UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA

ESCUELA DE POST GRADO

Maestría en Ciencias Veterinarias

Mención: Salud Animal

PROYECTO DE TESIS

TÍTULO:

“Evaluación de la Respuesta Inmune Humoral en Terneros

Inmunizados con Saposina 2 de Fasciola hepatica”

Presentado por

María Noemí. Cusquisibán Minchán

Asesor Ph.D. Pedro Luis Ortiz Oblitas

Co-Asesor: PhD Ana María Espino

INTRODUCCIÓN

Problema salud pública: Infección humana.

Fasciolias: Parasitosis mas importante en ganado vacuno y ovino.

Importantes pérdidas económicas.

Control: Dosificaciones periódicas - alto costo.

Fasciolicidas: Triclabendazole.

Problema de resistencia.

Calidad de fármacos.

Residuos químicos en alimentos.

I. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En la región Cajamarca, no existen estudios sobre el uso de vacunas

recombinantes para inmunizar al ganado vacuno contra F.

hepatica. En el mundo del campo científico se están realizando

diversos estudios tendentes a la obtención de vacunas (Ramajo et

al., 2001; Almeida et al., 2003; Martínez et al., 2004) y se han

propuesto elaborar diversos antígenos protectores potenciales

frente al trematodo (F. hepatica), dentro de ellas está la proteína

recombinante Saposina 2 de F.hepatica (Fh SAP-2) (Espino, 2005).

II FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

¿Cuál es la respuesta inmune humoral en terneros

inmunizados con Saposina 2 recombinante de Fasciola

hepatica (FhSAP-2).?

III. JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO

La resistencia de las drogas existentes y la constante

presión del consumidor para disminuir los residuos de

fármacos en lácteos hacen a los antihelmínticos una opción

cada vez menos deseable para el control de la fasciolosis en

los animales domésticos (Golden et al., 2010). Una vacuna

efectiva contra la Fascioliasis sería importante para el futuro

control y prevención de la enfermedad siendo una alternativa

ecológica, de bajo costo y con una estrategia sostenible.

IV. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN:

1. Objetivo General:

Evaluar la respuesta inmune humoral de la FhSAP-2 en terneros

inmunizados e infectados artificialmente con F. hepatica.

2. Objetivos Específicos:

Evaluar los niveles de anticuerpos IgG1 en terneros inmunizados

con FhSAP-2 e infectados artificialmente con F. hepatica.

Evaluar los niveles de anticuerpos IgG2 en terneros inmunizados

con FhSAP-2 e infectados artificialmente con F. hepatica.

V. HIPÓTESIS.

La FhSAP-2 produce altos títulos de anticuerpos específicos

IgG1 e IgG2 en terneros inmunizados.

Recuadro 1. Matriz de Consistencia y

Operacionalización de Variables

Efectividad de inmunización de la Saposina 2 de Fasciola hepatica en terneros .

problema Objetivo Variables Operacionalización de variables

Indicador Instrumento Escala Fuente

Cuál es la respuesta inmune humoral en terneros inmunizados con Saposina-2 recombinate de F.hepatica (FhSAP-2)?

O.General: Evaluar la respuesta inmune humoral de la FhSAP-2 e infectados artificialmente con F. hepatica

Y= Respuesta inmune humoral

Cantidad de anticuerpos

Elisa Absorbancia/ D.O

Suero sanguineo

O.Esp .1 Evaluar los niveles de anticuerpos IgG1 en terneros inmunizados con FhSAP-2 e infectados artificialmente con F. hepatica

X1= Saposina 2

Títulos de anticuerpos IgG1

Elisa Absorbancia/ D.O

Suero sanguineo

O.Esp. 2 Evaluar los niveles de anticuerpos IgG2 en terneros inmunizados con FhSAP-2 e infectados artificiamente con F. hepatica

X2= Saposina 2

Títulos de anticuerpos IgG2

Elisa Absorbancia/ D.O

Suero sanguineo

VI. MATERIALES Y MÉTODOS

1. localización

El trabajo de campo se realizará en el fundo Tres Molinos en

Cajamarca, con 48 terneros de raza Holstein. El trabajo de

laboratorio se realizará en el laboratorio de Inmunología de

la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad

Nacional de Cajamarca.

6.1. Metodología.

a) Animales de Experimentación.

El estudio será desarrollado de acuerdo a las normas de la

Asociación Mundial para el Avance de la Parasitología

Veterinaria (W.A.A.V.P.). Los animales serán alimentados y

mantenidos bajo buenas prácticas de manejo durante el

tiempo que dure la investigación (Wood et al., 1995).

Cuadro 1. Diseño Procedimental.

Grupo Tratamiento

1- Vacunados (N=24) 200 ug Fh SAP-2 + Montanide ISA70

2- Control adyuvante (N=12) 2 mL Montanide ISA70

3- Control (N=12) -

b)Protocolo de inmunización.

Figura 1. Diseño experimental en semanas. La ejecución durará

aproximadamente 24 semanas.

M = Muestreo de sangre para la extracción de suero

13

ELISA INDIRECTO Principio Básico

Ag Ag Ag

Micro placas Elisa

AntígenoSAP-2

Bloquearsitioslibres

Anticuerpo primario

Anticuerpo secundariomarcado (E)

SS

S SCambio Color = +

No Cambio Color = -

c)Titulación de anticuerpos IgG1 e IgG2

Las placas de ELISA de 96 pocillos serán fijadas con el antígeno

FhSAP-2 en una concentración de 5 μg/mL.

El antígeno se disolverá en el buffer carbonatado de fijación (CCB),

esta solución se añadirá a las placas colocando 100 μl/pocillo.

Las placas se envuelven con papel de aluminio y se incuban a 37°C

durante la noche

VII. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Se realizará un análisis descriptivo, se emplearán gráficos.

Las densidades ópticas de cada grupo experimental, así como

sus respectivos logaritmos serán comparados utilizando test

paramétricos o no-paramétricos, según el caso, utilizando el

programa estadístico Instat (GraphPadSofware, California

E.E.U.U.). Un valor de P<0,05 será considerado

estadísticamente significativo.

VIII. PRESUPUESTO Y FINANCIAMIENTO

Partida

Etapa de requerimiento

Descripción del bien

MONTO SOLICITADO A: Total

(desembolso)Unidad de

medidaCantidad S/. S/.

UNCInstitución

CofinancieraInstitución

CofinancieraFinanciamiento

personalS/. 1* 2*

Tabla 6. PRESUPUESTO ANALÍTICO DEL PROYECTO DE TESIS DE POSTGRADO

BienesDescripción del

bienTotal (S/.)

Proteína recombinante SAP 2 de Fasciola hepatica

10,000.00 10,000.00

Reactivos y sustancias diversas

3,000.00 3,000.00

Material de laboratorio

2,000.00 2,000.00

Compra de animales

5,000.00 5,000.00

Alimento para animales

6,000.00 6,000.00

Materiales de campo y medicinas

700 700

Materiales de escritorio

300 300

ServiciosDescripción del

servicioTotal (S/.)

Alquiler de instalaciones

2,000.00 2,000.00

Transporte 1,000.00 1,000.00

TOTAL DE LOS RUBROS Y/O ACTIVIDADES EN NUEVOS SOLES 30,000.00 30,000.00