Guía de laboratorio N0 3. DIVERSIDAD CELULAR I

LA CÉLULA BACTERIANA Y LA CÉLULA FÚNGICA

PRELABORATORIO

Antes de poder abordar el tema de diversidad debes tener algunos conceptos previos. Resuelve el siguiente cuestionario antes de realizar la práctica de laboratorio.

1. Cuales son las principales formas y agrupaciones bacterianas que se pueden encontrar? Diligencia el siguiente cuadro.

Formao agrupación Dibulo Ejemplode microorganismo

2. Existen muchos métodos de tinción de microorganismos, principalmente de células bacterianas. El mas usado es la Tinción de gram. Busca la función y el tiempo de aplicación de cada uno de los siguientes reactivos.

C ristal violeta

Función:

Tiempo de aplicación:

Lugol

Función:

Tiempo de aplicación:

A lcohol acetona

Función:

Tiempo de aplicación:

Fushina

Función:

Tiempo de aplicación:

3. Dentro de las tinciones para microorganismos podemos encontrar las tinciones simples, diferenciales o compuestas y coloraciones especiales, consulta un ejemplo de cada una de ellas y completa el siguiente cuadro.

T inción simple

• Ejemplo:

• Procedimiento:

T inción diferencial

• Ejemplo:

• Procedimiento:

T inción especial

• Ejemplo:

• Procedimiento:

4. Completa el siguiente cuadro comparando algunas diferencias entre la célula bacteriana y fúngica:

Característicascelulares

Célula bacteria Célula fúngica

Pared

M embrana

Organelos

Reproducción

1. OBJETIVOS

Reconocer la estructura de la célula bacteriana y fúngica con el uso de diferentes coloraciones.

Conocer e implementar protocolos de tinción de diferentes montajes.

2. INTRODUCCION

Dentro de los microorganismos se pueden encontrar las bacterias, los hongos y los virus. Para realizar el estudio microbiológico de cualquier muestra, es necesario la puesta en marcha de una serie de procesos estandarizados de laboratorio, que permitan en primer lugar reconocer a los microorganismos presentes. Inicialmente se debe desarrollar una descripción de sus características macroscópicas seguido de una caracterización microscópica de los mismos.

Para realizar una descripción macroscópica de bacterias debemos tener en cuenta los siguientes parámetros: Elevación, Borde o margen, aspecto, consistencia, pigmento o color y olor de la colonia (Tabla 1).

Tabla No.1. Parámetros guía para la descripción macroscópica de Bacterias

Parámetro C lases

Elevación

Plana

C onvexa

Umbilicada

M amelonada

Papilar

Borde o margen

Regular: continuo

Irregular: dentado

L obulado

Filamentoso

A specto

Brillante o traslucida

M ateo opaca

C onsistencia Blanda

Dura

M ucoide

Pigmento o color

A marillo

Blanco

Negro

Gris

Rojo

Olor

A romático

Pútido

A lcohólico

Por otra parte para realizar una descripción macroscópicas de las colonias fúngicas, se deben tener presentes características la apariencia, consistencia, color, anverso reverso de las colonias. Es esencial que la descripción se base en cultivos maduros de 1 a 3 semanas de edad. Se debe tener en cuenta el color de la colonia tanto al anverso como al reverso, así como la producción o no de pigmentos liberados al medio. Es importante anotar en que medio de cultivo estaba creciendo el hongo es decir sobre cual medio se realizó la descripción, ya que en ocasiones la morfología macroscópica de un hongo cambia según el medio de cultivo. Tabla 2.

Tabla No.2. Parámetros guía para la descripción macroscópica de colonias fúngicas

Parámetro Tipos

A pariencia Granular: mas gruesa quepolvorienta

Polvoriento: Como harina,polvo, talco

Aterciopelada: Como terciopeloo pana.

A lgodonosa:Lanosa

Color Brillantes: azul, verde, amarillo,rojo, naranja, blanco, etc.

Dematiáceos: café, gris o negro.

Para poder realizar una descripción microscópica de los microorganismos se hacen necesarias las coloraciones, debido a que por lo general las bacterias, hongos son transparentes y esto dificulta el estudio de los detalles morfológicos cuando se examinan en su estado natural.

Las coloraciones permiten diferenciar formas, agrupaciones, características tintoriales y estructuras de los diferentes microorganismos. A menos que se quiera demostrar alguna característica morfológica específica que dependa del tiempo del cultivo, en general se aconseja que se utilicen medios jóvenes para los métodos de coloración de rutina.

COLORACIONES.

Los colorantes biológicas tienen varias aplicaciones en microbiología, se usan para clasificar las bacterias en Gram positivas y Gram negativas, también para observar las diferentes estructuras microbianas como pared, capsula, espora, flagelo, núcleo y gránulos, tienen utilidad para la observación de levaduras y estructuras, en medios de cultivo se emplean como indicadores o inhibidores selectivos.

Al aplicar un colorante a la preparación microbiana, las bacterias se tiñen haciéndolas resaltar con claridad, debido a la composición química tan diferente con respecto al medio que las rodea, además permite estudiar las características morfológicas y emplear mayores amplificaciones microscópicas.

Al poner en contacto una célula bacteriana con un colorante, ocurre un intercambio de iones entre el colorante y los sitios activos de la superficie o del interior de la célula. Los iones tenidos del colorante reemplazan a los iones de los componentes celulares, por ejemplo, el catión azul de metileno, reemplaza el catión de sodio, dándoles el color.

Según la estructura que el colorante tiñe en la bacteria, las coloraciones se han clasificado en:

-Coloraciones simples: En las que se emplea un solo colorante para el proceso

-Coloraciones compuestas y diferenciales: En estas se usa más de un colorante, y con la misma coloración las células se tiñen de manera diferente.

-Coloraciones especiales: permiten la observación de estructuras especiales de la bacteria como esporas, glicocalix, cápsulas, flagelos.

COLORACIONES PARA BACTERIAS

COLORACIÓN DE GRAM

La coloración de Gram fue descrita en 1884, por el citólogo Christian Gram, para teñir bacterias presentes en los tejidos. Actualmente continúa siendo la más empleada en microbiología, esta clasificada como una coloración compuesta y diferencial, debido a que en el proceso se utilizan dos colorantes: el cristal violeta y la fuscina básica, y dependiendo de la coloración que toma la pared bacteriana se pueden encontrar dos grandes categorías denominadas: Gram positivas (se tiñen de cristal violeta) y las Gram negativas (toman el color de la fuscina básica).

Tabla No 3. Reacción de las células frente a los componentes de la coloración de Gram.

C OMPONENTES GRAM POSITIVAS (másconcentración depeptidoglicano)

GRAM NEGATIVAS (menosconcentración depeptidoglicano, doble capalipídica)

C ristal violeta (colorantebásico)

Bacteriade color violeta Bacterias de color violeta

L ugol (fi jador) Bacteriade color violeta Bacterias de color violeta

A lcohol acetona(decolorante)

Bacteriade color violetaDeshidratación de paredescelulares, retracción deporos, disminución de lapermeabilidad

Bacteria incoloraExtracción de lípidos de lapared, mayor porosidad,liberación del complejocolorante-fi jador

Fucsina básica Bacteriade color violeta Bacteriade color rosado

Coloraciones para hongos

Los métodos de identificación de rutina en el laboratorio son las coloraciones simples como azul de lactofenol, KOH directo de lesiones y cultivos en medios específicos para hongos como Agar PDA, Extracto de levadura, Extracto de malta, Medio Sabouraud, Mycosel, y OGY entre otros.

Colorante azul de lactofenol: colorante que esta compuesto de Ácido Láctico 20g, Cristales de fenol 20g, Glicerina 40g, Agua 20 mL los cuales se mezclan y una vez disueltos se les adiciona 0,05g de azul de algodón. La coloración se fundamenta en que las paredes de los hongos por sus radicales glúcidos (Quitina y/o Glucano ) reaccionan con el Azul de lactofenol tomando una coloración azulosa, coloración que es mantenida gracias al pH ácido que ejerce el ácido láctico y a la Glicerina que actúa preservando la integridad de la pared celular.

Por medio de la observación microscópica se logran observar estructuras como hifas septadas o cenocíticas, esporas, y estructuras reproductivas que sirven como criterio de clasificación.

Figura 1. Algunas estructuras microscópicas fúngicas.

1

21.Esporangio.

2.Esporangiosporas

3.Esporangioforo

4.Rizoides

5.Estolones

3

4

5

Hifa cenocítica Hifa septada

3. MATERIALES Y METODOS

Asas microbiológicas: asas bacteriológicas y micológicas

Aceite de inmersiónAzul de lactofenol

Colorantes de Gram: Cristal violeta, lugol, alcohol, fushinaCubreobjetos

Cultivo de bacterias en agar nutritivo

Cultivo de hongos en agar PDAPortaobjetos

MecherosMicroscopio

Solución salina estéril

Para la observación microscópica de bacterias:

1. Haz el frotis de una colonia bacteriana. Toma una gota de la solución salina esteríl y dispónla sobre el portaobjetos, a continuación esteriliza el asa, enfríala y toma una porción de la colonia bacteriana que quieres observar y homogenízala con la gota de agua.

2. Deja secar al aire por unos minutos y luego flamea el portaobjtetos con el mechero para favorecer la fijación de la muestra al mismo.

3. Realiza la coloración de gram así:

Cristal violeta (1 minuto). Lavar Lugol (1 minuto). Lavar Alcohol acetona (10 a 20 sg). Lavar Fucsina (1 minuto). Lavar y dejar secar

4. Observa en 10x, agrega una gota de inmersión a la preparación y observa en el objetivo de 100x. Diligencia el cuadro correspondiente que encontraras más adelante en la sección de registro de resultados.

Para la observación microscópica de hongos filamentosos

1. Toma una lámina y agrégale una gota de azul de lactofenol. Esteriliza el asa micológica.

2. Destapa el cultivo cerca al mechero y enfría el asa.

3. Toma un inóculo pequeño. Lleva el inóculo a la gota de azul de lactofenol

4. Separa el inoculo con ayuda del asa o un cubreobjetos

5. Coloca la laminilla sobre el montaje evitando que se formen burbujas, observa con el objetivo de 10X y 40X.

Al finalizar la practica lava el material que utilizaste. Limpia y guarda el microscopio en la gaveta correspondiente y deja ordenado el sitio de trabajo.

5. REGISTRO DE RESULTADOS

A. Diligencia el siguiente cuadro para registrar los resultados de la observación microscópica de bacterias.

Colonia Descripción macroscópica

Descripción microscópica

Esquema

1

2

3

B. Describe las colonias fúngicas que observaste y realiza esquemas de las estructuras fúngicas que lograste observar en el montaje con azul de lactofenol.

Colonia Descripción macroscópica

Descripción microscópica

Esquema

1 A pariencia:

Color(A /R):

2 A pariencia:

Color (A /R):

3 A pariencia:

Color(A /R):

(A/R): Anverso/ Reverso

REFERENCIAS

Berdugo y Useche.2010. Manual de prácticas para cursos de Biología celular y molecular.

Lizarazo, L. (2007). Técnicas en microbiología general. UPTC