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Helicobacter pylori: 15 años de investigación en el Eje cafetero
Investigadores principales:
José Ignacio Moncayo Ortiz
Jorge Javier Santacruz Ibarra
Adalucy Álvarez Aldana
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE MEDICINA - DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS
CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y BIOTECNOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
INTRODUCCIÓN
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
GRUPO DE INVESTIGACIÓN
INTEGRANTES
CONTENIDO
“El principal avance de la gastroenterología… la etiología de las enfermedades gastroduodenales ”
Helicobacter pylori causa:
Gastritis
Úlcera gástrica
Úlcera duodenal Barry Marshall Robin Warren
1984
Asociado con el desarrollo de:
Adenocarcinoma del estómago y Linfoma de tejido linfoide asociado a
mucosas (MALT)
INTRODUCCIÓN
Clinical Microbiology Reviews, 20(2): 280–322,2007.
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2005
"for their discovery of the bacterium Helicobacter pylori and its role
in gastritis and peptic ulcer disease"
Barry J. Marshall J. Robin Warren 1/2 of the prize 1/2 of the prize
Australia Australia
NHMRC Helicobacter pylori Research Laboratory, QEII Medical Centre; University of Western Australia Nedlands, Australia
Perth, Australia
1951 1937
Titles, data and places given above refer to the time of the award. Photos: Copyright © The Nobel Foundation
INTRODUCCIÓN
Helicobacter
pylori
Dominio Bacteria Proteobacterias subdivisión ε
Orden Campylobacterales Familia Helicobacteraceae
Género Helicobacter 20 especies: gástricas y no
gástricas (enterohepáticas)
Especies gástricas: H. pylori, H. felis, H. Mustelae, H. acinonychis, H. heilmannii
Especie no gástrica: H.hepaticus
Clin Microbiol Rev 2006; 19:449.
INTRODUCCIÓN
H. pylori en biopsia gástrica. 1000X. Foto Laboratorio
Morfología del bacilo:
Bacilo Gram negativo
Espiral o curvado
4 - 6 Flagelos polares
Ureasa+
Catalasa +
Oxidasa +
Características bioquímicas:
Atmósfera microaerofílica
Medio selectivo/enriquecido
Incubación de 3 – 7 días a 37°C
Condiciones del cultivo:
INTRODUCCIÓN
Clinical Microbiology Reviews. 2007; 20(2):280
H. pylori a partir de cultivo. Tinción de Gram. 1000X. Foto Carlos alexis
Dos copias de los genes 16S, 23S y 5S del ARN ribosomal.
En algunas cepas, se han descrito plásmidos (crípticos).
Cepa 26695 1’667.867 pb 1.587 genes 2001
Cepa J 99 1’643.831 pb 1.491 genes 2001
Cepa HPAG1 1’596.366 pb 1.536 genes 2006
Cepa Shi470 1’608.548 pb 1.647 genes 2008
Cepa G27 1’652.982 pb 1.570 genes 2008
Cepa P12 1’673.813 pb 1.624 genes 2008
Cepa B38 1’576.758 pb 1.576 genes 2009
Cepa B8 1’673.997 pb 1.744 genes 2010
INTRODUCCIÓN
Helicobacter 2004; 9:1.
Am. J. Epidemiol 1996; 144: 290
Colombia Médica 2003;34:124.
Baillière's Clinical Gastroenterology 2007; 21: 205. 35.
INTRODUCCIÓN
Países en desarrollo
Helicobacter pylori
J. Clin. Invest 2004; 113:321
Clin Microbiol Rev 2006; 19:449.
INTRODUCCIÓN
oCo-evolucionado con los humanos
oEquilibrio – Respuesta : Persistencia - Salud
oGastritis histológica – Síntomas
oRiesgo 10%-20% enfermedad ulcero péptica EUP
oRiesgo 1% - 2% cáncer gástrico distal.
oPatologías Factores genéticos, respuesta inmune, factores
ambientales y virulencia de la cepa.
Gen cagA (cytotoxin-associated gene A)
Citotoxina vacuolizante
50% cepas
Proteína de 87 KDa
Variantes s1 s2
m1 m2
Proteína de 120-140KDa
Asociada a Citotoxina
50-60% cepas
Gen vacA (vacuolating toxin A)
Invasivos No invasivos
Directos
Cultivo Diferente muestra (Jugo
gástrico, saliva, heces) Histología
Técnicas Moleculares Antígeno en heces
Indirectos Ureasa rápida Prueba del aliento
Serología
PCR - ureC en biopsia gástrica, positivas y negativa
para H. pylori. Foto laboratorio.
Cultivo de biopsia gástrica. Positivo para H. pylori. Foto laboratorio
Exámen histológico de biopsia gástrica. Positivo para H. pylori.
Foto laboratorio PRU, prueba de ureasa rápida en biopsia
gástrica. Positivo y negativo para H. pylori. Clinical Microbiology Reviews. 2007; 20(2):280.
INTRODUCCIÓN
Pacientes H. pylori positivos con: úlcera duodenal o úlcera gástrica,
linfoma tipo MALT, gastritis con cambios micro y macroscópicos severos y
después de resección de cáncer gástrico temprano.
Terapia triple: inhibidor de bomba de
protones (IBP), claritromicina y
amoxicilina.
Tratamiento
de elección
Antimicrobianos
más usados Claritromicina (CLA, 57%); amoxicilina
(AMO, 73%); metronidazol (MTZ, 37%) y
tetraciclina (TET).
INTRODUCCIÓN
Rev Col Gastroenterol 2007; 22: 7-16.
Comparación entre la PCR y los métodos de rutina
en la infección con H. pylori y detección del gen
cagA en pacientes con enfermedad ulcero péptica
en Risaralda.
Finalizado en 1999 - Financiado por Colciencias
Publicaciones:
Revista Médica de Risaralda. 5(2):10-14,1999.
MEDUNAB. 3(8):69-75, 2000.
Revista Médica de Risaralda. 8(1):4-10, 2002.
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
73 pacientes con Enfermedad Ulcero Péptica
Número de biopsias por paciente
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
Antro Cuerpo
Incubación microaerófila,
37◦C, 4 -12 días
Tinción con
azul de toluidina
Antro Cuerpo Antro
Incubación de 1 a
24horas, consultorio.
Antro
Extracción de ADN
y PCR-ureC
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
CULTIVO UREASA HISTOLÓGICO PCR
33%
69%
89% 82%
100%
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
Cultivo es la regla de
oro
Histológico y PCR
PRU, técnica de rutina
unidad de endoscopia
Un único método
86% de los pacientes
Baja sensibilidad
“microorganismo exigente”
Mayor número de casos
Sensibilidad y especificidad
debe ser evaluada
No cubre todos los casos
Cultivo o dos métodos positivos
Infectados con H. pylori
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
21 aislamientos tipificados para el gen cagA y las variantes de los
genes vacA.
Extracción de ADN
PCR-cagA y vacA
Aislamientos de H. pylori
Resultados
Gen cagA 90.5%
Variantes vacAs1m1 81.0%
“Correlaciona con lo descrito en
aislamientos de H. pylori en pacientes
con EUP, ya que en estos pacientes
están las cepas más virulentas”
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
18 aislamientos, con cinco repiques de colonias únicas sometidas
a RAPD
Pool
Subcultivos de cinco
colonias únicas de cada
aislamiento
Extracción de
ADN
RAPDs
“Solo uno de los 18 aislados de los pacientes presentaba dos patrones”
Estudio comparativo de dos pruebas rápidas de
ureasa elaboradas en el laboratorio de
Microbiología de la Universidad Tecnológica de
Pereira frente a una comercial para la detección
de H. pylori en biopsia gástrica.
Finalizado en 2002 - Financiado por premio
Universidad El Bosque
Publicaciones:
Revista Médica de Risaralda. Pereira,13(1):5-13. 2007.
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
Determinar la sensibilidad y especificidad de dos pruebas de
ureasa fabricadas en el laboratorio.
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
53 pacientes con síntomas dispépticos
Tres biopsias antrales
22 pacientes con la prueba comercial positiva.
PRU Líquida PRU Sólida
Tiempo de Lectura Sensibilidad Especificidad Sensibilidad Especificidad
24 horas 100% 100% 100% 100%
5 horas 91% 100% 100% 100%
1 hora 77% 100% 82% 100%
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
Buen resultado:
rango de lectura mínimo de 5 horas.
Las pruebas fabricadas localmente:
deben ser primero evaluadas en su
sensibilidad y especificidad y definir con exactitud el
tiempo de lectura necesaria para que el resultado sea
confiable.
Comparación de métodos diagnósticos en la
infección por H. pylori en el Departamento del
Quindío.
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
Finalizado en 2003 - Financiado por Vicerrectoría de
Investigación, Innovación y Extensión, UTP.
Publicaciones:
Colombia Médica. 37:203-212. 2006
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
Número de biopsias por paciente:
73 pacientes con síntomas dispépticos
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
“Una prevalencia de la infección de 97.3 % (71/73) por definición de caso”
Histológico
Cultivo
PRU
PCR
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
El examen histológico mostró diferencias significativas
frente a los otros métodos.
Por lo que, si no es posible emplear el concepto de
definición de caso se recomienda el examen histológico por
lo menos en dos biopsias (antral y cuerpo).
Prevalencia de H. pylori en estudiantes con
síntomas dispépticos de la Universidad
Tecnológica de Pereira
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
Finalizado en 2005 - Financiado por Vicerrectoría de
Investigación, Innovación y Extensión, UTP.
Publicaciones:
Revista Médica de Risaralda 11(1):17-25, 2005
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
“Una prevalencia de la infección de 88 % por definición de caso”
Correlacionado con la prevalencia en adultos jóvenes en países en desarrollo
comparado con 20 al 50% en los países industrializados.
94,3% con la patología mas frecuente que fue la gastritis.
Susceptibilidad antimicrobiana en aislamientos de
H. pylori de pacientes dispépticos de las ciudades
de Pereira y Armenia
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
Finalizado en 2007 - Financiado por Vicerrectoría de
Investigación, Innovación y Extensión, UTP.
Publicaciones:
Revista Médica de Chile 2009; 137: 1309-1314
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
Las fallas en la terapia se relacionan a un incumplimiento
del régimen terapéutico por parte del paciente y al
desarrollo de resistencia antimicrobiana.
Las tasas de resistencia a los antimicrobianos en H. pylori
difieren entre países e incluso entre las distintas áreas de
un país.
88 aislamientos de la colección obtenida desde 1999 al año
2003.
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
Detectar la resistencia in vitro a los antimicrobianos
metronidazol, claritromicina, amoxicilina y tetraciclina en
los aislamientos de Helicobacter pylori.
Detectar las mutaciones A2142G y A2143G en el ADN
ribosomal 23S, que confieren resistencia a claritromicina,
en los aislamientos de Helicobacter pylori.
A partir del vial a ‐70◦C
Incubación microaerófila,
37C, 3 - 5 días
DETECCIÓN DE RESISTENCIA EN CADA UNO DE LOS AISLAMIENTOS DE H. pylori
1. Método E-test
MTZ CLA
AMO TET Patrón de
Turbidez
McFarland 3:
Aislamiento y
Cepa control
ATCC 43504
Incubación microaerofila,
37C, 3 días
Lectura del MIC
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
2.1 Purificación del producto
de PCR HPYS-HPYA
2. Método molecular
PCR-RFLP
Extracción ADN
PCR: HPYS-HPYA
2.2 Corte con endonucleasa
de restricción
BsaI MboII o BbsI
Incubación O.N
2.3 Corrido de la restricción:
observación de las mutaciones
3. Confirmación de las mutaciones
observadas en PCR-RFLP por secuenciación
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
De los 88 aislamientos ninguno fue resistente a tetraciclina o
amoxicilina, el 2,2% (2/88) fueron resistentes a claritromicina y
el 88% (68/88) fueron resistentes a metronidazol.
Los aislamientos resistentes a claritromicina presentaban la
mutación A2143G. No se encontraron mutaciones en los 86
aislamientos sensibles a claritromicina.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
60
300
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
La primera vez que se hace un reporte de aislamientos
resistentes en estas ciudades.
La alta tasa de resistencia a metronidazol encontrada en este
estudio, precluye el uso de este antimicrobiano en el
tratamiento empírico de la infección por H. pylori en esta
población.
Los otros tres antimicrobianos tamizados, no presentan
inconvenientes para su utilización debido a su baja o nula
resistencia.
Comparación de dos protocolos de erradicación
de H. pylori
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
Finalizado en 2007 - Financiado por Vicerrectoría de
Investigación, Innovación y extensión, UTP.
Publicaciones:
Revista Médica de Risaralda 2007; 13(2) 1309-1314.
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
41 pacientes dispépticos H. pylori positivos.
Tratamiento durante una semana con 1gr/día de
claritromicina y 2gr/día de amoxicilina, más uno de los
siguientes anti ulcerosos: 800mg/día de ranitidina bismuto
citrato (RBC) (n₌22) ó 40mg/día de omeprazol (n₌19).
La erradicación de la infección, se consideró cuando el test
de antígenos fecales de H. pylori fue negativo 4-6 semanas
después del tratamiento.
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
No hubo diferencias significativas entre los grupos respecto a
variables biológicas y tolerabilidad del tratamiento.
Los dos regímenes, resultaron similares en sus tasas de
erradicación (79% omeprazol vs 91% RBC, p₌0.39).
Las mutaciones en el ADNr 23S, se encontraron en tres de los
cuatro pacientes para quienes fracasó el tratamiento.
En conclusión, los dos esquemas son comparables en
efectividad y seguridad para el tratamiento de la infección por
H. pylori. La resistencia de la bacteria a la claritromicina es la
principal causa del fracaso en su erradicación.
Prevalencia de H. pylori en pacientes con
síntomas dispépticos que consultan a unidades de
endoscopia de Manizales
Finalizado en 2009 - Financiado Vicerrectoría de
Investigación, Innovación y Extensión, UTP.
Publicación: Investigaciones Andina 2011, 13 (23):
297-311.
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
Se estudiaron 72 pacientes con síntomas dispépticos.
“Una prevalencia de la infección de 88,1 % por definición de caso”
Muy baja sensibilidad del cultivo, consumo de IBP?, Medio de cultivo?
Detección de susceptibilidad y resistencia en
aislamientos de H. pylori de pacientes del eje
cafetero
Finalizado en 2009 - Financiado Vicerrectoría de
Investigación, Innovación y Extensión, UTP.
Publicaciones:
Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9): 4022–4024, 2009.
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
La resistencia a metronidazol, claritromicina y amoxicilina se
encontró en el 82, 3,8, y 1,9% de 106 aislamientos de H. pylori,
respectivamente. Ningún aislamiento fue resistente a
tetraciclina.
Resistentes a metronidazol Resistentes a claritromicina
Ciudad Armenia Manizales Pereira Armenia Manizales Pereira
n/Total 38 (41) 12 (13) 38 (52) 1 (41) 2 (13) 1 (52)
Porcentaje 92 93 73 2,4 15,4 1,9
Año 2003 2009 1998-2002 2003 2009 1998-2002
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
En todos los aislamientos resistentes a la claritromicina, sólo
una mutación puntual estaba presente, la A2143G o la
A2142G.
Nativo,
aislamiento 2M
A2143G,
aislamiento 21EP
A2142G,
aislamiento 6M
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
La concentración inhibitoria mínima varía de acuerdo con el tipo de
mutación, la mutación A2142G se asocia con CIMs ≥64 mg/L y la mutación
A2143G con CIMs ≤ 64 mg/L. La mutación más frecuente a nivel mundial es
la A2143G. Nuestros resultados fueron similares a lo previamente descrito.
El 71% de las CIM en los aislamientos resistentes a MTZ fue mayor a 256mg/L
RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN
En conclusión, hemos detectado, aislamientos de H. pylori resistentes a
metronidazol, claritromicina y amoxicilina de pacientes con síntomas
dispépticos en eje cafetero de Colombia.
Con base en estos resultados es necesario que en todo el país se realice una
vigilancia epidemiológica de la evolución de la resistencia en este
microorganismo, ya que es necesario conocer qué ocurre en este aspecto en
cada lugar geográfico del país, para orientar los esquemas de tratamiento.
No utilizar metronidazol en el tratamiento.
Además, los datos de un país en desarrollo como Colombia, contribuyen al
conocimiento de las estadísticas epidemiológicas mundiales de la resistencia
del H. pylori.
PROYECTO NIUEVO DE LA LINEA
CARACTERIZACION DEL FENOTIPO Y GENOTIPO DE PERFILES
ANTIMICROBIANOS EN AISLAMIENTOS DE HELICOBACTER PYLORI OBTENIDOS
DE PACIENTES DISPEPTICOS DEL EJE CAFETERO
FINANCIADO
CONVOCATORIA INTERNA UTP
2012
CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Y BIOTECNOLOGÍA
FUNDADO EN 1995
GRUPO DE INVESTIGACIÓN
INTEGRANTES
Investigadores asociados que participan o han participado y su papel:
Beatriz Franco O. Patóloga. Examen histológico.
Manuel Alfonso López B. Patólogo. Examen histológico.
Emiro Meissel Chinchilla. Gastroenterólogo. Toma de biopsias y PRU en Pereira.
Fabio Salazar J. Gastroenterólogo. Toma de biopsias y PRU en Pereira.
Sonia Valencia Yepes. Médica. Consulta con estudiantes en Pereira.
Solangel Cano Giraldo. Médica. Consulta con estudiantes en Pereira.
Mario Santacoloma. Gastroenterólogo. Toma de biopsias y PRU en Manizales.
Brenda Lucía Arturo. Gastroenteróloga. Toma de biopsias y PRU en Manizales.
Alberto Angel. Gastroenterólogo. Toma de biopsias y PRU en Armenia.
Carlos Alberto Isaza. Farmacólogo.
Asesores estadísticos:
Herman Serrano L. PhD .
José William Martínez. PhD.
Cálculo tamaño de muestra y comparación de métodos diagnósticos
INTEGRANTES
Investigadores principales y su papel:
José Ignacio Moncayo Ortiz. MSc.
Jorge Javier Santacruz Ibarra. MSc.
Adalucy Álvarez Aldana. MSc .
Cultivo de las biopsias.
Identificación de los aislamientos.
Almacenamiento de los aislamientos.
Pruebas de biología molecular.
Almacenamiento de la información.
Análisis de los resultados.
Escritura de informes y artículos.
Consecución de recursos
Estudiantes dirigidos y tesis:
Maestría: 5
Especialización: 2
Pregrado: 2
GRACIAS CONTACTO:
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y
PARASITOLOGÍA
3215393 Ext 15
