapia-antibacteriana

18

7. C.S. Ciobanu, C.L. Popa, and D. Predoi, J. Serb. Chem. Soc. , 81, 1 (2016).

8. C. L. Popa, A.M. Prodan, C. S. Ciobanu, and D. Predoi, Gen. Physiol. Biophys. ,35, ,

299 (2016).

9. C.S. Ciobanu, S.L. Iconaru, M.C. Chifiriuc, A. Costescu, P. Le Coustumer, and D.

Predoi. BioMed Res. Int. ,2013, 1 (2013).

10. N. Rameshbabu, T.S. Sampath Kumar, T.G. Prabhakar, V.S. Sastry, K.V.G.K. Murty,

and K. Prasad Rao, J. Biomed. Mater. Res. A.,80(3), 581 (2007).

11. T.N. Kim, Q.L. Feng, J.O. Kim, J. Wu, H. Wang, G.C. Chen, and F.Z. Cui, J. Mater.

Sci. Mater. Med. , 9, 129 (1998).

12. Md. Shariful Islam, and T. Mitsugu, Mater. Lett. , 173, 231 (2016).

13. H. W. Kim, H. E. Kim and V. Salih, Biomaterials, 26, 5221 (2005).

14. D.I. Zeugolis, S.T. Khew, E.S.Y. Yew, A.K. Ekaputra, Y.W. Tong, L.Y.L. Yung,

D.W. Hutmacher, C. Sheppard, and M. Raghunath, Biomaterials. , 29, 2293 (2008).

15. S.C. Rodrigues, C.L. Salgado, A. Sahu, M.P. Garcia, M.H. Fernandes, and F.J.

Monteiro, J. Biomed. Mater. Res., 101A, 1080 (2013).

16. M.S. Chapekar, J. Biomed. Mater. Res., 53, 617 (2000).

17. A.G.A. Coombes, E.Verderio, B. Shaw, X. Li, M. Griffin, and S.Downes,

Biomaterials. , 23, 2113 (2002).

18. Q.P. Hou, D.W. Grijpma, and J. Feijen, Biomaterials. , 24, 1937 (2003).

19. D.W. Hutmacher, J. Biomater. Sci. Polym. Ed. , 12, 107 (2001).

20. E. Piskin, N. Bolgen, S. Egri, and I. Isoglu, Nanomedicine. , 2, 441 (2007).

21. A. Senkoylu, E. Ural, K. Kesenci, A. Simsek, S. Ruacan, L. Fambri, C. Migliaresi,

and E. Piskin, Int. J. Artif. Organs. , 25, 1174 (2002).

22. K. Tuzlakoglu, N. Bolgen, A.J. Salgado, M.E. Gomes, E. Piskin, and R.L. Reis, J.

Mater. Sci. Mater.Med. ,16, 1099 (2005).

23. G.M. Cunniffe, G.R. Dickson, S.Partap, K.T. Stanton,and F.J. O’Brien, J. Mater. Sci.

– Mater.Med. ,21, 2293 (2010).

24. J.P. Gleeson, N.A. Plunkett,and F.J. O’Brien, Eur. Cells. Mater. ,20, 218 (2010).

25. V. Mourino, and A.R. Boccaccini, J. R. Soc. Interface. ,7, 209(2010).

26. D.W. Hutmacher, Biomaterials. ,21,2529(2000).

27. S.H. Lee, and H. Shin, Adv. Drug Deliv. Rev. ,59, 339 (2007).

28. G.E. Poinern, R.K. Brundavanam, X. Thi Le, P.K. Nicholls, M.A. Cake, and D.

Fawcett, Sci. Rep. ,4, 6235 (2014).

29. E. Landi, G. Logroscino, L. Proietti, A. Tampieri, M. Sandri, and S. Sprio, J. Mater.

Sci. Mater.Med. ,19, 239 (2008).

30. J. Jin, J. Wang, J. Huang, F. Huang, J. Fu, X. Yang, and Z. Miao, J. Biosci. Bioeng.

,118, 593 (2014).

31. M.G. Albu, Collagen gels and matrices for biomedical applications Lambert

Academic Publishing, Saarbrücken (2011).

32. Carmen Steluta Ciobanu, Simona Liliana Iconaru, Phillippe Le Coustumer, Liliana

Violeta Constantin, Daniela Predoi, “Antibacterial activity of silver-doped

hydroxyapatite nanoparticles against gram-positive and gram-negative bacteria”,

Nanoscale Res Lett. 2012; 7(1): 324.

33. S. Brunauer, P.H. Emmet, E. Teller,” The adsorption of gases in multimolecular

layers.”, J.Am. Chem.Soc., 60, 309, 1938.

29.11.2016

Documents

Etapa 3: Studii complexe privind tratamentul plagilor ... · PDF fileEtapa 3: Studii complexe ... P4 - S.C. Biosintex SRL ... ce analiza chimica s-a facut prin ICP. Suprafata pansamentelor