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Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Tecnologia e Geociências
Departamento de Energia Nuclear
Programa de Pós-Graduação em Tecnologias
Energéticas e Nucleares (PROTEN/UFPE – CRCN–NE/CNEN)
Thaísa Feliciano de Souza
EXPRESSÃO DA PROTEÍNA P53 NO PROGNÓSTICO DE
REAÇÕES ADVERSAS DA RADIOTERAPIA DO CÂNCER DE
LARINGE
Dissertação de Mestrado
RECIFE – PE – BRASIL
MAIO – 2013
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EXPRESSÃO DA PROTEÍNA P53 NO PROGNÓSTICO DE
REAÇÕES ADVERSAS DA RADIOTERAPIA DO CÂNCER DE
LARINGE
Dissertação de Mestrado
15
THAÍSA FELICIANO DE SOUZA
EXPRESSÃO DA PROTEÍNA P53 NO PROGNÓSTICO DE
REAÇÕES ADVERSAS DA RADIOTERAPIA DO CÂNCER DE
LARINGE
Dissertação submetida ao Programa de Pós-
Graduação em Tecnologias Energéticas e
Nucleares, do Departamento de Energia
Nuclear, da Universidade Federal de
Pernambuco, como parte dos requisitos
necessários para obtenção do título de
Mestre em Ciências. Área de Concentração:
Dosimetria e Instrumentação Nuclear.
Orientador: Prof. Ademir de Jesus Amaral
RECIFE – PE
2013
Catalogação na fonte Bibliotecário Rosineide Mesquita Gonçalves Luz, CRB-4 / 1361
S729a Souza, Thaísa Feliciano de.
Análise da expressão da Proteína P53 no Prognóstico de reações adversas da radioterapia do câncer de laringe / Thaísa Feliciano de Souza . - Recife: O Autor, 2013.
67 folhas, figs., tabs; gráf. Orientador: Prof. Dr. Ademir de Jesus Amaral. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de
Pernambuco. CTG. Programa de Pós-Graduação em Tecnologias Energéticas e Nucleares. PROTEN/UFPE, 2013.
Inclui Referências, Apêndice e Anexos 1. Energia Nuclear. 2. Radiossensibilidade. 3. Câncer de
Laringe. 4. Radioterapia. I. Amaral, Ademir de Jesus (orientador). II. Título.
UFPE 621.48 CDD (22. ed.) BCTG/2013-201
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ANÁLISE DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA P53 NO PROGNÓSTICO DE
REAÇÕES ADVERSAS DA RADIOTERAPIA DO CÂNCER DE LARINGE
Thaísa Feliciano de Souza
APROVADA EM: 03.05.2013
ORIENTADOR: Prof. Dr. Ademir de Jesus Amaral
COMISSÃO EXAMINADORA:
_______________________________________
Prof. Dr. Waldeciro Colaço – DEN/UFPE
____________________________________________________
Profa. Dra. Marcela Maria de Lemos Pinto – DEN/UFPE
______________________________________________________________
Profa. Dra. Neyliane Frassinetti Gonçalves dos Santos – DEN/UFPE
Visto e permitida a impressão
__________________________________
Coordenadora do PROTEN/DEN/UFPE
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Dedico aos meus pais, José e Marta.
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AGRADECIMENTOS
A Deus, porque sem Ele, nada disso existiria.
Aos meus pais, Marta e José, pelo amor incondicional, pelos valiosos ensinamentos e
exemplo e por terem se esforçado tanto para que eu pudesse ter uma boa educação. Às
minhas irmãs, Lalá e Larissinha por me darem tantos momentos alegres e divertidos.
Amo muito vocês, obrigada por tudo.
À minha avó Geni, pelo seu imenso amor, carinho, cuidado, pelas palavras de conforto
e orações.
Aos tios Dequinho e Mariluce pela vibração por cada conquista na minha vida, que
mesmo longe se fazem presentes. À minha tia Márcia, pelo carinho e cuidado. Ao meu
tio Bebeto, pelos momentos de descontração. Ao meu querido tio Marcelo, pelo qual
tenho imensa admiração, obrigada pelas conversas, incentivo, apoio e amizade. Ao meu
tio Júnior, do qual tenho um orgulho imensurável, obrigada pela amizade, por ter sido
tão importante na minha formação, por ter influenciado positivamente no
desenvolvimento do meu gosto pela leitura, nas minhas preferências musicais, na forma
de ver o mundo... Obrigada!
Ao Prof. Ademir Amaral, por ter me acolhido em seu laboratório, ter me orientado e
confiado em mim para realização dos meus trabalhos. Obrigada por seus ensinamentos e
pela confiança.
À Nani, pela amizade e grande ajuda na realização deste trabalho, por ter me ensinado
pacientemente a citometria de fluxo.
A Heberton, que foi fundamental na realização deste trabalho, por ter sido uma ponte
entre o LAMBDA e o IMIP, por ajudar no encaminhamento e avaliação dos pacientes e
também pelos momentos de descontração e amizade.
Aos meus amigos biomédicos (Bruno, Camila, Cati, Manu, Marcela, Will, Felipe,
July), por sempre estarem presentes nas horas que mais precisei e pelos momentos de
descontração em nossos maravilhosos encontros.
Ao meu primo Hugo, pelas suas incríveis piadas, por divertir-se junto comigo e pelo
carinho.
Às minhas lindas primas Helen, Valana e Íris, pela amizade, pelos momentos de
descontração, pelas trocas de confidências, pelas conversas e apoio nos momentos
difíceis.
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À minha grande amiga Cecília, que sempre foi meu anjo da guarda; obrigada pelos
conselhos, conversas, momentos de descontração, e à sua mãe Joélia, por sempre me
acolher de forma tão carinhosa e materna na sua casa.
À Suelen, pela sua grande amizade, conversas, risadas e companhia, que fizeram meus
dias mais felizes durante o mestrado. Obrigada por ter sido minha segunda família
durante este período.
A Igor, pelo imenso apoio, conversas, conselhos, pelo amor, por se importar comigo,
pelo grande carinho, amizade e dedicação que ajudaram a tornar a caminhada mais leve.
Obrigada!
Aos meus queridos amigos de infância Amanda, Andreza, John, Tarcila, Vanessa e
Wilson, dos quais tenho muito orgulho, obrigada pela leveza das conversas, pelas
palavras de apoio, conselhos e por torcerem por mim.
Aos meus amigos do GERAR (DEN-UFPE), em especial, Thiago Salazar, Carlos
Eduardo, Rafael Freitas, Geane Michelle, Hector Silva, Camila Dias, Amanda
Salviano, Marcela Pinto, Mariel Cadena, Edvane Borges, Mariana Brayner e aos
colegas do Departamento de Energia Nuclear que marcaram minha vida nestes últimos
anos, pela amizade e pelos momentos de descontração.
À equipe do setor de Radioterapia do IMIP, em especial aos
técnicos Tarso e Geneci que sempre ajudaram e disponibilizaram com boa vontade o
setor de radioterapia para a irradiação das amostras.
Aos Professores membros das bancas: Profa Dra. Terezinha de Jesus, Profa. Dra.
Edvane Borges, Profa. Dra. Marcela Pinto, Profa. Dra. Neyliane Santos, Prof. Dr.
Thiago de Salazar e Prof. Dr. Waldeciro Colaço pela cuidadosa leitura do texto,
sugestões e críticas científicas que contribuíram significativamente para a melhoria
deste trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) por me
conceder uma bolsa de estudos neste período.
Muito Obrigada!
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RESUMO
Nos estágios iniciais do câncer de laringe a radioterapia é uma das principais opções de
tratamento e cura da doença. Entretanto, esta modalidade terapêutica resulta em reações
adversas do tecido sadio adjacente ao tumor. Embora submetidos ao mesmo protocolo,
os pacientes apresentam reações com intensidades diferentes, fenômeno atribuido à
radiossensibilidade individual que é acarretada por falhas no rearo de danos celulares.
Em termos moleculares, os mecanismos de reparação celular estão intimamente ligados
aos níveis de expressão da proteína p53. Neste contexto, esta pesquisa teve como
objetivo principal investigar possíveis correlações entre os níveis de expressão da
proteína p53 e as principais reações adversas resultantes da radioterapia de pacientes
com câncer de laringe. Para tanto, foi coletado sangue periférico de 10 pacientes com
câncer de laringe, em estágio T1 e T2, submetidos ao mesmo protocolo de radioterapia.
Uma parte das amostras de sangue foram irradiadas com dose de 2 Gy, enquanto outra
foi mantida sem irradiar (controle). Em seguida, linfócitos foram separados e marcados
com anticorpo monoclonal anti-p53 e posteriormente analisados por citometria de fluxo.
Avaliou-se as reações adversas de hiperemia, rouquidão, disfagia e odinofagia nos
pacientes após a última sessão de radioterapia. Observou-se um aumento
estatisticamente significante da expressão da p53 após irradiação das amostras de
sangue, mas com grande variação interindividual. Relacionando os graus de reações
adversas de pele com a expressão basal (células não irradiadas) e expressão da p53 nas
células irradiadas com 2 Gy, não foi observada correlação entre os dados. As reações
adversas de rouquidão, disfagia e odinofagia tiveram correlação com a expressão basal
da p53 dos pacientes, onde quanto maior a expressão basal da p53, menores foram os
graus de tais reações após a radioterapia. Relacionando essas reações adversas com a
porcentagem da expressão da p53 após irradiação das células, não foi observado
correlação. Os resultados desta pesquisa sugerem a análise dos níveis basais da proteína
p53 de linfócitos do sangue periférico, por citometria de fluxo, para prognóstico das
principais reações adversas (rouquidão, odinofagia e disfagia) em pacientes com câncer
de laringe nos estágios iniciais, encaminhados para radioterapia.
Palavras- chave: p53; radiossensibilidade; câncer de laringe; radioterapia;
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ABSTRACT
In the early stages of larynx cancer, radiotherapy is a major option of treatment and
cure. However, this therapy results in adverse reactions in healthy tissue adjacent to the
tumor. Although subjected to the same protocol, patients have different intensity
reactions, a phenomenon attributed to individual radiosensitivity, by failures in the
repair cell damage. In molecular terms, the cellular repair mechanisms are closely
related to levels of p53 expression. In this context, this study aimed to investigate
possible correlations between the expression levels of p53 protein and the main adverse
reactions resulting from radiotherapy for patients with laryngeal cancer. To this aim, it
was collected peripheral blood from 10 patients with larynx cancer in stage T1 and T2,
undergo the same radiotherapy protocol. A portion of the blood samples were irradiated
with a dose of 2 Gy, whereas the other one without irradiating (control). Then,
lymphocytes were isolated and labeled with anti-p53 monoclonal antibody and
subsequently analyzed by flow cytometry. Was evaluated the side effects levels of
hyperemia, hoarseness, dysphagia and odynophagia in patients after the last session of
radiotherapy. There was an increase statistically significant in p53 expression after
blood samples irradiation, but with great inter-individual variation. Relating the levels
of adverse skin reactions with the basal expression (non-irradiated cells) and p53
expression in cells irradiated with 2 Gy, there was no correlation between the data.
Adverse reactions of hoarseness, dysphagia and odynophagia were correlated with basal
expression of p53, where as higher basal expression of p53, as lower levels adverse
reactions after radiotherapy. Relating these adverse reactions with the percentage of p53
expression after irradiation of the cells, there was no correlation. The results of this
research suggest the analysis of basal levels of p53 protein in peripheral blood
lymphocytes by flow cytometry, for prognosis of major adverse reactions (hoarseness,
dysphagia, and odynophagia) in patients with larynx cancer in the early stages, referred
for radiotherapy.
Key words: p53; radiosensitivity; larynx cancer; radiotherapy
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema anatômico da laringe ..................................................................... 4
Figura 2 - Efeito direto e efeito indireto da radiação ................................................... 10
Figura 3- Esquema das vias de atuação da p53 após estresse celular ........................... 14
Figura 4 - Linfócito humano visualizado por microscopia óptica ................................ 16
Figura 5 – Sistema de fluxo e detectores de dispersão frontal (FSC) e lateral (SSC) ... 20
Figura 6 - Arranjo experimental para irradiação das amostras sanguíneas em acelerador
linear........................................................................................................................... 24
Figura 7 - Esquema da metodologia de obtenção das células mononucleares do sangue
periférico .................................................................................................................... 26
Figura 8 - Citômetro de Fluxo do LAMBDA – DEN / UFPE ..................................... 29
Figura 9 - Gráfico de aquisição para delimitação dos linfócitos (FSC X SSC) ............ 30
Figura 10 - Dot plot apresentando o sinal captado pelos detectores FL1 e FL2 de
linfócitos irradiados marcados com anticorpo anti-p53 ................................................ 31
Figura 11 - Esquema da Metodologia para avaliação da expressão da proteína p53 em
sangue periférico irradiado .......................................................................................... 32
Figura 12 - Graus de reações adversas apresentadas pelos pacientes após a raditerapia
................................................................................................................................... 35
Figura 13 - a) Paciente apresentando reação leve logo após o tratamento radioterápico;
b) Mesmo paciente com reação considerada severa (provavelmente devido a interrupção
da utilização do creme hidratante) após 1 semana do término do tratamento ................ 42
15
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Estadiamento TNM para câncer de laringe ................................................... 5
Tabela 2 - Análise comparativa entre a imunochistoquímica, imunocitoquímica,
Western Blot e citometria de fluxo .............................................................................. 21
Tabela 3 - Escala dos graus de reações adversas para avaliação dos pacientes ............ 34
Tabela 4 - Interpretação dos coeficientes de Spearman ............................................... 37
Tabela 5 - Descrição do perfil dos pacientes utilizados no presente estudo ................. 38
Tabela 6 - Expressão da proteína p53 nas amostras controle e irradiada com dose de 2
Gy ............................................................................................................................... 38
Tabela 7 - Expressão basal individual da proteína p53 e graus de intensidade da reação
adversa de pele ............................................................................................................ 40
Tabela 8- Expressão individual da proteína p53, após irradiação com ......................... 41
Tabela 9 - Expressão basal individual da proteína p53 e correlação com os graus de .. 45
Tabela 10 - Expressão da proteína p53 em linfócitos irradiados com dose de 2 Gy e os
níveis de...................................................................................................................... 49
Tabela 11 - Comparação dos níveis basais da p53 com a sobrevivência das células de
cada paciente .............................................................................................................. 50
15
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AcMo Anticorpo monoclonal
ANOVA Analysis of variance / análise da variância
ATM Ataxia-telangiectasia mutated
CdK Cyclin-dependent kinases / Quinase dependente de ciclina
CF Citometria de Fluxo
DNA Deoxyribonucleic Acid / Ácido Desoxirribonucléico
DSB Double Strand Breaks/ Quebra de fita dupla
FSC Forward Scatter
GAdd45 Growth arrest and DNA-damage
IgG Interglobulina G
IMIP Instituto de Medicina Integral Professor Fernando Figueira
INCA Instituto Nacional do Câncer
LAMBDA Laboratório de Modelagem e Biodosimetria Aplicada
PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells / Células Mononucleares do
Sangue Periférico
PBS Phosphate Buffered Saline / Tampão Fosfato Salina
PHA Phytohemagglutinin / Fitohemaglutinina
PMT Photomultiplier tube / Tubo fotomultiplicador
PUMA p53 upregulated modulator of apoptosis /
RI Radiação Ionizante
RT Radioterapia
RTOG Radiation Therapy Oncology Group / Grupo Oncológico de
Radioterapia
SFB Soro Fetal Bovino
SSB Single Strand Breaks / Quebra de fita simples
SSC Side Scatter
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
UICC União Internacional Contra o Câncer
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SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 1
2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................ 3
2.1 Câncer de laringe ................................................................................................. 3
2.2 Tratamento do câncer de Laringe ......................................................................... 5
2.2.1 Radioterapia e reações adversas..................................................................... 5
2.3 Radiossensibilidade ............................................................................................. 8
2.4 Resposta celular às radiações ionizantes .............................................................. 9
2.5 Proteína p53 e resposta celular ........................................................................... 11
2. 6 Linfócitos Humanos.......................................................................................... 15
2.7 Ferramentas de análise da proteína p53 .............................................................. 17
3 OBJETIVOS .......................................................................................................... 22
3.1 Objetivo geral .................................................................................................... 22
3.2 Objetivos específicos ......................................................................................... 22
4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 23
4.1 Perfil da pesquisa e aspectos éticos .................................................................... 23
4.2 Seleção da População ........................................................................................ 23
4.3 Coleta das amostras ........................................................................................... 24
4.4 Irradiação das amostras ...................................................................................... 24
4.5 Obtenção das células mononucleares ................................................................. 25
4.6 Avaliação da viabilidade celular e ajuste da concentração celular ...................... 26
4.7 Cultivo celular ................................................................................................... 27
4.8 Marcação das amostras ...................................................................................... 27
4.9 Citometria de fluxo ............................................................................................ 28
15
4.10 Tratamento dos pacientes ................................................................................. 33
4.11 Acompanhamento dos pacientes e avaliação das reações adversas ................... 33
4.11.1 Hiperemia Cutânea ....................................................................................... 34
4. 2 Análise estatística ............................................................................................. 37
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 38
5.2 Expressão da proteína p53 ................................................................................. 38
5.3 Reações adversas de pele e a expressão da proteína p53 ..................................... 40
5.3 Reações adversas de rouquidão, disfagia e odinofagia e a expressão da proteína
p53 .......................................................................................................................... 45
6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 52
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 53
APÊNDICE A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO . 62
APÊNDICE B – FICHA DE ACOMPANHAMENTO ............................................ 63
ANEXO A – PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA ................................................ 65
ANEXO B – FICHA DE TRATAMENTO .............................................................. 66
1
INTRODUÇÃO
O câncer de laringe é o mais comum dentre as neoplasias de cabeça e pescoço,
sendo responsável por 30% a 40% dos cânceres dessa região (MARKOU et al., 2011).
Os principais fatores que contribuem com o desenvolvimento desse tipo de câncer são o
tabagismo, alcoolismo e, em menor grau, a poluição do ar (SAS-KORCZYNSKA et al.,
2003; PEREIRA et al., 2005).
Os tratamentos do câncer de laringe são a cirurgia, a radioterapia, a
quimioterapia, ou ainda a combinação destas. Porém, nas fases iniciais do câncer de
laringe (T1 e T2), o único tratamento utilizado é a radioterapia. O intuito de empregar a
radioterapia em estágios iniciais é a preservação do funcionamento normal da laringe,
proporcionando uma qualidade de vida satisfatória ao paciente após o término do
tratamento (INCA, 2011).
Embora a radioterapia tenha se mostrado uma ferramenta efetiva no combate ao
câncer de laringe, estudos têm observado que vários pacientes têm interrompido o
tratamento devido a manifestação de reações agudas adversas, o que tem levado à
diminuição da possibilidade de cura da doença (GIDDINGS, 2010). As diferenças na
intensidade das reações adversas apresentadas por pacientes com mesmas características
físicas, mesmo tipo e estágio de tumor, e que seguem o mesmo protocolo de
radioterapia apontam para a necessidade de se avaliar e determinar, no planejamento
radioterápico, a chamada radiossensibilidade individual (ANDREASSEN et al., 2002;
BURNET; PEACOCK, 2002).
O conceito de radiossensibilidade é bastante complexo, podendo ser descrito
como uma característica inerente do indivíduo, associada ao aumento dos efeitos
biológicos da radiação ionizante sobre o corpo humano. De acordo com diversos
estudos a radiossensibilidade está ligada a falhas no sistema de reparo celular
(TWARDELLA; CHANG-CLAUDE, 2002; FEI; EL-DEIRY, 2003).
A irradiação do sistema biológico desencadeia uma série de processos que é
capaz de alterar as moléculas que compõem as células, sendo à molécula de ácido
2
desoxirribonucléico (DNA) uma das mais importantes, já que nela está contido o código
genético humano (YOKOYA et al., 2008).
Quando a molécula de DNA sofre um dano, um dos principais mecanismos
ativados durante a resposta celular é a ação da proteína p53. Uma vez ativada, a p53
aumenta a transcrição de diversos genes que codificam proteínas importantes,
responsáveis pela parada do ciclo celular, o próprio reparo do DNA e pela morte celular
(ZHANG et al., 2004).
Cavalcanti e colaboradores (2008) demonstraram que há um aumento de p53 em
linfócitos humanos irradiados e cultivados in vitro por 72 horas, além de uma
variabilidade interindividual na resposta, sugerindo que essa análise possui potencial
para identificação da radiossensibilidade individual.
É importante, portanto, avaliar a correlação entre os níveis individuais de
expressão da proteína p53 e a intensidade das reações adversas em pacientes submetidos
à radioterapia, a fim de avaliar a possibilidade de seu emprego como teste preditivo de
radiossensibilidade individual. A consolidação de um teste de radiossensibilidade
promoveria grandes avanços na avaliação dos riscos e prevenção de danos na
radioterapia, pois o protocolo do tratamento poderia ser personalizado, e
consequentemente possibilitando uma melhora na qualidade de vida dos pacientes.
Neste contexto, esta pesquisa teve como objetivo geral investigar as correlações
existentes entre os níveis de expressão basal e pós-irradiação da proteína p53 em
linfócitos humanos e as reações adversas resultantes da radioterapia de pacientes com
câncer de laringe.
3
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Câncer de laringe
A laringe se localiza na parte anterior do pescoço, entre as vértebras cervicais 3 e
6, mede cerca de 5 cm de comprimento nos homens, sendo ligeiramente mais curta nas
mulheres (BURDETT; MITCHELL, 2011). Este órgão é responsável pela fonação, mas
também auxilia na tosse e no fechamento do sistema respiratório durante a deglutição,
impedindo a aspiração dos alimentos (KAWASAKI, et al., 2001; BURDETT;
MITCHELL, 2011).
Quanto à sua anatomia, a laringe é didaticamente dividida em:
Glote: espaço onde estão situadas as duas cordas vocais verdadeiras, as quais
são de extrema importância no processo de fonação (ROSA, 2011);
Supraglote: região onde estão as falsas cordas vocais (ou cordas vestibulares),
as quais tem uma constituição “flácida” com poucas fibras musculares, quando
comparadas com as cordas vocais verdadeiras (ROSA, 2011);
Epiglote: cartilagem em forma de folha que está situada entre a entrada laríngeo
superior e a base da língua (BURDETT; MITCHELL, 2011);
Subglote: região mais estreita e inextensível da laringe (MARCHANT, 2005).
4
A Figura 1 ilustra a laringe e suas subdivisões.
Fonte: Adaptado de Salvajoli et al. (1999)
O câncer de laringe representa cerca de 2% de todas as neoplasias malignas no
mundo, sendo o mais comum entre os cânceres de cabeça e pescoço (25%), ocorrendo
predominantemente no sexo masculino. Seu desenvolvimento está intimamente
relacionado com o tabagismo, o consumo de álcool e em menor grau, com a poluição
(LICITRA et. al, 2003; SAS-KORCZYNSKA et al., 2003; PEREIRA et al., 2005). O
grau evolutivo da doença é classificado de acordo com um sistema de estadiamento,
chamado TNM (INCA 2012).
O sistema TNM foi desenvolvido pela União Internacional Contra o Câncer
(UICC), e atualmente corresponde ao sistema de estadiamento mais usado para a
classificação de doenças como o câncer. O sistema TNM apresenta uma classificação
segundo três diferentes parâmetros: extensão do tumor, representada pela letra T;
presença de tumores em linfonodos próximos à lesão, representada pela letra N; e a
presença de metástase à distância, representada pela letra M. A adição de uma
numeração após a representação literal indica o nível de extensão da doença. De acordo
com a atual classificação, tem-se: para T, T0, T1, T2, T3, T4; para N, N0, N1, N2, N3;
para M, M0 e M1 (RTOG, 2011).
Figura 1 - Esquema anatômico da laringe
5
A Tabela 1 apresenta a classificação do câncer de laringe quanto à extensão do
tumor com base nesse sistema.
Tabela 1 - Estadiamento TNM para câncer de laringe
Grau Comprometimento da Laringe
T1 Limitado apenas a uma sub-região da laringe, apresentando mobilidade
normal das cordas vocais
T2 Comprometimento da mucosa de mais de uma sub-região da laringe,
apresentando mobilidade normal das cordas vocais
T3 Comprometimento somente da laringe, com fixação de corda vocal, ou invasão da
área pós-cricóidea, tecidos pré-epiglóticos e base da língua
T4 Extensão além da laringe
Fonte: Adaptada de Salvajoli e colaboradores (1999)
2.2 Tratamento do câncer de Laringe
A escolha terapêutica para o câncer de laringe é determinada de acordo com a
sub-região em que está localizada a lesão, levando em consideração também a
classificação de estadiamento da doença. Para os estadios T1 e T2 o tratamento pode ser
realizado exclusivamente com radioterapia ou com cirurgia, tendo os dois tratamentos
apresentado altos índices de cura (BJÖRK-ERIKSSON, et al. 1999; PELLIZZON, et al.
2008). As taxas de controle local para tumores iniciais variam de 87 % a 92 % para as
duas modalidades de tratamento (radioterapia ou cirurgia) com taxas de sobrevida após
cinco anos de remissão em torno de 80 % a 90 % (PELLIZZON et al., 2008). Nos
estágios mais avançados da doença, como as lesões em estadios T3 e T4, o uso da
quimioterapia no tratamento se torna indispensável (HALL; GIACCIA, 2006).
2.2.1 Radioterapia e reações adversas
A radioterapia (RT) é uma das modalidades terapêuticas não-cirúrgicas mais
importantes no tratamento do câncer. Dentre os pacientes diagnosticados com algum
6
tipo de câncer no mundo, mais de 50% utilizarão esta técnica em alguma fase do
tratamento (BARNETT, et al., 2009; RZESZOWSKA-WOLNY, 2009).
O objetivo principal da RT é danificar as células malignas através da exposição
destas a uma quantidade suficiente de dose de radiação ionizante (RI) (BURNET, et al.
1996; SEVERIN, et al. 2006; BARNETT, et al. 2009). As radiações ionizantes são
descritas como a energia que se propaga em forma de partículas subatômica (radiação
alfa e beta) e ou ondas eletromagnéticas (raios gama, raios X) através do espaço e da
matéria. Podem ser oriundas de fontes naturais ou artificiais, e possuem energia
suficiente para ionizar, isto é, arrancar elétrons dos átomos que compõem a matéria,
com a qual interagem, produzindo íons (CHASE; RITUPER, 2002; HALL; GIACCIA,
2006; SILVA LORETO, et al. 2008).
Na radioterapia, apesar das tentativas de limitar a exposição das células,
pequenas porções do tecidos sadios, o tecido circunvizinho ao tumor, também é
irradiado (PRISE et al., 2005). Como resultado, reações clínicas adversas podem ser
observadas no tecido sadio e o tratamento radioterápico pode vir a ser interrompido
(BURNET, et al., 1996; SEVERIN, et al. 2006; BARNETT, et al. 2009).
As principais reações adversas resultantes da radioterapia no tratamento do
câncer de laringe são:
Reações de Pele: As reações adversas na pele são um dos efeitos mais
comuns em qualquer tratamento envolvendo radiação ionizante
(FITZGERALD; KOCH, 1999; ZACKRISSON et al., 2003). A
maioria dos pacientes apresentam hiperemia1 e eritema cutâneo
na área do pescoço, descamação seca ou úmida e, em casos raros,
necrose (WELLS et al., 2004; SHARP, et al. 2011). A hiperemia
apresentada pela pele, que geralmente é uma reação comum da
radioterapia representa uma reação inflamatória, provavelmente a
partir da liberação de citocinas das células que estão em processo de
7
morte. Descamação seca é uma queratinização não usual causada
pela redução das células basais da epiderme. Já a descamação aquosa
é caracterizada pela perda da capacidade reprodutiva das células da
epiderme (HOPEWELL, 1990).
Rouquidão: Implica em soprosidade, aspereza, quebra de voz, ou a
mudança natural do tom. A rouquidão ou disfonia, pode ser provocada
pela inflamação da região glótica, mais espessa e delimitada pelas cordas
vocais verdadeiras (GARRET, et al, 1999).
Disfagia: Caracteriza-se pela dificuldade na passagem de alimentos
sólidos ou líquidos da boca até estômago (MANIKANTAN et al., 2009;
FITZGERALD; KOCH, 1999; ZACKRISSON et al., 2003). Processo
inflamatório agudo na região da supraglote e epiglote ocasiona a
disfagia, por serem regiões que estão muito próximas à base da língua,
chegando a tocá-la durante a deglutição. Foi observado que a disfagia
pode levar à perda de peso e pneumonia por aspiração, afetando a
qualidade de vida dos pacientes (CAGLAR, et al., 2008; STARMER, et
al., 2008).
Odinofagia: está intimamente ligada à disfagia e está relacionada com
deglutição dolorosa. É ocasionada pela inflamação aguda da epiglote e
supraglote, sendo também considerada uma das reações adversos mais
comuns da radioterapia (VAIMAN et al., 2009; FITZGERALD; KOCH,
1999; ZACKRISSON et al., 2003).
Outras reações adversas como perda de peso, aspiração das vias aéreas,
obstrução e fístula, também ligadas ao tratamento do câncer de laringe através da
radioterapia (FITZGERALD; KOCH, 1999).
8
Há alguns anos, a tolerância do tecido normal tem sido levada em conta como
um fator determinante no planejamento da dose utilizada, fazendo com que os órgãos
adjacentes ao tumor sejam afetados com a menor dose possível, mas só recentemente a
variação da tolerância interindividual foi identificada. Pacientes com mesmo tipo de
tumor e características físicas parecidas apresentam diferentes respostas ao nível de
tecido normal quando submetidos ao mesmo protocolo radioterápico (ANDREASSEN
et al., 2002; BURNET et al., 2002). Ainda que parâmetros físicos e biofísicos possam
determinar o surgimento de reações adversas ao tratamento, cerca de 80% dos fatores
envolvidos no surgimento destes efeitos não são determinados por tais fatores e
possivelmente estão relacionados ao perfil genético de cada indivíduo que determina
sua radiossensibilidade (BARNETT et al., 2009).
2.3 Radiossensibilidade
O planejamento do tratamento radioterápico é geralmente baseado em
parâmetros como: localização do tumor, tipo de tecido, estágio de desenvolvimento do
tumor, idade e peso do paciente. Entretanto informações a respeito da diferença de
radiossensibilidade individual não são utilizadas (BURNET et al., 1996; BARNETT et
al., 2009).
O conceito de radiossensibilidade é bastante complexo, podendo ser descrito
como uma característica inerente ao indivíduo, associada ao aumento dos efeitos
biológicos proveniente da ação das radiações ionizantes sobre o corpo (TWARDELLA;
CHANG-CLAUDE, 2002).
Evidências a respeito da radiossensibilidade individual surgiram, primeiramente,
a partir da observação dos efeitos da radiação ionizante manifestados em indivíduos
portadores de determinadas síndromes genéticas (i.e. Ataxia Telangiectasia, Anemia de
Fanconi) quando submetidos à radioterapia (BENOTMANE, 2004; HALL; GIACCIA,
2006; WILLERS; HELD, 2006). Foi observado que as células provenientes dos
indivíduos portadores destas síndromes genéticas eram mais radiossensíveis do que as
9
células de indivíduos não portadores. Posteriormente, foi constatado que essas
síndromes estavam relacionadas à falhas no sistema de reparo de danos na molécula de
DNA (BENOTMANE, 2004; BARNETT et al., 2009).
A radiossensibilidade, no entanto, não está restrita a indivíduos portadores de
síndrome genéticas desta natureza (TWARDELLA; CHANG-CLAUDE, 2002). Na
verdade, estima-se que 10% da população em geral apresenta extrema sensibilidade às
radiações ionizantes (ANDREASSEN et al., 2002; SEVERIN, et al., 2006;).
O fenômeno da radiossensibilidade individual está diretamente relacionado com
a resposta celular à irradiação. Deste modo, a radiossensibilidade do indivíduo pode ser
entendida como um fenômeno resultante da radiossensibilidade celular, ou seja, da
capacidade celular de reparar o dano radioinduzido, assim quanto mais radiossensivel
for o individuo maior será o potencial genotóxico das RIs (FEI; EL-DEIRY, 2003).
No intuito de se estabelece uma correlação entre a radiossensibilidade individual
e características ligadas ao individuo, diversos mecanismos tem sido investigados ao
nével celular e tecidual. (WILLERS; HELD, 2006).
A importância destes estudos deve-se ao fato de que uma radiossensibilidade
exacerbada, e consequente agravamento dos efeitos secundários, pode exigir a
interrupção da radioterapia, o que pode comprometer o resultado do tratamento
(VILLARÍN, et al. 2005).
2.4 Resposta celular às radiações ionizantes
As RIs ao interagirem com o meio biológico podem causar danos em várias
estruturas celulares. O DNA é considerado a principal molécula alvo para estudos em
radiobiologia, devido à sua importância biológica, uma vez que esta molécula contém as
informações genéticas do indivíduo e atua no controle do metabolismo celular
10
(POUGET; MATHER, 2001). Os danos radioinduzidos no DNA podem ser gerados
através do efeito direto ou do efeito indireto (Figura 2) (POUGET; MATHER, 2001;
GUDKOV; KOMAROVA, 2003).
Fonte: Adaptada da U.S National Library of Medicine
No efeito direto, a radiação interage diretamente com a molécula celular alvo, no
caso da Figura 2, a molécula de DNA, ionizando–a. Já o efeito indireto das radiações se
caracteriza pela interação da RI com outras moléculas (água, por exemplo) produzindo
radicais livres, que podem acarretar danos a esta molécula (BARCELLOS-HOFF et al.,
2005). Dos danos celulares radioinduzidos, 60% são produzidos a partir do efeito
indireto, visto que 80% do interior da célula é composto de água, o que aumenta a
probabilidade de interação das RIs com esta molécula (BARCELLOS-HOFF et al.,
2005).
Os radicais livres podem ser definidos como espécies que contém um ou mais
elétrons desemparelhados, e são caracterizados por serem muito reativos e instáveis,
Figura 2 - Efeito direto e efeito indireto da radiação
11
possuindo tempo curto de vida (SANTOS; CRUZ, 2001). A interação da RI produz
diversos destes radicais, como o OH- (radical hidroxila) e HO2
- (radical hidroperoxila),
bem como outras moléculas, a exemplo do H2O2 (peróxido de hidrogênio) que são
capazes de danificar a molécula alvo (BARCELLOS-HOFF et al., 2005).
Diversos tipos de danos radioinduzidos podem afetar o DNA, tais como as
quebras em uma só fita (SSBs–Single Strand Breaks) ou em ambas as fitas de DNA
(DSBs-Double Strand Breaks). Dos tipos de danos possíveis as DSBs são as que
representam uma maior toxicidade, devido a dificuldade de reparo desse tipo de dano
pela maquinaria celular, sendo capazes até mesmo de ativar vias que podem induzir a
morte celular (O’DRISCOLL; JEGGO, 2006; BORGES et al., 2008; BOEHME et al.,
2008).
Na tentativa de eliminar os danos no DNA, as células elaboraram mecanismos
para identificar e reparar estes danos, restaurar corretamente o material genético, e com
isso, manter a integridade do genoma e de suas informações (O’DRISCOLL; JEGGO,
2006; BOEHME et al., 2008; BORGES et al., 2008). De outra maneira, a manutenção
de lesões ou erros no reparo do DNA poderia resultar no surgimento de mutações e ou
alterações cromossômicas capazes de induzir o desenvolvimento de tumores malignos
ou morte da célula (MISTELI; SOUTOGLOU, 2009).
2.5 Proteína p53 e resposta celular
Nos mecanismos de defesa elaborados para recuperar o DNA de danos, uma das
proteínas chave na coordenação do reparo do DNA, na progressão do ciclo celular e na
apoptose é a p53. Considerada a “Guardiã do Genoma”, esta proteína estando
relacionada com a manutenção da estabilidade genômica tem a capacidade de ativar e
reprimir a transcrição de genes em resposta aos diversos estresses, inclusive por
radiação (FEI; EL-DEIRY, 2003).
12
Normalmente, a proteína p53 se encontra em baixas concentrações por ter uma
vida média em torno de vinte minutos. O nível da expressão da p53 aumenta após um
dano, porque além do aumento de transcrição, a vida média da proteína é prolongada
(LAKIN; JACKSON, 1999).
O aumento da expressão do gene TP53 ocorre através de uma via de sinal de
transdução. Esta mesma via também converte a forma estável da proteína p53 para uma
forma ativa, através da fosforilação da proteína ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated)
(LOWNDES; MURGUIA, 2000; ALBERTS, 2004). A sequência do fator de
transcrição da p53 coordena a expressão de um grande número de genes alvo que
participam das respostas celulares após uma situação de estresse (MENENDEZ et al.,
2009).
Uma das vias usadas pela proteína p53 para a manutenção da estabilidade
genômica após exposição à radiação, é a parada do ciclo celular nos pontos de
checagem (checkpoints). (LOWNDES; MURGUIA, 2000; FEI; EL-DEIRY, 2003;
PAWLIK; KEYOMARSI, 2004). A p53 coordena os dois principais pontos de
reparação do DNA, um deles entre as fases G1 e S e o segundo na transição entre G2 e
M (PAWLIK; KEYOMARSI, 2004).
A parada do ciclo celular em G1 é feita através do aumento da p53, que regula a
proteína p21. Níveis elevados de p21 inibem as ciclinas dependentes de quinase (Cdk),
impedindo assim a progressão do ciclo celular (LAKIN; JACKSON, 1999;
PECORINO, 2008). Há evidências que o aumento da proteína p53 também implica,
pelo menos em parte, na parada do ciclo celular na fase G2, através da ativação do gene
GADD45 e de membros da família 14-3-3 (LAKIN; JACKSON, 1999; FEI; EL-
DEIRY, 2003).
Ao contrário da atuação indireta da p53 na parada do ciclo celular, a qual é
mediada por genes alvos que inibem as CDKs, a p53 pode atuar diretamente no reparo
de quebras do DNA ligando-se não especificamente após quebras simples e quebras
duplas, detectando regiões de danos e promovendo o emparelhamento dos ácidos
13
nucléicos. Outros genes alvos, como o p53R2, também exercem funções importantes no
reparo de danos do DNA (FEI; EL-DEIRY, 2003).
Quando o dano ao DNA não é reparado, ou reparado de forma errônea, a
apoptose (morte celular programada), mediada pela proteína p53, pode ser iniciada. A
p53 regula um grande número de genes alvo com atividades pró-apoptóticas: NOXA
(também conhecida como PMAIP1 - Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein
1), PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), BAX (Bcl-2 associated X
protein), CD95 (Cluster of differentiation 95), KILLER/DR5, PERP, PIDD, P53Aip1,
BID, entre outros (FEI; EL-DEIRY, 2003).
A Figura 3 ilustra o esquema de atuação da proteína p53 após dano provocado
pelas radiações ionizantes.
14
Adaptada de FEI; EL-DEIRY, 2003
Cavalcanti e colaboradores (2008) identificaram, avaliando linfócitos do sangue
periférico irradiados in vitro, diferentes níveis de expressão desta proteína entre os
indivíduos avaliados. Esta variação interindividual indica que a avaliação da expressão
desta proteína é importante para detecção da radiossensibilidade individual, visto que
P53
Expressão dos genes-alvo
P21 / Gadd45/
14-3-3 / Outros
P53R2/
Outros
PUMA/ NOXA/
DR5/ p53Aip1/
Apaf1/ Caspase-
6/ Bid/ Outros
Reparo
do DNA
Parada do
ciclo celular Apoptose
DNA não reparado
P53
Sobrevivência da
célula
Figura 3- Esquema das vias de atuação da p53 após estresse celular
15
ela está diretamente ligada com o reparo e a morte celular (ALBERTS, 2004;
ROSSNER, 2004).
O estudo do comportamento individual da proteína p53 é importante a gravidade
dos danos depende do tipo de radiação, da dose administrada e da capacidade celular
individual de reparar os danos radioinduzidos (FAVAUDON, 2007). Neste contexto, a
avaliação de parâmetros bioquímicos, como a expressão da proteína p53 em células do
sangue periférico, a exemplo dos linfócitos, pode resultar no desenvolvimento de um
teste capaz de identificar previamente a radiossensibilidade individual (AZRIA et al.,
2008), visto que a utilização dos linfócitos como tecido representativo da
radiossensibilidade individual do tecido sadio já é bem validada (SHIH, et al., 2007).
2. 6 Linfócitos Humanos
Funcionalmente, os linfócitos humanos são células que atuam principalmente na
resposta imunológica específica que o organismo desenvolve para combater agentes
externos. Para isto, estas células permanecem inativas, até o encontro e reconhecimento
de uma substância capaz de ativá–las. A ocorrência deste evento necessário para induzir
a proliferação e diferenciação destas células na resposta imune (JANEWAY, et al.,
2007).
Morfologicamente, os linfócitos apresentam um núcleo grande com regiões de
cromatina condensada e inativa, e um citoplasma escasso com poucas organelas (Figura
4). Tais características indicam que os linfócitos possuem uma baixa atividade
transcricional e, consequentemente, metabólica (JANEWAY et al., 2007).
16
Figura 4 - Linfócito humano visualizado por microscopia óptica
Fonte: (FENECH et al., 2003)
Existem cerca de 2 x 1012
linfócitos no corpo humano, o que faz com que sua
massa celular total seja comparada com a de órgãos como o fígado ou cérebro, por
exemplo (ALBERTS, 2004). Estas células são transportadas entre os diferentes sítios de
localização através da circulação sanguínea e linfática: sua circulação é continua entre
sangue e os tecidos linfóides periféricos, retornando para o sangue através dos vasos
linfáticos (ABBAS; LICHTMAN, 2005).
Dessa maneira, os linfócitos são células que estão constantemente em circulação
entre os tecidos que compõem o organismo, levando aproximadamente 30 minutos para
completar um ciclo completo de recirculação no organismo humano. Cerca de 2% da
população linfocitária total é encontrada no sangue venoso periférico (JANEWAY et
al., 2007).
A utilização de linfócitos do sangue periférico em pesquisa de
radiossensibilidade é um fator que aumenta a rapidez das análises, já que estas células
são de mais fácil obtenção, por estarem presentes em grande quantidade no sangue
periférico e serem de fácil manipulação laboratorial (ALMODÓVAR et al., 2002;
LEONG et al., 2004; HENRÍQUEZ-HERNÁNDEZ, et al., 2012). Além disso, foi
demonstrado que os linfócitos do sangue podem ser um tecido substituto valido para a
estimativa da resposta a danos celulares e reparação de outros tecidos do corpo (SHIH,
et al., 2007).
17
Neste sentido, linfócitos são bons modelos biológicos para a investigação de
alterações de parâmetros celulares e moleculares, como a expressão da proteína p53, no
intuito desenvolver um teste preditivo de radiossensibilidade individual.
2.7 Ferramentas de análise da proteína p53
A detecção da proteína p53 pode ser realizada por métodos como
imunohistoquímica, imunocitoquímica, Western Blot e citometria de Fluxo.
O método de imunohistoquimica é um dos mais utilizados para este fim e
consiste no uso de anticorpos monoclonais (AcMo) que reconhecem a proteína p53 e
para detectar sua expressão em cortes histológicos, no entanto alterações na fixação do
tecido, modo de incubação e a subjetividade na contagem podem diminuir a
sensibilidade da técnica. O tempo de análise também é bastante longo (KLUMB, et al,
2002; CAVALCANTI JUNIOR, et al., 2006).
Na imunocitoquímica células em suspensão ou fixadas em lâminas, que são
incubadas com AcMo anti-p53. Esta técnica apresenta a vantagem de identificar a
localização precisa da proteína no núcleo da célula e ainda de correlacionar os
resultados obtidos com a análise citomorfológica (KLUMB, et al, 2002;
CAVALCANTI JUNIOR, et al., 2006). O principal fator limitante da técnica é a
necessidade da manutenção do material a temperaturas muito baixas (-70ºC), devido a
rápida degradação da p53 (KLUMB et al, 2002).
O método de Western Blot consiste na realização de uma eletroforese em gel de
poliacrilamida para determinação do peso molecular da proteína aliada à especificidade
da imunoquímica (TURPEINEN et al., 2002). Este método possui alto poder de
resolução, entretanto é pouco utilizado, pois se trata de uma metodologia demorada, que
constituída de várias etapas, e requer a necessidade de muitos equipamentos e
manipulação de substâncias químicas tóxicas, o que eleva o custo de execução e
18
dificulta sua utilização para análise de um número elevado de amostras (KLUMB et al,
2002; CAVALCANTI JUNIOR et al., 2006).
A citometria de fluxo (CF) tem se destacado como método de escolha na
detecção de antígenos presentes na superfície das células, intracitoplasmáticos e
nucleares. Trata-se de uma tecnologia semi-automatizada utilizada para o estudo de
populações celulares heterogêneas, e se distingue das demais por apresentar maior
praticidade e por permitir a avaliação de mais de uma proteína ao mesmo tempo,
quando necessário (KLUMB, et al, 2002; CAVALCANTI JUNIOR, et al., 2006).
Através da CF é possível avaliar parâmetros físicos e bioquímicos apresentados por uma
única célula (ELMORE, 2007).
As principais vantagens da citometria de fluxo estão associadas à sua capacidade
analítica. Um alto número de eventos pode ser analisado em questão de segundos,
podendo chegar a cerca de 20 000 células por segundo, contra cerca de 200 células
contadas no método de imunocitoquímica, sendo o primeiro mais representativo
estatisticamente (KLUMB, et al, 2002).
O equipamento que realiza estas análises é o citômetro de fluxo que é composto
basicamente por três sistemas físicos complementares:
Sistema de fluxo: Responsável por transportar as células em fila indiana,
individualmente, na camada de fluxo, para que estas sejam posicionadas
no centro de um feixe de laser.
Sistema óptico: Consiste em um feixe de laser que intercepta a célula, e
por um conjunto de filtros ópticos (espelhos dicróicos) que captam a luz
dispersa e emitida por fluorocromos;
19
Sistema eletrônico: Converte os sinais luminosos detectados em sinais
eletrônicos (tensão), que são processados e analisados pelo sistema
computacional (BACAL; FAULHABER, 2003).
Na CF as células são marcadas com um anticorpo específico conjugado a um
fluorocromo. Em seguida estas células são introduzidas no citômetro por aspiração e são
transportadas dispostas em fila indiana para as câmeras de fluxo através de um líquido
isotônico, onde o laser interceptará a célula, como visualizado na Figura 5 (BACAL;
FAULHABER, 2003).
O feixe de laser ao atingir uma célula ou partícula será disperso
proporcionalmente ao tamanho desta célula ou partícula e captado por um detector
frontal ao feixe, o Forward Scatter ou FSC. A dispersão lateral, ocasionada também
pela incidência do feixe de laser, que define a granulosidade e a complexidade da célula
será captada por espelhos laterais, Side Scatter ou SSC (BACAL, 2003).
Correlacionando as medidas do FSC e SSC é possível diferenciar células em
uma população heterogênea.
20
Figura 5 – Sistema de fluxo e detectores de dispersão frontal (FSC) e lateral (SSC)
Adaptado de http://probes.invitrogen.com
Fonte: Adaptado de http://probes.invitrogen.com
As positividade a com um anticorpo conjugado a um fluorocromo é identificada
através do fenômeno de fluorescência, que ocorre quando um composto absorve a
energia da luz e emite sua própria luz, a uma escala de comprimentos de onda
característica para aquele composto (BECTON, DICKINSON AND COMPANY,
2000).
Os citômetros de fluxo utilizam canais de fluorescência separados (FL) para
detectar a luz emitida. Os detectores são fotodiodos ou tubos fotomultiplicadores
(PMTs), onde fotodiodos são normalmente utilizados para medir a dispersão e os
PMTs,por serem instrumentos mais, são ideais para leituras de fluorescência (BECTON,
DICKINSON AND COMPANY, 2000).
Quando a luz atinge um fotodetector uma pequena corrente é gerada. A sua
tensão associada tem uma amplitude proporcional ao número total de fótons recebidos
pelo detector. Os valores dos dados digitais são recebidos pelo computador e o software
Feixe de laser
Side Scatter - SSC Forward Scatter - FSC
21
traduz esta informação em imagens (histogramas e “dot plots”) para que se possa
visualizar a informação (BECTON, DICKINSON AND COMPANY, 2000).
A Tabela 2 mostra o resumo das principais diferenças entre as técnicas citadas
como mais usadas para avaliação da proteína p53.
Tabela 2 - Análise comparativa entre a imunochistoquímica, imunocitoquímica, Western Blot e
citometria de fluxo
IMUNO-
HISTOQUIMICA
IMUNO-
CITOQUIMICA
WESTERN
BLOT
CITOMETRIA
DE FLUXO
Nº DE CÉLULAS
AVALIADAS 10
2-10
3 10
2-10
3 10
5-10
6 10
5-10
6
TEMPO DE
ANÁLISE Horas Horas Dias Minutos
TIPO DE
ANÁLISE Positivo/Negativo Positivo/Negativo Positivo/Negativo Multiparamétrica
PRECISÃO DA
ANÁLISE Subjetiva Subjetiva Subjetiva Objetiva
TIPO DE
TÉCNICA Manual Manual Manual
Semi-
automatizada
REPRODUTIBI
LIDADE Baixa Baixa Baixa Alta
Fonte: Adaptada de Cavalcanti Junior e colaboradores, 2003
Devido às vantagens e possibilidades do seu uso, a CF pode ser utilizada para avaliar a
expressão proteica de uma célula, entre outros eventos celulares.
22
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Investigar possíveis correlações entre os níveis de expressão basal e pós-
irradiação da proteína p53 em linfócitos humanos avaliados por CF, e as reações
adversas resultantes da radioterapia de pacientes com câncer de laringe.
3.2 Objetivos específicos
Avaliar, por citometria de fluxo, os níveis de expressão da proteína p53 em
linfócitos irradiados e não irradiados em pacientes com câncer de laringe;
Avaliar a presença e o grau de intensidade das seguintes reações adversas:
hiperemia cutânea, rouquidão, disfagia e odinofagia;
Investigar possível correlação dos níveis de expressão individual da proteína
p53, basal e após irradiação dos linfócito com os dados sobre as reações
adversas documentadas;
Avaliar a empregabilidade das análises em teste preditivo da radiossensibilidade.
23
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Perfil da pesquisa e aspectos éticos
O estudo foi do tipo experimental ou ensaio clínico não randomizado, aprovado
pelo comitê de ética do Instituto de Medicina Integral Professor Fernando Figueira
(IMIP) (nº do processo: 1939-11 – Anexo A).
De acordo com as orientações do comitê de ética todos os indivíduos deveriam
ser instruídos sobre a proposta do estudo, e mediante concordância, oficializarem sua
inclusão no estudo por assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
(TCLE) (Apêndice A).
4.2 Seleção da População
Para seleção da população de estudo, foram aplicados os seguintes critérios:
Critérios de inclusão:
Pacientes do IMIP
Indivíduos portadores de neoplasia de laringe em fase inicial (T1 e T2);
Indivíduos que seriam submetidos exclusivamente à radioterapia;
Indivíduos que não passaram por quimioterapia durante o tratamento;
Indivíduos que tenham conhecimento de não terem sido submetidos a
agentes químicos ou físicos que possam danificar o DNA, antes do início
do tratamento;
Indivíduos que assinaram o Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido/TCLE
As informações acerca do estágio da patologia e terapias utilizadas foram
obtidas a partir de prontuários e informações do médico que estava acompanhando cada
paciente.
24
Critérios de exclusão:
Recusa do indivíduo em continuar sua participação na pesquisa;
Circunstâncias materiais ou logísticas que tornassem impossível o
desenrolar normal da investigação.
Por fim, a população de estudo foi de 10 pacientes.
4.3 Coleta das amostras
A coleta das amostras foi realizada no IMIP, antes do início do tratamento
radioterápico.
Para a punção de cada paciente foi realizada a assepsia da porção anterior do
braço do paciente com álcool a 70%, e, utilizando sistema a vácuo, foram coletados 12
mL de sangue periférico venoso contendo o anticoagulante heparina sódica. As
amostras foram devidamente identificadas e divididas em duas alíquotas de 3 mL cada.
4.4 Irradiação das amostras
As amostras foram irradiadas em um acelerador linear de partículas (Siemens /
Primus) pertencente ao setor de radioterapia do IMIP com taxa de dose de 200 cGy.min-
1 e energia de 6 MeV. A Figura 6 ilustra o processo de irradiação das amostras
sanguíneas.
Figura 6 - Arranjo experimental para irradiação das amostras sanguíneas em acelerador linear
25
Duas seringas contendo 3 mL de sangue foram inseridas, uma por vez, em um
fantoma de água sólida com densidade semelhante ao tecido mole humano (ρ = 1 g.cm-
3) e foram posicionadas no centro do campo de irradiação (10cm x 10cm), a uma
distância de 100 cm entre o campo de origem da radiação e a superfície do bloco de
água sólida.
A dose de radiação X administrada foi de 2 Gy. A escolha por esta dose foi feita
com base no tratamento radioterápico convencional, esta dose é compatível com a dose
administrada por fração na radioterapia aplicada aos pacientes (2,25 Gy). Uma alíquota
não foi irradiada, sendo, portanto, o controle negativo do estudo.
Após a irradiação, as amostras foram acondicionadas em recipiente térmico e
transportadas ao Laboratório de Modelagem e Biodosimetria Aplicada (LAMBDA), no
Departamento de Energia Nuclear (DEN) da Universidade Federal de Pernambuco
(UFPE), para processamento.
4.5 Obtenção das células mononucleares
Para obtenção das células mononucleares (PBMC – Peripheral Blood
Mononuclear Cells), todas as amostras foram diluídas em solução salina tamponada
com fosfato (PBS - Phosphate Buffered Saline, pH = 7,2-7,4) na proporção de 1:1, e em
seguida depositadas individualmente sobre uma solução de Ficoll (GE Healthcare) na
proporção de 2:1, respectivamente. As amostras foram então centrifugadas a 400 x g
durante 35 minutos.
Após a centrifugação, o sangue foi separado em seus elementos principais de
acordo com a densidade, o que possibilitou a obtenção da PBMC, onde estão os
linfócitos (células de interesse desse estudo). A Figura 7 ilustra o processo de
separação do sangue por densidade e localização das PBMCs.
26
Figura 7 - Esquema da metodologia de obtenção das células mononucleares do sangue periférico
Fonte: Adaptado de Freitas-Silva, 2010
A camada de PBMC obtida foi removida por aspiração e transferida para outro
tubo. Em seguida, foi adicionado PBS na proporção de 1:2, respectivamente, para
retirada de resíduos de Ficoll das células. Após isso, as amostras celulares foram
centrifugadas a 250 x g por 10 minutos. Esta etapa foi repetida mais uma vez.
Após o término da centrifugação, o sobrenadante contido no tubo foi desprezado
e, em seguida, adicionado 1 mL de meio de cultivo RPMI 1640 (Cultilab) suplementado
com 10% de soro fetal bovino (SFB - Cultilab) ao botão celular obtido. A partir dessa
suspensão celular, foram analisadas a viabilidade celular e realizado o ajuste da
concentração celular.
4.6 Avaliação da viabilidade celular e ajuste da concentração celular
Para tal procedimento, um volume de 10 µL da suspensão celular obtida no item
anterior (item 4.5) foi adicionado a 90 µL do corante azul de tripan 0,4% v/v (Sigma).
Este corante azul de tripan é capaz de corar células com danos na membrana
celular (não viáveis), que podem ser visualizadas através de microscopia óptica
convencional. Desta maneira, só foram consideradas viáveis as células não marcadas
pelo azul de tripan.
Sangue Total
Ficoll
Plasma
PBMC
Ficoll
Outras células PBMC
Centrifugação ( 400 x g /35’)
27
As suspensões foram consideradas adequadas para o cultivo quando a
viabilidade foi maior que 90%. Com base na analise e contagem realizada, foi realizado
o ajuste da concentração da suspensão celular inicial. A concentração celular foi
ajustada para 2 x 106 células.mL
-1.
4.7 Cultivo celular
Para o cultivo celular, 100 µL da suspensão celular ajustada (isto é, 2 x 105
células) foram depositados em placas de cultura de 96 poços com fundo chato (Techno
Plastic Products-TPP).
Após a deposição das células nas placas, foi adicionado 100 µL de meio RPMI
1640 suplementado com 10% de SFB contendo o mitógeno fitohemaglutinina (Cultilab)
para estimular o crescimento e proliferação dos linfócitos T. A concentração final deste
agente foi ajustada para 10 µg.mL-1
por poço da placa de cultivo celular.
As células foram cultivadas em incubadora com 5% de CO2 a 37o
C durante 72
horas.
4.8 Marcação das amostras
O protocolo para esta pesquisa baseou-se no trabalho de Cavalcanti (2005), o
qual padronizou a técnica de avaliação da p53 por citometria de fluxo para o LAMBDA,
com adaptações.
Após o término do cultivo, as células foram transferidas para tubos de
citometria, perfazendo 6 x 105 células/tubo. As amostras celulares foram centrifugadas a
300 x g por 5 minutos e, ao término da centrifugação, o sobrenadante obtido foi
28
descartado e, às células contidas no tubo, foi adicionado um volume de 100 µL de PBS
gelado. As amostras foram centrifugadas novamente (300 x g por 5 minutos).
Após o descarte do sobrenadante, foram adicionados 300 µL de paraformaldeído
a 4% e incubou-se os tubos em gelo durante 20 minutos. Logo após as células foram
centrifugadas a 400 x g durante 5 minutos e foram adicionados 300 µL de solução
permeabilizante (Perm / wash – BD), a fim de deixar a membranas das células
permeáveis aos anticorpos a serem aplicados posteriormente. As células foram
centrifugadas a 400 x g durante 5 minutos, seguido do descarte do sobrenadante. Este
procedimento foi repetido mais uma vez.
Às células permeabilizadas foram adicionados 100 µL de perm/wash e, em
seguida, todas as amostras (não irradiadas e irradiadas) foram marcadas com anticorpo
monoclonal anti-p53conjugado a molécula de PE (ficoeritrina). As amostras não
irradiadas foram marcadas ainda com o anticorpo anti-IgG1-PE, para detecção de
marcações inespecíficas e uma alíquota foi mantida sem marcação para ajuste dos
parâmetros de aquisição do citômetro de fluxo. Em seguida, as amostras foram
incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz.
Após o período de incubação, as amostras foram ressuspensas duas vezes com
perm/wash e centrifugadas a 400 x g por 5 minutos para remoção de anticorpos que não
se ligaram. Finalizado, foi adicionado a cada tubo um volume de 500 µL de perm/wash
e as células seguiram para a análise por citometria de fluxo.
4.9 Citometria de fluxo
As células foram adquiridas no citômetro de fluxo Gallios da Beckman Coulter
(Figura 8) do LAMBDA-DEN/UFPE. As aquisições foram feitas utilizando-se o
software Gallios (Beckman Coulter), eas análises, o software Kaluza (versão 1.0,
Beckman Coulter).
29
As leituras foram iniciadas com a amostra não marcada. O laser utilizado foi o
de argônio (488 nm), que é capaz de excitar as moléculas de PE, cujo sinal é detectado
no canal FL2 (585/42 nm). A voltagem e ganho dos detectores do equipamento foram
ajustados de forma que fosse possível a identificação e delimitação da região de células
de interesse. Os dados obtidos foram apresentados em dot-plots bidimensionais (2-D)
do tipo densidade, nos quais dois parâmetros em questão são dispostos em um único
gráfico, onde o eixo horizontal apresenta o sinal captado pelo detector FSC, enquanto o
eixo vertical apresenta o sinal captado pelo detector SSC. Foram adquiridos 50.000
eventos para cada amostra.
A Figura 9 ilustra o gráfico de aquisição usado para delimitação dos linfócitos
através dos parâmetros de FSC e SSC. Para as análises dos dados foi utilizado o
software Kaluza (Beckman Coulter).
Figura 8 - Citômetro de Fluxo do LAMBDA – DEN / UFPE
30
A Figura 10 mostra um exemplo de dot plot obtido durante o presente trabalho,
onde o quadrante superior esquerdo apresenta as células que apresentaram
fluorescência, isto é, foram positivas para p53; enquanto o quadrante inferior esquerdo
ilustra as células negativas para o parâmetro avaliado. A partir das células de interesse
foi verificada a positividade para o fluorocromo PE, identificado em dot plot com os
parâmetros FL1 por FL2. Esta leitura foi realizada para todas as amostras (Não
marcada, IgG1-PE, p3-PE não irradiado, p53-PE irradiado).
Figura 9 - Gráfico de aquisição para delimitação dos linfócitos (FSC X SSC)
31
O resultado final da expressão da proteína p53 foi determinado através da
subtração do percentual de células positivas para o controle isotípico (IgG) do
percentual de células positivas para as amostras marcadas com p53 - não irradiadas e
irradiadas, afim de retirar as possíveis marcações inespecíficas do resultado final. O
resultado da expressão da p53 foi dado em termos percentuais (%).
A Figura 11 mostra o esquema da metodologia que foi utilizada no presente
estudo, para avaliação da proteína p53 em sangue periférico irradiado in vitro.
22,07%
Figura 10 - Dot plot apresentando o sinal captado pelos detectores FL1 e FL2 de linfócitos irradiados
marcados com anticorpo anti-p53
32
Não irradiado 2,0 Gy
Sangue Total
Ficoll
PBMC*
Ficoll
Outras células PBMC*
Plasma
Isolamento das Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMC)
Coleta de sangue periférico (10 pacientes)
1)
2)
3)
Permeabilização e Marcação das células
Controle Não marcado
Controle IgG
Controle p53
2,0 Gy p53
4) Análise – Citômetro de Fluxo
Cultura celular (72 horas; 37°C e 5% CO2)
Figura 11 - Esquema da Metodologia para avaliação da expressão da proteína p53 em sangue periférico irradiado
33
4.10 Tratamento dos pacientes
O tratamento dos pacientes foi realizado segundo protocolo do IMIP. Para os
pacientes com tumores com estadiamento T1 o tratamento consistiu em 28 frações de
2,25 Gy, totalizando 63 Gy; já para os pacientes com o estadiamento do tumor em T2
foram feitas 29 aplicações de 2,25 Gy, totalizando assim 65,25 Gy.
O protocolo do serviço de radioterapia do IMIP recomenda que após cada seção
e 3 vezes ao dia, seja feito o uso de uma loção oleosa à base de ácidos graxos essenciais,
com vitaminas A e E (Dersani) para manter o equilíbrio hídrico da pele, a fim de
minimizar as reações adversas apresentados pela pele durante e após a radioterapia. Este
procedimento foi mantido por questões éticas.
4.11 Acompanhamento dos pacientes e avaliação das reações adversas
Para acompanhamento dos pacientes foi utilizada a Ficha de Tratamento
(Anexo B), onde constam os dados e parâmetros de tratamento, com resumos das
revisões periódicas de cada paciente realizadas a cada 15 dias de tratamento, inclusive
após o termino do mesmo.
Para avaliação das reações adversas foi utilizada a Ficha de Acompanhamento
(Apêndice B), onde são documentados os graus das reações adversas (hiperemia
cutânea, rouquidão, disfagia e odinofagia) que ocorreram durante o tratamento,
observados pelos médicos e pelos próprios pacientes.
Os dados foram utilizados para avaliar a radiossensibilidade individual dos
pacientes. Segundo parâmetros da RTGO foi construída uma escala para avaliação das
reações adversas que foram apresentadas pelos pacientes, a qual é apresentada na
Tabela 3.
34
Tabela 3 - Escala dos graus de reações adversas para avaliação dos pacientes
Escala das Reações Adversas
NA Não apresentada
+ Leve
++ Moderada
+++ Severa
Fonte: Adaptada da RTOG, 2011
As reações adversas analisadas foram: hiperemia cutânea, rouquidão, disfagia e
odinofagia.
4.11.1 Hiperemia Cutânea
Para avaliação do grau das reações adversas de pele foram registradas imagens
pré e pós-tratamento, visando avaliar o grau das reações adversas de pele apresentados
em reação ao tratamento radioterápico. As imagens pré-tratamento foram registradas
antes da primeira aplicação de radioterapia e as imagens pós-tratamento foram
adquiridas logo após a última sessão.
Todas as imagens foram avaliadas por uma equipe médica, composta por quatro
radioterapeutas, dos quais somente um teve contato direto com os pacientes do estudo.
É importante salientar que esta análise foi realizada por cada médico separadamente, e
que os avaliadores não tiveram contato com os outros dados do estudo, como a
expressão da proteína p53, caracterizando o estudo como duplo cego. Buscou-se assim,
uma avaliação isenta e objetiva de cada profissional sobre os graus das reações adversas
de cada paciente.
A Figura 12 mostra exemplos de diferentes graus de reações adversas
apresentadas pelos pacientes, avaliadas pelos radioterapeutas. Em A constam registros
de antes do inicio da radioterapia (à esquerda) e após o tratamento (à direita) de um
paciente que teve reações adversas de grau leve, caracterizada apenas por vermelhidão
na região do tratamento. Em B encontra-se ilustrada uma reação adversa de grau
moderada, apresentando vermelhidão e descamação seca. Em C observa-se uma reação
35
adversa severa, onde se pode observar vermelhidão intensa e descamação aquosa após a
radioterapia.
(Grau Leve)
(Grau Moderado)
(Grau Severo)
B
A
(
C
Figura 12 - Graus de reações adversas apresentadas pelos pacientes após a raditerapia
36
4.11.2 Rouquidão, Disfagia e Odinofagia
As reações adversas referentes à rouquidão, disfagia e odinofagia foram
avaliados segundo informações fornecidas pelos próprios pacientes, seguindo a mesma
escala construída para as reações adversas de pele (que varia de “não apresentada” a
“severa”). Rancati e colaboradores (2010) utilizaram uma escala de avaliação das
reações adversas semelhante à do presente trabalho.
Para rouquidão, os seguintes parâmetros foram considerados para a classificação
da intensidade:
Não apresentada (NA) - paciente não apresentava diferença vocal antes
e depois do tratamento;
Leve (+) - ligeira mudança na voz, porém sem dificuldades na fala;
Moderada (++) - além de apresentar mudança vocal, o paciente também
sentia dificuldades no ato de falar;
Severa (+++) - o paciente sentia grande dificuldade para falar,
impedindo-o de exercer a fala fluentemente.
As reações adversas de disfagia (dificuldade ao engolir) e odinofagia (dor ao
engolir) são próximas e podem ser designadas como dificuldade para engolir de uma
forma geral, uma vez que os pacientes tiveram a mesma percepção a respeito dos graus
de severidade de ambas as reações, descrevendo os parâmetros de disfagia e odinofagia
como sendo de igual intensidade. Esta resposta também foi encontrada por Caglar e
colaboradores (2008), e por Jensen e colaboradores (2007) que também não
conseguiram distinguir este parâmetro nos seus estudos, caracterizando ambos como
dificuldade de engolir.
Os parâmetros para a classificação da intensidade das reações adversas de
Disfagia e Odinofagia:
37
Não apresentada (NA) - o paciente não sentia diferença na maneira de
deglutir em comparação à sua condição antes do tratamento;
Leve (+) - o paciente conseguia comer alimentos sólidos, porém sentia
maiores dificuldades se comparado à antes do tratamento;
Moderada (++) - o paciente não conseguia deglutir todos os tipos de
alimentos que comia antes do tratamento, mas ainda se alimentava de
alimentos sólidos;
Severa (+++) - o paciente não conseguia comer alimentos sólidos.
4. 2 Análise estatística
Para a comparação das expressões da proteína p53 das amostras controle com às
amostras irradiadas, bem como para comparação entre os indivíduos foi utilizada a
análise da variância (ANOVA), ao nível de 5%.
Foi realizado, como teste estatístico, a correlação de Spearman para verificar a
correlação entre os resultados de expressão da proteína e os graus das reações adversas
apresentadas pelos pacientes. O teste estatístico baseado na correlação de Spearman
indica a força e a direção do relacionamento entre duas variáveis aleatórias.
A Tabela 4 descreve como interpretar os valores do coeficiente de correlação de
Spearman.
Tabela 4 - Interpretação dos coeficientes de Spearman
Valor de r Interpretação
0,00 a 0,19 Correlação bem fraca
0,20 a 0,39 Correlação fraca
0,40 a 0,69 Correlação moderada
0,70 a 0,89 Correlação forte
0,90 a 1,00 Correlação muito forte
Fonte: Adaptada de MORETTIN e colaboradores, 2010
38
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Perfil dos pacientes
A Tabela 5 mostra as principais informações dos pacientes avaliados no presente
estudo.
Tabela 5 - Descrição do perfil dos pacientes utilizados no presente estudo
Pacientes Fumante Estadiamento Sexo Idade
(anos)
A SIM T1 M 51
B SIM T2 M 76
C NÃO T1 F 56
D SIM T2 F 69
E SIM T2 M 72
F SIM T1 M 57
G SIM T2 F 58
H SIM T1 M 51
I SIM T1 M 53
J SIM T2 M 60
M-masculino; F-feminino;
5.2 Expressão da proteína p53
A Tabela 6 mostra a porcentagem da expressão da proteína p53 de cada paciente
em linfócitos não irradiados (controle) e irradiados com 2 Gy.
31,81% 22,07% 9,79% a
b c
Pacientes
Controle 2 Gy Fator de aumento
A 0 6 ∞
B 0,03 6,85 228,3 x
C 3,04 13,32 4,38 x
D 4,2 23,7 5,64 x
E 4,4 9,63 2,18 x
F 7,13 8,37 1,17 x
G 8,04 5,08 0 x
H 11,02 10,63 0 x
I 12,28 22,02 1,79 x
J 15,02 24,4 1,62 x
Expressão da proteína p53
Tabela 6 - Expressão da proteína p53 nas amostras controle e irradiada com dose de 2 Gy
39
Os resultados mostraram aumento estatisticamente significante da expressão da
p53 após exposição dos linfócitos à radiação (p < 0,0001). Nota-se também que este
aumento ocorre de forma não homogênea, com significante variabilidade inter-
individual (p = 0,0003).
Estes resultados corroboram com os de Cavalcanti e colaboradores (2011), que
também identificaram aumento na expressão da proteína p53 com o aumento da dose de
radiação em linfócitos humanos irradiados in vitro e cultivados durante 72 horas, bem
como uma grande variabilidade entre os indivíduos analisados.
Pode-se observar que houve uma variação significante da expressão basal da
proteína p53 entre os pacientes avaliados. Rossner e colaboradores (2004), investigando
a proteína p53 através da técnica de ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
também encontraram uma grande variação da concentração basal da proteína p53 nos
linfócitos dos indivíduos analisados.
Ainda se sabe muito pouco sobre a dinâmica basal da proteína p53. Enquanto
alguns trabalhos têm sugerido que a p53 é mantida em níveis baixos em condições
basais (LOEWER, 2010), outros mostram variadas amplitudes da p53, ou mesmo que a
quantidade de expressão é independente da quantidade de danos (GEZA-ZATORSKY
et al., 2006). Levine (1997) afirma que o aumento dos níveis de expressão da proteína
p53 é proporcional ao dano celular, ou seja, aumenta com o aumento da dose.
A expressão basal da proteína p53 pode variar de acordo com o indivíduo,
considerando-se que as células no corpo humano estão sofrendo pequenos estresses
constantemente. O dano à estrutura do DNA é um evento comum e pode ocorrer através
de hidrólises espontâneas e formação de radicais livres. Além disso, as células são
expostas a vários outros tipos de estresses, como o estresse metabólico, que também
ativam a p53 (LOEWER et al., 2010).
40
Tem sido relatado frequentemente que a alta expressão basal da p53 se relaciona
fortemente com o tabagismo, hábito encontrado na maioria dos pacientes com câncer de
laringe (KATO et al., 2001). De acordo com Rössner e colaboradores (2004) os níveis
de expressão da proteína p53 em indivíduos fumantes são maiores quando comparados
com aos indivíduos não fumantes. No presente estudo, todos os pacientes eram
fumantes, com exceção do paciente C.
Cavalcanti Júnior e colaboradores (2004) encontraram variações entre 0 e 4% na
expressão basal da proteína p53 em linfócitos do sangue periférico de indivíduos sadios,
no entanto no estudo citado não havia a informação se os doadores teriam sido expostos
à algum agente químico, como o tabagismo, que pudesse interferir nos níveis de
expressão basal desta proteína.
5.3 Reações adversas de pele e a expressão da proteína p53
Na Tabela 7 é possível observar os níveis das reações adversas de pele dos
pacientes relacionado com o aumento da expressão basal da proteína p53, isto é, o
percentual de células que expressam a proteína sem o estresse físico da radiação.
Tabela 7 - Expressão basal individual da proteína p53 e graus de intensidade da
reação adversa de pele
Pacientes Expressão da proteína p53 (%) Reação adversa
Controle (Não irradiado) Pele
A 0 +++
B 0.03 ++
C 3.04 +
D 4.2 ++
E 4.4 +
F 7.13 +
G 8.04 +++
H 11.02 +
I 12.28 ++
J 15.02 ++ NA- reação não apresentada; + leve; ++ moderada e +++ severa;
41
O valor calculado do coeficiente de Spearman foi de -0,1168, o que indica uma
correlação bem fraca e não significativa (p > 0,05) entre os dados. A análise indica
portanto, que não há correlação entre os diferentes graus de reações adversas de pele e a
expressão basal da proteína p53.
A Tabela 8 apresenta os níveis de reações adversas da pele dos pacientes e a
expressão da proteína p53 nas amostras irradiadas com 2 Gy.
NA- reação não apresentada; + leve; ++ moderada e +++ severa
O coeficiente de Spearman foi de 0,3114, sendo assim, houve uma correlação fraca e
não significante estatisticamente (p > 0,05) entre os dados, isto é, não houve correlação
entre os níveis de reação adversa de pele apresentada após a radioterapia com a
expressão da p53 em linfócitos dos pacientes irradiados in vitro.
5.3.1 Estudo de caso
Durante este trabalho, um dos pacientes foi reavaliado por um comitê de
médicos radioterapeutas. Este paciente apresentou reações adversas de pele deste
paciente leves, com vermelhidão, logo após o término da radioterapia. Entretanto, após
Pacientes Expressão da proteína p53 (%) Reação Adversa
2 Gy Pele
G 5,08 +++
A 6 +++
B 6,85 ++
F 8,37 +
E 9,63 +
H 10,63 +
C 13,32 +
I 22,02 ++
D 23,7 ++
J 24,4 ++
Tabela 8- Expressão individual da proteína p53, após irradiação com
a dose de 2 Gy e reação adversa de pele
42
uma semana do término do tratamento, as reações de pele do mesmo paciente foram
consideradas severas, apresentando ainda uma descamação aquosa, como ilustrado na
Figura 13.
O paciente relatou ter parado de usar o creme hidratante logo após o término do
tratamento radioterápico, o que não ocorreu com os demais pacientes, e esta interrupção
do uso pode ter sido a causa do agravamento da lesão.
Este caso em particular mostrou que a não utilização ou a irregularidade no uso
do creme hidratante pode afetar o grau das reações adversas de pele, e o não controle
deste parâmetro pode ter afetado diretamente o grau das reações adversas de pele de
cada paciente não permitindo a devida correlação destes com a expressão da proteína
p53.
As razões para a aplicação tópica de cremes é o desconforto do paciente com
coceiras, ardor e irritação da pele. Tais sintomas podem ser agravados pelo
ressecamento de áreas com excesso de queratina (LAVERY, 1995).
A B
Figura 13 - a) Paciente apresentando reação leve logo após o tratamento radioterápico; b) Mesmo
paciente com reação considerada severa (provavelmente devido a interrupção da utilização do creme
hidratante) após 1 semana do término do tratamento
43
Ponten e colaboradores (2001) afirmam que o uso tópico de cremes
corticosteroides tem efeito radioprotetor, reduzindo o grau de intensidade de reações
adversas agudas radioinduzida.
Como dito anteriormente, o creme Dersani revitaliza e mantem o balanço hídrico
da pele, e possui em sua composição vitaminas A e E. A vitamina A protege a epiderme
contra os danos mediados por radicais livres, atuando como antioxidante através da sua
capacidade de inibição da oxidação de compostos pelos peróxidos. Além disso, a
vitamina A participa de inúmeros processos fisiológicos, dentre eles a manutenção da
integridade das células epiteliais (REIFEN, 2002). A vitamina A tem se mostrado
eficiente também como agente antiinflamatório, incluindo inflamação a nível epitelial,
onde sua aplicação tópica aumenta a renovação celular, tornando a epiderme mais fina,
diminuindo desta forma, o surgimento de tampões queratinosos (REIFEN, 2002).
A vitamina E é outro antioxidante de grande importância (WOLF et al., 1998;
SANTOS; CRUZ, 2001), protegendo, principalmente os tecidos adiposos da ação dos
radicais livres. Outra atividade importante da vitamina E, é a atuação na interrupção do
ciclo celular na fase G1 podendo conduzir a célula para a apoptose (SANTOS; CRUZ,
2001). Deficiências da vitamina E, fazem com o que os danos produzidos pelos radicais
livres causem peroxidação lipídica, e consequentemente destruição da célula (SANTOS;
CRUZ, 2001; YILMAZ, 2006).
A vitamina E, além de contribuir para a eliminação de radicais livres gerados
pela irradiação, e portanto, apresentar-se como um agente radioprotetor dos tecidos
normais durante a radioterapia (YILMAZ, 2006), também é um poderoso agente
antiinflamatório (BRUUNSGAARD et al., 2003). Rahman e colaboradores (2008)
constataram que a aplicação tópica desta vitamina diminui o índice de inflamação
cutânea.
As propriedades apresentadas pelas vitaminas A e E possivelmente levaram a
uma diminuição do efeito indireto da radiação, pelo combate aos radicais livres,
diminuindo assim os danos celulares provocados pela radioterapia. A reação
44
antiinflamatória e de renovação celular pode ter influenciado nos graus de descamação e
queratinização da pele, apresentados por alguns pacientes.
O estudo de caso deste paciente em particular sugere, portanto, que a frequência
do uso ou a não utilização do creme pode interferir nos níveis de reações adversas
apresentadas pela pele, o que pode explicar a não correlação com a expressão da
proteína p53.
Wells e colaboradores (2004) não encontraram diferenças significativas de
reações adversas entre grupos que usaram cremes hidratantes e grupos que não fizeram
o uso destes, diferentemente do presente estudo, que identificou uma alteração da
avaliação do paciente após a interrupção do uso do creme recomendado.
Campbell e Illingworth (1992) observaram que até mesmo a maneira de lavagem
do local irradiado afeta o grau das reações adversas da radioterapia. Os pesquisadores
monitoraram três tipos de lavagens em pacientes com câncer de mama submetidas à
radioterapia, onde um grupo não lavou a área irradiada, o segundo grupo lavou somente
com água e o último grupo fez a lavagem da área irradiada com água e sabão neutro.
Como resultado, obtiveram um decréscimo significante nos graus das reações adversas
apresentadas, como eritema e descamação, nas pacientes que usaram água e sabão
neutro para lavar a região.
Outros fatores também podem contribuir para a variação de severidade das
reações de pele, como o sítio do tratamento, volume do tecido irradiado, dose,
fracionamento da dose e tempo de irradiação, combinação com a quimioterapia,
tabagismo e predisposição genética (WELLS et al., 2004; MCQUESTION, 2006). No
presente estudo todos os parâmetros mencionados acima foram controlados, permitindo
que a predisposição genética ou radiossensibilidade individual fosse avaliada. Entre os
10 pacientes avaliados, apenas um era não fumante e o resultado das reações adversas
de pele não mostrou diferença entre os grupos.
45
5.3 Reações adversas de rouquidão, disfagia e odinofagia e a expressão da
proteína p53
A Tabela 9 mostra a correlação do percentual de expressão da proteína p53 nas
células não irradiadas (controle) com os graus de reações adversas apresentadas por
cada um dos pacientes.
NA- reação não apresentada; + leve; ++ moderada e +++ severa
Para os níveis de rouquidão, o coeficiente de correlação de Spearman (-0,7107)
indica uma forte correlação negativa com a expressão basal de proteína p53, sendo esta
correlação significativa estatisticamente ao nível de 5% (p = 0,0212). Este dado indica
que quanto maior o nível de expressão basal individual da proteína p53, menos severa
será a reação adversa de rouquidão.
Para as reações adversas de disfagia e odinofagia o coeficiente de Spearman foi
de -0,7135, o que confirma forte correlação negativa entre a expressão da p53 e a
intensidade destas reações. Esta correlação foi estatisticamente significante ao nível de
5% (p = 0,0232). A correlação apresentada indica que quanto maior os níveis de
expressão basal da p53, monos severas serão as reações de disfagia e odinofagia.
Numa segunda análise podemos separar 2 grupos distintos: o primeiro
apresentou baixa expressão da proteína (em branco) enquanto que no segundo
Pacientes Expressão da proteína p53 (%)
Controle (Não irradiado) Rouquidão Disfagia / Odinofagia
A 0 ++ ++
B 0.03 ++ ++
C 3.04 + +
D 4.2 ++ ++
E 4.4 ++ ++
F 7.13 + +
G 8.04 + +
H 11.02 + NA
I 12.28 + +
J 15.02 + +
Reações adversas
Tabela 9 - Expressão basal individual da proteína p53 e correlação com os graus de
rouquidão, disfagia e odinofagia.
46
observou-se alta expressão da proteína p53 (em cinza). O primeiro grupo apresentou
reações adversas mais severas quando comparados ao segundo grupo.
O fato do tecido sadio apresentar maior expressão basal da proteína p53, parece
servir como um “alerta” inicial, que faz com que o tecido biológico responda de forma
mais eficaz quando agredido pelas radiações ionizantes. É como se o organismo já
tivesse preparado para uma resposta imediata ao sofrer estresse, diferente dos que
expressam pouca p53 basal, que teria que aumentar os níveis destas para responder ao
mesmo dano.
A resposta celular ao dano radioinduzido depende da quantidade de p53 ativada
e do tempo de duração na sua ativação, isto é, quanto mais forte e mais longa for a
ativação da p53, maiores a chance de respostas mais efetivas, como o encaminhamento
da célula para apoptose (GUDKOV; KOMAROVA, 2003). Os resultados do presente
trabalho mostram que indivíduos que possuem, portanto, uma alta expressão basal da
proteína p53, portanto, mais tempo de contato com a p53 ativada, teria mais eficiência
no processo de encaminhamento da célula danificada ao reparo celular ou à apoptose ao
ser exposta à agressão por radiações ionizantes.
Em estudos realizados em células do timo, foi possível observar que as células
que não expressavam p53 morreram de outra forma que não apoptose, já as células que
expressavam p53 na sua forma ativa eram eliminadas por apoptose após serem
irradiadas (GUDKOV; KOMAROVA, 2003).
Diversos estudos têm observado que o acúmulo da proteína p53 leva à parada do
ciclo celular que pode facilitar o reparo do DNA e/ou levar à apoptose radioinduzida
(FEI; EL-DEIRY, 2003). Os pacientes que tiveram menor expressão da proteína p53,
provavelmente tiveram também menor morte celular induzida por apoptose e possível
aumento de morte celular por outras vias, como a necrose, fato que gerou fibrose do
tecido sadio e posterior aumento no grau da reação adversa de rouquidão destes
pacientes. Desta forma, é provável que pacientes que já possuem baixa expressão basal
47
da proteína p53 quando submetidos à exposição às RIs podem ter a morte via apoptose
diminuída, e consequente aumento da morte por outras vias, como a necrose, e
consequente aumento de inflamação tecidual.
A disfagia e odinofagia, bem como a rouquidão são resultados da formação de
edema. O edema é um dos efeitos da radioterapia, e ocorre devido ao crescimento da
permeabilidade vascular causada pelo bloqueio dos vasos sanguíneos e linfáticos e por
mediadores inflamatórios liberados por células que sofreram danos após irradiação e
não foram encaminhadas para a apoptose (ICHIMURA et al., 1997). A inflamação é a
resposta primária de danos do tecido biológico e se caracteriza pela liberação de vários
mediadores que regula a permeabilidade vascular (MANIKANTAN et al., 2009). O
processo inflamatório também induz fibrose tecidual, o que leva, por exemplo, a um
aumento da rouquidão (WANG et al., 1998; BARCELLOS-HOFF et al., 2005).
Considerando estes dados da literatura, pacientes que apresentaram uma baixa
expressão basal da proteína p53 apresentaram um alto grau de inflamação tecidual e
consequente aumento nos graus de rouquidão, disfagia e odinofagia, provavelmente
tiveram um retardamento do processo de checagem do ciclo celular. Com isso as células
danificadas pela radiação não puderam ser reparadas ou encaminhadas para a apoptose
em 72 horas (tempo de cultivo celular utilizado na pesquisa), ou seja, como as células
ainda estavam no processo de checagem e/ou sofrendo processo de morte por outras
vias, houve um aumento da inflamação e consequente aumento das reações adversas
apresentadas por estes pacientes.
Por outro lado, pacientes que apresentaram alto nível de expressão basal da
proteína p53, o que provavelmente levou ao aumento de reparação do dano celular e
grande parte das mortes via apoptose, que possibilita uma recuperação tecidual mais
rápida, associada a uma das características da apoptose celular, que é o não
aparecimento de inflamação, devido à formação dos chamados corpos apoptóticos e
rápida fagocitose destes. A fagocitose dos corpos apoptóticos evita a liberação de restos
celulares no tecido biológico, prevenindo assim a produção de citocinas indutoras de
48
reação inflamatória, diminuindo assim, o grau das reações adversas (SCHLEGEL;
WILLIAMSON, 2001; KUROSAKA et al., 2003).
Na Tabela 9 é possível observar ainda, que dentre os pacientes que
apresentaram baixo nível de expressão (em branco), o paciente C apresentou rouquidão,
disfagia e odinofagia consideradas leves, sendo considerado um ponto fora da curva.
Uma das possíveis explicações se deve ao fato de o paciente C ser o único dentre os 10
que não era fumante. De acordo com Hocevar-Boltezar e colaboradores (2009), o
tabagismo influencia na qualidade de voz e no nível de rouquidão após o tratamento de
radioterapia.
Considerando todas as impressões, o resultado das correlações sugere o uso da
avaliação da expressão dos níveis basais da proteína p53 como teste preditivo de
eficácia da resposta celular dos tecidos normais contra os danos causados pela radiação.
Esta análise parece predizer a radiossensibilidade em pacientes submetidos à
radioterapia. É necessário ainda mais estudos, com um número maior de indivíduos,
para que se possa avaliar a tendência mostrada no presente trabalho.
A Tabela 10, abaixo, mostra os níveis das reações adversas (rouquidão, disfagia
e odinofagia) nos pacientes, de acordo com o percentual de células que expressaram a
proteína p53 após irradiação com dose de 2 Gy. Para melhor visualização os dados
foram organizados em ordem crescente de expressão da proteína p53.
Para a reação adversa de rouquidão o valor do coeficiente de Spearman foi de -
0,2132, havendo portando, uma correlação fraca e não significativa estatisticamente ao
nível de 5%. Para as reações de disfagia e odinofagia o valor do coeficiente de
Spearman foi de - 0,2010, sendo também uma correlação fraca e não significativa.
49
Tabela 10 - Expressão da proteína p53 em linfócitos irradiados com dose de 2 Gy e os níveis de
reações adversas dos pacientes após a radioterapia
Pacientes Expressão da proteína p53 (%)
2 Gy Rouquidão Disfagia Odinofagia PeleG 5.08 + + + +++
A 6 ++ ++ ++ +++
B 6.85 ++ ++ ++ ++
F 8.37 + + + +
E 9.63 ++ ++ ++ +
H 10.63 + NA NA +
C 13.32 + + + +
I 22.02 + + + ++
D 23.7 ++ ++ ++ ++
J 24.4 + + + ++
Efeitos colaterais
NA- reação não apresentada; + leve; ++ moderada e +++ severa;
Estes dados corroboram com Ribeiro e colaboradores (2000) que relacionaram a
expressão da proteína p53 por imunohistoquímica após irradiação com efeitos clínicos
em pacientes com câncer retais submetidos à radioterapia. Estes autores também
detectaram nenhuma correlação.
Ponten e colaboradores (2001) avaliaram a expressão da p53 por
imunohistoquimica após irradiação de 2 Gy em células da pele, sendo observada uma
grande diferença inter-individual na expressão da p53. Os pesquisadores
correlacionaram ainda os resultados com as reações da radioterapia ligadas à
inflamação, como edema e eritema e foi observado que a expressão desta proteína não
reflete a resposta adversa individual. Pontem e colaboradores (2001) ainda afirmam que
o mecanismo que regula o crescimento da p53 em resposta ao dano radioinduzido
necessita de estudos adicionais para ser melhor elucidado.
Ferreira (2012), num trabalho complementar a este, observou forte correlação
entre a sobrevivência celular e as reações adversas dos mesmos pacientes avaliados
neste trabalho após tratamento de radioterapia para câncer de laringe em estágios T1 e
T2. Os dados obtidos são apresentados na Tabela 11. Observou-se que quanto maior o
50
índice de sobrevivência celular maiores foram os níveis de reações adversas
apresentados pelos pacientes.
Barber e colaboradores (2002) também mostraram uma correlação inversa
entre morte celular induzida por radiação e a toxicidade apresentada pelos pacientes
após radioterapia, isto é, quanto maior o nível de morte de linfócitos irradiados, menor
será o risco de desenvolvimento de reações adversas severas. A variedade da resposta à
radioterapia está associada com a condição genética individual do paciente.
Da análise desta Tabela 11, é possível observar que a maioria dos pacientes que
apresentaram expressões basais mais baixas par a p53 teve um alto percentual de
sobrevivência celular (69,17 ≤ 74,09), após irradiação com dose de 2,5 Gy. Já os
pacientes do grupo 2 (primeira coluna em cinza), que apresentaram os níveis expressão
basal mais altos, tiveram menores índices de sobrevivência celular após irradiação
(30,84 ≤ 60,14).
Foi realizado o teste estatístico de correlação de Pearson onde a sobrevivência
foi dividida em 2 grupos distintos: Grupo 1: sobrevivência de 30,84% até 52,5% e
Expressão da proteína p53 (%) Sobrevivência celular % (Ferreira, 2012)
Controle (Não irradiado) 2,5 Gy
0 54.88
0.03 74.09
3.04 69.17
4.2 72.9
4.4 70.28
7.13 54.3
8.04 60.14
11.02 30.84
12.28 56.98
15.02 50
Tabela 11 - Comparação dos níveis basais da p53 com a sobrevivência das células de cada paciente
irradiada com a dose de 2,5 Gy de Ferreira (2012)
51
Grupo 2: sobrevivência de 52,5% até 74,09%. O número 52,5 foi achado através de uma
média simples entre o maior e o menor percentual de sobrevivência celular. Como
resultado, obteve-se o coeficiente de correlação de Pearson no valor de – 0,76, isto é,
apresentou-se uma forte correlação estatisticamente significante entre a expressão da
proteína p53 e a sobrevivência celular.
A correlação da expressão basal de p53 dos pacientes com a sobrevivência
celular destes mesmos pacientes analisadas por Ferreira (2012) era esperada justamente
devido ao importante papel da p53 na apoptose de células que sofreram esse tipo de
estresse físico. A proteína p53 por estar envolvida no processo de parada celular, e
consequente controle na proliferação, bem como no processo de apoptose (KLUMB et
al., 2002) quando está em níveis altos nas células faz com que estas diminuam o grau de
proliferação e aumentem os níveis de apoptose, o que explica a correlação deste grupo
com as sobrevivências celulares mais baixas.
Todos estes resultados têm dado suporte à teoria de que o estudo das respostas
induzidas pela radiação em linfócitos do sangue periférico é um método eficaz para
predizer a resposta dos tecidos normais à radiação. Basicamente duas relações têm sido
utilizadas para predizer os níveis de reações adversas de tecidos sadios após
radioterapia: Altos níveis de danos ao DNA foram associados com altos níveis de
reações severas. Em contraste, baixos níveis de morte celular estão associados com alto
nível de toxicidade dos tecidos sadios (HENRÍQUEZ-HERNÁNDEZ et al., 2012).
Com isso, o presente trabalho indica que a avaliação da expressão dos níveis
basais individuais da proteína p53 por citometria de fluxo pode ser um bom indicador
de radiossensibilidade individual para as reações adversas de rouquidão, disfagia e
odinofagia em radioterapia de câncer de laringe, embora seja necessário o estudo com
maior número de pacientes.
52
6 CONCLUSÃO
Há variação interindividual significativa da expressão basal da proteína p53,
bem como um aumento significativo e variável da sua expressão após a
irradiação das células dos pacientes;
Não foi possível correlacionar os graus de reações adversas da pele com os
níveis de expressão basais e pós-irradiação da p53;
As reações adversas de rouquidão, disfagia e odinofagia não puderam ser
correlacionadas com os níveis de expressão da p53 em linfócitos irradiados com
a dose de 2 Gy;
Houve forte correlação entre os níveis basais individuais de expressão da
proteína p53 e as reações adversas de rouquidão, disfagia e odinofagia, onde
quanto maior a expressão basal da p53, menor é o grau de severidade das
reações adversas;
53
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62
APÊNDICE A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Projeto: Uso da citometria de fluxo na análise da proteína p53 para avaliação
de radiossensibilidade individual em pacientes de câncer de laringe
Eu, ___________________________________________________________________
residente em ____________________________________________________________
município de ____________________________________ Estado_________________
portador da identidade Nº ________________________, autorizo a coleta de amostra do meu
sangue periférico com a finalidade científica, cujo objetivo é investigar a correlação entre
diferentes doses de radiação gama com a expressão da proteína p53 de linfócitos do sangue
periférico humano irradiado in vitro, a fim de estabelecer uma curva de dose versus expressão
de p53, útil em protocolos de avaliação de radiosensibilidade individual que precede
tratamentos radioterápicos.
Recife, _______ de ______________________ de _________.
Assinatura do doador (ou responsável): ______________________________________.
Assinatura do responsável pela coleta: ______________________________________.
Testemunhas: ______________________________________
______________________________________
63
APÊNDICE B – FICHA DE ACOMPANHAMENTO
FICHA DE ACOMPANHAMENTO DO PACIENTE
DADOS DO PACIENTE
NOME: ____________________________________________________________
ENDEREÇO: _______________________________________________________
BAIRRO: _________________ MUNICÍPIO: ____________ ESTADO: _____
TELEFONE: ________________________
IDADE: _____________________________
SEXO: ( ) MASCULINO ( ) FEMININO
ETNIA: ______________________________
FUMANTE:
( ) SIM ( ) NÃO
FEZ USO DE ALGUM TRATAMENTO ANTERIOR COM RADIAÇÃO IONIZANTE?
( ) SIM ( ) NÃO
OBS: _______________________________________________________
FEZ USO ANTERIORMENTE DE QUIMIOTERAPIA?
( ) SIM ( ) NÃO
OBS:
_____________________________________________________________________________
PARÂMETROS DE TRATAMENTO
DOSE TOTAL: ________________ DOSE POR FRAÇÃO: ______________
64
TOXICIDADES
PELE
GRAU:
( ) LEVE ( ) MODERADA ( ) SEVERA
ROUQUIDÃO
GRAU:
( ) LEVE ( ) MODERADA ( ) SEVERA
DISFAGIA
GRAU:
( ) LEVE ( ) MODERADA ( ) SEVERA
ODINOFAGIA
GRAU:
( ) LEVE ( ) MODERADA ( ) SEVERA
DATA: _____ / _____ / ________
RESPONSÁVEL: _________________________________________
65
ANEXO A – PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA
66
ANEXO B – FICHA DE TRATAMENTO
67
