Profª. Dr. Deuzuitadeuzuitasantos@globo.com

O termo histologia foi usado pela primeira vez em 1819 por Mayer

Mayer fez a conjunção do termo histos = tecido e logos = estudo.

Tecido

Um conjunto de células que apresentam mesma forma, mesma função e mesma origem embrionária?

Não possui muita sustentação histológica-

O sangue:

hemácia (disco bicôncavo, anucleado na maioria dos animais domésticos)- transporta oxigênio e gás carbono

neutrófilo- é uma célula fagocitadora.

TECIDO é um conjunto de células que apresentam a mesma função geral e a mesma origem embrionária.

Espermatozóide e o óvulo – fecundação –zigoto

sucessivas mitoses- clivagem. Cada célula é chamada de blastômero (totipotentes)

Mórula

Blástula

Gástrula- Ectoderma, endoderma

A partir do endoderma forma-se o mesoderma

Ectoderma forma-se o tecido nervoso e alguns epitélios de revestimento;

Mesoderma origina-se a maioria dos tecidos conjuntivos e musculares;

Endoderma alguns epitélios de revestimento.

Epitelial

Conjuntivo

Muscular

nervoso

Os tecidos são constituídos por células e matriz extracelular

A matriz extracelular - fibrilas de colágeno e membranas basais.

pesquisa biomédica - células produzem a matriz extracelular mas são influenciadas e controladas por moléculas da matriz.

Células e matriz extracelular formam uma entidade continua que funcionam conjuntamente e reagem frente a estímulos e inibidores.

O tamanho pequeno das células e dos componentes de matriz torna a histologia dependente do uso de microscópios.

O método mais utilizado em Histologia é o preparado histológico permanente (lâmina histológica) estudado em microscópio óptico.

Os tecidos devem ser seccionados para se obterem cortes delgados

Micrótomo -

Artefatos- distorções e perda de componentes celulares

1ª ) Coleta da Amostra

a) Biópsia cirúrgica

b) Biópsia endoscópica – usada para órgãos ocos (estômago, intestino, etc) através de endoscopia;

c) Biópsia por agulha – a amostra (cilindro) é obtida pela punção do órgão (fígado, pulmão), sem precisar abrir a cavidade natural;

d) Cirurgias amplas (radicais) – a amostra corresponde a peças grandes (ex. tumores) ou órgãos (ex. mama, útero);

e) Necrópsia.

2º) Fixação- pode ser: Químicas- para microscopia óptica- solução isotônica

tamponada de formaldeído a 4%. Microscópio eletrônico-solução de glutaraldeído tamponado, seguida por uma segunda fixação em tetróxido de ósmio,

físicos- utilizando-se o calor ou o frio. O tempo de fixação varia de acordo com o tamanho da

peça, constituição do tecido, poder de fixação do fixador, objetivos a pesquisar e temperatura ambiente.

De forma geral, tendo o fragmento, a ser fixado, uma espessura de 4 mm o tempo mínimo de fixação é de doze (12) horas.

Obs: Para que se possa examinar o tecido ósseo ou tecido com áreas de calcificação, deve-se antes de processá-lo, incluí-lo e cortá-lo, proceder à descalcificação .

a) O material coletado deve ser imerso rapidamente no fixador;

b) O volume de fixador deve ser no mínimo dez vezes (10 X) maior que o volume da peça coletada.

Objetivos da fixação: a) Inibir ou parar a autólise tecidual; b) Coagular ou endurecer o tecido e tornar difusíveis as

substâncias insolúveis; c) Proteger, através do endurecimento, os tecidos moles

no manuseio e procedimentos técnicos posteriores; d) Preservar os vários componentes celulares e tissulares; e) Melhorar a diferenciação óptica dos tecidos; f) Facilitar a subsequente coloração.

3ª) Processamento:

Para que o grau de firmeza seja atingido, o tecido deve ser completamente impregnado com algum meio de sustentação que manterá juntas as células e as estruturas intercelulares.

Os materiais de sustentação usados são denominados materiais de inclusão.

Certos materiais de inclusão, tais como “Carbowax” e a gelatina são solúveis em água e os tecidos não precisam ser desidratados antes do uso.

4ª) Desidratação- imergindo o bloco de tecido em concentrações crescentes de álcool etílico.

O álcool é o agente mais utilizado (70% - 80% - 90% - 100%) para se evitar a retração pronunciada do tecido ocasionando lesões estruturais da célula de caráter irreversível.

O álcool endurece mais o tecido.

O volume de álcool deverá ser 10 a 20 vezes maior que o volume da peça.

5ª) Diafanização (Clarificação) - consiste na infiltração do tecido por um solvente da parafina que seja ao mesmo tempo desalcolizante.

A parafina não se mistura com água e nem com álcool. Ambos devem ser completamente removidos para que a parafina possa penetrar eficientemente no tecido.

O xilol é comumente utilizado. É chamado de agente clarificador porque torna o tecido semi-translúcido, quase transparente.

Os reagentes mais utilizados são: toluol, clorofórmio, óleo de cedro, benzol e salicilato de metila.

6ª) Inclusão (Impregnação)

A finalidade é eliminar completamente o xilol contido no material e a total penetração da parafina nos vazios deixados pela água e gordura, antes existentes no tecido.

Este processo serve também para preparar o material para os cortes, removendo o clarificante e endurecendo-o suficientemente e dando-lhe a consistência adequada para que possa ser cortado.

7ª) Microtomia

Para se obter cortes de material incluído em parafina ou por congelação é necessário um instrumento especial: o micrótomo.

8ª) Colagem do Corte à Lâmina

As fitas de cortes de parafina são estiradas cuidadosamente e os cortes individuais são separados por um bisturi.

Na superfície de uma lâmina de vidro é feito um ponto de aderência (normalmente com albumina de ovo) e o corte de parafina é colocado em banho-maria (água morna) de forma que as dobras provocadas pelo corte no tecido desapareçam.

9º) Coloração

Dentre todos os corantes, a combinação de hematoxilina e eosina (HE) é a mais comumente usada.

A hematoxilina cora em azul ou violeta o núcleo das células e outras estruturas acidas (como porções do citoplasma ricas em RNA e a matriz da cartilagem hialina).

A eosina- cora o citoplasma e o colágeno em cor-de-rosa.

Antes que o corte seja corado, a parafina em que ele foi incluído deve ser removida.

Existe um grande número de técnicas.

10ª ) Montagem Depois que o corte tiver sido corado com a solução apropriada,

ele é passado através de concentrações crescentes de álcool para remover, de novo, a água.

Finalmente, o corte é banhado em xilol antes de ser montado em um meio solúvel em xilol, que é o meio de montagem (para os cortes de parafina é usado o Bálsamo de Canadá).

Uma gota do meio de montagem é colocada sobre o corte e a lamínula é posicionada sobre o corte de forma delicada, de uma forma tal que o meio de montagem cubra completamente o corte.

Depois a lamínula é comprimida com firmeza sobre o corte e o meio de montagem se espalha formando uma delgada película entre a lâmina e a lamínula que posteriormente vão estar firmemente aderidas uma à outra pela estabilização do meio de montagem.

MICROSCOPIA DE LUZ - preparações coradas são examinadas por iluminação que atravessa o espécime.

Resolução- a menor distancia entre duas partículas ou duas linhas que permite que elas sejam vistas como dois objetos separados.

MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE E DECONTRASTE DIFERENCIAL DE INTERFERENCIA-

permitem a observação de células e cortes não corados.

MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO- raios de luz passam através de um filtro polarizador (como um filtro Polaroid), eles saem vibrando em uma só direção.

MICROSCOPIA CONFOCAL- ele torna possívelfocalizar um plano de foco muito delgado do

espécime. MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA- Substancias

fluorescentes com afinidade por moléculas presentes nas células ou na matriz podem set usadas como corantes fluorescentes, como o alaranjado de acridina, que pode combinar-se com o DNA e o RNA.

Microscopia Eletrônica de Transmissão- Técnicas de congelação permitem o exame

de tecidos por microscopia eletrônica sem a necessidade de fixação e inclusão em resina.

Com estas técnicas ha menos artefatos. Tecidos congelados podem ser seccionados e

submetidos a técnicas citoquímicasimunocitoquímicas ou podem ser fraturados (criofratura, freeze fracture) para fornecer detalhes da estrutura interna de membranas celulares.

Microscopia Eletrônica de Varredura- fornece imagens pseudotridimensionais das superfícies de células, tecidos e órgãos.

Mostra somente uma visão de superfícies.

O interior de órgãos pode ser analisado congelando células ou órgãos e em seguida fraturando-os para expor as suas superfícies internas.

RADIOAUTOGRAFIA EM SECÇÕES DE TECIDOS- permite a localização de substancias radioativas em tecidos pelo efeito de sua radiação em emulsões fotográficas.

Precursores- aminoácidos radioativos, nucleotídeos radioativos, açucares radioativos etc.

CULTURA DE CELULAS E TECIDOS As células e os tecidos são cultivados em soluções de

composição conhecida (sais, aminoácidos, vitaminas) as quais são frequentemente adicionados componentes do

soro. As células devem ser inicialmente separadas

mecanicamente ou por meio de tratamento enzimático. Culturas primarias- células cultivadas em suspensão ou

sobre uma placa de Petri ou sobre uma lamínula de vidro, superfícies sobre as quais elas costumam aderir e crescer sob forma de uma única camada de células.

Transformação- oncogênes

A cultura de células tem sido extensamente usada para o estudo do metabolismo de células normais e cancerosas e para o desenvolvimento de novos fármacos.

Esta técnica também é útil para o estudo de microorganismos que só crescem no interior de células, como os vírus, micoplasma e alguns protozoários.

Em citogenética, a determinação do cariótipo pode ser realizada pelo cultivo de linfócitos do sangue ou de fibroblastos da pele.

FRACIONAMENTO CELULAR- processo físico pelo qual e usada forca centrifuga para separar organelas e componentes celulares em função de seus coeficientes de sedimentação.

HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA- métodos que identificam e localizam substancias tanto em cortes histológicos como em células cultivadas.

Estes métodos normalmente originam substancias

insolúveis coloridas ou eletro-densas, que permitem a

localização de átomos ou moléculas por microscopia de luz ou eletrônica.

Muitos procedimentos histoquímicos são usados em diagnostico laboratorial.

A reação de Perls para ferro, as reações de PAS-amilase para glicogenio e Alcian blue para glicosaminoglicanas são habitualmente aplicadas a biopsias de tecidos de pacientes em que se quer diagnosticar doenças em que se acumulam nos tecidos quantidades elevadas de ferro (por exemplo, hemocromatose, hemossiderose), glicogênio (glicogenoses), glicosaminoglicanas(mucopolissacaridoses) e esfingolipídios (esfingolipidoses).

Marcadores- podem ser visto por meio d e um microscópio de luz ou eletrônico

Os marcadores mais usados são:

substancias fluorescentes

átomos radioativos

Moléculas de enzimas como a peroxidase

metais (geralmente partículas de ouro).

Imunocitoquímica- uma interação altamente especifica entre moléculas e aquela que ocorre entre um antígeno e seu anticorpo.

HIBRIDIZACAO IN SITU -é excelente para averiguar se uma célula tem uma sequencia especifica de DNA

Distorções e Artefatos Causados pelo Processamento dos Tecidos

A Totalidade do Tecido- uma grande dificuldade apresentada por cortes de microscopia de luz é a impossibilidade de se corar diferencialmente todos os componentes das células e tecidos em um só preparado.

Duas Dimensões e Três Dimensões- quando uma estrutura tridimensional e cortada em secções muito delgadas, as secções parecem ter só duas dimensões: comprimento e largura.

Isto frequentemente conduz o observador a erros se ele não se conscientizar de que uma esfera seccionada se parece com um circulo e que um tubo seccionado se parece com um anel