p53 ja apoptoosOnkobioloogia

Taavi Päll lektor, TTÜ

/

Recap

RakutsükkelRakutsükkel on järjestikuste sündmuste jada mille käigus rakk duplitseerib kõik omakoostisosad ja jaguneb kaheks tütarrakuks.

Raku rakutsüklisse sisenemist reguleerivad raku väliskeskkonna signaalid.

Mittejagunev rakk on vaikeolekus ( ) ehk G0 faasis.

·

·

·

/

Rakku jagunema/mittejagunema mõjutavadsignaalidRakk on tundlik väliskeskonna signalisatsioonile varases ja keskmises G1 faasis.

türosiin kinaas retseptorid (mitogeenid).

G-valk retseptorid (GPCR).

TGF- retseptorid, TGF- on üks prominentsemaid anti-mitogeene.

toitainestaatus.

· ↑

· ↑

· ↓ β β

· ↓

/

Tsükliinid ja CDK inhibiitoridKasvufaktorid stimuleerivad kiire tsükliin D taseme tõusu rakus ja CDK4/6 aktivatsiooni.

Anti-mitogeenne TGF- signalisatsioon aktiveerib p15INK4B tsükliini kinaasi inhibiitori.

·

· β

/

RB kontrollib restriktsioonipunktiPeale R punkti on rakutsükli regulatsioon automaatne ja ei allu enam mitogeensele-anti-mitogeensele kontrollile.

R punkti läbimist reguleerib

·

·

RB hüpofosforüleerimine tsükliin D-CDK4/6 poolt ja

hüpofosfo-RB hüperfosforüleerimine tsükliin E-CDK2 poolt.

-

-

/

Kasvajates on rakutsükkel dereguleeritudKuni 90% vähke sisaldab muutusi rakutsükli regulatsioonis.

/

TP53

p53 avastamine1979. aastal esitasid kuus sõltumatut uurimisrühma andmed, et nad on avastanud 53 kDavalgu inimese ja hiirte rakkudest (DeLeo et al. 1979, Kress et al. 1979, Lane & Crawford 1979,Linzer & Levine 1979, Melero et al. 1979, Smith et al. 1979).

Viiel juhul avastati see valk sellepärast, et see immuunosadestus koos SV40 viirusvalgugasuur T-antigeen ( ).

Sama valk avastati ka pooljuhuslikult kui keemiliselt transformeeritud sarkoomirakkudevastu genereeritud antiseerum tundis ära 53 kDa valgu transformeerunud rakkudest, kuidmitte normaalsetes rakkudes.

·

·

·

/

Onkoviiruste märklauaks on pRb, p53 ja apoptoosVIIRUS VIIRUSVALK MILLE

MÄRKLAUAKS ON RB

VIIRUSVALK MILLE

MÄRKLAUAKS ON P53

VIIRUSVALK MILLE

MÄRKLAUAKS ON APOPTOOS

SV40 suur T (large T antigen) suur T

adenoviirus E1A E1B55K E1B19K

HPV E7 E6

polüoomiviirus suur T suur T? keskmine T (middle T)

herpesviirus

saimiri

V tsükliin (D tsükliini homoloog) v­Bcl­2

HHV­8

(KSHV)

K tsükliin (D tsükliini homoloog) LANA­2 v­Bcl­2, v­FLIP

HCMV IE72 IE86 vICA, pUL37

HTLV­I Tax

Epstein­Barr EBNA­1 LMP­1

/

p53 peeti algselt onkogeeniks1980.ndate alguses oli tuumorsupressorgeenide kontseptsioon veel väga teoreetiline javiirustest isoleeritud rakulisi onkogeene peeti võtmeks vähi olemuse mõistmisel.

p53 seostus SV40 viiruse peamise onkogeeni - suur T-antigeeniga, viidates et ta kuulubmiskitmoodi suur Tag "signaaliraja"" koosseisu.

p53 oli paljudes kasvajates üle-ekspresseeritud.

"Normaalse" p53 viimine normaalsetesse rakkudesse oli võimeline põhjustama rakkudetransformeerumise.

·

·

·

·

p53 immuunovärvimine metastaatilises rinnavähis (paremal) võrreldes normaalse koega (vasakul). Pilt: doi:10.1038/srep02246

/

p53 on klassikaline "two-hit" tuumorsupressorp53 ilmus jäädavalt radarile kui käärsoolevähist otsiti oletatavat tuumorsupressorgeenikromosoomi 17p lookusest (Baker et al. 1989).

Enamuses käärsoolevähkides olid p53 geenis aminohappe asendusi põhjustavad missensmutatsioonid (C T).

Kõigil juhtudel oli p53 geeni mõlemad koopiad muteerunud: üks koopia sisaldasmutatsioone ja teine koopia oli täielikult kaduma läinud (LOH).

p53 oli muteerunud väga erinevates vähkides (Nigro et al. 1989)

·

·→

·

·

/

p53 mutatsioonisagedused kasvajates

IARC TP53 Database R17, November 2013. Petitjean A, Mathe E, Kato S, Ishioka C, Tavtigian SV, Hainaut P, Olivier M. Impact of mutant p53 functional propertieson TP53 mutation patterns and tumor phenotype: lessons from recent developments in the IARC TP53 database.Hum Mutat. 2007 Jun;28(6):622-9.

/

TSG mutatsioonidTSG sisaldavad laias laastus kahte tüüpimutatsioone,

p53 kuulub selliste TSG hulka milles onkõige sagedasemad aminohappeasendusteni viivad mutatsioonid.

Võib oletada, et selline mutatsioone sisaldav tuumorsupressorvalk annab vähirakkudele mingiselektsioonilise eelise.

·

ühed viivad valgu osalise või täielikutrunkeerumiseni nt. APC, CDKN2A,

teised põhjustavad aminohappeasendusi ( mutatsioonid).

-

-

·

·

Andmed: TOP 5% enim mutatsioone sisaldavad TSG (kokku 637 TSG-st). TSG-d Vanderbilt University andmebaasist ja mutatsioonid COSMIC andmebaasist,cancer.sanger.ac.uk.

/

p53 mutatsioonid asuvad peamiselt DNA sidumisedomäänis

/

p53 mutandid on dominant negatiivsedp53 toimib homotetrameerina.

Kui rakus on näiteks üks p53 alleel muteerunud, siis see mutantne p53 moodustabkomplekse p53 ja inaktiveerib need.

Tetrameeride puhul on kombinatoorikast lähtudes ainult 1/16 p53 kompleksist täielikult ehk aktiivne.

Kui rakus oleks mutantse p53 alleeli ekspressioon täielikult inaktiveeritud, siis säiliks ikkagip53 funktsioon.

Kasvajates p53 muteerunud siiski (kuni 50%) ja läbinud LOH sündmuse.

·

·

·

·

·

"3KMD p53 DNABindingDomian" by Richard Wheeler (Zephyris) - Own work. Licensed under CC BY-SA 3.0 via Commons

/

p53 reguleeritakse valgu stabiilsuse läbiNormaalsetes, mitte stressis olevates rakkudes on p53 väga ebastabiilne poolestusajaga 5-30 min.

Selline kiire tsükkel võimaldab rakul kiiresti vastata füsioloogilistele signaalidele.

Ksenotoksilised agendid indutseerivad p53 minutite jooksul.

Selline induktsioon ei ole tingitud p53 mRNA taseme tõusust.

p53 valgu tase tõuseb rakkudes täielikult tingituna post-translatsioonilistestmodifikatsioonidest mis tõstavad selle normaalselt labiilse valgu stabiilsust.

·

·

·

·

·

/

STIIMULI

TÜÜP

STIIMUL

stress hüpoksia, nukleotiidide puudus, UV kiirgus,

ioniseeriv kiirgus, RNA­ või DNA sünteesi

blokk, madal pH, NO, DNA kahjustused,

kemoteraapia

onkogeenne

signalisatsioon

MYC, E2F1 üle­ekspressioon, DNA

demetülatsioon

p53 indutseerib stressp53 taseme tõus rakkudes viib pöörduvavõi pöördumatu ( ) rakutsükliarrestini.

p53 aktiveerib DNA reparatsiooni raja.

p53 blokeerib angiogeneesi (TSP-1 ).

p53 indutseerib apoptoosi

·

·

· ↑

·

/

p53 indutseerib p21 transkriptsioonip21 vahendab p53 rakutsüklit inhibeerivat efekti, samas p21 inhibeerib p53-sõltuvatapoptoosi.

·

/

DNA kahjustused ja onkogeenid stabiliseerivad p53Peamised p53 stabilisatsiooni rajad

dsDNA kahjustus, ioniseeriv kiirgus, telomeeride lühenemine aktiveerib ATM Chk2 raja.

ssDNA, UV kiirgus, replikatsioonistress, kemoterapeutikumid akiveerivad ATR () Chk1 raja.

p53 fosforüleeritakse amino terminusest Ser-15, Ser-37 jt.

Amino-terminaalne fosforüleerimine blokeerib MDM2 sidumise p53.

Myc või E2F1 aktivatsioon viib rakus p19ARF valgu taseme ülesse, mis blokeerib MDM2 javõib viia rakud apoptoosi.

· →

·→

·

·

·

/

MDM2MDM2 avastati kui kromosoomid hiire sarkoomirakkudes( ).

Mdm2 on E3 ubikvitiin ligaas mis tunnebära p53 amino-terminaalse trans-aktivatsiooni domääni.

Mdm2 on p53 märklaudgeen.

MDM2 ekspressiooni indutseerib kamitogeenne signalisatsioon läbi MAPK raja(AP-1 TF).

Samuti stabiliseerib MDM2 Akt/PKB, millepoolt fosfoforüleerimine blokeerib MDM2auto-ubikvitineerimise.

·

·

·

·

·

Double-minute kromosoomid on ekstrakoromosomaalne DNA kasvajates mis on tekkinud geeniamplifikatsiooni tagajärjel.

/

ARF

Pilt:HHMI

p19ARF (hiir) või p14ARF (inimene) valku kodeerib kompaktne geneetiline lookus kus asubkokku kolm tuumorsupressorgeeni: p16INK4A, p15INK4B ja p19/p14ARF .

ARF geeni promootor asub 13 kB ülevalpool p16INK4A promootorist. ARF - .

ARF seob MDM2 ja inhibeerib selle korjates ta tuumakesse.

ARF ekspressiooni aktiveerivad c-MYC, RAS ja ka adenoviiruse E1A.

·

·

·

·

/

Rb funktsiooni kadumine käivitab ka apoptoosiprogrammi

RB-sõltuv apoptoosi rada: pRb E2F ARF MDM2 p53 apoptoos

E2F liigse aktiivsuse puhuks on evolutsiooniliselt kujunenud mehhanism, mis elimineeribnormaalse pRb kontrolli kaotanud rakud.

Kõrge E2F1 aktiveerib mitmete apoptootiliste geenide transkriptsiooni: kaspaasid (3,7,8,9),pro-apoptootilised Bcl2 valgud (Bim, Noxa, PUMA), Apaf-1 ja p73 (p53 homoloog).

E2F1/2 reguleerib ka p53-sõltuvat apoptoosi indutseerides p14ARF .

·

·

·

⊣ → ⊣ ⊣ →

/

Valik p53 märklaud geene. Kokku on ~120 geeni leitud.GEENI FUNKTSIONAALNE KLASS GEEN FUNKTSIOON

p53 antagonist MDM2 p53 ubikvitiinligaas

rakutsükli inhibiitorid p21CIP1 CDK inhibiitor

Siah­1 ubikvitiinligaas, ­kateniini lagundamine

14­3­3 tsükliin B­CDK1 inhibiitor

Reprimo G2 arrest

DNA reparatsioon p53R2 DNA biosüntees

XPE/DDB2, XPG, XPC NER (nucleotide excision repair)

GADD45 NER (nucleotide excision repair)

DNA pol. DNA polümeraas

apoptoos BAX mt poorivalk

PUMA, NOXA BH3 mt poorivalk

APAF1 kaspaas­9 aktivaator

NF­ B TF

Fas/APO1 surmaretseptor

anti­angiogenees TSP­1 (trombospondiin) ECM valk

β

σ

κ

κ

/

Onkogeenne stress käivitab apoptoosi

The p53 transcription factor activates target genes that promote cell-cycle arrest or apoptosis in response to oncogene activation.

/

p53 anti-neoplastiline toime on peamiselt tingitudapoptoosi induktsioonist

p53 aktiveerib näiteks CD95 (Fas/APO1) ja mitmete Bcl-2 perekonna pro-apoptootilistegeenide transkriptsiooni.

p53-indutseeritud apoptoos kulgeb siiski peamiselt läbi mitokondriaalse tsütokroom cvahendatud kaspaaside aktivatsiooni.

·

·

/

p53 või/ja ARF knockout pärsib apoptoosi.

Pildid:Genes Dev. Oct 15, 1999; 13(20): 2670–2677

INK4a/ARF mutations accelerate lymphomagenesisand promote chemoresistance by disabling p53

E –myc hiired ekspresseerivad c-Myc B-rakkudes ja neil areneb välja B-rakulümfoom ja leukeemia

Ainult c-myci ekspressioontasakaalustatakse suuresti apoptoosiindutseerimise läbi

p53 või/ja - ARF knockout selles mudeliskiirendab oluliselt lümfoomi teket(joonisel: c,d,e).

· μ

·

·

/

Apoptoos

Apoptoosi mehhanismid: sisemine ja ligandvahendatud

Rakkude sisemine ( ) mehhanism käib üle tsütokroom c vabanemise mitokondrist jaindutseeritud mehhanism käib läbi surmaretseptorite või TNF ja TRAIL-i raja.

Vastusena apoptootilistele stiimulitele aktiveeritakse kõigepealt initsiaatorkaspaasid(kaspaas-2,-8,-9,-10) mis aktiveerivad omakorda effektor kaspaasid (kaspaas-3 või-7).

Kaspaaside kaskaadi aktiveerimine käivitab raku valkude proteolüütilise lagundamise jarakusurma.

·

·

·

/

Kaks apoptoosi rada

Allikas:BH3-only proteins in apoptosis at a glance

/

B cell lymphoma 2 (BCL-2) perekonna valgudPro- ja anti-apoptootiliste BCL-2 perekonna valkude tasakaal määrab mitokondriaalse rajaaktiveerumise.

BCL-2 valke klassifitseeritakse valgus olevate BH domäänide ( ) järgi.

Pro-apoptootilised BCL-2 valkude hulka kuuluvad valgud BIM (), BID ( ) ja BAD (

) ning multi BH domääne sisaldavad valgud BAX (), BAK ( ) ja BOK.

Anti-apoptootilised ( ) BCL-2, BCL-XL ( ) ja MCL-1 (), mis sisaldavad kõiki BH1-BH4 domääne.

Anti-apoptootilised valgud toimivad nii, et nad sekvesteerivad pro-apoptootilised valgud.

·

·

·

·

·

/

Allikas:Evading apoptosis in cancer

Apoptoosis osalevad valgud on vähis dereguleeritudVähis on apoptoosis osalevad geenid jageeniproduktid ülesse või alla reguleeritudkas

·

transkriptsiooni tasemel (sinisedkolmnurgad),

translatsiooni tasemel (punased) või

posttranslatsiooniliselt (rohelised).

-

-

-

/

BH3

GEEN

KO HIIRE FENOTÜÜP INIMESE VÄHK BH3 GEENI MUUTUSED

BIM lümfoid ja müeloid hüperplaasia mantelraku lümfoom, Burkitti

lümfoom

homosügootne deletsioon, promootori

hüpermetülatsioon, promootori mutatsioon

PUMA ­kiirguse resistentsus pea­kaela lamerakuline kartsinoom,

mitte­väikserakuline kopsuvähk

LOH

glioom, neuroblastoom, B­raku

lümfoom

vaigistamise kadu

melanoom vähenenud ekspressioon

ninaõõne­ ja mao kartsinoom miR­34a ekspressioon

NOXA normaalne ei ole muutunud

BMF progressiivne B­lümfoidne

hüperplaasia

Burkitti lümfoom ekspressioon

B­raku krooniline lümfotsüütne

leukeemia

ekspressioon

rinna­, kopsu­ ja käärsoole kasvaja lookuse 14q14.15 deletsioon

BAD ~norm; vähesel määral esineb

difuusset suure B­rakulist lümfoomi

käärsoole adenokartsinoom loss­of­function mutatsioon (BH3 domään)

γ

↑

↓

↑

/

BH3 valkude regulatsioon

Allikas:BH3-only proteins in apoptosis at a glance

/

Onkogeensed kinaasid reguleerivad MCL-1, BIM jaPUMA

Allikas:Evading apoptosis in cancer

/

Erinevad stiimulid indutseerivad erineva BH3-onlyrepertuaariSTIIMUL BH3 VALK

tsütokiinide nälg BIM, PUMA, BAD, HRK

proteasoomi inhibiitorid (Bortezomib) BIM, NOXA, BID, BIK

DNA kahjustused (kemoteraapia, ­kiirgus) BIM, PUMA, NOXA

glukokortikoidid (Dexamethasone) BIM, PUMA, BMF

türosiin kinaasi inhibiitorid (Gefitinib, Imatinib) BIM, BMF, BAD

HDAC inhibiitorid (Vorinostat) BIM, BID, BMF

ionomütsiin BIM

Paclitaxel BIM

forbool estrid (PMA) PUMA

γ

/

Apaf-1 vaigistamine melanoomis annab sellelekemoresistentsuse

Melanoomid kannavad sagedasti p53 geeni.

Apoptoos on neis supresseeritud läbiApaf-1 valgu ekspressiooni kadumise.

Apaf-1 vaigistamine toimub läbiepigeneetilise mehhanismi ja LOH-i.

DNA metülatsiooni või histoonideatsetüleerimist supresseerivad agendidon võimelised taastama Apaf-1ekspressiooni ja melanoomirakkudetundlikkuse kemoterapeutilisteleühenditele.

·

·

·

·

Pilt: Apaf-1 loss in metastatic melanoma. doi:10.1038/35051606

/

Vähirakud kasutavad erinevaid mehhanisme, et vaigistada apoptoosi masinavärk jakontrollimatult paljuneda. Selleks kasutavad nad Akt/PKB raja aktivatsiooni, anti-apoptootilisteBcl2 valkude üle-ekspressiooni, p53 inaktivatsiooni, pro-apoptootiliste geenide promootoritehüpermetüleerimist, tsütokroom c vabanemise pärssimist, kaspaaside inhibitsiooni.

/

Lingid teistele loengutele

Sissejuhatav loeng

Vähitüübid

Onkoviirused

Onkogeenid

Retseptorid

Signaalirajad

Tuumorsupressorgeenid

Rakutsüklikontroll

·

·

·

·

·

·

·

·

p53 ja apoptoos

Immortalisatsioon

Tumorigenees

Genoomiterviklikkus

Mikrokeskkond

Metastaasid

Immuunsus

Vähiravimid

·

·

·

·

·

·

·

·

/