Geneticky  modifikovaný  organizmus  

s  Geneticky  modifikovaný  organizmus  je  organizmus,  ktorého  genetický  materiál  bol  zmenený  spôsobom,  ktorý  sa  prirodzene  pri  pohlavnom  rozmnožovaní  a  prirodzenej  rekombinácii  nevyskytuje.  

s  Zásahy  do  genetického  materiálu  organizmov  môžeme  rozdeliť:  s  náhodné;  odrody  získané  pôsobením  mutagénov  -­‐  napríklad  

odrody  pšenice  získané  ožarovaním  ich  semien,  s  cielené;  získané  tak,  že  do  rastliny  vnesieme  alebo  v  nej  cielene  

deaktivujeme  nejaké  konkrétne  gény.  

s  70-­‐té  roky  20.  str.  

2  

http://ec.europa.eu/food/food/biotechnology/qanda/a1_en.htm#a  

Transgénny  organizmus  

s  Je  geneticky  modifikovaný  organizmus,  do  ktorého  bol  metódami  genetického  inžinierstva  prenesený  gén  z  iného  druhu  

3  

Geneticky  modifikované  rastliny  

s  Rastliny,  do  ktorých  bol  za  pomoci  Agrobacterium  tumefaciens  vnesený  gén  pre  odolnosť  proti  herbicídom  alebo  pre  produkciu  insekticídov  (napr.  bt-­‐kukurica)  

4  

http://www.efsa.europa.eu/en/panels/gmo.htm    

5  

Biotechnologické  plodiny  

6  

Hlavné  znaky  GMO  rastlín  

s  Tolerancia  na  herbicídy  (71%)  

s  Rezistencia  na  hmyz  (28  %)  

s  Kvalitatívne  znaky  (1%)  

7  

Hlavné  znaky  GMO  

8  

Hlavné  plodiny  

s  Sója    

s  Kukurica    

s  Bavlna  

s  Repka  

s  Zemiaky    

9  

Hlavné  krajiny  

10  

Zákaz  kultivácie  GMO  

s  Šesť  členských  štátov  EU  v  súčasnosti  uplatňuje  ochranné  ustanovenia  pre  GMO:  s  Rakúsko  s  Francúzsko  s  Grécko  s  Maďarsko  s  Nemecko  s  Luxembursko  

11  

EU  register  geneticky  modifikovaných  potravín  a  krmív  

s  Kukurica  (23)  

s  Bavlna  (7)  

s  Soja  (3)  

s  Repka    olejná  (3)  

s  Cukrová  repa  (1)  

s  Zemiaky  (1)  

12  

http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm      

GMO    v  Europe  a  na    Slovensku  

s  http://www.gmo.sk/sk/?page=38  

s  Max.  0,9%  

s  Max.  Korea  3%  

s  Max.  Japónsko/Korea    5%  

13  

Produkty uvedené na trh podľa smernice

2001/18/ES

Použitie

Používateľ

Štát podania žiadosti

Rozhodnutie

Komisie

poznámka

Kukurica Roundup Ready NK603 tolerantná k herbicídom s účinnou látkou glyfosát

dovoz a spracovanie,

nie pestovanie

Monsanto

Španielsko

2004/643/ES

Kukurica MON 863 odolná voči hmyzu Diabrotica (kukuričiar koreňový)

dovoz a spracovanie,

nie pestovanie

Monsanto

Nemecko

2005/608/ES

Povolená aj ako potravina - rozh. Komisie 2006/68/ES (ešte podľa nariadenia 258/97).

Repka línia GT 73 tolerantná k herbicídom s účinnou látkou glyfosát

dovoz a spracovanie,

nie pestovanie

Monsanto

Holandsko

2005/635/ES

Kukurica línia 1507 Odolná voči hmyzu Lepidoptera (zavíjač kukuričný) a tolerantná k herbicídom s účinnou látkou glufosinát

dovoz a spracovanie do

krmív, nie pestovanie

Pioneer / Mycogen

Holandsko

2005/772/ES

Povolená aj ako potravina - rozh. Komisie 2006/197/ES (ešte podľa nariadenia 258/97). V Španielsku podaná žiadosť (podľa smernice) na pestovanie.

Kukurica MON 863 x MON 810 odolná voči škodcom Diabrotica a Lepidoptera

dovoz a spracovanie,

nie pestovanie

Monsanto

Nemecko

2006/47/ES

Povolenie aj podľa nariadenia 1829/2003: rozhodnutie Komisie 2010/140/EÚ

Repka línia Ms8, línia Rf3 a Ms8xRf3 tolerantná k herbicídom s účinnou látkou glufosinát

dovoz a spracovanie semien,

nie pestovanie

Bayer

Belgicko

2007/232/ES

Klinček línia 123.2.38 Moonlite zmenená farba kvetu

dovoz rezaných

kvetov

Florigene

Holandsko

2007/364/ES

Klinček línia 123.2.12 Moonaqua zmenená farba kvetu

dovoz rezaných

kvetov

Florigene

Holandsko

2009/244/ES

Zemiak EH92-527-1 vysoký obsah amylopektínu, obchodný názov Amflora

pestovanie a spracovanie na výrobu technického

škrobu

BASF Plant Science (predtym Amylogene)

Švédsko

2010/135/EU

Zvyšky možu byť použité ako krmivo na základe rozhodnutia 2010/136/EU vydaného podľa nariadenia 1829/2003.

14  

GMO    v

 Eur

ope    

15  

GMO    n

a    Slove

nsku

 

Metódy  genetických  modifikácií  

s  Pre  prípravu  transgénnych  rastlín  sa  používajú  dve  základné  metódy:  s  transformácia  pomocou  agrobaktérie    s  “nastrelenie”  DNA  do  bunkového  jadra  

16  

Ako  pripraviť  transgénny  organizmu  

http://cls.casa.colostate.edu/TransgenicCrops/animation.html  

 

17  

1.  Prehľad  procesu  

3.  Klonovanie  génov  Baktéria  

2.  Izolácia  DNA  

4.  Výber                    génov  

5.  Transformácia  a  kultivácia  

6.  Kríženie  rastlín  

Klónovanie  génov  

18  

Klonovanie  je  proces  využívaný  na  lokalizáciu  a    vytvorenie  kópií  špecifického  génu  v  genomickej  DNA  daného  organizmu.  

Táto  baktéria  má    jeden  gén    

(červený  segment),  ktorý  chceme  klonovať  do  iného  organizmu.  

Izolácia  DNA  

http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/index.php#Anchor-­‐Biological-­‐3800    

Klónovanie  génov  

19  

Štiepenie      DNA    

Štiepenie    plazmidovej  

DNA  

Rovnaká  restrikčná    endonukleáza  

EcoRI:  CAATTC  

20  

21  

Klónovanie  génov  

22  

Štiepenie      DNA    

Štiepenie    plazmidovej  

DNA  

Rovnaká  restrikčná    endonukleáza  

Zmiešanie  a  ligovanie  pomocou  ligázy  

Vytvorenie  rekombinantnej  

DNA  

Klónovanie  génov  

23  

Vytvorenie  rekombinantnej  

DNA  

Transformácia  baktérií  

Kultivácia  na  pôde  s  ATB  

Klónovanie  génov  

24  

Kultivácia  na  pôde  s  ATB   Bakterie  s  rekombinantnou  DNA  porastú    

=    máme  génovú  knižnicu  

Selekcia  hľadaného  klonu  

Klónovanie  génov  

25  

Pomnoženie  vybraného  klonu  bakterií  s  rekombinantnou  

DNA  

Selekcia  hľadaného  klonu  

Preočkovanie  hľadaného  klonu  

Metódy  genetických  modifikácií  

s  Pre  prípravu  transgénnych  rastlín  sa  používajú  dve  základné  metódy:  s  transformácia  pomocou  agrobaktérie    s  “nastrelenie”  DNA  do  bunkového  jadra  

26  

Agrobacterium  tumefaciens    (starý  názov:  Rhizobium  radiobacter)  

s  G-­‐,  nesporulujúca  tyčinkovitá  baktéria  

s  Nachádza  sa  v  rizosfére    

s  Vyvoláva  tvorbu  nádorov  u  viac  než  140  druhov  dvojklíčnych  rastlín  

27  Ricín  obyčajný  

Agrobacterium  tumefaciens    

s  Pri  transformácii  pomocou  baktérie  Agrobacterium  tumefaciens  sa  využíva  prirodzená  schopnosť  tejto  patogénnej  baktérie  prenášať  určité  gény  z  tzv.  Ti  (Tumor  inducing)  plazmidu  do  genómu  rastliny.  

s  Tieto  gény  prinútia  rastlinu  vytvoriť  nádor  a  syntetizovať  špeciálne  aminokyseliny,  ktorými  sa  potom  baktérie  živia.  

s  Takto  napadnuté  rastliny  sú  prirodzene  transgénnymi  rastlinami  

28  

Ti  (Tumor  inducing)  plazmid    

s  Stráca  sa  z  buniek  ak  rastú  pri  >280C  

s  Má  dva  typy  génov:  s  Onkogénne  gény  

zodpovedné  za  syntézu  auxínov  (rastlinné  hormóny)  a  cytokínov  –  za  vznik  nádoru  

s  Gény  kodujúce  syntézu  opinov  –  sú  pre  baktériu    zdrojom  dusíku  a  energie  

29  

Ti  (Tumor  inducing)  plazmid    

s  T-­‐DNA  oblasť    je  zodpovedná  za  inzerciu  DNA  do  chromozómu  a  za    nádorovú  transformáciu  buniek    

s  Gény  potrebné  k  transferu  plazmidu  sú  mimo  T-­‐DNA  oblasti  

30  

Využitie  Ti  plazmidu  na  prípravu  transgénnych  rastlín    

31  

Infekcia  rastlinných  buniek  

32  

s  Klonovaný  gén  je  vložený  do  vektora  (Ti  plazmid),  v  ktorom  je  aj  markerový  gén  (identifikácia  transformantov)  -­‐  spektinomycín  

s  Rekombinantný  plazmid  je  vnesený  do    A.tumefaciens,  ktorými  sú  následne  infikované  rastlinné  bunky  

s  Bunky  sú  kultivované  v  in  vitro  podmienkach  

s  Výsledok:  rastlina,  ktorá  má  v  každej  bunke  inkorporovaný  nový  gén  

Transformácia    rastlinných  buniek  pomocou  nastreľovania  

33  

s  Klonovaný  gén  je  naviazaný  na  častice  zlata  

s  Tieto  sú  nastrelené  do  rastlinnej  bunky,  prechádzajú  do  jadra,  kde  sa  uvoľnujú  a  rekombinantný  gén  sa  včlení  do  chromozómu  

s  Bunky  sú  kultivované  v  in  vitro  podmienkach  

s  Výsledok:  rastlina,  ktorá  má  v  každej  bunke  inkorporovaný  nový  gén  

Kríženie  rastlín  

s  Transgenná  rastlina  sa  kríži  s  normálnou  rastlinou  prostredníctvom  opelenia  

s  Výsledok:  transgénny  hybrid  

34  

Modifikácia  génu  

35  

Modifikácia  génu  

36  

V  molekule  DNA  sú  tisícky  génov  

Jeden  gén  (tri  oblasti)  

Modifikácia  génu  

37  

Ø  Promotor  je  časť  génu,  na  ktorú  sa  viaže  RNA  polymeráza  Ø  Funguje  na  princípe  “on-­‐of”  Ø  Určuje  množstvo  kópii  mRNA  t.j.    v  akom  množstve  sa  

bude  daný  proteín    syntetizovať  Ø  Určuje,  kedy  sa  bude  daný  proteín    syntetizovať  (celú  

sezónu  alebo  len  určitú  dobu)  Ø  Určuje,  kde  sa  bude  daný  proteín    syntetizovať  (v  každom  

pletive  alebo  iba  v  niektorých  častiach  rastliny)  

Modifikácia  génu  

38  

Kódujúca  časť  určuje,  ktorý  proteín  sa  bude    syntetizovať  

Modifikácia  génu  

39  

Terminačná  sekvencia  (terminátor)  signalizuje  koniec  génu.    

RNA  polymeráza  sa  oddelí  od  vlákna  DNA    

Modifikácia  génu  

40  

Génový  inžinieri  môžu  zmeniť  alebo  nahradiť    ktorúkoľvek  časť    daného  génu  za  tým  účelom,  

aby  zabezpečili    expresiu  daného  génu  v  rastlinných  bunkách  

Príklady  modifikácie  rastlín    

41  

Hlavné  ciele  pri  príprave    GMO  rastlín  

s  Tolerancia  na  herbicídy  (71%)  

s  Rezistencia  na  hmyz  (28  %)  

s  Kvalitatívne  znaky  (1%)  

42  

Bt  proteín    (CrylA  proteín)  

s  Prirodzene  sa  nachádza  v  Bacillus  thuringiensis  a  je  toxický  pre  víjačku  kukuričnú  (Ostrinia  nubilalis)  

43  

Víjačka  kukuričná    (Ostrinia  nubilalis)  

s  Vijačka  kukuričná  je  motýľ,  ktorý  patrí  k  významným  škodcom  kukurice.  

s  Larvy  škodcu  vyžierajú  do  stebiel  kukurice  chodby  a  zvonka  na  steblách  pozorovať  trus.  Steblá  sa  v  dôsledku  poškodenia  často  lámu.  Okrem  stebiel  larvy  môžu  poškodzovať  aj  šúľky.    

s  Zníženie  úrody  kukurice  spôsobené  vijačkou  kukuričnou  dosahuje  pri  50%  napadnutých  rastlín  10%  a  pri  80%  napadnutých  rastlín  takmer  20%.    

s  Ak  je  napadnutých  80-­‐100%  rastlín,  zníženie  úrody  môže  byť  väčšie  ako  30%.  

44  

http://www.floraservis.sk/vijacka-­‐kukuricna.php  http://carozahrady.sk/skodce/vijackakukuricna.html  

   

Modifikácia  Bt  génu  Promótor     Kódujúca  oblasť   Terminačná  sekvencia  

35S  AGATTACA  

Bt.  CrylA  GTCAGCTTATGCCAT  

ACCGATACGTTACA  

Bt.  CRY  9  CAAGTAAGTGCCAAT  

45  

s  Kukurica,  ktorá  nesie  gén  pre  Bt  proteín  môže  ho  expresovať  v  každej  bunke:    s  Bt  gén  je  klonovaný  spolu  s  promótorom  génu  

mozaikového  vírusu  karfiolu  

Bt-­‐  toxín  Bacillus  thuringiensis    

Modifikácia  Bt  génu  Promótor     Kódujúca  oblasť   Terminačná  sekvencia  

Bt.  CrylA  GTCAGCTTATGCCAT  

ACCGATACGTTACA  

PEP  KARBOXYLÁZA  GACCTTACA  

Bt.  CRY  9  CAAGTAAGTGCCAAT  

46  

s  Kukurica,  ktorá  nesie  gén  pre  Bt  proteín  môže  ho  expresovať  iba  v  zelenom  tkanive  :      s  Bt  gén  je  klonovaný  spolu  s  promótorom  rastlinného  

génu  kódujúceho  fosfoenolpyruvatovú  (PEP)  karboxylázu      s  Bt  proteín  s  PEP  promótorom  je  aktívny  iba  v  zelenom  

pletive  rastlín  s  Na  konci  sezóny  rastliny  s  takýmito  Bt  génmi  nebudú  

mať  tento  endotoxín  na  zrne  

Bt-­‐  toxín  Bacillus  thuringiensis    

Rezistenciu    na  Roundup  

47  

s  Roundup  je  herbicíd  –  likviduje  listy,  výhonky  aj  korene.  

s  Gén  pochádza  z  pôdnych  agrobaktérií,  ktoré  sú  prirodzene  rezistentné  na  Roundup  

Modifikácia  génu  zabezpečujúceho  

rezistenciu  na  Roundup  

Promótor     Kódujúca  oblasť   Terminačná  sekvencia   35S  

AGATTACA  Rezistencia  na  ROUNDUP  

TTTGGCTTTACCTTT  

  ACCGATACGTTACA  

48  

s  rastlina,  ktorá  nesie  gén  klonovaný  spolu  s  promotorom  35S    bude  rezistentná  po  celú  dobu.  

s  Gén  je  expresovaný  v  každej  bunke.  

Prečo  robiť  detekciu  GMO?  

s  Slobodný  výber  pre  konzumenta  

s  Súlad  s  nariadeniami  EU  

   

49  

50  

Detekcia  GMO  

51  http://passel.unl.edu/pages/informationmodule.php?idinformationmodule=1081367867&topicorder=2&maxto=8&minto=1  

Vložený  nový  gén          

Tvorba  nových  proteínov      

Genomická  DNA  

Zmena  vlastností  rastliny  alebo  semien    

Analýza    DNA  -­‐  genotyp  

Analýza    proteínov  -­‐  fenotyp  

GMO  Detection  method  Database  (GMDD)    http://gmdd.shgmo.org/index/search  

Metódy  detekcie  GMO  

52  

s  Analýza  biologických  vlastností  -­‐  biotesty  s  Testovanie  rezistencie  na  herbicídy  

s  Analýza  fenotypu  s  Metódy  založené  na  proteínoch  

s  ELISA  s  Imunochromatografia  -­‐  strip  testy  

s  Analýza  genotypu  s  Metódy  založené  na  DNA  amplifikácii  

 

Analýza  biologických  vlastností  -­‐  biotesty  

53  

s  Klíčenie  semien    

s  Sprejový  test  s  herbicídmi  

s  Obvykle  sa  testuje  200-­‐400  semien  s  Jednoduché  s  Lacné    

s  Vyžadujú  čas  s  Ťažká  interpretácia  

Detekcia  proteínov  v  rastlinách  

s  Výber  je  daný:  s  Ktorý  proteín  nás  zaujíma?  s  V  ktorej  časti  rastlín  je  prítomny?  s  V  ktorom  vývojovom  štádiu  rastliny  je  tvorený?  

54  

Detekcia  proteínov  v  rastlinách  

s  ELISA  s  Sendvičová  ELISA  

s  http://www.youtube.com/watch?v=Tp61S-­‐2F2B4&feature=related  

s  http://www.youtube.com/watch?v=70TPrfL_8-­‐M&feature=relmfu  

s  Stripové  testy  s  Lateral  Flow  Strip  Test  

s  http://passel.unl.edu/pages/informationmodule.php?idinformationmodule=1081367867&topicorder=7&maxto=8&minto=1  

55  

Stripové  testy  na  GMO  

56  

http://www.seedburo.com/productDetail.asp_Q_catID_E_517_A_subCatID_E_2583_A_productID_E_3182_A_Trait_GMO_E_Trait_GMO    

DNA  metódy  

s  Kvalitatívne  PCR  

s  Kvantitatívne  RT-­‐PCR  

s  Alternatívne  metódy  s  DNA  čípy  s  Biosenzory    

57  

http://gmdd.shgmo.org/index/search    http://www.seedtest.org/upload/cms/user/5EnricoNoli.pdf    

GMO  Detection  method  Database  (GMDD)    http://gmdd.shgmo.org/index/search  

s  Hlavné  PCR  stratégie  na  identifikáciu  GMO  -­‐  hľadávanie    s  Screening  GMO  

s  Modifikovaných  génov  

s  Špecifických  konštruktov  

s  Častí  špecifických  pre  GMO  

58  

Multiplex  PCR  

59  

Princíp  microarray  

60  

Vzorka  

Extrakcia  DNA  

PCR    so  značenými  primermi  

(multiplex)  Proby  uchytené  na  

sklíčku  

Hybridizácia  

Detekcia  

61  

(1)  DNA  is  extracted  from  leaves  or  powder.    (2)   A  PCR  amplification  is  performed  with  consensus  primers.  During  this  amplification,  the  DNA  is  labelled  with  biotin.    (3)  Capture  probes,  complementary  of  the  amplified  sequences,  are  grafted  on  a  chemically  treated  glass  slide.    (4) The  amplified  product  is  laid  down  on  the  biochips.  The  amplified  sequences  will  hybridize  with  their  complementary  

capture  probes.    (5)   After  the  washing  steps,  the  biotinylated  sequences,  which  stay  hybridized  on  the  capture  probe,  are  detected  by  a  

colorimetric  technique  (streptavidin  conjugated-­‐  nanogold  particles,  silver  salt  precipitation,  SilverquantÒ  reagent).    (6)   Comparison  of  the  hybridization  pattern.  

62  

GMO  Chip    

63  

The  first  class  was  capture  probes  specific  for  the  GMOs  The  second  class  of  capture  probes  (‘‘Plant  GMOchip’’)  allowed  the  specific  identification  of  five  plant  species,  i.e.  kukurica,  sója,  repka,  paradajky  a  cukrová  repa  The  third  class  was  named  ‘‘Screening  GMO-­‐  chip’’  Four  capture  probes  specifically  hybridize  with  DNA  elements  often  occurring  in  GMOs,  i.e.  CaMV  35S  promoter,  nos  terminator,  nptII  and  pat  genes.    

Vyhodnotenie  

64  

Porovnanie  testov  Metóda   Vhodnosť     Časová  

náročnosť  Výhody     Nevýhody    

PCR   Detekcia  Identifikácia    Kvantifikácia    

5  –  7  dní   Veľmi  citlivé  a  presné,    Kvalitatívne  a  kvantitatívne  meranie  cieľovej  DNA  sekvencie    

Nákladné,  vyžadujúce  špeciálne  vybavenie  a  skúsený  personál    

ELISA   Špecifická  identifikácia    

2  –  4  dní   Rýchle,  menej  nákladné  ,  kvantitatívne  stanovenie  hladiny  proteínov  

Neumožňujú  detekciu  denaturovaných  proteínov,  nemôžu  identifikovať  GM  vzorky  v  ktorých  sa  nachádza  ?  

Strípové  testy  

Špecifická  identifikácia    

10  –  20  minút   Rýchle,  kvalitatívna  stanovenie  prítomnosti  alebo  neprítomnosti  hľadaného  proteínu  

Nie  sú  na  kvantifikáciu,  nemôžu  identifikovať  GM  vzorky  v  ktorých  sa  nachádza  ?  

Biotesty  na  herbicídy  

Špecifická  identifikácia    

7  –  10  dní   Nie  sú  nákladné,  veľmi  presné,  identifikácia  plodína  semien    

Iba  životaschopné  semená  môžu  byť  testované  Iba  detekcia  tolerancie  na  herbicíd  

65  

Leena  Tripathi:  Techniques  for  detecting  genetically  modified  crops  and  products.    African  Journal  of  Biotechnology  Vol.  4  (13),  pp.  1472-­‐1479,  December,  2005,    

Dôležité  www  stranky  o  GMO  

s  http://www.gate2biotech.com/agbios/  

s  http://www.cera-­‐gmc.org/?action=gm  

s  http://gmdd.shgmo.org/  

s  http://www.gmo-­‐compass.org/eng/home/  

s  http://www.crl.edu/  

Ďakujem  Vám  za  pozornosť  

67