GUÍA PRÁCTICA DE: PARASITOLOGÍA - ORAS - CONHU Anexo 17q...El hombre es huésped de cientos de especies de parásitos, sin contar a los virus, bacterias y hongos que en general

Curso para Microscopistas - Malaria. Proyecto “Control de Malaria en las Zonas Fronterizas de la Región Andina:

Un Enfoque Comunitario”

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GUÍA PRÁCTICA DE: PARASITOLOGÍA Generalidades El hombre es huésped de cientos de especies de parásitos, sin contar a los virus, bacterias y hongos que en general las especies de éstos son también parásitos en su mayoría. La parasitología se inicia con el hallazgo de los parásitos por el hombre, hecho que tiene su origen en los tiempos más remotos de la humanidad. Pero quizá el nacimiento real de la parasitología se inicia en la época de Leeuwenhoeck con el invento del microscopio. Se sabe que las enfermedades parasitarias han producido a través de los tiempos más muertes y daño económico a la humanidad que todas las guerras juntas. Generalmente en los países con poco desarrollo socioeconómico es en donde las enfermedades parasitarias y la parasitosis se presentan con mayor frecuencia, viéndose favorecido esto por las condiciones climáticas cálidas o templadas y por la falta de cultura médica en el pueblo, ya que en los países desarrollados social, médica y económicamente, las enfermedades parasitarias han sido erradicadas o tienen muy poca significación. La República del Ecuador, debido a su diversidad geográfica y al desigual desarrollo económico, presenta frecuencias variables de enfermedades parasitarias en las diferentes regiones. Dentro de la parasitosis en que juegan un papel los transmisores biológicos, el paludismo, sin duda, la más importante y sigue requiriendo de medidas preventivas y de vigilancia epidemiológica. Ecología del Parasitismo El parasitismo que es principalmente el resultado de las interrelaciones entre dos seres vivos, uno de ellos denominado parásito y el otro huésped, hospedero o mesonero, también es influido por las interacciones de los seres vivos antes mencionados y el medio ambiente, interacciones que constituyen la ecología del parasitismo. De acuerdo con el número de especies animales que les pueden servir de reservorios, a los parásitos los podemos dividir en: Intermediario: Es el que alberga las formas inmaduras o asexuadas del parásito, por ejemplo: el cerdo para Trichinella spiralis, el hombre para Plasmodium. Definitivo: Es el que alberga las formas sexualmente maduras del parásito, ejemplo; el mosco Anopheles para Plasmodium. Reservorio: En este huésped se garantiza la supervivencia del parásito en la naturaleza. Transmisor: Que transfiere activamente al parásito de un huésped a otro.



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Si nos referimos al concepto necesidad al parasitismo se le puede nombrar como: Accidental: En el que el parásito normalmente desarrolla vida libre. Facultativo: En el que el parásito también puede hacer vida libre. Obligatorio: En este caso el parásito siempre está sobre o dentro de su huésped. Si se toma en consideración la ubicación del parásito resulta él: Ectoparatismo: Cuando el parásito se encuentra en el superficie del huésped como sucede con los piojos y el hombre. Endoparasitismo: Cuando el parásito invade el interior del huésped. Intracelular: El parásito crece y se reproduce en el interior de las células. Extracelular: El parásito crece y se reproduce en cavidades o espacios intercelulares como sucede con Entamoeba histolytica cuando se encuentra en la luz del intestino humano. Errático: El parásito se encuentra en localización no habitual como Áscaris Lumbricoides cuando parasita riñones.

Dinámica De Transmisión

Transmisión: En las infecciones parasitarias, es la acción de transferir formas infectantes del parásito de un huésped a otro, dando como resultado la infección del segundo. La infección se efectúa por contacto directo, por fomites o por transmisores. Un fomite, es la causa que excita o promueve una cosa; es todo agente físico que transportando mecánicamente a los agentes infectantes, efectúa la transmisión del agente infectante.

Los transmisores son generalmente animales artrópodos, que realizan o participan activamente en la transferencia de formas infectantes de un huésped a otro, dando lugar a la transmisión. Existen varios tipos de transmisores tomando en consideración la evolución del parásito en él, así tenemos a:

Transmisor mecánico: (El parásito se reproduce en el transmisor) como es el caso de moscas y cucarachas que solo transportan en sus pelos y cuerdas a los agentes infectantes;

Transmisor Biológico desarrollativo: (Si el parásito sufre metamorfosis) como los simúlidos para Onchocerca volvulus.

Si el parásito se reproduce dentro del transmisor, entonces será un transmisor biológico reproductivo, como es el caso del Tripanosoma cruzi dentro de las triatomas. Sí además de



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reproducirse dentro del transmisor los parásitos también sufren un ciclo, entonces será Transmisor biológico ciclo reproductivo, como el mosquito Anopheles, para los Plasmodium.

Mecanismos De Transmisión: El agua es fundamental en la distribución de ciertas formas infectantes, Por aspiración de gotitas de Pflügger se puede transmitir Pneumocistis carinii y Toxoplasma gondii, en cambio con el polvo, aunque no es tan importante, pueden transmitirse quistes de protozoos y huevos viables de helmintos.

A través de las mucosas se puede llevar a cabo la transmisión de protozoos como Entamoeba gingivalis, Trichomonas tenax por contacto directo o por medio de transmisiones sanguíneas se pueden producir infecciones con Plasmodium sp. Y Tripanosoma cruzi. La vía cutánea puede ser utilizada como salida o como entrada de los parásitos, ya sea por esfuerzo propio o por medio de un artrópodo transmisor.

Así mismo, existen helmintos parásitos, son incapaces de continuar el desarrollo; sin embargo, sobreviven y se mueven a través de las capas cutáneas por considerables períodos de tiempo, pudiendo ser verdaderos miembros de la comunidad cutánea por tiempos indefinidos, en donde originan alteraciones de distinta naturaleza, con frecuencia infecciosa secundaria



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GUÍA PRÁCTICA DE: BIOSEGURIDAD

Generalidades: La bioseguridad está formada por un conjunto de medidas probadamente eficaces para reducir el riesgo de la adquisición accidental de infecciones con patógenos contenidos en las muestras, así como los riesgos relacionados con la exposición a agentes químicos, físicos o mecánicos a los que está expuesto el personal en los laboratorios. Sólo si las personas que trabajan en los laboratorios conocen las normas de bioseguridad y las aplican, pueden determinar su propia seguridad, la de sus compañeros y la de la colectividad. El personal de laboratorio debe cumplir con las normas de bioseguridad y los directivos de la institución deben cumplir con brindar las facilidades para que estas normas sean aplicadas. Objetivo: Repasar los principios generales de Bioseguridad, las directrices en materia de Bioseguridad y Bioprotección en el laboratorio. Medidas De Bioseguridad: Trabajar en un laboratorio y más aun en la toma de muestra aumenta el riesgo de enfermar por la exposición a los agentes biológicos, sea a través de accidentes con agujas o materiales cortopunzantes contaminados, aerosoles, manejo de material contaminado o por falta de vacunación. El personal involucrado en los diferentes procesos para el diagnóstico de malaria debe aplicar las medidas de bioseguridad. Se deben controlar las medidas necesarias, aplicables a:

• El personal. • La vestimenta. • Los ambientes. • La obtención de muestras. • El envío de muestras al laboratorio. • Los casos de accidentes. • El laboratorio.

Medidas De Protección:

• Lavarse las manos cada vez que sea necesario. • Los objetos afilados y punzantes deben manejarse con sumo cuidado. • Desinfectar, esterilizar o descartar adecuadamente los instrumentos después de

usarlos. • Usar guantes cada vez que maneje sangre o productos de sangre así como mascarilla,

bata de protección, según los requerimientos de cada procedimiento. • Cubrir cualquier corte o abrasión de las manos con adhesivos. • Cuidar de punzarse con cualquier instrumento agudo que haya estado en contacto con

sangre. • Nunca utilizar lancetas o agujas más de una vez.



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• Cualquier material contaminado con sangre, deberá ser colocado en un envase con cloro o hipoclorito de sodio al 5%, y luego para mayor seguridad disponer su entierro o incineración.

Práctica: En grupos de dos personas realizaran la evaluación de los siguientes parámetros durante el desarrollo de las siguientes prácticas:

• Toma de una muestra de sangre con una lanceta para preparar un frotis o gota gruesa HOJA DE EVALUACION Sí No A

veces No es

necesario Se lava las manos cada vez que es necesario Usa guantes, mascarilla, bata de protección, anteojos de protección, según los requerimientos de cada procedimiento

Muy bien

Bien Regular Mal

Como maneja objetos afilados y Punzantes Se cuida de punzarse con cualquier instrumento agudo que haya estado en contacto con sangre

Utiliza lancetas o agujas más de una vez Utiliza soluciones desinfectantes como hipoclorito de sodio al 1%, fenol al 5%, peróxido de hidrógeno al 6%, glutaraldehído, formaldehído, etc.

Utiliza recipientes para el descarte de residuos y /material desechable

Limpia el o los equipos antes y después de utilizarlos Conclusiones: Discutir los resultados de la evaluación anterior en base a la experiencia personal de cada participante y en relación a las Normas de Bioseguridad Referencias: 1. Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos de laboratorio para el Diagnostico de Malaria. Serie de Normas Técnicas No 39. Lima 2003. 2. Normas de Bioseguridad (Serie Normas Técnicas No 18), INS 3. Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, OMS, 2005



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GUÍA DE PRÁCTICA:

CICLO DE VIDA DEL PLASMODIUM ESQUIZOGONIA (Hombre) Esta fase se realiza en el Hombre y empieza cuando los esporozoitos son inoculados por el mosquito al alimentarse de la sangre de una persona sana, los mismos que llegan al hígado en aproximadamente 30 minutos. Transportados por la circulación sanguínea, sin que se endociten en célula alguna, todos han tenido oportunidad de transitar por el parénquima hepático donde penetran en hepatocitos. Esto se debe a que estas células expresan en su membrana receptores específicos para la proteína circunsporozoíta que los invasores exponen en gran cantidad en su superficie. Aquí los esporozoitos inician un Ciclo Hepático que demora aproximadamente de 6 a 14 días según la especie del Plasmodium y la respuesta inmune del huésped. Fase Hepática, pre-eritrocítica o exo-eritrocítica: Conocido como ciclo preeritrocítico, ciclo exoeritrocítico, ciclo tisular. Los esporozoitos ingresados en los hepatocitos inician un proceso de crecimiento ( trofozoitos exoeritrocíticos), que una vez completado, inician una reproducción asexuada empleando una de las modalidades que poseen exclusivamente los protozoos apicomplexos para realizar este tipo de multiplicación, por endogenia, que les permite generar una cantidad cuantiosa de descendientes (merozoítos exoeritrocíticos o merozoítos tisulares). Finalizada la reproducción, estallan los hepatocitos que los albergaban, obviamente habían incrementado su tamaño durante el proceso, y los merozoítos tisulares liberados invaden la sangre circulante para efectuar la siguiente fase del ciclo evolutivo. Cabe agregar que mientras se lleva a cabo este ciclo en los hepatocitos, no se detecta ninguna manifestación inflamatoria en el hígado ni otras alteraciones histológicas especiales. Fase hematica o eritrocítica: Los merozoitos tisulares que se han volcado a la sangre rápidamente se internalizan en eritrocitos (requieren unos 20 segundos para lograrlo). Una vez internalizados, los parásitos inmediatamente adquieren forma esférica con una gran vacuola digestiva central. Este estadio recibe el nombre de trofozoito anular debido a la imagen que brinda cuando se los observa microscópicamente en frotis sanguíneos teñidos con



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los métodos comúnmente usados en Hematología: una banda citoplasmática delgada con la forma de una circunferencia teñida de azul-celeste, que rodea a la vacuola central, la que no toma ningún color, y un pequeño núcleo con la forma de un gránulo de color rojo, localizado en cualquier sitio de la banda citoplasmática. Semeja un anillo con una piedra engarzada. Este trofozoito, en cuestión de pocas horas, pierde esta morfología debido a que crece hasta ocupar prácticamente todo el glóbulo rojo (trofozoito maduro). En este punto, comienza el proceso de reproducción por esquizogonia, o sea, el núcleo sufre una serie de divisiones binarias sucesivas sin que simultáneamente acontezcan divisiones del citoplasma llamado esquizonte. Completada las divisiones nucleares, recién surge la partición del citoplasma, una porción para cada núcleo, quedando así conformados organismos independientes, los merozoítos sanguíneos o merozoítos eritrocíticos, los que a continuación provocan el estallido del eritrocito. Los merozoítos liberados invaden nuevos eritrocitos para repetir la esquizogonia. El número de veces que se reitera este proceso depende de varios factores, básicamente los relacionados con la especie y cepa de plasmodio involucrado y con la capacidad de respuesta defensiva del hospedador. Después de varias y sucesivas esquizogonias eritrocíticas, comienzan a aparecer parcelas de merozoítos que, después de invadir eritrocitos, poseen la cualidad genética de transformarse en gametocitos (microgametocitos los masculinos y macrogametocitos los femeninos). Estos estadíos evolutivos constituyen las formas infecciosas para los mosquitos cuando éstos pican a sujetos infectados. Durante su evolución intraeritrocítica no efectúan reproducción alguna y muestran características morfológicas y tintoriales que permiten no confundirlos con los estadíos que se encuentran efectuando la esquizogonia. Con el tiempo, son cada vez más los merozoítos genéticamente programados para transformarse en gametocitos. A los gametocitos en el Plasmodium Falciparum, el tiempo que les demanda alcanzar su completo desarrollo es de aproximadamente ocho días y se mantienen viables circulando por sangre periférica unos 30 días. ESPOROGONIA O GAMETOGONIA (Mosquito)



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Cuando hembras de Anopheles pican a sujetos infectados ingresan a su tubo digestivo (estómago o intestino medio) todas las formas evolutivas sanguíneas del parásito, pero solamente los gametocitos, una vez liberados de los eritrocitos en los que se encontraban endocitados, tienen la capacidad de continuar su evolución. Por una parte, los macrogametocitos separan parte de su cromatina nuclear, la exocitan (reducción cromosómica) y exponen en un sector externo de su membrana celular receptores específicos para gametos del sexo opuesto. Quedan así constituidos los macrogametos (gametos femeninos). Por otra parte, y al mismo tiempo, los microgametocitos mediante un complejo proceso denominado exflagelación, dan origen a 6 u 8 microgametos (masculinos), con morfología y locomoción semejante a un largo flagelo, que se desprenden de lo que fue el cuerpo del microgametocito. Antes de transcurridos 30 minutos desde la ingesta de sangre por el mosquito un microgameto localiza un macrogameto y lo fecunda. La fusión de los núcleos va seguida de un proceso de meiosis, quedando constituido un huevo o cigote. En las siguientes 24 horas, el cigote adquiere una forma alargada, como un pequeño gusano, que tiene capacidad para desplazarse por reptación (ooquineto o huevo móvil). Cuando éste toma contacto con la pared del estómago, penetra entre las células epiteliales sin sobrepasar la membrana basal de la pared estomacal, y allí se aquieta, se redondea y se transforma en un estadío llamado ooquiste, obviamente aún inmaduro. En los días siguientes el Ooquiste crece y divide repetidas veces su núcleo. Finalmente, a partir de cada núcleo diferencia un esporozoito, elementos nucleados y alargados. Hay miles de ellos en un ooquiste maduro, aquí toma el nombre de esporoquiste. Cuando está totalmente lleno el esporoquiste se rompe y los miles de esporozoitos se vuelcan en el celoma del insecto de donde se arrastran hasta las glándulas salivales, donde se almacenan. Esta fase del proceso se denomina esporulación. La próxima vez que el mosquito pique, serán inoculados a un nuevo hospedador y se iniciara nuevamente el ciclo anterior. El tiempo que demanda este ciclo denominado esporogónico varía con la temperatura, la humedad relativa de aire y los factores que influyen sobre ellos. Las condiciones óptimas son 20 a 30 ºC y 60% o más de humedad relativa. En estas condiciones, el ciclo se completa en una semana, pero suele demandar hasta un mes en condiciones límites.



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COMPORTAMIENTO DE CADA ESPECIE EN EL HIGADO Y EN SANGRE PERIFÉRICA Plasmodium Falcíparum: A partir de cada esporozoito que ingresa en el hombre, ésta especie produce unos 40.000 merozoitos tisulares en aproximadamente de 6 días. Una vez que invaden la sangre, los merozoitos eritrocíticos encuentran receptores en glóbulos rojos de todas las edades, a esto se le acredita sus altas parasitemias. La denominada “citoadherencia”, determina que los eritrocitos que son invadidos por el parásito, tanto para efectuar la esquizogonia como la gametogonia, queden secuestrados o pegados en la superficie de capilares de órganos tales como cerebro, pulmones, riñones, intestino e hígado, sin que ello impida que los parásitos continúen su evolución. Por ello, desaparecen de sangre circulante hasta el estallido del eritrocito y los merozoitos liberados que están programados para la esquizogonia reaparecerán en sangre circulante en el estadío de trofozoito, los que, al cabo de pocas horas, quedarán secuestrados. En el caso de eritrocitos que porten parásitos que están transformándose en gametocitos, éstos no estallarán y se despegarán del endotelio cuando los gametocitos hayan alcanzado su completa maduración. Este proceso de citoadherencia determina el taponamiento de pequeños los capilares que generalmente se encuentran en el cerebro, produciendo así una embolia cerebral y como consecuencia la muerte. Realiza un ciclo en sangre (esquizogonia eritrocítica) de 48 horas y cada esquizonte pone en libertad de 12 a 32 merozoitos. Plasmodium Vivax: A partir de cada esporozoito que ingresa en el hombre, ésta especie produce unos 10.000 a 12.000 merozoitos tisulares en aproximadamente 8 días. Una parte de los esporozoitos que ingresaron al huésped están genéticamente programados para evolucionar hacia un estadio llamado hipnozoítos (zoítos dormidos o en estado de vida latente), los cuales permanecen en esta condición por espacios variados de tiempo, desde pocos meses y hasta un máximo de cinco años, para recién entonces iniciar y concretar su ciclo preeritrocítico y posterior invasión de la sangre. Una vez que invaden la sangre, los merozoitos eritrocíticos encuentran receptores en glóbulos rojos muy jóvenes (reticulocitos) que son muy elásticos, por ello su morfología es variada; a lo que se agrega que sólo podrán evolucionar en aquellos que posean el antígeno del grupo sanguíneo Duffy. Realiza un ciclo en sangre (esquizogonia eritrocítica) de 48 horas y cada esquizonte pone en libertad de 12 a 24 merozoitos.



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Plasmodium Malariae: A partir de cada esporozoito que ingresa en el hombre, ésta especie produce unos 10.000 merozoitos tisulares en aproximadamente 14 días. Una vez que invaden la sangre, los merozoitos eritrocíticos encuentran receptores en glóbulos rojos viejos, por ello su limitación a sus posibilidades de progreso reproductivo y sus bajas parasitemias. Presenta fuerte tendencia a evolucionar hacia una cronicidad prolongada, es decir, tiene la capacidad de sobrevivir en pequeño número en la sangre circulante del hospedador ejecutando esquizogonias eritrocíticas y gametogonias durante muchos años (décadas), durante los cuales no provoca manifestaciones clínicas, salvo cuando se producen recrudescencias. Realiza un ciclo en sangre (esquizogonia eritrocítica) de 72 horas y cada esquizonte pone en libertad de 6 a 12 merozoitos. Plasmodium Ovale: A partir de cada esporozoito que ingresa en el hombre, ésta especie produce unos 2.000 merozoítos tisulares en aproximadamente 11 días. Una parte de los esporozoítos que ingresaron al huésped están genéticamente programados para evolucionar hacia un estadio llamado hipnozoítos (zoítos dormidos o en estado de vida latente), los cuales permanecen en esta condición por espacios variados de tiempo, desde pocos meses y hasta incluso cinco años, para recién entonces iniciar y concretar su ciclo preeritrocítico y posterior invasión de la sangre. Una vez que invaden la sangre, los merozoítos eritrocíticos encuentran receptores en glóbulos rojos jóvenes, pero produce pocos gametocitos, por tanto su reproducción no logra extenderse. Realiza un ciclo en sangre (esquizogonia eritrocítica) de 48 horas y cada esquizonte pone en libertad de 4 a 12 merozoitos. SINTOMAS: Existen 3 etapas principales: La primera son los escalofríos, que duran de 15 minutos a una hora, comienza cuando una nueva generación de parásitos rompe los eritrocitos huésped y escapan hacia la sangre. En este momento es común que haya náuseas, vómito y cefalea. La siguiente etapa es caliente, dura varias horas, se acompaña de fiebres en aguja que en ocasiones alcanza 40° C o más. Durante esta fase los parásitos que salieron de la etapa anterior invadan nuevos eritrocitos. Con la tercera etapa, la sudoración, termina el episodio. Todo este conjunto de síntomas, se conoce como Paroxismo y van a la par de la esquizogonia eritrocítica. La infección por P. Falciparum tiene mayor importancia ya que a diferencia de las otras infecciones, tiene complicaciones graves o mortales. También es la más difícil de identificar clínicamente ya que con frecuencia se presenta como una enfermedad tipo influenza, con síntomas inespecíficos de fiebre, cefaleas, mialgias, náuseas, diarrea o dolor y molestias abdominales. La fiebre puede ser de tipo febrícula, continua, o con agujas diarias y ocurrir sin escalofríos ni sacudidas. En ocasiones es difícil identificar parásitos en bajas parasitemias, en



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frotis de sangre o en gota gruesa y se necesita de un Microscopista de mucha experiencia para lograrlo. DIAGNÓSTICO: Diagnóstico y tratamiento temprano, son la clave para disminuir la morbilidad y la mortalidad en Malaria. Las características clínicas de la malaria dependen de la especie del parásito, del número de parásitos y del estado inmunitario del huésped. El diagnóstico de la malaria se debe realizar en los siguientes casos: A los casos probables de malaria que demanden atención, es decir que procedan de una zona con malaria y presente una clínica compatible con Malaria. Como muestra de control el día cuarto después de iniciado el tratamiento. A todo paciente con recaída o reinfecciones. Para evaluar la eficacia del tratamiento de las infecciones por P. falciparum en los días 2, 3, 4, 7, 14, 21 y 28 posteriores al comienzo del tratamiento (el día 0 es aquel en el cual se hace el diagnóstico y se debe iniciar el tratamiento). A donantes de sangre con antecedentes de malaria y/o procedencia de zona endémica. A todo caso probable de malaria. A recién nacidos, producto de madre con malaria durante el embarazo. A embarazadas en control prenatal, desde la primera cita en forma rutinaria. A menores de cinco años con enfermedad diarreica aguda, infección respiratoria aguda o anemia grave. A recién nacidos, producto de madre con malaria durante el embarazo, en el momento del parto y en los controles posteriores. Para confirmación de diagnóstico de malaria, en pacientes remitidos con ese diagnóstico. TIPOS DE DIAGNÓSTICO: Diagnóstico Clínico Diagnóstico de Laboratorio: -Examen Microscópico -Pruebas Rápidas DIAGNOSTICO CLÍNICO: Caso probable de malaria no complicada Paciente con escalofríos, episodio febril actual o reciente de >37.5 y sudoración, en aceptables condiciones generales, consciente, con tolerancia a la vía oral y sin evidencias de signos y síntomas de gravedad, procedente de área endémica de malaria por lo menos en los últimos 15 días. Caso probable de malaria complicada: Paciente expuesto a la transmisión por P. falciparum con signos y síntomas clínicos de una o más complicaciones:



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Reporte de más de un esquizonte en la gota gruesa. Parasitemia > 50.000 parásitos/µL. Deshidratación severa (más de 5 episodios de vómito en las últimas 24 horas). No puede pararse o sentarse pero está consciente. Es incapaz de tomar líquido. Alteraciones de la conciencia, conducta o convulsiones. Ictericia (bilirrubina total mayor de 3 mg/dl). Un paciente con ictericia presenta la piel y las mucosas de color amarillo. Coluria intensa (utilizando tirilla reactiva). Se refiere a una orina de color oscuro. Palidez intensa en conjuntiva o palmas. Hematemesis o melenas. Se refiere a sangre en la materia fecal, la cual se observa de color negro. Presión arterial sistólica < 70 mmHg en adultos y de 50 mmHg en niños. Frecuencia respiratoria mayor de 24 por minuto en adultos y de 50 en niños. Glicemia menor de 40 mg/dl. Temperatura axilar mayor de 39.5 ˚C. Caso de malaria confirmado: Paciente con fiebre actual o reciente (últimas 72 horas) ≥37.5 ˚C, con escalofríos y sudoración, procedente de área endémica de malaria por lo menos en los últimos 15 días, confirmado mediante examen parasitológico. Confirmación de caso: Confirmación mediante la presencia de parásitos, por gota gruesa o de sus antígenos (Pruebas rápidas). DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO: Se establece al encontrar parásitos examinados en 100-200 campos Microscópicos, con un objetivo de 100X a inmersión, en un frotis de sangre grueso o delgado teñido con Giensa, Romanowsky modificado u otro método de coloración. La película delgada se utiliza principalmente para la diferenciación de especies después de descubrir la infección en una película gruesa.



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GUÍA DE PRÁCTICA TOMA DE MUESTRA PARA EL DIAGNÓSTICO DE MALARIA

Generalidades Desde que se describiera por primera vez en 1880, el diagnóstico de esta enfermedad se ha realizado, mediante la observación de las distintas formas del parásito, el examen microscópico de extensiones de sangre periférica teñidas con diversos colorantes. Hoy en día, muchos años después, el examen de la gota gruesa y el frotis siguen siendo el método de referencia a pesar de existir otras pruebas. Realizar el examen de gota gruesa con la sangre del paciente debe ser el primer paso que nos permita observar los parásitos y hacer el diagnostico a tiempo, lo que puede ser vital para el enfermo, ya que la aparición de complicaciones está muy relacionada con la demora de la administración del tratamiento. Objetivo Actualizar y repasar las técnicas de toma de muestra para diagnostico de laboratorio para malaria. GOTA GRUESA esta conformada por numerosas capas de células sanguíneas, en mayor numero eritrocitos o glóbulos rojos, los cuales son deshemoglobinizados durante la coloración con Giemsa. La concentración de glóbulos rojos permite la detección de los parásitos que pudieran estar presentes en el interior de alguno de ellos, especialmente cuando la densidad parasitaria es baja. (5-10 parásitos/ul). FROTIS consiste en una capa delgada y única de células sanguíneas. Esto facilita la observación de las características morfológicas de los parásitos presentes en los glóbulos rojos, sobre todo para la identificación de la especie del parásito. PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA -Disponer de materiales adecuados y previstos para realizar una gota gruesa:

• Lancetas • Algodón con alcohol • Láminas limpias • Guantes de látex • Lápiz • Recipiente para descartar materiales punzo cortantes • Formato de Solicitud de gota gruesa

-Proceder a obtener la muestra siguiendo las normas y procedimientos del Servicio Nacional de control de la Malaria • Tomar las precauciones y medidas de bioseguridad adecuadas



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• Sostener la mano no dominante del paciente correctamente (con la palma hacia abajo). • Seleccionar el dedo indice de la mano no dominante (menos usada). • Limpiar el dedo con algodón embebido de alcohol. • Secar el dedo con algodón limpio estimulando la circulación de la sangre. • Sostener el dedo adecuadamente y presionarlo antes de la punción. • Tomar la lanceta y realizar un dígito punción en un solo movimiento, asegurándose de que la punta de la lanceta penetre totalmente • Descartar la primera gota de sangre, limpiando suavemente con un algodón, y luego obtenerla gota de sangre para la gota gruesa. El tamaño de la gota de sangre debe ser como el tamaño de una cabeza de fósforo. -Ejecución de la técnica de gota gruesa y frotis tomando en consideración las recomendaciones exigidas por el Programa Nacional de Malaria. • Se coloca una gota de sangre en una lámina portaobjetos limpia, entre el primer y segundo tercio de la superficie de la lámina, y con la esquina de otra lámina diseminar la sangre circulante hasta llegar a un diámetro de 1cm, o de manera que quede en forma de un cuadrado de 1 cm2. El espesor debe ser tal, que permita leer a través de la preparación. • La sangre no debe ser excesivamente revuelta, es suficiente con 3 a 6 movimientos. De preferencia, realizar el homogenizado de la muestra en una sola dirección, de adentro hacia fuera, de derecha a izquierda o viceversa. • Presionar nuevamente el dedo y colectar una segunda gota de sangre (más pequeña que la primera) en el centro de la lámina portaobjeto, para realizar el frotis, con el lado menor de otra lámina ponerla en contacto con la superficie de la lámina que contiene la gota central y hacerla correr firmemente a lo largo de su borde en un ángulo de 45°. Asegúrese de que ocurra un contacto parejo con la superficie de la lámina para obtener una capa unicelular • Limpiar la sangre restante del dedo con una torunda de algodón humedecido en alcohol, e indicar al paciente que presione esta torunda contra el lugar de la punción por 5 minutos. • Luego de haber secado el frotis, rotular con lápiz de carbón suave (o lapicero de vidrio si es que no se piensa reutilizar la lámina), escribiendo en la parte más gruesa el código, número y fecha de la muestra. No utilizar bolígrafo para etiquetar la lámina. Dejar secar la lámina con la gota gruesa en una superficie plana y protegida de polvo, calor e insectos. -Para el secado de las láminas se debe tener en consideración lo siguiente: • Las láminas con las muestras de sangre deben permanecer en posición horizontal, lo que va a permitir que la gota gruesa esté en un mismo nivel y seque uniformemente. • Proteger las muestras con la ayuda de pequeños mosquiteros para alejarlas de dípteros y otros insectos, así como del polvo. • En climas húmedos y cálidos, la autofijación de las muestras ocurre rápidamente, por lo tanto deben ser coloreadas cuanto antes, a más tardar en un plazo no mayor de tres días luego de su colección. -Cuidados y recomendaciones para el manejo de la muestra. • Elegir el lugar correcto a partir del cual se obtendrá la muestra empleando la técnica apropiada. Esta debe obtenerse del pulpejo del dedo de la mano, de preferencia el dedo indice. • Obtener una muestra adecuada para asegurar la calidad técnica.



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• La muestra debe ser obtenida de preferencia antes de que el paciente haya recibido el respectivo tratamiento antimalárico. • Deje secar la muestra de sangre a temperatura ambiente, sobre una superficie plana y libre de polvo. • Limpie bien la lámina que utilizó para realizar el extendido, para evitar la transferencia de parásitos de una muestra a otra. -Errores más comunes en la toma de las muestras.

• Mala posición de las muestras de sangre • Las películas de sangre deberán estar situadas correctamente en la lámina. Si no es así,

puede dificultar el examen de gota gruesa; incluso porciones de la muestra pueden ser lavadas durante el proceso de coloración.

-Mucha sangre Lo que traerá como consecuencia la presencia de muchas células blancas por campo, pudiendo estas oscurecer o cubrir algunos parásitos de malaria que puedan estar presentes. Si el extendido es demasiado grueso, los glóbulos rojos pueden estar unos encima de otros imposibilitando una adecuada observación. -Poca sangre Si se emplea poca sangre en la preparación de las muestras, no habrán suficientes células blancas por campo y no se examinará suficiente cantidad de sangre como lo establece la norma. -Lámina con grasa En una lámina sin desengrasar, la sangre se esparcirá irregularmente, lo que hará difícil el examen. Por otro lado, parte de la gota gruesa en algunos casos puede desprenderse durante el proceso de coloración. -Si el borde de la lámina extensora es irregular Cuando el borde de la lámina empleada como extensora está astillada, el frotis es esparcido irregularmente, afectándose la calidad del frotis. -El frotis demasiado grande y la gota gruesa mal ubicada Si el frotis es demasiado grande, la gota gruesa estará fuera de lugar, cerca al borde de la lámina, entonces no podrá ser visto fácilmente a través del microscopio. Durante el proceso de coloración o secado, porciones de la gota gruesa pueden ser desprendidas. Esto también puede afectar el proceso de tinción ya que se podría fijar la gota gruesa por la proximidad del frotis. -Otros errores comunes

• Dejar las láminas expuestas a moscas, cucarachas, hormigas y otros insectos que se alimentan de sangre seca y dañan las muestras de sangre.

• Realizar gotas y frotices en láminas mal seleccionadas o rayadas. • Secado irregular de la gota gruesa. Permitir la autofijación de la gota gruesa que

ocurre con el transcurrir del tiempo o a través de la exposición al calor, por lo que la coloración se hace difícil e insatisfactoria.

PRACTICAS



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• Disponer de materiales adecuados y previstos para realizar una gota gruesa y frotis. • Realizar la toma de muestra para gota gruesa. • Realizar la toma de muestra para frotis

EVALUACION Los participantes serán e valuados durante las clases teóricas y prácticas bajo los siguientes criterios: De la obtención de la muestra: • Tamaño • Ubicación • Calidad Del frotis: • Tamaño • Ubicación • Extendido CONCLUSIONES Se obtendrán al finalizar la clase. Referencias 1. www.anlis.gov.ar/consulta/ infecciosas/malaria/diagnost.htm 2. www.seimc.org/control/revi_Para/malaria.htm 3. www.ins.gob.pe/insvirtual/ images/otrpubs/pdf/manual%20MALARIA.pdf 4. www.enferaclinic.com/Premios%20Terumo EVALUACIO DE TOMA DE MUESTRA Toma la mano correcta del paciente Limpieza del dedo con alcohol Secar el dedo estimulando la Circulación

Sostener el dedo a muestrear apropiadamente

Toma la lanceta adecuadamente Digitopunción adecuada Descarte de la lanceta Descarte de la primera gota de Sangre

Manipula láminas limpias Presiona el dedo para aumentar la Muestra

Coloca la segunda gota de sangre entre el primer y segundo tercio de



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la lámina Tamaño adecuado de la segunda Gota

Coloca la tercera gota de sangre en el centro de la lámina

Tamaño adecuado de la tercera Gota Limpieza de la mano del paciente después del procedimiento

Dio indicaciones posteriores al paciente

1) Gota gruesa Esparce la sangre en forma concéntrica

Distribución homogénea de la muestra

Tamaño adecuado de la muestra Transparencia de la muestra 2) Frotis Usa la segunda lámina en el ángulo apropiado para esparcir la muestra

El frotis es homogéneo y fino Deja secar el frotis Rotula sobre el frotis Deja secar la lámina 3) Envío de lámina para su tinción Usa el formato para envolver la lamina

La lamina esta seca al ser envuelta 4) Secado de la muestra



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Seca horizontalmente la lamina Uso de algún método de secado rápido

Protege la muestra Calificación: MB = Muy bueno, B = Bueno, R = Regular, M = Malo

GUÍA DE PRÁCTICA TINCIONES PARA EL DIAGNÓSTICO DE MALARIA

INTRODUCCIÓN El diagnostico de malaria se da en base al hallazgo de los parásitos en la sangre. La identificación de las especies puede hacerse observando el tamaño y la forma de los diferentes estadios del parásito y otras características de la célula hospedera. Para poder percibir diferencias en las células observadas es que se usan los diferentes métodos de tinción para diagnóstico. Hay varias tinciones que se aplican para el diagnóstico del paludismo, desde las convencionales de Giemsa, May-Grünwald-Giemsa, Field y Leishman hasta las fluorescentes con naranja de acridina o el sistema QBC. La tinción más usada para el diagnóstico de malaria es la tinción Giemsa, la cual fue desarrollada muchos años atrás. En 1879 Ehrlich propone el uso de dos tintes neutrales para la diferenciación de células en los frotis de sangre periférica. En 1891 Romanowsky y Malakowsky desarrollan por separado un método en el cual usan Eosina y Azul de metileno “madurado” el cual ayudaba a mostrar el núcleo de los parásitos de la malaria. El termino “maduración” se refiere a una serie de reacciones de oxidación, por las cuales algunas mezclas de tintes pueden ser inestables tendiendo a formar precipitados rápidamente. Así, a inicios de 1900 se empezó a usar el metanol como un solvente para el tinte precipitado, desarrollándose una técnica que utiliza las propiedades fijadoras de la solución metanólica previa a la tinción con la dilución acuosa de los tintes. En 1902 Giemsa mejoró estas técnicas usando métodos mas controlados de oxidación de los colorantes al medir las concentraciones adecuadas y al agregar glicerol al metanol para incrementar la solubilidad y estabilidad de los tintes. En la actualidad los tintes están disponibles comercialmente como polvos o soluciones stock. Para almacén, la presentación en polvo es más estable. Respecto a las soluciones stock en un solvente de metanol/glicerol es más estable que otras que solo usan el metanol. Diferentes marcas y presentaciones pueden producir variaciones en las tinciones, por lo que debe de medirse la calidad de tinción continuamente. Sin embargo hay puntos importantes para juzgar la calidad de la técnica de una buena tinción:



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1. Deshemoglobinización 2. Tonalidad 3. Precipitado En cuanto a las características que debe tener una buena tinción de gota gruesa tenemos: Deshemoglobinización

• Fondo libre de glóbulos rojos. Tonalidad

• Coloración del parásito: Núcleo: rojo grosella Citoplasma: azul cielo. Pigmento: amarillo sin brillo.

• Coloración de leucocitos: - Linfocitos: Citoplasma azul cielo Núcleo: azul oscuro. Gránulos inespecíficos: rojo o azul. - Monocitos: Citoplasma gris. Núcleo: azul tenue - Neutrófilo: Citoplasma rosado. Núcleo: púrpura. - Eosinófilos: Citoplasma rosado. Gránulos gruesos, rojo salmón.



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-Basófilos: Citoplasma y núcleo color azul. Granulaciones burdas. (grueso)

• Precipitado: Ausencia de precipitado de colorante OBJETIVOS GENERALES 1. Ensayar la técnica de pre-coloración 2. Evaluar los puntos clave en el uso de la coloración de Giemsa 3. Revisar los problemas más comunes y las recomendaciones en el proceso de tinción. 1. Técnica de precoloración -Definición: tratamiento de la gota gruesa con azul de metileno fosfatado -Momento en el que se realiza: Antes de someter la lámina con la muestra al proceso completo de coloración -Objetivo de la técnica:

• Procurar una mejor coloración y facilitar el diagnóstico • Evita que las láminas que se demoran en el campo se contaminen con

hongos(conservación) -Materiales

• Azul de metileno • Ortofosfato disódico anhidro (Na2HPO4) • Ortofosfato monopotásico (KH2PO4) • Agua destilada • Papel filtro No 4 • Envases oscuro • Vaso • Papel toalla

-Métodos para:

• Preparar el agua amortiguadora o tamponada Mezclar completamente en un mortero seco: - Ortofosfato disódico anhidro (Na2HPO4) 6 g - Ortofosfato monopotásico (KH2PO4) 5 g Tomar 1 g de la mezcla de las sales y disolver en 1 litro de agua destilada, agitar y ajustar a pH 7.2. Se agrega 1 g de mezcla de sales de sodio y de potasio por cada litro de agua destilada en proporción de 6:5 ó en cualquier otra proporción que haya resultado satisfactoria. Se mezclan



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perfectamente dichas sales en las proporciones seleccionadas, se pesa el polvo homogéneo en lotes de un gramo.

• Preparar el azul de metileno fosfatado Mezclar completamente en un mortero seco: - Cloruro de azul de metileno (medicinal) 1,0 g - Ortofosfato disódico anhidro 3,0 g - Ortofosfato monopotásico 1,0 g Disolver un gramo de la mezcla en 300 ml de agua destilada y filtrar en papel filtro No. 4 Usar hasta que se observen precipitaciones, luego de lo cual debe ser filtrado o desechado.

• Técnica de precoloración: - En un vaso verter la solución de azul de metileno en cantidad suficiente para cubrir una lámina en posición vertical y cubrir la gota gruesa por la solución - Contar "uno", "dos" "tres", (tres segundos), sacarla inmediatamente y hacerla escurrir verticalmente sobre un papel absorbente. - En un vaso que contenga agua tamponada, hacer el primer enjuague, introduciendo la lámina hasta que el agua cubra la gota por dos segundos. Sacarla inmediatamente después y hacerla escurrir nuevamente sobre el papel absorbente. - En otro vaso que contenga agua tamponada, hacer el segundo enjuague, introduciendo la lámina hasta que cubra únicamente la gota, sucesiva y rápidamente de 5 a 10 veces, inmediatamente después hacerla escurrir, por tercera vez, en la esponja. - Dejar que seque la gota, colocándola verticalmente en un soporte de madera 2. Técnica de Tinción con el colorante Giemsa -Definición: tratamiento de la muestra (gota gruesa y frotis) con el colorante Giemsa -Momento en el que se realiza: Luego de la precoloración. -Objetivo de la técnica:

• Permite observar las características de la célula hospedera y del parásito. -Materiales

• Colorante Giemsa (Solución) • Agua destilada o solución amortiguadora • Probeta • Varillas de vidrio • Piceta

-Preparación de la solución stock del colorante Giemsa Para preparar 100 mL de solución "madre”

-Colorante Giemsa en polvo, certificado 0,75 g - Alcohol metílico puro (sin acetona) 65,00 mL - Glicerina pura 35,00 mL

Mezclar el Giemsa en polvo con el alcohol metílico puro y la glicerina en un balón con perlas de vidrio y agitarlo en círculos fuertemente para conseguir una buena disolución del colorante.



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Filtrar pequeñas cantidades y experimentar con muestras hemáticas. Si los elementos se colorean adecuadamente el colorante esta listo para ser filtrado en el papel filtro Nº 4 en un embudo hacia un frasco color caramelo.

-Preparación de la solución de trabajo del colorante Giemsa Se necesita

• Solución "madre" Giemsa • Agua destilada o solución amortiguadora • Probeta

Utilizar una probeta de vidrio para diluir el colorante. Preparar la solución de trabajo diluyendo la solución "madre" 1/10, con agua destilada o solución amortiguadora de pH 7,2 (puede ser reemplazada por agua de lluvia o agua hervida fría). -Coloración de las muestras

• Fijado (solo para el frotis) • Fije el frotis sumergiéndolo en metanol, por tres segundos y déjelo secar Tinción • Método de coloración en varilla:

Coloque las varillas de vidrio sobre un lavatorio o recipiente para la fácil eliminación de los líquidos que se usarán en la coloración Coloque las láminas que debe colorear sobre las varillas, espaciándola de tal forma que pueda manipularlas con seguridad Vierta suavemente el colorante diluido sobre la gota gruesa cubriéndola por completo y deje actuar el colorante por 10 minutos. Descarte el exceso de colorante diluido y lave la lámina con agua corriente, usando una piceta hasta que el agua no desprenda colorante Deje secar las láminas en una gradilla de madera, de modo que queden inclinadas y con la gota gruesa hacia abajo en esta posición.

• Método de coloración en bandeja:

Coloque las láminas con la sangre hacia la concavidad de 2 ó 3mm. de una bandeja esmaltada. Déjese deslizar solución acuosa de Giemsa (1 Gota/ml de agua amortiguadora) recién preparada por debajo de los portaobjetos hasta que se llene la depresión. Elimínense todas las burbujas que puedan formarse debajo o cerca de la muestra de gota gruesa. Déjese que el colorante actúe durante 6 a 10 minutos. El tiempo de coloración puede variar de un lote a otro de colorante y para obtener resultados óptimos deben ser controlados estrictamente. Sumérjase brevemente 3 o 4 veces el portaobjetos en solución amortiguadora para eliminar el exceso de colorante de Giemsa. Deje escurrir y seque mediante el calor suave y abanicado. PRÁCTICA



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• Preparar la solución de trabajo usando agua tamponada y con agua hervida • Colorear una muestra usando el método de coloración en varilla

3. Problemas y recomendaciones generales Entre los problemas más comunes causados por una mala tinción de la gota gruesa están:

• Los glóbulos rojos pueden hemolizarse por la tinción de la muestra no fijada, por lo que sólo se ven leucocitos y parásitos (no células rojas).

• El citoplasma de los trofozoitos jóvenes no se ve como un anillo celeste, si no como un anillo incompleto o puntos consecutivos.

• El punteado característico de P. vivax y P. ovale pueden ser menos obvios o desaparecer. • El citoplasma de los trofozoitos tardíos de P. vivax y P. ovale pueden verse

fragmentados • Pueden aparecer artefactos y plaquetas que pueden ser confundidos con parásitos. • Cuando se usa una solución tampón con un pH diferente al óptimo de 7.2 (es decir muy

ácido o muy alcalino), las células de importancia toman coloraciones diferentes a las descritas

Recomendaciones

• Las soluciones stock deben guardarse en envases de polietileno tapados, permanecer en la oscuridad a 4ºC para prolongar su vida media

• El material de vidrio empleado en su preparación y almacén debe estar limpio, seco y sin residuos de detergente ya que estos pueden variar el pH del colorante.

• Un buffer alcalino de pH 7.2 es vital para una clara diferenciación del núcleo y del citoplasma del parásito, entre otras características. Nunca usar un buffer ácido.

• En una lámina bien teñida la cromatina se tiñe de rojo-púrpura y el citoplasma de azul. Los leucocitos tienen un núcleo púrpura y el punteado rojo si esta presente debe ser visible.

• La solución de trabajo solo es estable por unas pocas horas y debe ser preparada siempre en pocos volúmenes ya que se debe usar fresca.

• Si se usa un tinte deteriorado o viejo es probable que haya pérdida de la coloración rojiza por la precipitación de la eosina

• La tinción que mejor capacidad de diferenciación da es la que se hace con un tinte diluido y por más tiempo de incubación

• Nunca se debe añadir agua a la solución "madre" del colorante porque produce su completo deterioro.

• El frasco de almacenamiento no se debe nunca agitar antes de usar porque suspendería cristales que pudieran encontrarse en el fondo, perjudicando la coloración y dificultarían el examen bajo microscopio.

• Nunca regrese el colorante no utilizado a las botellas que contengan la solución "madre". • Mantenga el envase (vidrio ámbar u oscuro) con la solución madre Giemsa, cerrado y en

lugar seco, fresco y protegido de luz solar directa. Así evitará la volatilización del solvente y la oxidación del colorante prolongando la duración de la solución.

Referencias 1. Instituto Nacional de salud. Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnostico de Malaria. Serie de Normas Técnicas No 39. Lima 2003.



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2. http://www.impact-malaria.com/en/index_prehome.asp 3. http://www.seimc.org/control/revi_Para/malaria.htm 4.http://www.btinternet.com/~ukneqas.parasitologyscheme/Blood_Scheme/Teaching_Information/Stains_for_malaria_parasites/stains_for_malaria_parasites.html TINCIÓN 1) Preparación de reactivos Deja precipitar la solución de trabajo

Uso de buffer para preparar la solución de trabajo

Prepara la cantidad necesaria e solución de trabajo

Destino del colorante diluido no usado 2) Proceso de tinción Usa láminas con muestra seca Fija el frotis Tiempo de fijación Secado Cubre por completo la gota gruesa con el colorante

Tiñe por 10 minutos Lavado adecuado de lámina Secado de la muestra teñida Coloración del frotis y gota gruesa en una misma lamina

Conoce el método de lámina invertida y sus ventajas

Usa Mandil, Guantes y Mascarilla Se lava las manos después de la tinción

Limpia materiales utilizados y area de trabajo

MB=Muy bueno, B=Bueno, R=Regular, M=Malo

GUÍA DE PRÁCTICA: OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA INTRODUCCIÓN



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En su afán de llegar siempre más lejos en la investigación de la naturaleza, el hombre ha construido múltiples instrumentos que le han permitido acceder allí donde los sentidos no podían penetrar. Así como el telescopio abrió a la humanidad las puertas de lo infinitamente grande, el microscopio hizo posible conocer los mundos de dimensiones ínfimas, entre ellos la célula, base de la vida. Los microscopios son aparatos que, en virtud de las leyes de formación de imágenes ópticas aumentadas a través de lentes convergentes, permiten la observación de pequeños detalles de una muestra dada que a simple vista no se percibirían. CARACTERISTICAS DEL MICROSCOPIO BINOCULAR PARASITOLÓGICO El microscopio de alta resolución debe de ser binocular con tratamiento certificado antihongos, luz halógena, con espejo adaptable de fábrica, ergonómico, que permita observar imágenes nítidas, y que pueda ser usado en regiones tropicales húmedas. ESTRUCTURA: Ergonómico, metálico anticorrosivo, resistente y liviano. El tubo de observación binocular debe de tener un rango de inclinación entre 25° a 45°. Base anticorrosiva estable y fuerte. MECÁNICA: Enfoque macro y micro coaxial, con botones fuertes e independientes. La platina no esmaltada debe de tener sistema de fijación de la muestra. El carro porta láminas con control de ajuste axial horizontal y vertical y con rejillas de precisión para localización de imagen. Los botones de encendido y apagado así como los controles del foco y del condensador deben de ser diseñados para uso permanente y fuerte. OPTICA: No brillante de tipo infinito. Los objetivos deben de ser acromáticos y con lentes de cristal planas para obtener nitidez de imagen. Debe de contar con un Objetivo de 100X con resorte y tope. Y dos objetivos secos de 40X y 10X. Los Oculares deben de ser 8X o 10X/20X con distancia interpupilar graduable. Debe de contar con un condensador con diafragma para campo claro y opción futura de campo oscuro. Filtro de conversión azul. La fuente de luz eléctrica halógena con regulador de intensidad de 6 a 12 voltios y de 20 a 30 vatios. PARTES DEL MICROSCOPIO 1. Tubo para oculares. 2. Base de oculares - Prismas. 3. Revólver. 4. Objetivo. 5. Carro, platina 6. Condensador con diafragma. 7. Fuente de luz - Espejo. 8. Base - Pie. 9. Ocular.



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10. Brazo. 11. Tornillo macrométrico. 12. Tornillo micrométrico. EL SISTEMA MECÁNICO El pie: Constituye la base sobre la que se apoya el microscopio y tiene por lo general forma de Y o bien es rectangular. El tubo: Tiene forma cilíndrica y está ennegrecido internamente para evitar las molestias que ocasionan los reflejos de la luz. Adentro se encuentran los prismas y en su extremidad superior se colocan los oculares. El brazo: Es una pieza colocada en la parte posterior del aparato. Sostiene el tubo en su porción superior y por el extremo inferior se adapta al pie. Revólver: componente móvil en el que van atornillados los objetivos. Platina: sobre ella se ponen las láminas portaobjetos. Carro: da movimiento a la lámina porta objeto hacia delante y hacia atrás y hacia la derecha y la izquierda. Pinza: asegura la lámina portaobjetos. Tornillo macrométrico: ubicado a ambos lados del microscopio da ajuste grueso a la imagen. Tornillo micrométrico: ubicado a ambos lados del microscopio da ajuste fino a la imagen. EL SISTEMA ÓPTICO Condensador: está ubicado debajo de la platina y sirve para concentrar el rayo de luz. Diafragma: está ubicado dentro de la pieza que contiene el condensador y posee unas láminas que al cerrarse estrechan el rayo de luz y al abrirse lo amplían. Oculares: son dos tubos ubicados en la parte superior y contienen en su interior dos lentes cada uno. A través de ellos puede hacerse contacto visual hasta los objetivos. Objetivos: dan diferentes aumentos (4X, 10X, 40X, 100X), van atornillados al revólver y sirven para el contacto visual hasta la muestra. COMPONENTE DE ILUMINACIÓN Y SU FUNCIÓN Se refiere a la fuente de luz. Puede ser una bombilla eléctrica halógena, o un espejo que refleja la luz solar o artificial, colocándola en dirección del condensador. Si se usa como fuente luz artificial una bombilla incandescente, la luz se debe hacer pasar por un filtro azul o preparar la "solución luz del día" para disminuir la entrada directa de los rayos de luz. CUIDADOS DEL MICROSCOPIO Para mover el microscopio de un sitio a otro, deben usarse las 2 manos: Con una se toma el microscopio por el brazo y con la otra se soporta por su base. Si se va a transportar entre dos sitios distantes, siempre debe usarse el estuche original, en el cual viene empacado.-El microscopio debe colocarse en un sitio seco y ventilado, sobre una superficie limpia libre de vibraciones. No debe recibir los rayos solares, porque se puede condensar el agua en las lentes lo cual facilita el crecimiento de hongos.-El microscopio debe permanecer con su respectivo



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forro cuando no se esté utilizando, para evitar que se acumule polvo en la superficie.-Cuando el objetivo de inmersión presenta problemas por el exceso de aceite, se limpia con una mezcla que consiste en 30% de éter y 70% de alcohol etílico, realizar secado perfecto inmediatamente con una tela que no suelte hilacha.-El maquillaje ocasiona una película aceitosa en las lentes de los oculares, por esta razón, se acostumbra a limpiar los oculares regularmente con papel de arroz o con pañuelos faciales, al igual que el objetivo de inmersión luego de examinar.-No se deben fumar en el lugar donde se tiene ubicado el microscopio porque las lentes se cubren de una capa de material no combustible mezclados con restos de carbón lo cual impide una visualización nítida de los campos.-Después de trabajar, se baja la intensidad de la luz del microscopio antes de apagarlo; se deja el microscopio en el objetivo de menor aumento, se centra el carro, y se desconecta el microscopio directamente del tomacorriente la superficies externas del microscopio se pueden limpiar con productos para limpiar computadores, xilol, etc. Debe realizársele limpieza y mantenimiento por lo menos una vez al año. RECUERDE: Del manejo correcto, cuidado y mantenimiento del microscopio depende la calidad de su trabajo y la vida de muchas personas incluida la suya.

GUÍA DE PRÁCTICA LECTURA DE LÁMINAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE MALARIA

Generalidades La observación tanto de la gota gruesa como del frotis, es una técnica establecida más de 100 años. La continuación de su vigencia es por su bajo costo y su amplio uso. Este método es usado para la cuantificación de parásitos presentes en la sangre de la persona infectada. Para dar un diagnostico adecuado, se requiere tener un buen conocimiento de la morfología y características del parásito, además de contar con los materiales necesarios para su observación. Objetivo: Reconocer perfectamente la presencia de parásitos en una muestra hemática. Observación microscópica de los parásitos de malaria en gota gruesa



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La morfología de los glóbulos se ve alterada por la presencia del parásito tanto en el frotis y en la gota gruesa lo mismo sucede con la morfología de los parásitos, cuya forma puede ser alterada por el proceso de elaboración de la lámina. Los parásitos de malaria pueden ser confundidos con los glóbulos blancos en la gota gruesa ya que en este tipo de lámina sólo se ven los núcleos de las células. Para evitar esta confusión se necesita observarlos muy cuidadosamente antes de identificarlos, enfocando y usando el ajuste micrométrico cada vez que mueva un campo microscópico, esto le permitirá examinar la gota gruesa en profundidad. El citoplasma de los anillos finos de los trofozoitos puede aparecer incompleto o roto. Esta apariencia es normal en muestras de sangre de gota gruesa. Observar el parásito en diferentes etapas de desarrollo le ayudará para hacer el diagnóstico. Recordar que las granulaciones de Maurer de Plasmodium falciparum no pueden ser vistos en gota gruesa. -Disponer de los materiales necesarios: • Un microscopio compuesto con fuente de luz propia o con sistema de espejos para recibir luz natural o artificial. • Si se usa como fuente externa de luz una bombilla incandescente (foco de 100W y pavonado), la luz se debe hacer pasar por un filtro azul (que se puede preparar con la solución azul cielo), esto facilita la visualización de los parásitos. • Aceite de inmersión • Registro para anotar los hallazgos. -Reconocimiento del Parásito • Los parásitos de malaria toman con la coloración de Giemsa un aspecto característico en la gota gruesa y en el frotis que permite el reconocimiento del tamaño y la forma del parásito. • El núcleo del parásito (cromatina) es generalmente redondo y se colorea de un rojo intenso (rojo grosella); el citoplasma toma diferentes formas, desde una forma de anillo a una totalmente irregular y se colorea siempre de azul, aunque la tonalidad pueden variar ligeramente. 3. Formas evolutivas del Parásito Los estadios y sus características del Plasmodium que se observan en la gota gruesa y frotis son: Etapa de trofozoito joven • Esta etapa es la que se observa con mayor frecuencia en todas las especies. Pueden tomar la forma de coma o anillo como en el caso de Plasmodium falciparum, o formas ameboideas, como en el caso de P. vivax • En el estadio de trofozoito, los Plasmodium presentan tres características indispensables, presentes tanto en la gota gruesa como en el frotis: citoplasma azul violáceo o azul cielo, núcleo rojo intenso o rojo grosella, y pigmento amarillo pálido o castaño oscuro o negro (dependiendo de la especie y de las formas maduras del parásito).



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Etapa de trofozoito mediano y adulto • El trofozoito es una etapa del desarrollo del parásito dentro del glóbulo rojo, puede variar en tamaño desde pequeño a grande. En el trofozoito se visualiza, en la mayoría de las veces, el pigmento malárico el cual aparece a medida que el parásito crece. Este pigmento no se colorea porque adopta un color propio, que puede variar de amarillo pálido a castaño oscuro o negro. • El trofozoito mediano se caracteriza porque morfológicamente es grande, de citoplasma fragmentado y con presencia de vacuola, pudiendo ser la cromatina o núcleo del parásito de posición central o excéntrica. • El trofozoito adulto es de menor tamaño, de citoplasma compacto, la cromatina se ubica por lo general excéntricamente y es más pequeña que la de los gametocitos. Etapa de esquizonte • En la etapa de esquizonte el parásito de malaria comienza a reproducirse. El parásito presenta núcleos con cromatina y citoplasma definido. Cuando este estadio está presente el número de núcleos observados son de utilidad para determinar la especie. Etapa de gametocito • La morfología de los gametocitos depende de la especie. El gametocito masculino es llamado microgametocito y el gametocito femenino macrogametocito).



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• En malaria por P. falciparum se pueden ver en sangre periférica gametocitos y anillos a diferencia de malaria por P. vivax y P. malariae en los que se visualiza todos los estadios parasitarios. 4. Lectura de Gota Gruesa La gota gruesa es recomendable para detectar rápidamente la presencia de los parásitos de malaria. En el examen de rutina de la gota gruesa se requiere observar 100 campos microscópicos óptimos a un aumento final de 1000x, con lente de inmersión. Procedimiento a) Verificar la clave de la lámina que va examinar en la hoja de registro de datos. b) Colocar la lámina entre los soportes de la platina mecánica y verificar que esté sostenida firmemente al momento de mover el carro, de lo contrario se pueden perder de vista objetos sospechosos antes de que puedan ser ubicados. c) Examinar la gota gruesa completa con el objetivo de 10X, hasta localizar una zona conveniente para la búsqueda del Plasmodium (que se observen leucocitos numerosos y bien coloreados). d) Colocar aceite de inmersión sobre la zona seleccionada de la gota gruesa y girar el objetivo de 100X hasta ponerlo en posición sobre ella. e) Bajar el objetivo hasta ponerlo en contacto con el aceite de inmersión. f) Verificar que la parte seleccionada de la lámina sea óptima (leucocitos de 10 a 20 por campo microscópico). Desplazar la lámina que contiene la muestra de sangre siguiendo el patrón mostrado. Recorrido de la gota gruesa durante la observación microscópica. 5. Número de campos leídos en muestra positiva. Si se encuentran parásitos en el primer campo se deben examinar los 100 campos microscópicos; esto asegura detectar la posibilidad de infección mixta (más de una especie presente en una muestra de sangre). 6. Número de campos leídos en muestra negativa



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Una lámina puede declararse como negativa, sólo después de observar 100 campos microscópicos sin haber encontrado parásitos. 7. Registro y Número de Parásitos Anotar el número de parásitos observados ya sea por campo o en 100 campos. En lo posible, debe identificarse la(s) especie(s) a la(s) que pertenecen los parásitos. Se pueden dar los siguientes casos en la gota gruesa: • Negativo. • Positivo para P. falciparum, P. vivax o P. malariae • Positivo para Infección mixta: • Se sugiere nuevo examen. 8. Recomendaciones • En las preparaciones sanguíneas las siguientes estructuras pueden confundirse con parásitos de malaria: plaquetas adheridas a los eritrocitos en las extensiones sanguíneas, conglomerados de plaquetas, fragmentos de leucocitos en las preparaciones de gota gruesa, colorante precipitado, restos de piel del paciente, polvo, bacterias, levaduras, esporas y otros microorganismos que caen en la preparación (si no se tienen protegidos) mientras se está secando, además de algas u otros organismos que pueden estar contaminando el colorante. • Recuerde usar el ajuste fino para enfocar, accionando el tornillo micrométrico hacia delante y atrás, con el fin de observar el mayor número posible de capas sanguíneas Morfología de las especies de plasmodium en el frotis de sangre Una simple manera de distinguir entre las cuatro especies de malaria es observar los cambios morfológicos que provoca el parásito al infectar los glóbulos rojos. Los caracteres distintivos son:

• El tamaño del glóbulo rojo (si está o no agrandado) • Si se han coloreado o no las granulaciones de Schuffner dentro de la célula. • El tamaño del parásito • Número de merozoitos etc.

1. Lectura del Frotis El frotis sirve como herramienta auxiliar para determinar la especie de Plasmodium en caso de que no sea posible hacerlo en la gota gruesa. Además el código del paciente es rotulado en la cabeza del frotis. Para realizar la lectura se debe tener en cuenta lo siguiente: a. Este examen requiere mayor tiempo de observación en comparación con la gota gruesa, debido que la concentración de los elementos sanguíneos es mucho menor. b. Se debe realizar en las siguientes circunstancias: • Cuando no es posible examinar la gota gruesa por alguna razón (Ejemplo: por ser muy pequeña). • Cuando no es posible identificar en la gota gruesa la(s) especie(s) de Plasmodium. c. El aspecto que debe presentar esta preparación al microscopio debe ser: • Fondo limpio y libre de residuos los eritrocitos deben estar teñidos de color rosa pálido. • El núcleo de los leucocitos, de color morado oscuro y gránulos bien definidos.



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• Los gránulos de Schüffner deben verse como un moteado en los eritrocitos que contienen P. vivax. • La cromatina de los plasmodium se tiñe de color rojo grosella intenso y el citoplasma de azul violáceo o azul cielo. Procedimiento para la lectura a. Colocar la lámina sobre la platina mecánica entre los soportes de esta. b. Enfocar con el objetivo de 10X el extremo menos denso del frotis, donde los glóbulos rojos estén dispuestos en una sola capa. c. Bajar el objetivo de inmersión hasta poner en contacto con el aceite de inmersión. d. Enfocar y examinar la película de sangre siguiendo el patrón mostrado. 2. Número de campos leídos en muestra positiva Examinar el mayor número de campos microscópicos (300) para determinar si la muestra de sangre es positiva. 3. Número de campos leídos en muestra negativa Se necesitan examinar 300 campos para diagnosticar muestra negativa. Si el diagnóstico es dudoso deberá examinar de 400 a 500 campos microscópicos. 4. Registro de número y especie de parásitos encontrados Se pueden dar los siguientes casos en frotis: • Negativo. • Positivo para P. falciparum, P. vivax o P. malariae • Positivo para Infección mixta: • Se sugiere nuevo examen. 5. Recomendaciones En las preparaciones sanguíneas de frotis, las plaquetas adheridas a los eritrocitos pueden confundirse con plasmodios, así como otros contaminantes como bacterias, esporas, hongos, precipitado de colorante, etc. Ocasionalmente se puede encontrar dificultades para establecer diferencias entre trofozoitos maduros y gametocitos de Plasmodium vivax y entre trofozoitos maduros de Plasmodium malariae y gametocitos redondeados de Plasmodium falciparum. Tampoco es posible distinguir entre trofozoitos en estadios avanzados y gametocitos de Plasmodium malariae en muestras de gota gruesa, aunque si están presentes los gametocitos de Plasmodium falciparum es relativamente fácil de realizar el diagnóstico. Práctica.



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Se usará el material de ayuda como son láminas previamente elaboradas en lo que se tendrá en cuenta los siguientes: 1. Identificar la especie en gota gruesa 2. Identificar la especie en frotis. 3. Características diferenciales del parásito. 4. Numero de campos observados en un tiempo. Evaluación Los participantes serán evaluados durante las clases teóricas y practicas. Conclusiones Las que se obtendrán al finalizar la clase. Referencias 1. www.anlis.gov.ar/consulta/ infecciosas/malaria/diagnost.htm 2. www.seimc.org/control/revi_Para/malaria.htm 3. www.ins.gob.pe/insvirtual/ images/otrpubs/pdf/manual%20MALARIA.pdf 4. www.enferaclinic.com/Premios%20Terumo LECTURA 1) Manejo del microscopio Uso del filtro azul Uso de objetivos 10X, 100X por tipo de muestra

Uso del aceite de inmersión 2) Lectura de gota gruesa Verifica y registra la clave de reconocimiento de la muestra

Forma en que lee la gota gruesa Características microscópicas de la zona elegida

Número de campos leídos Reconocimiento del parásito Diferencia trofozoitos Diferencia esquizontes Diferencia gametocitos



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Diferencia Pf Diferencia Pv Diferencia Pm Anota el numero y especie de parásitos encontrados

MB=Muy bueno, B=Bueno, R=Regular, M=Malo 3. Lectura de frotis Forma en que lee el frotis Características microscópicas de la zona elegida

Número de campos leídos Reconocimiento del parásito Diferencia trofozoitos Diferencia esquizontes Diferencia gametocitos Diferencia Pf Diferencia Pv Diferencia Pm Anota el numero y especie de parásitos encontrados

MB=Muy bueno, B=Bueno, R=Regular, M=Malo

GUÍA DE PRÁCTICA:

DETERMINACIÓN DE DENSIDAD PARASITARIA Y NIVELES DE

CONCORDANCIA EN LA LECTURA DE LÁMINAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE MALARIA

GENERALIDADES: La determinación de los niveles de parasitemia es importante debido a que se relaciona con el grado de severidad de infección malárica y sirve para evaluar la eficacia del tratamiento antiparasitario, monitoreando la densidad parasitaria durante el tratamiento. Si el tratamiento es eficaz, la densidad parasitaria disminuirá progresivamente. La determinación de la densidad parasitaria es especialmente importante en la infección por P. falciparum, la cual se asocia a enfermedad severa y potencialmente fatal, por lo que es necesario el seguimiento de la evolución parasitológica en respuesta al tratamiento instaurado.



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Además, la medida de la densidad parasitaria es utilizada en Salud Pública para establecer metas de trabajos de intervención, tales como vacunación en malaria, impregnación de mosquiteros y quimiosupresión. OBJETIVOS: Revisar las técnicas para determinar la densidad parasitaria. Evaluar el Nivel de Concordancia en la Lectura de Láminas. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE LA DENSIDAD PARASITARIA Los métodos más usados para establecer la densidad parasitaria son: 1. Determinación de la densidad por sistema de cruces o método simple (semicuantitativo) 2. Determinación de la densidad por número de parásitos por microlitro de sangre -Determinación de la densidad por sistema de cruces o método simple (Semicuantitativo) Sistema indirecto, simple, usado rutinariamente que permite determinar el número de parásitos presentes por microlitro de sangre mediante la suma del total de parásitos observados en 100 campos. El resultado se deberá informar de la siguiente manera: Cualquier número inferior a 40 parásitos en 100 campos debe escribirse el número de parásitos encontrados en la lectura. Si observó más de 40 parásitos, use la siguiente escala: +/2: De 40 a 60 parásitos en 100 campos +: Un parásito por campo en 100 campos ++: De 2 a 20 parásitos por campo en 100 campos +++: De 21 a 200 parásitos por campo en 100 campos ++++: Más de 200 parásitos por campo en 100 campos

Número de campos leídos Con un aumento de 100X, 100 campos microscópicos de inmersión, una muestra de gota gruesa bien preparada corresponde aproximadamente a 0,2 ml de sangre.

-Determinación de la densidad por número de parásitos por microlitro de sangre Método práctico, razonable y de precisión aceptable. El número de parásitos por microlitro de sangre se mide comparando el número de parásitos con el número de leucocitos en la gota gruesa en base a un recuento medio estimado en cerca de 6000 leucocitos por microlitro de sangre. Aunque existen variaciones este número nos permite comparaciones razonables, particularmente cuando se comparan densidades de muestras obtenidas sucesivamente del mismo paciente. Para poner en práctica este método se necesitan dos contadores: uno para contar los parásitos y otro para los leucocitos. • Aplicar los siguientes criterios, según se presente el caso:



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a. Si después de contar 200 leucocitos, 10 ó más parásitos han sido identificados y contados, anotar los resultados en los formatos de registro en términos de número de parásitos por 200 leucocitos. b. Si después de contar 200 leucocitos, menos de 10 parásitos han sido identificados y contados, continuar el recuento de leucocitos hasta llegar a 500 leucocitos, para luego anotar los resultados en los formatos de registro en términos de número de parásitos por 500 leucocitos. c. En caso de parasitemia alta, realizar el recuento en función del número de parásitos, registrando su recuento hasta 500 y reemplazar su valor en la fórmula con la cantidad de leucocitos encontrados. -Cálculo del número de parásitos por microlitro de sangre En cada caso, el número relativo de parásitos al número de leucocitos contados puede ser convertido a parásitos por microlitro de sangre usando la siguiente fórmula: Nº de parásitos contados x 6000 = Parásitos / µL Nº de leucocitos contados Donde: Nº de parásitos = Número de parásitos contados. Nº de leucocitos = Número de leucocitos contados. µL= microlitro Ej.: .Si se cuentan 205 leucocitos y 50 parásitos, al aplicar la fórmula se tendrá: Parásitos/ µL = 50 x 6000 = 1463 p / µL 205 En caso de parasitemia alta, realizar el recuento en función del número de parásitos, registrando su recuento hasta 500 y reemplazar su valor en la fórmula con la cantidad de leucocitos encontrados. -Cálculo de la densidad por estadio del parásito Si la infección malárica es por P. falciparum, además de la densidad parasitaria, se debe registrar las fases de desarrollo de la siguiente manera: F = anillos únicamente F y Fg = anillos y gametocitos Fg = gametocitos únicamente Aplicar la formula independientemente para cada estadio. REPORTE ADECUADO DE LA DENSIDAD PARASITARIA Aquí algunos ejemplos como realizar un reporte. • Positivo para P. falciparum (ej. 20.000 trofozoitos/µl, 200 gametocitos/µl 80 esquizontes/ µl) • Positivo para P. falciparum (100 trofozoitos /µl y 5 gametocitos /µl). • Positivo para P. falciparum (200 gametocitos /µl). • P.vivax (16.000 parásitos/µl) y P.falciparum (40 gametocitos/µl).



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• Positivo para Infección mixta: P.falciparum (10.000 trofozoitos /µl) y P.vivax (4 trofozoitos /µl). Medición de la reproducibilidad y concordancia diagnóstica Reproducibilidad, se refiere a que cuando se realiza un Control de Calidad interno, el cual debe ser realizado de manera continua a nivel de equipos, reactivos, materiales, técnicas y procedimientos, para hacer el seguimiento de las condiciones reales de trabajo de cada laboratorio, lo cual permite ver a diario la confiabilidad de los resultados con base en la precisión o exactitud. Concordancia diagnóstica, es un proceso esencial para garantizar la armonía o transferencia de resultados entre los laboratorios y para identificar errores. Se realiza mediante envío de láminas con diagnostico confirmado por un laboratorio local hacia un laboratorio de referencia nacional, quienes evalúan con porcentaje de concordancia, la calidad en la identificación de cada uno de los microscopistas de los laboratorios nacionales Para la reproducibilidad y concordancia diagnóstica, se determinará la concordancia y discordancia del total de láminas evaluadas expresado en porcentaje. Calificación por evaluación = Puntaje obtenido x 100 Puntaje total posible El porcentaje máximo de discordancia aceptable es 2%. Cuando sea mayor deberá realizarse una supervisión directa para detectar las causas de la discordancia y corregirlo, dando sugerencias pautas para ello. Práctica. Se usará el material de ayuda como son láminas previamente elaboradas en lo que se tendrá en cuenta los siguientes: 1. Hallar el número de parásitos por microlitro en gota gruesa 2. Hallar el número de parásitos por microlitro en frotis. 3. Evaluar por sistema de cruces una gota gruesa 4. Calcular el número de parásitos por estadio en gota gruesa. 5. Diagnóstico de láminas por especie. 6. Nivel de concordancia en la lectura de gota gruesa. Evaluación Los participantes serán evaluados durante las clases teóricas y prácticas. CONCLUSIONES Las que se obtendrán al finalizar la clase. Referencias 1. www.anlis.gov.ar/consulta/ infecciosas/malaria/diagnost.htm 2. www.seimc.org/control/revi_Para/malaria.htm 3. www.ins.gob.pe/insvirtual/ images/otrpubs/pdf/manual%20MALARIA.pdf 4. www.enferaclinic.com/Premios%20Terumo



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DETERMINACIÓN DE DENSIDAD PARASITARIA Identifica el motivo por el que determina la densidad parasitaria

Características microscópicas de la zona elegida

Identifica los métodos para determinar la densidad parasitaria

Número de campos leídos Determinación de la densidad por sistema de cruces

Cálculo del número de parásitos por microlitro de sangre

Calculo de la densidad por estadio del parásito

Calculo de la densidad por especie del parásito

Reporte adecuado de la densidad Parasitaria

MB=Muy bueno B=Bueno R=Regular M=Malo



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GUIA DE PRÁCTICA: PROCEDIMIENTOS PARA EL CORRECTO LLENADO DE FORMULARIOS USADOS EN LA INFORMACIÓN DE LABORATORIOS Generalidades: La práctica de Laboratorio, al igual que otras prácticas relacionadas con la salud, requiere del registro de sus actividades en Formularios, los cuales deben reflejar en sus variables todos aquellos factores considerados de importancia y asociados a los pacientes a los cuales se atiende cotidianamente. Estas variables al ser analizadas y estudiadas nos darán las armas necesarias para tomar decisiones orientadas a la mejora continua del laboratorio y en la atención a los pacientes, además éstas notificaciones epidemiológicas le permitirá al Servicio Nacional de Control de la Malaria, tomar las medidas necesarias para establecer un correcto programa de actividades de control en las áreas de procedencia las personas que acuden a los Laboratorios.

Objetivo:

Los participantes tendrán la capacidad de realizar un correcto llenado de los Formularios utilizados en la práctica cotidiana de laboratorio.

Tipo de Formularios:

• Formulario OC - 19

• Formulario E – 1

• Formulario E - 2

-Formulario OC – 19: Utilizado en la práctica diaria y presenta las siguientes variables:

Código: Se refiere al código de la lámina o del paciente, el mismo que empieza desde el 0001 al iniciar cada año. Laboratorio: Se refiere al Nombre y número de Laboratorio que le ha sido asignado. Semana: Se refiere a la semana epidemiológica en que se tomó la muestra del paciente. Apellidos y Nombres: Se refiere a los Apellidos y Nombres del paciente. C.I.: Se refiere al número de cédula de identidad. Fecha de Nacimiento: Se refiere a la fecha en que nació el paciente. Día, mes y año. Edad: Se refiere a la edad en años del paciente. Sexo: Se refiere al sexo del paciente. Recibió tratamiento Antipalúdico: Se refiere a si el paciente ha ingerido o no, algún tipo de medicamento previo al examen. Provincia: Se refiere al nombre y código asignado de la Provincia de donde proviene el paciente. Cantón: Se refiere al nombre y código asignado al Cantón de donde proviene el paciente. Parroquia: Se refiere al nombre y código asignado a la Parroquia de donde proviene el paciente. Localidad: Se refiere al nombre y código asignado a la Localidad de donde proviene el paciente. Dirección domiciliaria: Se refiere a la cooperativa, urbanización, lotización, plan de vivienda, además el barrio, sector, manzana y/o casa en donde vive el paciente.



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Fecha de inicio de síntomas: Se refiere al día en que el paciente presentó por primera vez el cuadro clínico.

Fecha de la muestra: Se refiere al día en que el paciente acudió al puesto de Diagnóstico a realizarse la toma de la gota gruesa.

Fecha de examen: Se refiere al día en que el Puesto de Diagnóstico realizó el examen a la gota gruesa.

Resultado: Se refiere al resultado de la lectura de la gota gruesa y será registrado como positivo o negativo.

Plasmodium: Se refiere al diagnóstico del tipo de plasmodium que se encuentra en la muestra leída y se registrará si es que la variable anterior resulta ser positivo.

Gametos: Se refiere a si en la lectura de la gota gruesa se encontraron gametocitos y sólo se registrarán en los casos de Plasmodium Falcíparum.

Parasitemia: Se refiere a la densidad parasitaria en el sistema de cruces (método semicuantitativo), que determina el número de parásitos visualizados en 100 campos analizados.

Toda ésta información recopilada diariamente en base a los pacientes que acuden al Laboratorio o Puesto de Diagnóstico, es resumida semanalmente en dos Formularios:



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-Formulario E – 1: En este formulario se anota el número total de láminas, positivas y negativas, tomadas en el Laboratorio y en otros establecimientos de Salud, el mismo que consta de las siguientes variables:

Laboratorio: Se refiere al nombre del Laboratorio No.: Se refiere al número asignado para el Laboratorio Provincia: Se refiere al nombre de la Provincia donde está ubicado el Laboratorio Cantón: Se refiere al nombre del Cantón donde está ubicado el Laboratorio Semana: Se refiere a la semana epidemiológica que se está informando. Fecha: En esta casilla se anota los días laborados dentro de la semana epidemiológica. Unidad de Salud: En esta casilla se reporta el número de láminas positivas y negativas que fueron tomadas en las Unidades de Salud. Colaboradores Voluntarios: En esta casilla se reporta el número de láminas positivas y negativas que fueron tomadas por los Colaboradores Voluntarios. Laboratorios SNEM: En esta casilla se reporta el número de láminas positivas y negativas que fueron tomadas en los Laboratorios de Malaria. Otros notificantes: En esta casilla se reporta el número de láminas positivas y negativas que fueron tomadas por otras personas o Establecimientos de Salud, públicos o privados. Total: En esta casilla se reporta la suma total del número de las láminas positivas y negativas de los casilleros antes nombrados. -Formulario E – 2: En este formulario se anota los datos de las láminas positivas tomadas en el Laboratorio y en otros establecimientos de Salud, el mismo que consta de las siguientes variables:

Laboratorio: Se refiere al nombre del Laboratorio No.: Se refiere al número asignado para el Laboratorio Provincia: Se refiere al nombre de la Provincia donde está ubicado el Laboratorio Cantón: Se refiere al nombre del Cantón donde está ubicado el Laboratorio Semana: Se refiere a la semana epidemiológica que se está informando. Fecha: En esta casilla se anota la fecha de toma de muestra y la fecha en la que se realizó el examen de Malaria. Fuente: En esta casilla se anota el número de la muestra, la clave asignada (tipo y número) del Laboratorio o establecimiento de Salud que tomó la muestra originalmente, así como también Provincia y Cantón donde está ubicado el Laboratorio. Paciente: En esta casilla se anota la edad y sexo del paciente que se tomó la muestra Procedencia: En esta casilla se anota la Provincia, Cantón, Parroquia y Localidad de procedencia del paciente, con sus respectivos códigos asignados previamente. Dx: Se refiere al resultado del Diagnóstico de la muestra (Densidad Parasitaria y Especie).



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INFORME SEMANAL DE PRODUCCIÓN DE MICROSCOPISTA Laboratorio_____________ Nº ________ Provincia_______________ Cantón_________________ Semana Nº_________ del____________ al_____________________ de ____________________ FECHA UNIDAD DE SALUD COL. VOLUNTARIO LABORATORIOS OTROS TOTAL SNEM NOTIFICANTES Negativos Positivos Negativos Positivos Negativos Positivos Negativos Positivos Negativos Positivos Form.E-1 Observación: _________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_______________________ MICROSCOPISTA Revisión de diagnóstico en el Laboratorio Central

Total Lam. Exam. Especie Errores Clave

Negativas Positivas F V N P E Revisión



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ECUADOR SERVICIO NACIONAL DE ERRADICACION DE LA MALARIA

REGISTRO SEMANAL DE MUESTRAS POSITIVAS

Laboratorio: ______________

No. _______________

Provincia: _______________________

Cantón : _________________

Semana No.: ____________ del______________ al __________________ de ___________________

FECHA FUENTE PACIENTE PROCEDENCIA DX Examen Toma de # de la Clave

Muestra Muestra Tipo No. Prov. Cant. Edad Sexo Prov. Cant. Parroquia Localidad / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / /

Form. E -2 RSMP ___________________________ Firma del Microscopista



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GUÍA DE PRÁCTICA:

DIAGNOSTICO DE MALARIA MEDIANTE EL USO DE PRUEBAS RAPIDAS Generalidades Las pruebas rápidas se fundamentan en la detección de sustancias extrañas para el humano (antígenos), que hacen parte de los parásitos que circulan en los pacientes con malaria. Las pruebas rápidas (pruebas inmunocromatográficas) detectan estos antígenos parasitarios en la sangre lisada del paciente empleando anticuerpos específicos. La unión del antígeno y del anticuerpo migra a lo largo de una tirilla y se ubica en una zona predeterminada de la tirilla en la cual se observará una línea de color violeta en caso de haber una reacción positiva. Es importante tener presente que si bien las pruebas rápidas pueden ayudar a fortalecer la atención de los pacientes con malaria, las mismas tienen limitaciones generales como ser cualitativa (no es posible cuantificar la parasitemia), no diferenciar entre estadios parasitarios, ser menos sensible que la gota gruesa, la sensibilidad disminuye con la disminución de la parasitemia y ser inestables a factores ambientales como la humedad y las temperaturas que se encuentren por fuera del rango de 2 a 30 °C. Para garantizar la calidad del diagnóstico de malaria mediante el uso de pruebas rápidas, es necesario capacitar al personal responsable de esta actividad en el manejo, interpretación y cuidados de las mismas. Objetivo Obtener conocimiento de las Pruebas Rápidas y su utilidad en el diagnóstico y tratamiento temprano de la malaria Importancia de Las Pruebas Rápidas: -Eficaz en zonas en donde el diagnóstico microscópico no es factible y lograr notificación epidemiológica en estas áreas. -Orienta para un correcto tratamiento con una consecuente disminución de la resistencia selectiva en cepas parasitarias. -Impacta la morbilidad y mortalidad. Uso de las Pruebas Rápidas -Auto diagnóstico en viajeros. -Presencia de pacientes asintomáticos. -Zonas de alto riesgo como medida de contingencia en brotes y epidemias cuando la capacidad de diagnóstico sea desbordada por las urgencias. -Zonas de mediano, bajo riesgo y sin riesgo, principalmente en los laboratorios de salud pública como complementariedad del diagnóstico microscópico y ante la duda de una de las especies de Plasmodium observadas al microscopio, principalmente para el caso de P. falciparum.



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-En general en regiones con población dispersa con problemas de malaria y en donde no se cuente con el diagnóstico microscópico, pero que cuente con las condiciones necesarias para mantener las condiciones ambientales sugeridas por el fabricante de las pruebas rápidas. -Reconocimiento de los Antigenos Parasitarios de los Plasmodium. Proteína II Rica en histidina (HRP-II). Es una proteína extracelular hidrosoluble Sintetizada por formas asexuadas y Fg jóvenes de P. falciparum del ciclo intraeritrocitario, es un Ag estable. No es adecuado para monitorear tratamiento, puede encontrase postratamiento hasta por 15 días. Enzima lactato deshidrogenasa parasitaria (pLDH) Son Isoenzimas, secretada como producto del metabolismo por las formas sexuadas y asexuadas intraeritrocítaria. El enzima común para las 4 especies, puede ser utilizada para monitorear pruebas que usen Ag muy estables (HRP-II). Antígeno Pan-Malarico (PMA): antígeno común para las 4 especies. Poca afinidad para P.malariae y P. ovale. Se ha visto su prevalencia postratamiento en la presencia de Fg. Aldolasa parasitaria: Isoenzimas. (Aldolasa pan específica).

Antígenos que detectan las Pruebas Rápidas: Prueba Rápida Antígeno que detecta OptiMAL

Lactato deshidrogenasa parasitaria (pLDH) común para las cuatro especies y una (pLDH) específica para P. f.

Core Malaria Proteína II Rica en histidina (HRP-II) específica para P. f, la enzima lactato deshidrogenasa parasitaria (pLDH) específica para P.v y la lactato deshidrogenasa parasitaria (pLDH) común a las 4 especies.

Parasight Proteína II Rica en histidina (HRP-II) específica para P. f,

Now Malaria Proteína II Rica en histidina (HRP-II) específico para P. f y un antígeno PAN malárico (aldolasa) común para las 4 especies parasitarias.



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Prueba rápida OptiMal

Prueba rápida Now malaria

Prueba rápida CORE malaria



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Ventajas y desventajas de las Pruebas Rápidas

MICROSCOPÍA vs. PRUEBAS RÁPIDAS Comparativo Microscopía Pruebas Rápidas. Equipo Microscopio Ninguno Electricidad Preferiblemente Preferiblemente Insumos Colecta sangre, coloración,

insumos, agua. Colecta sangre

Entrenamiento Elevado, Experiencia en lectura.

Mínimo

Duración prueba 25 minutos 25 minutos Intensidad labor Alta Baja Subjetividad Alta Baja Costos Directos Menor Mayor Límite detección 5-10 parásitos/uL 40-100 parásitos/uL Distinción Especie Si Se están realizando avances

Ventajas: -Rápidas -Sencillas -Prueba de campo -Poca muestra. OptiMal: 8-12 µl -Detectan desde 40-100 parásitos /µl. -Resultados: 13 - 25´ -Diagnóstico oportuno. -Control de calidad.

Desventajas: -Mayor costo -No todas diferencian malaria mixta. -No todas diferencian entre malaria por P. vivax, P. ovale y P. malariae -Cualitativas, no cuantitativas -Anticuerpos inestables a T fuera del rango 2 - 30°C -No detectan bajas parasitemias < 40 p/ul. -HRP-II: Ag estable. Rx positiva.



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Cuantificación Posible No es Posible Diferenciación Estado Sexual

Posible No es Posible

Detección de Parásitos Secuestrados

No

Si

TRATAMIENTO CON ANTIMALÁRICOS Objetivos El control de la transmisión de la enfermedad, mediante la curación radical de la infección malárica, evitando así la infección de los anofelinos vectores.

La curación clínica del paciente, ó sea, la eliminación de los síntomas y signos de la enfermedad, la prevención de las recrudescencias y de las complicaciones, mediante la administración oportuna de medicamentos antimaláricos eficaces y seguros.

La curación radical de la infección malárica, ó sea la curación clínica más la eliminación de todas las formas del Plasmodium en el organismo humano, evitando así las recaídas

Criterios para el tratamiento

Identificación de la especie de Plasmodium causante de la infección;

Evaluación de la densidad parasitaria: número de parásitos por ul/ sangre;

Clasificación del caso como de malaria no complicada ó complicada, para lo cual se requiere practicar un examen clínico básico;

Evaluar la tolerancia del paciente al tratamiento por vía oral;

Obtener información sobre episodios maláricos y tratamientos anteriores;

Antecedentes de resistencia a medicamentos antimaláricos, que se debe basar en la evidencia de estudios realizados o en el conocimiento de fracasos terapéuticos.

Nivel de atención de salud donde se diagnostica el caso: todos los casos de malaria no complicada deben ser tratados en instituciones del primer nivel de atención y los casos de malaria grave ó complicada deben ser manejados en un nivel de mayor complejidad.



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ESQUEMAS DE TRATRAMIENTOS: TRATAMIENTO RADICAL DE INFECCIONES A P. VIVAX

CLOROQUINA 3 DÍAS PRIMAQUINA 7 DÍAS GRUPOS DE EDAD 1ER. DÍA 2DO. DÍA 3ER. DÍA 1ER. DÍA 2DO. DÍA 3ER. AL

7MO. DÍA MENORES DE 6 MESES

1/4

1/4

1/4

-

-

-

DE 6 A 11 MESES

1/2

1/2

1/2

1 Inf

1 Inf

1 Inf

DE 1 A 2 AÑOS

1

1/2

1/2

1 Inf

1 Inf

1 Inf

DE 3 A 6 AÑOS

1

1

1

2 Inf

2 Inf

2 Inf

DE 7 A 11 MESES

2

1 1/2

1 1/2

3 Inf

3 Inf

3 Inf

DE 12 A 14 AÑOS

3

2

2

2 Ad

2 Ad

2 Ad

DE 15 O MAS AÑOS

4

3

3

2 Ad

2 Ad

2 Ad

Dosis Cloroquina Base: 1er día 10 mg/kg./PESO 2do dia 7,5 mg/kg./PESO 3er dia 7,5 mg/kg./PESO Dosis Primaquina: 0,50 mg/Kg./PESO/DIA/7DIAS



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Presentación: Cloroquina Tabletas 150 mg Primaquina Adultos Tabletas 15 mg Primaquina Infantil Tabletas 7,5 mg TRATAMIENTO PARA MALARIA NO COMPLICADA POR P. FALCIPARUM

GRUPOS DE EDAD

SULFADOXINA Y PIRIMETAMINA

1er. DÍA

ARTESUNATO

1er. DÍA

ARTESUNATO

2do. DÍA

ARTESUNATO

3er. DÍA

MENORES DE 6 MESES

-

1/4

1/4

1/4

DE 6 A 11 MESES

1/2 1/2 1/2 1/2

DE 1 A 2 AÑOS

1/2 1/2 1/2 1/2

DE 3 A 6 AÑOS

1 1 1 1

DE 7 A 11 MESES

1 1/2 1 1/2 1 1/2 1 1/2

DE 12 A 14 AÑOS

2 2 2 2

DE 15 O MAS AÑOS

3 2 1/2 2 1/2 2 1/2

Dosis Sulfadoxina / Pirimetamina 25 mg/Kg.



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Dosis Artesunato 4 mg/Kg. /3 días Presentación: Sulfadoxina/Pirimetamina: tableta de 500/25 mg Artesunato: tabletas de 100 mg TRATAMIENTO PARA P. FALCIPARUM PARA CASOS COMPLICADOS

Dosis: 10 MG/KG/PESO – Diluida 300cc. Máximo 3 dosis con intervalo de 8 horas. Presentación: Ampollas Biclorhidrato de Quinina 2 ml. =600mg.

DOSIFICACIÓN DE QUININA GRUPOS DE EDAD PESO EN KG. MG. BASE

DE 1 A 3 AÑOS 10 – 14 90 DE 4 A 6 AÑOS 15 – 16 130 DE 7 A 10 AÑOS 20 – 29 200 DE 11 A 15 AÑOS 30 – 40 300 DE 16 O MAS AÑOS 50 600



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Tratamiento para Malaria no Complicada por P. falciparum Segunda Elección Presentación: COARTEM Artemether + Lumefantrine Tabletas: Artemether 20 mg + Lumefantrine 120 mg Indicaciones: No usar en embarazadas o pacientes con malaria complicada) Contraindicaciones: Primaquina: Menores de 6 meses, embarazadas, enfermedades hepáticas, renales o medulares severas, e infantes prematuros.

TRATAMIENTO EN EMBARAZOS Y MENORES DE 6 MESES Clindamicina: 300 a 600 mg C/12 horas por 5 días. + Quinina: 10 mg/Kg. c/8h × 7 días Menores de 6 meses: Clindamicina × 5 días (10 - 20mg/Kg./dia). + Quinina: 8 mg/Kg. c/8h × 7 días Presentación: Frasco × 80 ml. Cada 5 ml. Equivalen a 75 m. de Clindamicina Base

COARTEM NRO. DE TABLETAS HORARIO DE ADMINISTRACIÓN

Niños < 10 Kg.

Niños 10-24 Kg.

Niños 15-24 Kg.

Niños 25-34 Kg.

Adultos > 35 Kg.

0 HORAS NR 1 2 3 4 8 HORAS NR 1 2 3 4 24 HORAS NR 1 2 3 4 36 HORAS NR 1 2 3 4 48 HORAS NR 1 2 3 4 60 HORAS NR 1 2 3 4 TOTAL TABLETAS - 6 12 18 24



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CALIDAD Y CALIDEZ DE ATENCIÓN Objetivo: Motivar al personal de laboratorio a trabajar con calidad y mejorar la relación trabajador de salud – paciente. CALIDAD: La calidad de la atención consiste en la aplicación de la ciencia y tecnología médicas en una forma que maximice sus beneficios para la salud sin aumentar en forma proporcional sus riesgos. El grado de calidad es, por consiguiente, la medida en que se espera que la atención suministrada logre el equilibrio más favorable de riesgos y beneficios. CALIDEZ: Calidez en el servicio no es otra cosa que la amabilidad, la sonrisa y cortesía que el personal de Salud debe de brindar a los usuarios. COMO DEBE DE SER NUESTRO LUGAR DE TRABAJO: El puesto de malaria debe estar equipado para el diagnóstico parasitológico de la malaria, tiene que ser un espacio apropiado, con una buena iluminación y ventilación, que cumpla los requerimientos de bioseguridad. El lugar debe contar con un mesón y con un lavamanos. Del mismo modo, tendrá que estar señalizado con carteles informativos. Todos los equipos deberán ser instalados adecuadamente e identificados de manera clara y precisa, lo mismo que las muestras que se toman a los pacientes. El área de trabajo tiene que mantenerse siempre limpia y ordenada. Y es necesario conocer las salidas de emergencia y la localización y utilización de los extintores y equipos de emergencia. Es conveniente, además, apagar los instrumentos eléctricos antes de manipular las conexiones. RECONOCIMIENTO DEL ENTORNO DE LAS PERSONAS Muchas personas al llegar a los centros médicos pueden traer consigo miedos frente al personal, los uniformes y sus propias enfermedades, esto implica que si además, encuentran un ambiente adverso y hostil, pueden desistir de su consulta y esto afecta el diagnóstico parasitológico, y el tratamiento adecuado de la malaria. Para evitar esta situación la persona deberá encontrar un ambiente amable y acogedor, donde pueda esperar con tranquilidad y donde el personal le brinde la confianza suficiente para hablar sobre lo que le sucede y lo que siente. Haga que a través de sus gestos de amabilidad, el paciente se sienta bien y que, lo que le quiere comunicar, le va a beneficiar, sonría, muéstrese dispuesto y abierto hacía los demás. Sí está ocupado, dígale al paciente con la mano, que lo espere, que ya lo atiende, combinando con amabilidad, respeto y cuidado.



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Para generar cercanía y confianza con el paciente siéntese uno al lado del otro, y verá como la persona, puede presentarle con más facilidad su caso. La identificación y el compromiso con el trabajo se demuestra en como se lleva el uniforme, el cuidado y el respeto por las insignias que representan la institución donde se trabaja, también es un aspecto fundamental, por ello, es importante que el uniforme sea impecable y bien llevado; y al mismo tiempo es necesario ser muy meticuloso con el cuidado personal, haciendo respetar los ideales y las insignias que se representan, teniendo presente que los centros de salud siempre son territorios de paz. Esto permite que la comunidad, tenga como referente de ayuda y de apoyo al personal de salud, lo que a su vez, hace más fácil su identificación en el momento de realizar las jornadas de prevención, atención, diagnóstico y tratamiento de la malaria en dicha comunidad. Actué con naturalidad, es importante que su tono de voz sea adecuado ni muy fuerte ni muy suave, pero que denote que esta seguro del procedimiento que realiza con el paciente. Permita que el paciente se sienta cómodo a través del saludo de bienvenida al examen, muéstrese interesado con sus palabras, esto le dará la oportunidad de romper el hielo. Luego de un corto, pero acogedor saludo de bienvenida, pregúntele a la persona: Si lo atendieron bien o tuvo que esperar mucho, discúlpese si fue así, además puede indagar sobre ¿Cuánto tiempo tardo en llegar aquí?, ¿Cómo se siente?, entre otras, sin dejar de lado los interrogantes propios para el diagnóstico de la malaria. CÓMO ROMPER EL HIELO O LLEGAR A LAS PERSONAS CON MÁS FACILIDAD Para llegar a las personas con mayor facilidad es necesario, tener presente el tipo de población con la cuál se vaya a trabajar, la edad, el nivel educativo de la misma, su estrato socioeconómico y sus necesidades, expectativas e intereses. Se puede iniciar la conversación haciendo un halago sobre la apariencia física de la persona, o expresar el propio gusto sobre comidas, actividades e invitar a la persona que haga lo mismo. Lo descrito le permite comprender si la persona esta ansiosa, nerviosa o angustiada y si es así, busque tranquilizarla con una sonrisa, gesto o mímica que le de confianza, esto es fundamental para propiciar la comunicación verbal. No se debe prolongar mucho el momento de bienvenida, pues lo fundamental es recoger la información para saber como se esta presentando la enfermedad en la región. La comunicación hablada es necesaria para el diagnóstico y control de la malaria, ya que proporciona un conocimiento de los antecedentes de las personas, que permiten determinar si continúan en riesgo de contagio de esta enfermedad. Para comunicarse verbalmente se puede realizar una entrevista informal, que consiste en un diálogo a través del cual se pueden conocer datos básicos sobre el riesgo de la transmisión de la malaria en el lugar donde se encuentra el paciente. Entre las preguntas que se pueden formular están: ¿De dónde viene?, ¿Cuál es el motivo de la consulta?, ¿Qué siente?, ¿Desde cuándo se siente mal?, ¿Hay otras personas de su familia con lo mismo que tiene usted? Etc.

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GUÍA PRÁCTICA DE: PARASITOLOGÍA - ORAS - CONHU Anexo 17q...El hombre es huésped de cientos de especies de parásitos, sin contar a los virus, bacterias y hongos que en general