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ヒトヒトヒトヒト再生医療の実現に再生医療の実現に再生医療の実現に再生医療の実現に向けた向けた向けた向けた

イヌイヌイヌイヌiPS細胞の細胞の細胞の細胞の創製創製創製創製

大阪府立大学大阪府立大学大阪府立大学大阪府立大学 大学院生命環境科学研究科大学院生命環境科学研究科大学院生命環境科学研究科大学院生命環境科学研究科 獣医学専攻獣医学専攻獣医学専攻獣医学専攻

教授教授教授教授 稲葉稲葉稲葉稲葉 俊夫俊夫俊夫俊夫

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自然発症例モデルとして

医学領域に応用できる

獣医療の発達ヒトと共通の疾患

ヒトと共通の生活環境

イヌゲノムの

解読完了

イヌ飼育頭数：1,035万頭イヌ飼育家庭：830万世帯

/5,450万世帯室内飼育率：約72%

イヌについてイヌについてイヌについてイヌについて

2014年

3

幹細胞

自己複製能

多分化能

神経神経神経神経肝肝肝肝 心筋心筋心筋心筋

血管内皮細胞血管内皮細胞血管内皮細胞血管内皮細胞

体性幹細胞 ES細胞

iPS細胞

自己の細胞から

細胞治療細胞治療細胞治療細胞治療

4

従来技術とその問題点従来技術とその問題点従来技術とその問題点従来技術とその問題点

担保

安

全性

有

効性

イヌiPS細胞

自然発症犬長期観察

ヒトiPS細胞

前臨床試験

マウスiPS細胞

疾患モデル

マウス短期観察

？ ？ ？

動物実験：マウスで得られた結果が

ヒトに当てはまるのか？

5

マウスとサルの中間の位置にある（形態、機能面で）マウスとサルの中間の位置にある（形態、機能面で）マウスとサルの中間の位置にある（形態、機能面で）マウスとサルの中間の位置にある（形態、機能面で）

ヒトと同様、生活習慣病などの自然発症があるヒトと同様、生活習慣病などの自然発症があるヒトと同様、生活習慣病などの自然発症があるヒトと同様、生活習慣病などの自然発症がある

イヌ サル

経費 中程度 高い

寿命 14年 25年

妊娠期間 60日 170日

産子数 8～12匹 1頭

取扱い 容易 困難

生活環境 ヒトと同じ空間

マウス

容易

6～8頭

20日

2年

安い

ヒトと類似の疾病 少ない

ヒトと異なる ヒトと異なる

自然発症して

抽出容易自然発症する

が抽出困難

イヌiPS細胞作製の意義

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・日本では10万人以上の脊髄損傷患者が存在

・毎年、5000～6000人以上が新たに発症

・日本においては人気犬種である

ミニチュアダックスフントの増加

に伴い、脊髄損傷の発症数が増加

重度の場合、効果的な治療法はない

脊髄損傷はヒトとイヌで共通の疾患である

軸索損傷

軸索再生

退縮/変性

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間葉系幹細胞間葉系幹細胞間葉系幹細胞間葉系幹細胞

神経細胞神経細胞神経細胞神経細胞

神経栄養神経栄養神経栄養神経栄養因子の産生因子の産生因子の産生因子の産生自己複製能自己複製能自己複製能自己複製能

肝細胞肝細胞肝細胞肝細胞

TGFβ-1 IL-6

（MSC）自家移植自家移植自家移植自家移植 他他他他家移植家移植家移植家移植

免疫抑制作用免疫抑制作用免疫抑制作用免疫抑制作用

組織傷害部位組織傷害部位組織傷害部位組織傷害部位への集積性への集積性への集積性への集積性

軟骨細胞軟骨細胞軟骨細胞軟骨細胞

脂肪細胞脂肪細胞脂肪細胞脂肪細胞

多分化能多分化能多分化能多分化能

骨細胞骨細胞骨細胞骨細胞

再生医療への応用に期待再生医療への応用に期待再生医療への応用に期待再生医療への応用に期待

体性幹細胞

8

骨髄単核細

胞を分離

Colony Forming Unit-Fibroblast

（CFU-F）

Colony Forming Unit-Fibroblast

（CFU-F）

骨髄吸引

骨 脂肪

100 µm10 µm

骨髄間質細胞の分離と性状

100 µm

神経幹細胞

9

イヌ重度脊髄損傷を伴った胸腰部椎間板ヘルニアの臨床例を対象

コントロール群（n = 13）、投与群（n = 10）に分けるコントロール群（n = 13）、投与群（n = 10）に分ける

1カ月ごとに6ヶ月間、運動および感覚機能を評価1カ月ごとに6ヶ月間、運動および感覚機能を評価

・ミニチュアダックスフント・椎弓切除術により脊髄を減圧し、

脊椎を固定

・術後1カ月の時点で運動および感覚

機能の改善が認められない

自己骨髄間質細胞によるイヌの重度脊髄損傷の治療

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投与方法投与方法投与方法投与方法

10% FBSのDMEMで培養

0.05% トリプシンEDTA

生理食塩水に懸濁

脳 脊髄 損傷部

第5-6腰椎間

自己骨髄間質細胞によるイヌの重度脊髄損傷の治療

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コントロール群コントロール群コントロール群コントロール群

（（（（n =13））））

投与群投与群投与群投与群

（（（（n =10））））

歩行の改善率 2/13（15.3%）

6/10（60.0%）

痛覚の改善率 0/13（0%）

1/10（10.0%）

・ 両群において、排尿、排便機能に改善は認められず

・ 投与群において、副作用は認められなかった。

運動および感覚機能の改善

a b

a vs b p < 0.05

自己骨髄間質細胞によるイヌの重度脊髄損傷の治療

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MSC

増殖能が低い増殖能が低い増殖能が低い増殖能が低い

採取時のリスク採取時のリスク採取時のリスク採取時のリスク

細胞の調整に細胞の調整に細胞の調整に細胞の調整に

時間がかかる時間がかかる時間がかかる時間がかかる

採取効率が低い採取効率が低い採取効率が低い採取効率が低い

ウイルスウイルスウイルスウイルス

微生物汚染微生物汚染微生物汚染微生物汚染

骨髄間質細胞の臨床応用における問題点

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DOX誘導性レンチウイルスによる初期化４遺伝子の導入

胎子線維芽細胞の培養

Klf4

Oct3/4

C-Myc

Sox2

DOX誘導性

レンチウイルスベクター

iPS細胞作製～継代維持

無血清培地で培養

フィーダー細胞上に播種

フィーダー細胞フィーダー細胞フィーダー細胞フィーダー細胞

イヌiPS細胞の作製

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核型解析核型解析核型解析核型解析 2n=78, XY型型型型

単一細胞コロニー単一細胞コロニー単一細胞コロニー単一細胞コロニー

正常な核型正常な核型正常な核型正常な核型三胚葉への分化能三胚葉への分化能三胚葉への分化能三胚葉への分化能

イヌイヌイヌイヌiPS細胞細胞細胞細胞

線維芽細胞線維芽細胞線維芽細胞線維芽細胞

Oct3/4Sox2Klf4

C-Myc

初期化因子初期化因子初期化因子初期化因子

胚様体 iPS細胞

GATA4内胚葉

中胚葉

外胚葉 TUJ1

DESMIN

胚様体胚様体胚様体胚様体

未分化マーカーの発現未分化マーカーの発現未分化マーカーの発現未分化マーカーの発現

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イヌiPS細胞からMSCへの分化誘導

浮遊培養浮遊培養浮遊培養浮遊培養

フローサイトメトリーフローサイトメトリーフローサイトメトリーフローサイトメトリー 免疫染色免疫染色免疫染色免疫染色

イヌイヌイヌイヌiPS細胞細胞細胞細胞 胚様体形成用培地胚様体形成用培地胚様体形成用培地胚様体形成用培地

胚様体を接着培養胚様体を接着培養胚様体を接着培養胚様体を接着培養

MSC分化培地分化培地分化培地分化培地

形態観察形態観察形態観察形態観察

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P1 P2 P5

継代に伴う細胞形態の比較

骨髄間質細胞骨髄間質細胞骨髄間質細胞骨髄間質細胞（BMSC）

扁平・大型化扁平・大型化扁平・大型化扁平・大型化

P1 P2 P5

iPS細胞由来細胞由来細胞由来細胞由来MSC様細胞様細胞様細胞様細胞

大きな変化なし大きな変化なし大きな変化なし大きな変化なし

イヌイヌイヌイヌiPS細胞から間葉系幹細胞への分化誘導細胞から間葉系幹細胞への分化誘導細胞から間葉系幹細胞への分化誘導細胞から間葉系幹細胞への分化誘導

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iPSiPSiPSiPS細胞由来細胞由来細胞由来細胞由来MSCMSCMSCMSC

特徴：

①細胞増殖能が高い

②比較臨床試験が可能

③有効性と安全性の検証が可能

考慮すべき点：

①導入遺伝子の安全性

②作製が困難

③高価

成体MSC特徴：

①複数の組織から採取可能

②細胞調整が容易

考慮すべき点：

①採取患者の多くは高齢者

で採取効率が低い

②採取時のリスク

③ウイルス・微生物汚染

④細胞増殖能が低い

⑤製品化が困難

新技術の特徴・従来技術との比較新技術の特徴・従来技術との比較新技術の特徴・従来技術との比較新技術の特徴・従来技術との比較

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間葉系幹細胞間葉系幹細胞間葉系幹細胞間葉系幹細胞

神経細胞神経細胞神経細胞神経細胞

神経栄養神経栄養神経栄養神経栄養因子の産生因子の産生因子の産生因子の産生自己複製能自己複製能自己複製能自己複製能

肝細胞肝細胞肝細胞肝細胞

TGFβ-1 IL-6

（MSC）自家移植自家移植自家移植自家移植 他他他他家移植家移植家移植家移植

免疫抑制作用免疫抑制作用免疫抑制作用免疫抑制作用

組織傷害部位組織傷害部位組織傷害部位組織傷害部位への集積性への集積性への集積性への集積性

軟骨細胞軟骨細胞軟骨細胞軟骨細胞

脂肪細胞脂肪細胞脂肪細胞脂肪細胞

多分化能多分化能多分化能多分化能

骨細胞骨細胞骨細胞骨細胞

再生医療への応用に期待再生医療への応用に期待再生医療への応用に期待再生医療への応用に期待

新技術の応用iPS細胞

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イヌiPS細胞の作製

目的の細胞へ分化

移植移植移植移植

再生獣医療への応用

ヒト再生医療への応用ヒト再生医療への応用ヒト再生医療への応用ヒト再生医療への応用獣医学領域への応用獣医学領域への応用獣医学領域への応用獣医学領域への応用

in vivoでの治療成績

実験動物使用の減少

難病の解明・治療

毒性試験への応用

想定される用途想定される用途想定される用途想定される用途

血液細胞へ分化

血液バンク

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iPS細胞の評価

iPS細胞株の樹立

効果的な分化方法の検討安全性の確保（腫瘍化の抑制）

免疫拒絶抑制（バンクの作製？）

分化細胞

③ウィルスを用いない方法

②最適な初期化因子

④高分化能の株を選抜

⑤確実に分化させる方法

①最適な体細胞

⑥動物実験

実用化に向けた課題実用化に向けた課題実用化に向けた課題実用化に向けた課題

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共同研究を希望する企業等・医薬、獣医薬、バイオ関連企業

・動物病院

・医学・獣医学系大学及び附属研究所等

企業への期待企業への期待企業への期待企業への期待

実用化に向けて・産学共同促進ステージなどへの共同申請

実用化後・製品化

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本技術に関する知的財産権本技術に関する知的財産権本技術に関する知的財産権本技術に関する知的財産権

• 発明の名称 ：イヌiPS細胞の製造方法• 出願番号 ：特願2015-123775• 出願人 ：大阪府立大学

• 発明者 ：稲葉俊夫、西村俊哉、

田中恵里菜、鳩谷晋吾、

杉浦喜久弥

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産学連携の経歴産学連携の経歴産学連携の経歴産学連携の経歴

• 2006年-2007年 JST シーズ発掘試験事業に採択• 2011年-2012年 JST A-STEP(FS探索)事業に採択• 2014年-2015年 JST A-STEP(FS探索)事業に採択

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お問い合わせ先お問い合わせ先お問い合わせ先お問い合わせ先

公立大学大阪府立大学

地域連携研究機構

産学官研究連携推進センター

知財マネジメントオフィス

統括コーディネーター 岡澤一秀

ＴＥＬ 072-254-9873 (内線)3510

ＦＡＸ 072-254-9849

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