HİSTOLOJİK TEKNİKLER I

Prof.Dr.Emel KOPTAGEL

Histoloji, dokuları inceleyen bir bilim dalıdır. Dokuların yapısının araştırılması yanısıra ikincil

olarak tek tek hücrelerin ayrıntılı yapısını da araştırır. Histoloji ve sitoloji birbirleri ile yakın ilişkilidir.

Canlı dokuların mikroskobik incelenmesi ile ideal sonuçlara ulaşılır. Ancak sadece küçük ilkel canlılar bu

yolla incelenebilir. Dokuların çoğu bu yolla incelenemeyecek kadar kalındır. Histolojik tekniklerin çoğu

canlı dokuya en yakın bir biçimde korunmuş veya fikse edilmiş öldürülmüş dokulara uygulanır. Ölü

dokulardan hazırlanan histolojik preperatların canlı dokulardan daha farklı olduğunu unutmamak gerekir.

Bu değişiklikler artifakt olarak adlandırılır. Artifaktlar herhangibir işlem basamağında ortaya çıkabilir.

Dokuda en az hasara yol açacak yöntemler kullanılmalıdır.

Sitolojik ve histolojik çalışmalardaki amaç, organizmayı oluşturan hücre, doku ve organların

normale yakın bir şekilde morfolojik olarak mikroskop altında incelenmesidir. Bu da ancak histolojik ve

histokimyasal teknikler sayesinde olabilmektedir. Histokimya 1830’dan bu yana ayrı bir bilim dalı olarak

gelişmiştir. Ancak 1899-1928 yıllarında anilin boyaların histolojide kullanılmaya başlamasıyla büyük bir

atılım olmuştur.

Preparat hazırlamak için çok teknik vardır. Bunların çoğu değişik tip mikroskoplarda incelenen

kesitlerin hazırlanması ile ilgilidir. Tek bir yöntem tek bir boyama yöntemi dokunun ne tüm hücrelerini ne

de hücre bileşenlerini ayrıntılı gösteremez. Çok az bir doku örneğinin boyanması ile morfoloji,

histokimyasal ve immünolojik yöntemlerle fonksiyonel özellikleri, elektronmikroskopi ile de ince yapı

gösterilebilir.

Histologlar, tekniğin neden kullanıldığını, nasıl çalıştığını ve yöntemin ayrıntılarını bilmelidir.

Uygun zaman içinde, dokudan mümkün olan en fazla bilgi edinilmelidir. Teknikler dikkat ve beceri ile

uygulanmalı sonuçlar doğru yorumlanmalıdır.

Histolojide Kullanılan Yöntemler

1-Preparasyon Yöntemleri

Taze hücre ve dokular: Kan ve lenf gibi sıvısal örnek hücreleri, derialtı bağ dokusu hücreler direkt

olarak incelenebilir. Doku kalın veya katı bir organ halindeyse tuz çözeltisi içinde diderek veya

ayırarak hücrelerin birbirinden ayrılması sağlanır. Taze preparatlarda hücreler gerçek

morfolojilerini yitirmeden incelenir. Ancak kontrast azlığından dolayı vital boyama uygulanmalı ya

da faz-kontrast mikroskop kullanarak incelenmelidir.Canlı ve taze materyelin

çalışılması için lam ve lameller temiz olmalı. Canlı numuneler için

kullanılan pipetler, cam eşyalar ve aletler kimyasal maddeler için

kullanılanlar ile asla karıştırılmamalıdır. Herbir kültürden alınacak

2

küçük organizmalar için ayrı bir pipet kullanılır. Her kimyasal madde için

de ayrı pipet kullanılmalıdır. Saf kültür için çalışmaya başlanmadan önce

cam eşyayı ve ortamı sterilize etmek gereklidir. Canlı ve taze materyel için

bright-Field illumination- ışıklandırma dikkatli kontrol edilmeli, çünkü

canlı hücrenin birçok yapısı refraktif indeks veya renkte çok az fark

ile ayırt edilir. Küçük ve şeffaf organizmalar, serbest yaşayan protozoalar,

küçük sölenteratlar, rotiferler, ectoproct lar, yassı kurtlar, nematod lar

snnelidler, krustaseler ve omurgasızların ve aşağı omurgalıların larvaları,

embriyoları ve yumurtaları bir iki damla su içinde incelenebilir. Tatlı su

ve toprakta yaşayanlar tatlı suda ve deniz suyu veya tuzlu ve acı suda

yaşıyanlar uygun tuzluluktaki suda incelenirler. Ancak su metaller,

chlorine veya diğer zehirler ile kirlenmemiş olmamalıdır.Tatlı su

organizmaları için havuz veya kültür kabından alınan su yeterlidir. Deniz

suyu yalnız cam, porselen, toksik tipte olmayan bazı plastik ile temasta

olmalı, metal borular birçok organizma için toksiktir.

Vital boyama ile hücrelerin sitoplazmasına renk ve kontrast kazandırılır. Vital boyama 2 şekilde

uygulanır. Canlı hücreler boya solusyonunda ayrılarak (supra-vital boyama ) veya canlı organizmaya

boyanın injeksiyonu ile (intra-vital) boyanabilirler. Canlı hücre kısımları gösterildiğinden bu yöntemler

idealdir. Vital boyama ile sitoplazmik yapılar gösterilir. Çekirdek zarı vital boyalara dirençlidir. Çekirdek

zarının boyalara geçirgenleşmesi hücre ölümünün ifadesidir.

2-Sitolojik Yöntemler

Hücre içeren sıvılar, aspire kemik iliği gibi ince doku parçaları lam üzerine alınır ve hücrelerin

görünüşlerini koruyabilmeleri için tespit edilir. Organlar ve dokular da lama sürülerek ve smearler hücre

yapısını göstermek için boyanırlar. Boyanmış smearlerin incelenmesi eksfolyatif sitolojide standart bir

yöntemdir. Atipik hücrelerin bulunuşu malignite hakkında fikir verir. Diagnostik sitolojideki gelişmeler

Beale (1860) ‘nin karsinoma hücreleri için vücut sıvılarını incelemesi ile başlamış ve Papanicolaou (1943)

yöntemi ile ilerlemeler kaydetmiştir.

Dalak ve kemik iliği gibi organlarının kesi yüzeyine veya organın bir parçasına lam değdirilerek

uygulanan impression yöntemi ile dokunun küçük bir artitektürel düzeni hakkında fikir edinilebilir.

Yumuşak tümörlerde malignite bu teknikle hızla çalışılabilir.

Smearlerde hücreler yassıldıkları, dokulardan hazırlanan kesitlerdeki hücrelerden daha geniş

olduklarından ve dokunun artitektürünü koruduklarından hücresel ayrıntılar daha kolaylıkla izlenir.

Kesitsel tekniklere ek olarak smearler kullanılabilir.

3-Kesitsel Yöntemler

3

Doku parçalarından alınan örnekler yaklaşık olarak 1 hücre kalınlığında dilimlere ayrılırlar.

Hücresel yapıyı görmek için bu kesitler değişik tekniklerle boyanırlar. Kesitlerin yorumu, kesitler dikey

ya da yatay konumda alınmamışsa tecrübe gerektirir.

Histolojide doğru sonuç veren birçok kesitsel yöntem vardır. Seri kesitlerin alınması ile küçük bir

dokunun rekontriksüyonu yapılabilir. Tüm örneklerden numaralandırılarak kesitler alınır, boyanır ve

incelenir. Doku büyük ise belirli aralıklarla alınan kesitler örneğin tüm yapısını kapsamlı olarak

açıklayabilir. Bu yöntem basamaklı kesit alma (step-sectioning) olarak bilinir.

Taze veya tespit edilmiş dokulardan jilet ile mikrotomsuz kesit alınabilir. Sadece yüzey

boyanacağından histolojik yapı iyi gözlenemez. Bu yöntem hala dokuları tanımanın hızlı ve kolay yoludur.

Mikrotom kullanarak uygulanan kesitsel yöntemlerin çoğunda doku uygun bir kıvama getirilir,

parafin, selloidin veya sentetik resinlere gömülür ya da dondurma (freezing) yapılabilir. Frozen kesitler

taze dokulardan alındığı için tespite gerek duyulmaz. Diğerleri için tespit gereklidir.

Histolojik kesitler genellikle 4-7 m kalınlığında alınır. Yağ damlacıkları, sinir fibrilleri ve kan

damarları gibi geniş yapılar için 10-25 m daha uygundur. Sentetik rezinlere gömülen dokulardan 1

m’luk kesitler alınabilir. Doğal olarak hücresel ayrıntı daha iyi olacaktır. Elektronmikrospobik gözlemler

için ultratom ile 50-100 nm’ lik kesitler alınır. Genellikle gösterim ve eğitim için çıplak gözle incelemek

üzere 300-400 m’ luk kesitler alınabilir. Bu amaçla jelatine gömülmüş organlardan geniş bir mikrotom ile

kesitler alınarak incelenir.

Dokuların çoğu yumuşaktır. Dişler, kemik gibi bazı dokular ise çok serttir. Bu nedenle kesitten

önce dekalsifikasyona gereksinim vardır. Matriksin kalsifikasyonun normal olup olmadığı ise dekalsifiye

edilmemiş örneklerde araştırılır. Bu amaçla dens gömme ortamları ve ağır mikrotomların kullanılması

gereklidir.

Mikroskobik inceleme için dokuların renge ve kontrasta gereksinimi olduğundan kesitlerin

boyanması yapılır. Preperatların uygun bir kırma indisi olmalıdır. Boyama; renkli olan veya floresansı

artıran boyalarla, renkli son ürünler oluşturan kimyasal reaksiyonlarla veya metalik çöktürme ile doku

bileşenleri opaklaştırılarak yapılabilmektedir. Geleneksel boyama yöntemlerine ek olarak boyama-

olmayan teknikler de kullanılabilir.

Histolojide floresans immünolojik yöntemler, otoradyografi, mikroinkrinasyon ve mikroradyografik

yöntemler de kullanılmaktadır.

Floresans immüno-histolojik yöntemler: Florokromla işaretlenmiş antikorların kullanımına

dayanmaktadır. Çok spesifik bir yöntemdir. İmmün kompleksleri ve dokulardaki yapıları göstermek için

kullanılır. Floresans mikroskopta incelenen preparatlar az miktardaki florokromu gösterme yeteneğindedir.

4

Otoradyografi: İşaretlenmiş bir radyoaktif element dokuya verilimini takiben dokudaki hücrelerle

birleşebilir. Otoradyografi bir fotografik emülsiyondaki gümüş tuzlarını indirgeme yetenekleri ile

radyoaktif izotop alanlarını gösterecektir. Fotografik emülsiyon özel plaklardan çıkarılır ve kesitlere

uygulanır. Çalışanlar, radyoaktivitenin zararları konusunda uyarılmalıdır. Biyolojik kullanımdaki

radyoaktif izotopların yarı-ömrü birkaç saatten yıllara kadar değişebilir.

Mikroinkrenasyon (yakıp kül etme ): Lam üzerine alınan kesitler elektrikli fırında ısı yavaş yavaş

artırılarak ısıtılır. Organik maddelerin tümü uzaklaştığından geriye dokunun mineral iskeleti kalır.

Yansıyan ışık ve karanlık saha mikroskobu ile inkrenasyon yapılmamış kontrol kesitle karşılaştırılarak

incelenir. Histospektrografik yöntemle minerallerin kantitatif ölçümü de yapılabilir.

Mikroradyografi: X-ışınlarının absorbsiyonu ile dokunun kimyasal yapısı hakkında bilgi edinilir. X-

ışınlarını absorbe eden kemik, kıkırdak, enamel ve dentin gibi hidroksi-apatit kristallerini içeren kalsifiye

dokular ince taneli fotografik emülsiyon ile yakın temasa tutularak yumuşak bir X-ışını verilir. Elde edilen

fotograf mineralin dağılımını gösterir ve kontakt mikroradyograf olarak adlandırılır. Klasik ışık

mikroskobu ile incelenebileceği gibi projeksiyon mikrografi için geliştirilen aletlerle de incelenebilir.

Kesitin alanlarında mineral miktarları da ölçülebilir. Kemik örnekleri metil metakrilata gömüldükten sonra

öğütülür ve parlatılır. 20 kV X-ışını ile ışınlanır. Çok ince taneli özel fotografik emülsiyonundan geçirilir.

5-10 kV’ lik çok yumuşak X-ışınları kullanılırsa yumuşak doku kesitlerinin mikroradyografları dokuların

protein içeriği ve hücrelerin kuru kütlesi hakkında bilgi elde edilebilir. Mikroradyografi, bazen radyoopak

maddenin injeksiyonu sonunda kan damarlarının düzenini göstermek için kullanılır.

İNCELEME YÖNTEMLERİ

Makroskobik Yöntemler: Histolojide çıplak gözle inceleme yöntemleri de kullanılmaktadır. Müze

örnekleri, kan damarlarının ve diğer anatomik yapıların injeksiyon teknikleri ile gösterimi makroskobik

yöntem, bütün halindeki organların geniş kağıda monte edilmiş kesitleri ise makroskobik ve mikroskobik

yöntemler arasında bir yöntemdir.

Mikroskobik Yöntemler:

Steroskobik diseksiyon mikroskobu ile yansıyan veya geçen ışık kullanarak embriyoları,

dokuları ve bağırsak villusları incelebilir.

Faz-kontrast mikroskobu ile taze ve boyanmamış doku ve hücreler incelenir.

İnterferans mikroskobu ile canlı ve boyanmamış hücrelerin detayları araştırılır. Bu mikroskop

optik terazi olarak kullanılarak hücre içi yapıların ağırlıkları hesaplanabilir.

Konvensiyonel mikroskop ile şeffaf kesitler ve smearler incelenir.

Karanlık saha mikroskobu ile objelerin indirekt görünümünü sağlamak için yüksek yoğunlukta

aydınlatma gereklidir.

5

Polarizasyon mikroskobu ile polarize veya kristalli yapılara sahip dokular incelenir.

Floresans mikroskop ile florokrom boyalarla boyanan veya immünohistolojik yöntemlerle

floresanla işaretlenmiş kesitler incelenir.

Elektron mikroskoplar da yüksek büyütme ve ayrım gücü üreten elektronlar kullanılır. Scanning

elektron mikroskobunda doku yüzey özellikleri ortaya konurken, transmisyon elektron mikroskobunda

hücre ince yapısı ortaya konur.

Histolojik Gözlemleri Kaydetme

Yapılan gözlemler kaydedilmelidir. Kayıtlar şu şekilde olmalıdır.

1-İncelenen dokuların yapısını açıklamak için nitel terimler kullanılmalıdır.

2-Gözlemler fotograflanmalıdır.

3-Nicel ifadelerle dokuların alanı, hacmi ve sayıları kesin veya karşılaştırmalı terimlerle ifade edilmelidir.

HİSTOLOJİ LABORATUVARLARI

İdeal bir histoloji labaratuvarlarında neler bulunmalıdır?

1- Uygun ölçülerde lavabosu bulunan bir tezgah

2- Formalin ve diğer gazların çalışanları etkilenmemesi için çeker ocak

3- Sert tahtadan yapılı 45x35 ebatlarında bir diseksiyon tablası

4- Diseksiyonda kullanmak üzere:

- 20-30 cm uzunluğunda ince ağızlı bıçaklar

- Makaslar

- Traş makinası

- Jiletler

- Paslanmaz çelikten cetvel

- Çeşitli ebatlarda forcepsler

- Spanclar

- Terazi

- Steromikroskop

- İlk yardım çantası

5- Bunzen beki

6- Sıcak tabla

7- 37C’lik inkübatör

8- 60 C’lik fırın

6

9- Boyama alanının iyi ışıklandırılması (Parlak gün ışığı iyidir ancak sürekli olamayacaktır. Düşük vattlı

tungsten – filamanlı lambaların verdiği sarı ışık eozinin boyama yoğunluğunu yanıltabilir. Floresan

aydınlatma ile “colour matching” tüpler tavsiye edilmektedir).

10- Bir başkasının inceleyeceği kesitleri boyayan bir kişi, her iki mikroskopta da renk filtrelerinin aynı

olmasına dikkat etmelidir. Çok kullanılan yellowish eozin eğer mavi filltre ile incelenirse farklı bir

renk tonunda görülür.

11- Boya kapları

12- Cam kapaklı kavanozlar

13- Distile su ve trikrom boyamadaki %1’lik asetik asit için polietilen yıkama şişeleri

14- Pipetler

15- Seri kapatılan kesitleri boyamak için paslanmaz çelik veya plastik kaplar

PREPERASYON

Bazı organ ve dokular için özel hazırlama yöntemleri vardır.

1-ADRENAL: Adrenalde ölümden hemen sonra otolitik değişiklikler oluşur. Otopside bez yarı – sıvı

döküntü içeren ince bir kortikal kapsülde bulunur. Bazı enzimler uzun süre değişmeden kalmasına rağmen,

hücresel ayrıntı için adrenaller ölümden sonraki 1-2 saat içinde tespit edilmelidir. Kan damarları adrenal

çevresinde dallanır. Bez etrafındaki yağlar uzaklaştırılmalıdır.

2-SİNDİRİM KANALI: Fiksasyon en önemli problemdir. Mide mukozasında otolitik değişiklikler

dolaşım durur durmaz ortaya çıkar. Otoliz bağırsakta daha hızlıdır. Özefagus ve mide mukozasının

korunması için ölümden hemen sonra fazla miktarda fiksatifin özefagustan mideye geçirilmesi gereklidir.

Formal-salin bu işlem için önerilir. Vücudu açmadan ve bağırsakları perfüze etmeden tüm bağırsak

kanalını fikse etmek zordur. Fiksatifin periton boşluğuna injeksiyonu da kaba bir fiksasyon sağlar.

Örnekler gerilmeli ve fiksatifle perfüze edilmelidir. Mide açılabilir ve mantar üzerine mukoza üste gelecek

şekilde iğnelenebilir ya da mide açılır ve fiksatif içinde dikey şekilde tespit edilip tutturulur. Gazlı bez

uygulaması önerilmez. Mide ve bağırsak içeriği asla su ile yıkanmamalıdır. Hücrelerde patlama olur. Çok

gerekli ise serum fizyolojik ile içerik uzaklaştırılmalıdır.

3-KESİLMİŞ EKSTREMİTELER: Deri su geçirmez özelliktedir ve birçok fiksatif için etkili bir

bariyerdir. Kesilmiş uzuvlar hemen dissekte edilerek fiksatife aktarılmalıdır. Hemen diseksiyon

yapılamayacaksa ekstremiteler % 10’luk formal-salin içeren bir tanka alınıp, su geçirmez bir kapak ile

kapatılıp +4 C’ de buzdolabına konulmalıdır.

4-GÖZ: Fiksasyon ve kesit alma sırasında ayrılmaya meyilli olan farklı yapıdaki tabakalardan oluşan

karmaşık organlardır. Korneanın kurumasını önlemek ve retinadaki otolitik değişiklikleri azaltmak için

göz çıkarıldıktan hemen sonra % 10’luk formal-salin içine konulmalıdır. Fiksasyondan 48 saat sonra göz

jiletle horizontal olarak açılır. Göz fiksasyondan önce açılmamalı, dondurulmamalı veya fiksatif kamera

içine enjekte edilmemelidir. Cellulose nitrat göz için önerilen gömme ortamıdır. Parafin kesitler,

7

selloidinden veya alçak viskositeli nitrocelluse (LVN) kesitlerinden daha çok retinal ayrılma ve bükülme

göstermesine rağmen kullanılabilir. Celloidin-parafin çiftli gömme ortamı da göz için yararlı bir işlemdir.

5-AKCİĞER: İyi fiksasyon için ağız içinden tüp veya kanülü geçerek toraksı açmadan önce trake içine

fiksatif injeksiyonu yapılmalıdır. 100 mm Hg’den daha az basınçlı bir şırınga ile % 10’luk nötral formal-

salin bir dirençle karşılaşıncaya kadar enjekte edilir. Eğer trake ve akciğerler dikkatli olarak vücuttan

çıkarılmışsa, trake içine akciğerler canlı ölçülerine gelene kadar fiksatif enjekte edilirse tatmin edici

sonuçlar alınmaktadır.

Trake enjeksiyondan sonra çözülür ve akciğerler 48 saat fiksatifte immerse edilir. Eğer plevra

çıkarılırken haraplanmışsa ve yoğun plevral adezyon varsa bu teknikler pek tatminkarlar olmayacaktır.

Vücuttan çıkarıldıktan sonra tüm akciğerleri fikse etmek için diğer yöntem ise formalin buharı ile

şişirmedir. Özel bir aygıtla uygulanan bu işlemde pulmoner yapı mükemmel korunur. Bu yöntemde

akciğerler formalin ile doygun hale getirilmiş kapalı bir alanda 5-6 saat bekletilmektedir.

6-LENFATİK DOKU: Lenf nodları ve dalağı fikse etmek zordur. Eğer kapsül bütünse ne kadar çabuk

fikse edilirse edilsin daha derin kısımlar otoliz olur. Dalak genellikle gerisine fiksatifin penetre olmadığı

dar bir subkapsüler kenar fiksasyonu gösterir. 5 mm den ince küçük lenf nodları bütünüyle fikse olabilir.

Büyükler ufaltılmalıdır. Yumuşak tümörlerde ve dalakta dokunun önce tamamını fikse etmek daha sonra

küçültmek uygun olur.

7-HİPOFİZ: Hipofizin medyan sajital kesitleri önden ön lop, sap ve arka loptan iyi fotograf verir. Sitoloji

lop içinde uniform olmadığından ön lop çalışmaları için horizontal kesitler daha aydınlatıcıdır. Asidofil

hücrelerin çoğunu içerdiğinden lateral kanatları içine alan kesitler tavsiye edilir.

RUTİN HİSTOLOJİK TAKİP

1- Parça alma

2- Tespit (Fixation)

3- Sudan kurtarma (Dehyration)

4- Şeffaflandırma (Clearing)

5- Parafine gömme (Embedding)

6- Kesit alma (Sectioning)

7- Boyama (Staining)

8- Kapatma (Mounting )

1 -PARÇA ALMA

Mikroskobik kesitler için kullanılacak parçaların ölümden,biopsiden ve operasyon işleminden hemen sonra

veya en kısa zamanda alınması gereklidir. Elde edilen ve büyük olan doku ve organ parçalarının çok keskin

bir bisturi veya jiletle daha küçük parçalara ayrılması gerekmektedir. Bu parçaların kalınlığı, tespit

solusyonunun (fiksatifin) nüfuz edebilrne özel1iklerine göre 2-4 mm arasında olmalıdır (1 cm3 ). Jiletin

veya bisturinin keskin olmaması doku parçalarında zedelenme, ezilme ve büzülmelere ve dolayısıyle

yapısal değişikliklere yolaçar.

8

2- TESPİT –FIKSASYON

Bir insan ve hayvan ölür ölmez hücreleri ve dokuları çeşitli katabolik enzimleri kapsadığı için yavaş

yavaş otoliz (kendi kendini çözme) sebebiyle değişikliklere uğrar. Buna postmorterm (ölüm sonrası)

dejenerasyon diyoruz. Aynı değişiklikler operasyonla alınan canlı doku parçalarında da görülür.

Fiksasyonun amacı hücrelerin ve doku elemanlarının canlı hale yakın bir konumda muhafaza etmektir. Bu

yolla ince, boyanmış kesitlerin hazırlanması mümkün olacaktır. Histolojik inceleme için vucuttan çıkarılan

materyelle bu amaç asla tam olarak yerine getirilemez. Mevcut yöntemler, esasen sınırlı teknikler, koruma

arzusu ve her doku kompenentini tamamen canlı halini göstermek arasındaki bir uzlaşmadır.

Amaç:

l-Otolizi ve bakteriyel bozulma ve çürümeyi önlemek veya durdurmak

2-Kolaylıkla diffüzyon olan maddelerin kaybını önlemek

3-Kesit hazırlama basamaklarındaki sağlığa zararlı kötü etkilere karşı dokuyu kuvvetlendirmek (Örnek

dehidrasyon, şeffaflandırma, parafine gömme gibi)

4-Dokuyu boyalarla ve diğer reaktiflerle diferensiyel boyamayı kolaylaştıran bir

duruma getirmek

FİKSASYONUN ETKİLERİ

Otoliz, hücrelerin ölümünden sonra intraselüler enzimlerin hareketinin değişmesi ile protein

yıkımına ve sonuçta hücrelerin sıvı hale gelmesine yol açar. Otolitik değişiklikler herhangibir bakteriyel

hareketten bağımsızdırlar, soğukla geciktirilir, 37 C de muhafaza etmek önemli ölçüde hızlandırır. Doku 57

C'ye ısıtılırsa hemen hemen tamamen inhibe edilir. Otoliz, beyin, böbrek gibi çok iyi özelleşmiş organları ,

elastik fibriller, kollajen gibi yapılardan daha hızlı ve ciddi olarak etkilemektedir. Mikroskobik incelemede

otoliz olmuş dokunun hücre çekirdekleri kondensasyon (piknoz), fragmentasyon (karyoreksis), lizis veya

görülmeme (karyolizis) gösterebilir. Sitoplazma şişmiş ve granüler hale gelebilir ve tüm doku sonradan

boyama reaksiyonunda kayıp veya büyük değişimle granüler ve homojenöz kütle haline dönüşür. Otoliz,

epitelin dökülmesine, hücrelerin bazal membrandan ayrılmasına yol açar. Ek olarak teşhis önemi olan

maddeler (örn.glikojen) miktarca azalır ve uygun fiksasyonun olmayışından dokuda yayılırlar.

Bakterilerin dokularda yol açtıkları değişiklikler otolizdekine çok büyük benzerlik gösterir ve ölüm

sırasında (septisemi gibi) hasta dokudaki veya yaşamda vücutta normalde bulunan ( Örneğin barsak flora

bakterileri gibi) non-patojenik organizmaların çoğalmasıyla meydana gelmektedir. Fiksatifler dokuda

mevcut olan veya ölümden sonra meydana gelen ve dokunun daha ileri değişimlerine yol açan bütün

bakterileri öldürür.

Fiksasyonun en önemli etkilerinden biri doku proteinlerinin ve yapı taşlarının koagülasyonudur.

Böylece takip sırasında kayıpları ve diffüzyonları minimuma inmektedir. Ancak ek olarak fiksatif, takip

sırasındaki haraplayıcı etkilere karşı koruyucu olmalıdır. Eğer, taze tespit edilmemiş doku çeşme suyunda

yıkanacak olursa ciddi ve tamir edilemez harabiyet ve hücre lizisi oluşur. Fakat doku önce, Zenker de tespit

9

edilirse ve daha sonra suya daldırılırsa zararsızdır. Akılda tutulmalıdırki doku elemanlarının koagulasyonu

gerekli olmasına rağmen büyük bir artifakt oluşacaktır. Çünkü canlı hücre sıvı veya yarı-sıvıdır.

Fiksasyon hücre ve doku elemanlarına değişen oranlarda kırma indislerini değiştirerek optik

differansiasyon sağlamaktadır. Bazı hücre elemanlarının kırma indisleri çevreleyen ortama çok yakındır.

Bu nedenle klasik mikroskopla canlı olarak incelendiklerinde görülemezler. Fiksasyon dokuların boyama

basamağında da önemli bir etkiye sahiptir ve genellikle boya hareketlerini kolaylaştırır. Tespit ajanları bazı

boyaların uygulanması üzerine özellikle faydalı bir etkidir. Örneğin çekirdek boyası olan carmalum,

formalinden sonra merkurik klorid fiksasyonuna göre daha az boyar. Bazen tespit ajanı özel doku

kompenenti ve doku arasında direkt bir link olarak hareket edebilir ve bu durumda fiksatifin bir mordant

olarak hareket ettiği söylenebilir. Örnek olarak da hematoksilenle miyelinin gösterimi için dokunun

potasyum dikromatla muamele edilmesi verilebilir.

Fiksatiflerin diğer önemli bir fonksiyonu ise, dokuyu sertleştirmeleri sebebiyle doku parçalarından

kolaylıkla ince kesitlerin alınmasına sebep olmalarıdır. Fiksasyon olayında fiksatifte kullanılan bazı

kimyasal maddeler sebebiyle enzimler inaktif hale getirilir veya muhafaza edilir. Fiksatiflerin pratik

uygulanması düşünülürken, araştırmanın gerçek amacı, dokunun boyutu, tipi ve tazeliği kesit alma prosesi

ve uygulanmak istenen boyama tekniğinin bilinmesi gereklidir. Hiçbir fiksatif bütün dokular ve teknikler

için ideal değildir. Proteinler, tuzlar, CH'lar veya lipidler çökertilir ve dolayısıyle dokunun yapısı

elemanları sertleşir ve katılaşır.

Fiksasyon işlemi fiziksel (ısı, kurutma ve dondurma ile ) ve kimyasal yolla yapılabilir. Isı ile

fiksasyon dezavantajları nedeni ile artık uygulanmamaktadır. Kurutma ile fiksasyon, kan ve kemik iliği

yaymalarında kullanılır. Dondurma ile fiksasyon, lipidler, enzimler ve ameliyat parçalarının hızlı

teşhisinde kullanılır. Dondurulan örneklerden dondurma mikrotomu ( Cryostat ) ile kesit alınır. Kimyasal

fiksasyon en çok kullanılan yöntemdir. Bu yöntemde alınan örnekler ya fiksatife atılır (immersiyon

yöntemi ) ya da hayvan anestezi altında iken organı besleyen arter yolu önce serum fizyolojik ardından

fiksatif verilerek yapılır (Perfüzyon Yöntemi). Perfüzyondan sonra örnekler alınarak tekrar fiksasyonun

tamamlanması için fiksatife atılırlar. Böylelikle organ vücuttan çıkarılmadan bir miktar tespit edilir.

Morfoloji daha iyi korunduğundan genellikle titiz çalışma gerektiren araştırmalarda kullanılır.

Fiksatifler daima maksada ve boyama metodlarına uygun olarak seçilmelidir. Tespit olayının

basarılı olması aşağıdaki unsurlara bağlıdır

1- Ölümden ve operasyondan sonra elde edilen doku ve organ parçaları derhal fiksatife atılmalıdır. Kalp

durmasından en geç ışık mikroskobunda 30 dk., elektron mikroskobunda 4 dk. sonra örnekler fiksatife

alınmalıdır.

2- Fiksatifte kullanılan kimyasal maddelerin tazeliğinde emin olmalı ve bu maddeleri titizlikle tartmalı ve

karıştırmalıdır. Aksi taktirde fiksatifin etki ve nüfuz kabiliyeti ortadan kalkar.

3- Doku parçaları mümkün olduğu kadar küçük olmalıdır.

10

4- Fiksatif yeterli miktarda yani doku parçasının en az 10 misli olmalıdır (Formalin için 20 misli).

5- + 4C'de fiksasyon yapılması önerilmektedir. Her ne kadar düşük ısılar fiksatifin, dokuya penetrasyonunu

azaltırsa da otolizi önlendiğinden iyi tespit için gereklidir.

6- İçi boş organlar tespit solusyonu ile doldurulmalıdır. Böylece tespit solusyonu dokuya her iki yüzden

işler. Hem de boşluğun iç yüzündeki düzgün yüzey şeklini korumuş olur.

7- Kırışma ve katlanma olasılığı olan dokular mantar plakalar üzerine gerilmelidir.

8- Kaba önce fiksatif konmalı sonra parçalar aktarılmalı. Aksi taktirde doku kaba yapışır ve yapışma

yerinden tespit solusyonu dokuya işlemez.

9- Yağdan ve havadan zengin dokular tespit solusyonunda yüzdükleri için bir kaset içine alınarak tespit

edilmelidir.

10- Tespit solusyonunun dokuya işleyişini hızlandıran işlemlerden kaçınmalıdır. Yüksek ısı bir yönden

tespit solusyonunun. dokuya işlerliğini artırır. Diğer yönden de dokuda otolizi hızlandırır.

11- Kullanılan tespit solusyonunun dokulara işleme hızları bilinmelidir. Bu hız her tespit solusyonu için

değişiktir. Örneğin aIkol 5 mm kalınlığında bir dokuyu 2-4 saatte tespit eder. Aseton 5 mm kalınlığında bir

dokuyu 2 saatte tespit ederken, sublime 5 mm kalınlığında bir dokuyu 5 saatte tespit eder .% 4'1ük formalin

4 mm kalınlığında bir dokuyu + 4 Cde 5 saatte tespit eder.

12- Kural olarak özel amaçlar dışında doku 24 saatten fazla tespit edilmemelidir.

13- Tespit solusyonu ne hipotonik,ne de hipertonik olmalıdır. Kullanılacak tespit solusyonunun

osmomolaritesi canlı dokunun osmolaritesi (300 mosl) ve ölü dokudakine (450 mosl) uygun olmalıdır. Bu

özellik gözönünde bulundurularak tespit edilmeyen doku su ile kesinlikle yıkanmamalıdır.

14- Tespit solusyonunun pH'sı canlı dokunun pH'sına yakın olmalıdır (6-8). Bu nedenle tamponlanmış

formalinle dokuların tespit edilmesi daha uygun olur.

16- Dokunun aşırı derecede sertleşmesine müsade edilmemelidir. Doku aşırı derecede katılaşacak olursa

daha sonraki işlemleri zorlaşır.

17- Kaplar yeterli büyüklükte ve düz hatlı olmalı, boğazı ise dar olmamalıdır. Böylelikle spesimenlerin

sonradan çok küçük kavanoza aktarılırken minumum hasar görmesi sağlanır.

Uzun zaman tespit solusyonunda kalan ve tespit solusyonunun buharlaşması sonucu sertleşen

dokulardan tekrar çalışmak istendiğinde bu doku antiformine konarak yumuşatılabilir.

ANTi FORMİN SOLUSYONU: 1 gr antiformin 5 ml suya konarak yahutta konsantre solusyonun

20 ml'si 80 ml suya konarak hazırlanır. Tamamen kuruyan dokuysa Dimetilsülfoksid (DMSO) içinde

yumuşatılarak tekrar çalışır hale getirilebilir.

TESPİT ESNASINDA MEYDANA GELEN HATALAR

Fiksasyon artefaktları birçok nedeni vardır. Bunlar :

11

a) Doku parçaları iyi tesbit edilmemişse, tespit olmamış doku elemanları otolize uğrarlar. Böylece ileride

yapılacak işlemlerde beklenen netice alınamaz.

b) Eğer bir fiksatif hazırlanırken formule iyi dikkat edilmez ve karışımı temin edecek maddeler uygun bir

denge sağlıyamazlarsa hücrelerde şişme, büzülme ve ayrılmalar meydana gelerek, histolojik detaylar

kaybolur.

TESPİT AJANLARI

A-SIVI TESPİT AJANLARI: Tek ya da diğer sıvılarla ve katılarla karıştırılarak kullanılan en çok

kullanılan sıvı tespit ajanları, alkol, aseton, formalin, gluter aldehit ve asetik asittir. Trikloroasetik asit daha

az kullanılır. Son yıllarda trikloroasetik asit hem fiksatif hem de dekalsifiye ajanı olarak kullanılmaktadır.

1-Absolu Alkol: 78 C de kaynayan, renksiz, tutuşabilen bir sıvıdır. Glikojeni iyi korur ancak çekirdek

detayının kaybına ve sitoplazmanın büzülmesine neden olur.

2-Soğuk Aseton: Özellikle lipazlar ve fosfatazlar gibi enzimlerin histokimyasal çalışmalarında tercih

edilir. Rutin fiksatif olarak kullanılmaz. Çekirdek detayının kaybına ve sitoplazmanın büzülmesine neden

olur. Glikojeni iyi korumaz.

3-Formaldehit: Ağırlığının yaklaşık %40 ı kadar suda çözunebilen bir gazdır ve formaldehit (%40) veya

formalin adı altında satılmaktadır. Proteinleri precipite etmez ve diğer hücre bileşenlerini ise kısmen

precipite eder. Albümini sertleştirmez ve çözünür halde tutar ve sonraki dehidratasyonda alkollerle

sertleşmeyi engeller Formalin yağları ne korur ne de haraplar. Kompleks lipidler için iyi bir fiksatiftir

fakat nötral lipidler üzerine etkisi yoktur. Formalin karbohidratlar için seçilen bir fiksatif olmamasına

rağmen glikojeni kolaylıkla çözünmesini engelleyerek korur. Frozen kesitler için ideal bir fiksatiftir.

Solusyonun nötralizasyonu arzu edilir. Tampon tuzları nötralizasyon sağlanabilir. Konsantre asit formalin

sonuçta çıkan CO2 in labarotuvarda ciddi patlamalara yol açtığından Mg veya CaCO3 ile muamale

edilmemelidir. Kalsiyuım karbonat dokularda pseudokalsifikasyon oluşturabilir. Konsantre formalin

solusyonu bazen paraformaldehit oluşumu nedeni ile bulanıklaşır, solusyonun gücü azalır. Fakat filtre

edilirse kullanılabilir. Formalin renksiz olmalıdır. Sarı solusyonlar kullanılan demir kaptan kaynaklanan

demir iyonları ile kontamine olmuştur. Demir içeren formalinle fikse edilen dokuların kesitleri pozitif

Prusya mavisi reaksiyonu verir ve kontamine olacağı düşünülen formalin örnekleri aynı yöntemle test

edilebilir. Formalini konsantre solusyon olarak kullanmak uygun değildir ve çesme suyuyla serum

fizyolojik ile veya tampon tuz solusyonları ile yaygın olarak %10 luk olarak seyreltilir. Bu solusyonlar %4

oranında formaldehit içermektedir.

Formalin, özellikle bazı kişilerde gözlere, solunum epiteli iridasyonuna yol açan istenmeyen bir duman

çıkarır. Bu nedenle formalinle tespit edilen dokuların diseksiyonu için iyi havalandırılan oda kullanılmalı,

tüm saklama kaplarının ağzı sıkıca kapatılmalı, korozyona dirençli kapaklar kullanılmalıdır. Bunlara ek

olarak eldiven veye etkili krem bariyer, formalinle tespit edilmiş materyal tutulduğunda kullanılmalıdır.

12

Bazı çalışmalar bu etkilere bağışıktır fakat bazıları bu solusyona ellerini daldırdıktan sonra istenmeyen

"formalin

dermatitis" den yakınırlar. Formalin, ideal bir fiksatif olarak önerilse de bazı çekirdek şişmeleri oluşabilir.

Asetik asit formalini ile post fikse edilirse bu etki ortadan kaldırılır ve H-E ile parlak boyanma sağlanır.

Formalin, kromatlar formik asite oksitleyeceğinden kromatlarla kullanılmamalıdır.

4-Gluter Aldehit: Formaldehitten daha yavaş penetre olur.Elektron mikroskopi ve enzim

histokimyası için çok yararlıdır. E.m için standart bir fiksatiftir ve OsO4 den önce birinci fiksatif olarak

kullanılmaktadır. Fikse edilen örnekler solusyonda aylarca kalabilir. GA ile tespit edilen kesitler

PAS+reaksiyon vermeye meyillidirler. Formaline göre daha pahalıdır.

5-Trikloro Asetik Asit: Günümüzde kullanılmamaktadır. Sistin, sistein ve metionin gibi sülfür

grubu amino asitleri iyi korur. Dekalsifiye ajanı olarak kullanılmaktadır.

6-Asetik Asit: Tek olarak kullanılmaz. Hızlı ve iyi penetre olur ancak alyuvarların lizisine yol açar.

Kollajen fibrilleri şişirir, nukleoproteinleri precipite eder ve bazı sitoplazmik granüller üzerine çözücü bir

etkiye sahiptir.

B-KATI TESPİT AJANLARI:

1-Civa Klorür (HgCl2): Çok zehirli ve metallere korosivdir. Merkurik klorid kapları kesinlikle

metal kapaklı olmamalı ve kullanılan metal aletler parafine daldırılarak kullanılmalıdır. Civa klorür,

kuvvetli bir protein precipitantıdır. Dokuya hızla penetre olur ve dokuyu sertleştirir. Dokuyu büzer fakat

eğri büğrü etmez. Hem nukleusu hem de sitoplazmayı iyi fikse eder. Çekirdeğin özellikle sitoplazmanın

asit boyalarla boyanmasını sağlar. Diğer fiksatiflerle (özelikle formalin, potasyum dikromat ve asetik asit)

karıştırılarak kullanır fakat dokunun her tarafına uniform olarak dağılan kahverengiden siyaha kadar

değişen granüler madde oluşturur. "Mercury pigment'' olarak adlandırılan bu madde alkolik iodinde,

çözünür ve daha sonraki boyamayı etkilemez. Dehidratasyon sırasında bloklardan %70-80 alkoldeki %0.-

25-05 iodin eklenmesiyle veya kesitleri boyamadan önce aşağıdaki gibi işlemden geçirerek uzaklaştırılır.

İşlem

l-Ksilol ile muamele ederek parafin uzaklaştırııir.

2-%100'lük alkolde yıka

3-%70'lik alkolle hazırlanmış %0.5'lik iodinle 3-5 dakika muamele et

4-Çeşme suyunda kısa bir süre çalkala

5-%2.5 luk sodyum thiosulfatla(hipo) beyazlaşıncaya kadar (30 saniye-iki dakika) muamele et

6-Akarsuda 5 dakika yıka

7-Boyamayı yap

2-Potasyum Dikromat: Potasyum dikromat solusyonlarının pH’sı fiksasyonu önemli ölçüde

etkiler. pH 3.4-3.8 arasında sitoplazma homojen olarak ve mitokondriler fikse olurken, nukleoproteinler

korunamazlar. Daha asidik olduğunda ise kromik asit gibi davranır; hem nukleus hem sitoplazma

13

mitokondri harabiyeti ile birlikte precipite olur. Potasyum dikromat diğer maddelerle karıştırılarak birçok

önemli fiksatif elde edilir. Potasyum dikromatla tespit edilen dokular, çözülemeyen precipitelerin

oluşumunu engellemek için alkolden geçirilmeden önce akarsuda yıkanmalıdır. Dokuya uzun süre maruz

bırakmak (günlerden haftalara kadar) özellikle parafine gömülmüşse gevrekleşerek kesit almada zorluk

çıkarır.

3-Kromik Asit: Kromik asit anhidritin(Cr03)' in koyu kırmızı kristallerini distile suda çözerek

hazırlanır. %2'lik solusyon fiksatiflerin hazırlanması için uygundur. Proteinleri precipite eder ve

karbohidratları tespitler. Kuvvetli bir oksitleyici ajan olarak genel olarak alkol veya formalinle

karıştırılmamalıdır. Kromik asitle fiksasyondan sonra dokular alkolle muamele edilmeden önce akarsuda

yıkanmalıdır. Böyle yapılmazsa dokularda çözünemez precipat oluşumuyla sonuçlanabilir.

4-Pikrik Asit: Pikrik asit parlak sarı kristalin bir maddedir. Isıtılırsa patlayıcı özelliği vardır.

Tedbirli olarak suda oda ısısında yaklaşık %1 oranında, benzende %10 oranında çözünür. Pikrik asit

nukleoproteinleri precipite eder ve biraz büzer fakat hafif sertleştirir. Sitoplazmik boyalarla zenginleştirir

ve glikojen için kullanılan fiksatiflerin faydalı bir elemanıdır. Pikrik asit fiksasyonundan sonra dokular

direkt olarak alkole alınırlar.

5-Osmiyum Tetroksit: Yaygın olarak söylendiği gibi osmik asit, 0.5 veya 1 gramlık etiketli

ampullerde bulunan soluk sarı kristal bir maddedir. Pahalıdır. Hem kristalin hem de çözeltinin dumanı

iridanttır ve tehlikelidir. Gözün dumana maruz kalmasından sıkı gözlük kullanarak kaçınılmalıdır.

Kullanıldığı şişe sıkıca kapatılmalıdır. Çözelti aşağıdaki gibi hazırlanır.

Etiketi çıkarın.Tüpteki yapışkanı suyla (sıcak su değil) yıkayıp çıkarın.Temiz bir bezle ampulu kurulayın,

ortasından kırın. Her iki yarısını uygun miktarda distile su içeren koyu renkli cam şişeye koyun.

Kristallerin çözünmesi zaman alır. Fakat hızlandırmak için ısı kullanılmamalıdır. Şişenin cam kapağı

olmalı ve soğukta muhafaza edilmelidir. OSO4' ışık, ısı veya organik etkenlerle kolaylıkla gri veya siyah

lower okside indirgenir ve bir kere kullanılan solusyon, stok şişesine geri konulmamalıdır. İndirgenmeyi

önlemenin etkili bir yolu her 10 cc lik solusyona bir damla suda doyurulmuş merkurik klorid eklemektir.

OSO4, formalin gibi protein ile additive bileşikler oluşturur, miyelini de içeren çoğu lipidler OS04 in

lower okside indirgenmesiyle siyahlaşır. Penetrasyonu zayıftır. Küçük objeler, smearler ve ince kesitler

sıvıya daldırmaksızın dumanıyla fikse olabilir. Genel histolojik ve histopatolojik çalışmalarda az

kullanılmasına rağmen (fiat yüksek, kullanımdaki sınırlamalar) e.m de yaygın kullanılmaktadır.

TESPITTE KULLANILAN STOK SOLUSYONLAR

Formalin: %40' lık formaldehit

Gluter aldehit: %25' lik solusyon

14

Civa klorür: doymuş sulu solusyon

Potasyum dikromat: %5' lik sulu solusyon

Kromik asit: %2' lik sulu solusyon

Pikrik asit: Doygun sulu solusyon

OSO4: %2'1ik sulu solusyon

Asetik asit: Glasial asetik asit

Etil alkol: Absolu etil alkol

Yukardaki maddelerden başka birçok madde özel amaçlar için kullanılmaktadır. Aseton bazen

histokimyasal araştırmalarda kullanılır. Trikloroasetik asit bir dekalsifiye ajan olarak kullanılabildiği gibi

''Susa'' fiksatifinin de içeriğinde bulunur. Çinkoklorür, Zenker fiksatifindeki civa klorür yerine daha ucuz

olduğu için kullanılabilir. % 71ik sulfosalisilik asit, ayrıca %2-10'1uk glyoxal formalin yerine kokusuz

olduğu için kullanılabilir.

FİKSATİFLER VE HAZIRLANIŞLARI

Fiksatifler kullanımlarına göre iki gruba ayrılabilir.

l-Mikro-anotomik fiksatifler: Bu fiksatifler doku tabakaları arasındaki bağlantıları ve geniş hücre

kümelerinin diğeri ile bağlantılarını tam olarak korumak amaçlandığında kullanılır. Normal ve patolojik

histolojinin rutin çalışmalarının çoğu bu tip fiksatiflerle yapılmaktadır.

2-Sitolojik fiksatifler: Hücreyi oluşturan elementleri korumak istendiğinde kullanılırlar. Penetre olma

gücü, büyük doku kütleleri ile çalışma yeteneği, kesit almayı veya boyamayı engellememeli. Şöyleki

Flemming fiksatifinde ara zon çok güzel fikse olurken en dış ve iç parçalar kötü fikse olabilirler.

% 10’luk Formalin

Formalin 100 cc

Çeşme Suyu 900 cc

%10'luk Formal Salin

Formalin 100 cc

NaCl 8.5 gr

Çeşme suyu 900 cc

%10' luk Tamponlanmış Formalin (pH=7.0)

Formalin 100 cc

Çeşme suyu 900 cc

15

NaH2P04 : H20 4 gr .

Na2HP04 6.5 gr

Formalini nötralize etmek için %2' lik kalsiyum asetat birçok araştırıcı tarafından tavsiye edilmiştir. Fakat

yumuşak dokularda artifakta benzer alanlar oluşturabilir.

%10' luk formal-salin histolojik fiksatiflerin ençok kullanılanıdır. Aşırı bir sertleşme olmaksızın dokuyu

sertleştirir. Fiksasyon süresine dayanıklıdır. Genellikle formalin fiksasyonundan sonra dokuların doğal

rengini kısmen veya tamamen korumak mümkündür. Bu fiksatif, müze örneklerinin hazırlanmasında özel

bir değere sahiptir. Özellikle nötral tamponlanmış olarak kullanıldığında kırmızı kan hücrelerinin

korunması içeren iyi fiksatiftir.

Formalinde uzun süre kalma (aylarca-yıllarca) dokunun kesit alma niteliğini bozmaz. Dokunun

bazik boyalarla boyanmasında biraz kayba yol açabilir. Bazı gümüş çöktürme tekniklerindeki sonuçlar

daha iyiye gidebilir. İnce bloklar % 10'luk formal-salinle 24-48 saatte iyi şekilde fikse olurlar fakat

optimum fiksasyon süresi 7-10 gündür. Formalin fiksasyonundan sonra, değişen miktarlarda kan içeren

dokular bir artifakt pigmenti (formalin pigmenti) gösterebilirler. Bu, kahverengi, granüler, ekstraselüler bir

materyeldir. Çoğunlukla post-mortem dokularda bulunur, saklandıkca artar ve sıklıkla formaline

daldırdıktan birkaç saat sonra yoktur fakat birkaç gün sonra dokularda çok geniş ve fazla olarak depo edilir.

Kanla asit formalin pigmente yol açar ve nötral tamponlu solusyonlar kullanarak bunlardan kurtulabilir.

Pikrik asidin alkolde doymuş solusyonunda 20 dakika ya da daha fazla tutarak kesitlerden uzaklaştırılabilir.

Pigmentin görünümü ve özellikleri malarya pigmentine benzemektedir fakat malarya pigmenti

intraselülerdir.

% 10' luk formal-saline mikroanotomik bir fiksatiftir. Birçok boyama yöntemi için uygundur.

Hematoksilenle iyi sonuçlar verir. Nadiren belirli hiçbir neden olmaksızın formal-salinle tespit edilip, H+E

ile boyanmış kesitlerde garip bir artifakt görüIür. Nukleusların hematoksilen ile kısmen veya tamamen

boyanmamasına, bunun yerine eozini almasına sonuçta ise çekirdek kenarlarının kaybına yol açar. Ençok

lenfoid ve epitel dokusunda göze çarpan artifakt, dağılımında aşırı olarak bozuktur ve garip bir şekilde

fiksasyonu iyi yapılmış dokularda ortaya çıkar. Nadiren otolize olmasına rağmen, postmortem dokularda da

görülür. Bu artifakt "pembe hastalık" olarak açıklanmıştır ve ortaya çıkmaması için %1O'luk formalindeki

%2' lik asetik asit kullanımı ile korunur veya olduğunda parafini alınmış kesitlerin hematoksilenle

boyanmasından önce absolu alkoldeki %l'lik HCl ile 1 saat bırakarak uzaklaştırılır. Formalin

fiksasyonundan sonra hiçbir şeye gereksinim yoktur ve dokular gömmeden önce direkt % 70'lik alkole

alınabilir veya dondurma yöntemi ile kesit alınabilir .

ALKOL-FORMALİN SOLUSYONU:

Nötralize edilmiş formalin 10 cc

%95 Alkol 90 cc ,

16

Bu fiksatifte parçalar 2-4 saat içinde çabucak tespit olur. Eğer doku parçaları kalın olursa, bu solusyon

içinde buzdolabında 24 saat kalmalıdır. Bilhassa polisakkaridlerin gösterilmesi için kullanılan fiksatiflerden

biridir.

ALKOL FİKSATİFLERİ: Absolu alkol (%99) özellikle hücrelerde glikojenin gösterilmesinde kullanılan

bir fiksatiftir. Eğer buzdolabında veya daha düşük derecede kullanılmazsa dokuda büzülmelere sebep olur.

Doku parçaları absolü alkolde 20C'de iki gün bırakılacak olursa en elverişli şekilde, büzülrne meydana

gelmeden tespit olurlar. %80 alkol fiksatif ise 5C'de 24-48 saat arasında dokuyu büzmeden tesbit etme

özelliğine sahiptir. Bu solusyon alkaline phosphatasın gösterilmesinde kullanılır. Alkol fiksatifleri oda

ısısında kullanıldiklarında bunların %65-%70' lik solusyonları kullanılmalıdır. Aksi halde dokuda çok fazla

büzülme ve değişikliklere sebep olurlar.

LİSON VOKAER' İN GLİKOJEN TESPİT ÇÖZELTİSİ: %96' lık alkolde doymuş picric

asit çözeltisinden 85 ml; 10 ml formalin, 5 ml asetik asit. Küçük parçaları buzdolabında 5-10 saatte tespit

eder. Glikojen için iyi tespit edicidir. Tespitten sonra absolu alkolden geçirilerek gömme işlemi

yapılmalıdır. Çünkü gıikojen suda erir.

MERKÜRİK KLORİD-FORMALİN (FORMAL-SUBLİMATE)

Suda doymuş merkürik klorid 900cc

Formalin 100 cc

Mükemmel bir mikro-anotomik fiksatiftir. Formal-salindeki distorsion olmadan dokuyu büzer. Asit

boyalarla çok parlak boyadığı gibi mükemmel bir sitoplazma korunması sağlar ve metakromaziyi

artırır.Formal-saline göre sinir fibrilleri ve hücreler için gümüş çöktürme tekniklerinde daha az elverişli

olmasına rağmen mükemmel retiküler fibril impregnasyonu elde edilebilir. Bloklar 12-24 saat tespit edilir

fakat uzun süre işlem kesit almayı zorlaştıran bir sertlik yaratmaz. Formal-sublimat özellikle formal-salinle

birinci fiksasyondan sonra ikinci fiksatif olarak yararlıdır. En büyük dezavantajı pahalı olması ve metallere

korosiv olmasıdır. Dokular fiksasyondan sonra %70-90' lık alkole aktarılmalı ve mercury pigmenti

kesitlerden daha önce açıklandığı gibi uzaklaştırılmalıdır.

SUSA FİKSATİFİ ( HEİDENHAIN 1916)

Merkürid klorid 45 gr

Sodyum klorid 5 gr

Trikloroasetik asit 20 gr

Asetik asit 40 cc

Formalin 200 cc

Distile su 800 cc

17

Özellikle biopsi materyelleri için uygun bir fiksatiftir. İyi bir mikro-anotomik fiksatiftir. Nedeni

açık olmamakla birlikte Susa' dan sonra elastik fibriller Weigert'in (1898) elastik fibril boyası ile zayıf

boyanırlar. Hazırlanması için gerekli maddelerin çokluğu dezavantajdır. Ancak karışım bir önceki formal-

sublimata göre biraz daha avantajlıdır.

Bloklar 3-24 saatte fikse olurlar ve direkt olarak % 95' lik etil alkole aktarılırlar. Daha sulu

solusyonlara aktarma kollajen fibril1erin şişmesine yol açmaktadır.

ZENKER FİKSATİFİ ( ZENKER 1894)

Merkürik klorid 5 gr

Potasyum dikromat 2.5 gr

Sodyum sülfat 1 gr .

Distile su 100 cc

Asetik asit 5 cc (kullanımdan hemen önce eklenir)

Asetik asitsiz stok solusyon iyi korunur. Zenker etkili bir mikro-anotomik fiksatiftir ve özellikle

sitoplazmik ve fibril boyaları üzerine çok yararlı etkisinden dolayı kullanılmaktadır. Taze materyelde post-

mortem dokulara göre daha yararlıdır. Alyuvarları iyi korumazlar. Bloklar 3-8 saatte fikse olurlar ve fazla

dikromatı uzaklaştırmak için çeşme suyuyla yıkanırlar. Mercury pigmenti ise daha önceki yöntemle

uzaklaştırılır.

HELLY SIVISI ( VEYA ZENKER-FORMAL, HELLY 1903)

Zenkerdeki asetik asit yerine 5 cc formalin kullanmadan hemen önce eklenir. Helly sıvısı bir

oksitleyici ajan (potasyum dikromat ve bir indirgeyici ajan (formalin) içermesine rağmen rnükemmel bir

fiksatiftir. Helly özellikle kemik iliği, dalak, lenf bezleri, hipofiz ve pankreas için çok yararlıdır. Bloklar 6-

24 saat tespit edilmeli ve mercury pigmenti Zenkerdeki gibi uzaklaştırılmalıdır. Helly hem mikro-anotomik

hem de sitolojik (sitoplazmik) fiksatif olarak kullanılabilir ve formal-sublimat gibi % 10' luk formal-

salinden sonra ikinci fiksatif olarak da uygulanabilir.

BOUİN FİKSATİFİ ( BOUİN l897)

Suda doyurulmuş pikrik asit 75 cc

Formalin 25 cc

Asetik asit 5 cc

18

Bouin, alyuvarların kısmen veya tamamen lizisine yol açar ve kollajen fibrilleri şişebilir. Aşırı

sertleşmeye yol açmaz. Sitoplazmik boyalarla parlak boyanma sağlar. Glikojen çok iyi korunur (özellikle

yukardaki karışımın alkolik varyantı ile) fakat böbrek iyi korunamaz. Bazı sitoplazmik granüller

çözünebilir. Bouin, bir mikro-anotomik fiksatif veya kromozomların gösterilmesi için kul1anıldığında da

sitolojik (nükleer) fiksatiftir. Bloklar 6-24 saat fikse edilirler ve % 70 lik alkole aktarılırlar. Dokuların sarı

boyanması çok küçük örnekler için avantaj oluşturur. Fakat kesitlerden bu boya, alkolü takiben bazik anilin

boyaları kullanmadan önce % 2.5 lik sodyum thiosulfat kullanarak uzaklaştırılmalıdır, aksi takdirde

precipat oluşacaktır.

CARNOY FİKSATİFİ (CARNOY, 1887)

Absolü alkol 60 cc

Kloroform 30 cc

Asetik asit 10 cc

Carnoy, hızla penetre olan ve hareket eden bir fiksatiftir. Acil teşhis için dokuların hızlı tespit edilmesi ve

kısmi dehidrasyonu için kullanılır. Kromozom çalışmaları için kullanılır fakat alyuvarların lizisine ve fazla

büzülmeye yol açar. Glikojen korunur fakat bazı sitoplazmik granüller çözünebilir. 3 mm' den kalın

olmayan dokular 30-90 dakikada fikse edilmeli ve % 95'lik ya da % 100' lük alkole transfer edilmelidir. Bir

mikro-anotomik veya sitolojik (nükleer) fiksatifdir.

SANFELİCE FİKSATİFİ (SANFELİCE, 1918)

Çözelti A Çözelti B

Formalin 128 cc %l'1ik kromik asit 100 cc

Asetik asit 16 cc

Karışım: Kullanmadan az önce hazırlanır. 9 cc A +16 cc B

Genellikle mitotik figürler ve kromozomlar için mükemmel bir fiksatifdir. 3 mm den kalın olmayan küçük

parçalar 12-24 saatte tespit edilmeli ve sonra akarsu ile yıkanmalıdır. Sitolojik (nükleer) fiksatiftir.

FLEMİNG FİKSATİFİ (FLEMMİNG, 1884)

% l'1ik kromik asit 15 cc

%2' lik OSO4 4 cc

Asetik asit 1 cc ya da daha az

19

Kullanmadan önce hazırlanmalıdır. Penetrasyon eşit olmayabilir ve tam olmayan fiksasyonla yüzeyel

tabakaların aşırı kararmasına neden olabilir ve sonradan en içteki hücrelerin zayıf boyanmasına yol açabilir.

Page (1970), Flemming sıvısını formalin fiksasyonunu takip eden ikinci fiksatif olarak kullanarak

miyelini .başarılı şekilde göstermiştir. İki mm kalınlığındaki küçük parçalar 12-48 saat tespit edilmeli ve

sonradan akarsuda yıkanmalıdır. Asetik asit içeriği ile bir nükleer fiksatiftir. Lipidler OSO4 ile siyahlaşır.

Bu fiksatiften sonra alum hematoksilen nükleer boyaları kolaylıkla alınmaz, bunun yerine safranin

kullanılmalıdır.

FLEMİNG SIVISlNIN LEWITSKY-BAKER MODIFIKASYONU

Flemming sıvısını asetik asitsiz fakat % O.75'lik sulu NaCl solusyonunu distile su yerine çözücü olarak

ekleyerek hazırlanır. 12-24 saatlik fiksasyondan sonra dokular akarsuya aktarılır. Sitolojik (sitoplazmik)

fiksatif, bu ve diğer krom-osmium karışımlar omurgasız ve alt omurgalıların dokuları ile çok iyi sonuçlar

verirler. Helly sıvısı memeli dokuları için tavsiye edilmemektedir.

ORTH FİKSATİFİ ( ORTH 1896)

Formalin 10 cc

Müller sıvısı (Potasyum dikromat 2.5 gr +sodyum sülfat 1 gr+distile su 100cc) 100 cc

Taze olarak hazırlanmalıdır. Formalin ve Müller sıvısını karıştırma mitokondri gibi sitolojik yapılar üzerine

ve kromaffin reaksiyonundaki mordantlama özelliği nedeni ile çok yararlıdır. Bloklar çeşme suyuyla

yıkanmadan veya distile sudaki %2.5'lik potasyum dikromatla ileri kromasyondan önce 24-48 saat tespit

edilmelidir.Bazen potasyum dikromatla uzun süre muamele etme hemen hemen kaçınılmaz olarak

kırılganlıkta artış ve parafin kesitlerden kesit alma zorluğu ile (özellikle yumuşak dokularda, dalak ve beyin

gibi) sonuçlanmaktadır.

FİKSASYONDAN SONRA DOKULARA UYGULANAN İŞLEM

%10' luk formal-saline

%1O'1uk tamponlanmış formalin %70'1ik alkol ile

Bouin

Formal-sublimat %8O-90'lık alkolle

Susa %95' lik alkolle

Carnoy %95'lik ve %lOO' lük alkolle

Zenker Çeşme suyu ile yıkama (l2-24 saat)

Helly Çeşme suyu ile yıkama (l2-24 saat)

20

Sanfelice Çeşme suyu ile yıkama (l2-24 saat)

Flemming Çeşme suyu ile yıkama (l2-24 saat)

Lewitsky-Baker Çeşme suyu ile yıkama (l2-24 saat)

Orth Çeşme suyu ile yıkama (l2-24 saat)

İKİNCİ FİKSASYON

%10' luk formal-salin ile tespit edilen dokuların hala diğer ve daha etkili precipitant fiksatiflerin etkilerine

duyarlı olduğunu gösterilmiştir. Uygulama ''ikinci fiksasyon'' olarak adlandırılır. Civa klorür-formalin ve

Helly fiksatifi özellikle ikincil fiksatif olarak yararlıdır. Böylelikle dokular daha iyi korunur ve boyanırlar.

Post-kroming ve post mordantlama: Korunmayı ve özel doku bileşenlerini boyamayı kolaylaştıran ve

doku bloklarının (fiksasyondan sonra) veya kesitlerinin bir krom tuzu ile muamele edilmesiyle yapılan

yöntemlerdir. Yöntem özellikle mitokondri ve miyelini göstermek için kullanılır.

Postfiksasyon: Bazı doku proteinlerinin çoğu fiksatiflerin tam penetrasyonunu önleyen yağsı maddelerle

maskelenir veya saklanır. Bu protein sonradan yağ çözücüleri ile şeffaflandırma sırasında yağsı maddenin

ortadan kaldırılmasından sonra kaybolur. Dokular bir yağ çözücü içinde tespit edilip, sudan kurtarma,

şeffaflandırma ve sonradan tekrar şeffaflandırma ve parafine gömmeden önce absolu alkolde postfikse

edilirse iyi sonuçlar verir.

Hemen kesit alınmasına gerek olmayan formalinle tespitlenmiş dokular fiksatif değiştirilmeden uzun yıllar

fiksatifde kalabilir.Tamponlanmış nötral solusyonlar bu etkiyi geçiktirmesine rağmen, boyanma kalitesi

kademeli olarak bozulur. Diğer bir yöntemde fiksasyondan ve fiksatifin yıkanarak uzaklaştırılmasından

sonra saklama solusyonu olarak %70'lik alkole koymaktır. Formal-sublimat ve yıkamadan sonra %30’luk

gliserol, %10-20' lik dietilen g1ikol önerilmektedir.

DOKU TAKİBİNİN (İMPREGNASYON ) PRENSİPLERİ

Doku takibinin amacı, dokuyu desteklemek için yeterince sert bir katı ortama gömmek ve kesitlerin

alınması için gerekli sertliği vermektir. Bu sertliği verirken de dokunun bıçağa çok az zarar verecek

sertlikte olmasını sağlamaktır. Rutin histoloji için tatmin edici gömme materyeli parafindir. Doku parafine

gömülmeden önce şu işlemlerden geçirilmelidir.

l-Fiksasyonun tamamlanması

2-Sulu fiksatifi ve doku sıvısını uzaklaştırmak için hafif fakat tatmin edici bir dehidrasyon

3-Hem kendinden önceki dehidrasyon ajanı ile hem de daha sonra uygulanacak gömme ajanı ile tam olarak

karışabilen bir madde ile şeffaflandırma

21

İMPREGNASYON HIZINI ETKİLEYEN FAKTÖRLER

Doku sıvıya daldırıldığında, doku sıvısı ve çevresindeki sıvı arasında karşılıklı yer değişimleri olmaktadır

ve bunu birçok faktör etkilemektedir. Bunlar fiksasyondan gömmeye kadar tüm basamakları

etkilemektedir.Bunlar:

1-Ajitasyon: Shandon Elliott ve Technicon ultra modelleri vertikal ajitasyon uygularken Colombia

Histokineti dönme hareketi uygulamaktadır. Ajitasyonun hızı önemlidir, çok düşük hız etkisizken, çok

yüksek hız ise yumuşak veya gevşek dokularda harabiyete yolaçabilir. Dakikada 25-30 cm' lik bir hız her

iki ajitasyon için de uygundur.

2-Isı: Isı penetrasyon hızını artırırken, soğuk azaltır. Isı her nekadar süreci hızlandırırsa da dokuları fazla

ısıtmamaya dikkat edilmelidir. Çünkü büzülmeye, gevrekleşmeye ve kesit almada zorluklara yol açabilir.

Kullanılan sıvıların birçoğu yanıcıdır ve ısıtma yangın tehlikesini artırabilir.

3-Viskozite: Kullanılan sıvıların viskozitesi, dokulara penetre olma hızını etlkiler, molekül büyüdükce

viskozite artar ve penetrasyon hızı azalır.

4-Ultrason: Ultrason kullanımı önerildiği halde birçok nedenle çok geniş kullanım kazanamamıştır.

5-Vakum: Azaltılmış vakumun kullanımı erimiş parafinle dokuların impregnasyonunda çok

kullanılmaktadır. Bazı otomatik takip aletlerinde takibin tüm basamaklarında vakum kullanılmaktadır.

Dehidrasyon ve şeffaflandırmada vakumun kullanılmasının çok az avantajı vardır. Dokudaki hava

kabarcıkları bu yolla uzaklaştırır.

Sert Dokuların Muamelesi: Tendon, tırnak, fibröz doku, keratin kütleleri normal şekilde takip edilebilir.

Fakat takipten önce özel işlemden geçirilirse daha iyi sonuçlar alınabilir. Bu dokuları yumuşatmak için %

70 lik alkolle hazırlanmış % 4 lük phenol kullanılabilir. Ayrıca molliflex gibi çeşitli gliserol, alkol ve

anilin oil karışımları da kullanılabilir. Mollflex, kesit alırken parafin bloklarda da kullanılabilir.

3-SUDAN KURTARMA ( Dehidrasyon)

Tespitten sonra suyun ve bazı lipid doku sıvılarının uzaklaştırılmaları gerekir. Dehidrasyonda

genellikle değişik alkol tipleri kullanılmaktadır. Bunların çoğu hidrofiliktir ve dokulardaki suyu çekerler.

Diğerleri ise sulu doku sıvılarının seyreltilmeleri ile dehidrasyonu etkilerler. Dehidrasyon basamağı

katılaştırıcı ortam olarak suyla karışabilen madde kullanan gömme teknikleri hariç tüm tekniklerde

kullanılır.

Dokular genellikle fazla miktarda su içerirler. Dokulardan suyun çıkarılmasıyla erimiş parafinin

doku parçalarına tamamıyle nüfus etmesi sağlanır. Alkol en iyi su çeken maddedir. Genellikle dehidrasyon

22

safhasında doku parçaları tespitten sonra en az 2-3 saat akar suda yıkanırlar. Sonra %30 veya %50 alkolden

başlayarak %10 artan alkol serilerinden geçirilirler. En çok kullanılan dehidrant etil alkoldür. % 70’lik

derişim ile başlayarak, % 95’ lik alkole kadar artan derişimlerden sonra birkaç absolü alkolden geçirerek

dokular sudan kurtarılır. Kademeli geçiş ile dokular büzülme olmadan sudan kurtarılır. Özellikle

embriyonik dokular gibi hassas yapılarda % 30’ luk derişimden başlamak uygun olur.

Dehidrasyon Sıvıları

1-Etanol: Şeffaf, renksiz, yanıcı ve hoş kokulu bir sıvıdır. Hidrofiliktir bu yüzden su ile her oranda

karışır. Histolojik çalışmalar için çok uygundur.

2-Ticari Endüstriyel Metillenmiş Ruh: Etanole biraz metanol eklenerek hazırlanmış bir dehidranttır.

3-Metil Alkol: Su, etanol ve çoğu organik çözücü ile karışır.

4-Propan-2-ol,ipopropil alkol:Su, etanol ve çoğu organik çözücü ile karışabilir.Rutin histoloji

laboratuvarında çok kullanılmaz fakat dokuları etanolde olduğu gibi sertleştirmez.

5-Aseton: Renksiz, şeffaf, yanıcı ve karakteristik keskin kokulu, su, etanol ve çoğu organik çözücü ile

karışan bir sivıdır. Yaygın kullanılan diğer dehidrantlardan daha uçucudur ve etanol ve metanolden daha

hızlı hareket etmektedir. Fakat uzun süre mualemede dokuları gevrekleştirir. Uçucu, yanıcı yapısından ve

sertleştirici etkisinden dolayı rutin dehidrant olarak otomatik takiplerde fazla kullanılmaz. Hız önemli

olduğunda ise aseton, çoğu şeffaflandırma ajanını hızla uzaklaştırdığından elle takip yöntemlerinde iyi bir

dehidranttır. Aseton, lipidler üzerine etanol ve metanolden daha çözücü bir etkiye sahiptir.

6-Katı Dehidrantlar: Anhidros bakır.sulfat yüksek konsantrasyonlu dehidretleyici alkollerde

kullanılabilir. Anhidros olduğunda tuz beyazdır fakat suyun absorbsiyonunda mavileşir; su

kontaminasyonu ile sıvı mavi renktedir.

7-Kimyasal Dehidrasyon: Son yıllarda. dokuların sudan kurtarımında 2,2-dimetoksipropanın kimyasal

olarak su ile birleşimi kullanılmaktadır. Doku hızla aşağıdaki karışım kullanılarak sudan kurtarılır.

2,2-dimetoksi propan 100 cc

Konsantre HCl 0.05 cc

Bu yöntemde dehidrant tek seferde kullanılır, değişik kaplardan geçirmeye gerek yoktur. Gece boyunca

tutmak gibi uzun süre kullanım, dokuda bir miktar büzülmeye yol açmaktadır. Dimetoksipropan çoğu

resinle ve erimiş parafinle karışmaz. Fiksasyonu takiben ve dehidrasyondan önce doku suda iyice

yıkanmalıdır. Çünkü tampon tuzları dimetoksipropanla precipite olur. Dimetoksipropan bir fiksatifle veya

dehidrantla birleştirerek de kullanılabilir.

Dehidrasyon genellikle aşağıdaki gibi uygulanır:

%50 alkolde 1 saat

23

%60 alkolde 1 saat

%70 alkolde 1 saat

%80 alkolde 1 saat

%95 alkolde 2 saat

%100 alkolde 2 saat ( iki defa değiştirilerek)

4-ŞEFFAFLANDIRMA (Clearing) : Bu terim, dehidratlayıcı ajanı uzaklaştırmak için seçilmiş sıvının

uygulanmasından sonra dokuların görünümünü ifade etmektedir. Bu sıvıların çoğu proteinlerinkine benzer

bir refraktif indisine sahiptir. Bu nedenle de dokuyu yarı şeffaf hale getirir. De-alkolleyici ajan olarak

ksilen kullanırken bu yarı şeffaflık, küçük bir doku parçası aydınlık görüldüğünde bir rehber olarak

kullanılır. Şeffaflandırıcı ajanın kullanımı dehidratlayıcı ajanın-örneğin alkol- gömme ortamı ile

karışmadığı zaman-örneğin parafinle- gereklidir. Bir şeffaflandırıcı ajandan esasda beklenen şey hem

dehidrant .ile hem de gömme ajanı ile karışabilir olma özelliğidir. Bu amacı tam olarak yerine getirecek

birçok sıvı vardır. Uygun şeffaflandırıcı ajanın seçiminde şunlara dikkat edilmelidir:

l-Alkolü uzaklaştırma hızı,

2-Erimiş gömme ortamı ile uzaklaştırılmasının kolaylığı,

3-Dokulara karşı nezaketi

4-Yanıcılık,

5-Toksisite

6-Fiyat

Şeffaflandırıcı ajanların çoğu yanıcı sıvılardır onun için dikkati gereklidir. Bir şeffaflanrıcı ajanın

kaynama noktası erimiş parafinin uzaklaştırılmasındaki hızının belirleyiciliğini verir. Sıcak parafine

aktarmada kaynama noktası düşük sıvılar, yükseklere göre uçuculuklarındaki fark nedeni ile daha hızlı

uzaklaştırılmaktadır. Bu özellik vakum altında artırılır. Bu kesin bir faktör değildir. Örneğin çok düşük

kaynama noktasına sahip olan kloroform, ksilene göre daha yavaş uzaklaştırır. Viskozite, şeffaflandırıcı

ajanın penetrasyon hızını eşit olarak etkileyebilir. Parafine gömme takibinde kullanılan şeffaflandırıcı ajan,

kesit almanın kolaylaştırılması üstüne ve kesitlerin sonuçtaki niteliği üzerine etkilidir. Çoğu şeffaflandırıcı

ajan, dehidratasyon ajanının tam olarak uzaklaştırılması için gereklı minimum zamanda kullanılırsa tatmin

edici sonuçlar verir. Otomatik olarak takip yapılıyorsa zaman çok geniş ve çok dens bloklar için yeterli

olmalıdır fakat zamanda küçük doku parçaları , bu uzun uygulamadan da etkilenmemelidir.

Şeffaflandıcı Ajanlar

1-Ksilen

2-Toluen

3-Kloroform

4-Benzen

5-Karbon tetraklorür

24

6-Propilen oksit

7-Petrol

8-Karbon disülfit

9-Amilasetat

10-Metil benzoate ve metil salisilat

11-Sedir yağı

12-Karanfil yağı

13-İnhibisol (1,1,1,trikloroetan (metil kloroform)

Dehidrasyondan alınan doku parçaları xylol, toluol, benzen ve sedir yağı içine aktarılırlar. Burada

parçalar şeffaflanıncaya kadar bırakılırlar. Amaç, dokulardaki alkolün şeffaflandırıcı madde ile yer

değiştirmesidir. Böylece alkol ve sudan yoksun hale gelmiş ve şeffaflanmış doku parçaları artık parafinin

nüfüz etmesine elverişli hale gelmişlerdir.

5-PARAFİNE GÖMME ( Embedding) :Gömme materyeli olarak parafin, selloidin, selloidin-parafin

kullanılabilir. Amacı, dokuları yarı sert ve kolayca kesebilen bir materyal içerisine yerleştirmek ve

şeffaflandırıcı ajanı dokudan uzaklaştırmaktır. Böylece kolay taşınan ve parçanın istenilen yönde

kesilmesini sağlayan bloklar elde edilir. Histolojik çalışmalarda ençok kullanılan parafine gömme

tekniğidir. Çünkü uygun takip hızına sahiptir, seri kesit alınımı için iyi bir kıvamı vardir. Kesit kalınlığında

geniş ranjı vardır. Dens kortikal kemiği parafinde kesmek, kalın kesitler istendiğinde büyük beyin parçaları

için sellüloz nitrat gömmesi veya dondurma kesit daha uygundur.

Erime derecesi 45-50 C olan parafin yumuşaktır, 55-60 C' lik ise daha sert olur. Parafinin seçimi

çalışma ortamının ortalama ısısına, gömülecek materyelin yapısına ve istenilen kesit kalınlığına bağlı

olmalıdır. 3-5 mikronluk kesitleri, sıcak bir iklimde 45 derecelik ergime noktası olan parafinle kesmek çok

zordur. Parafine gömme safhası sıvı parafinin dokuya nüfuzu ve şeffaflandırıcı madde ile yer değiştirmesi

ile başlayıp dokunun kesilmesi için uygun blok yapılması ile sona erer. Şeffaflandırıcı maddeden çıkarılan

doku parçaları 55-60 C deki parafin etüvünde üç ayrı kaptaki erimiş parafinden geçirilerek blok yapılırlar.

Genellikle doku parçaları parafinde 1 ,5 saat , 2.parafinde 1 .5 saat , 3.parafinde 2-3 saat kalabilir. Fakat

her dokuya sıvı parafinin nüfuz etme kabiliyeti değişik olduğundan parafinde kalma süresi doku çeşitlerine

göre tecrübe ile ayarlanmaktadır Büyükçe bir cam parçası üzerine ''L'' şekline sahip olan blok demirleri ,

tahta, hatta kağıtlardan yapılmış kare veya dikdörtgen şeklindeki kalıplara yerleştirilir. "Leuckhart's

plakları'' ile hazırlanan kalıba önce bir miktar erimiş parafin, ardından dokuyu istenilen yönde yerleştirip

tekrar parafin dökülerek etiketlenip soğumaya bırakılır. Sıvı parafin buz kalıplar içinde doku parçaları ile

birlikte dondurulurak (soğuk su ile veya buzdolabında) kalıplardan kolaylıkla ayrılabilen sert parafin

blokları elde edilir.

GÖMME HATALARI

1. Parafin dokuya nüfuz edememişse , blok iyi kesilemez , kesitler yırtılır veya parçalanır.

2. Parafinin dokuya nüfuzu safhasında sıvı parafinler çok sıcak ise dokuda büzülmelere sebep olurlar.

25

3. Demir kalıp içine parafin dikkatsizce dökülürse, donmuş blokta parafin kristalleri veya hava

kabarcıkları meydana gelir. Kesit alırken parafin ufalanır ve doku parçalanır.

6-KESİT ALMA (Sectioning)

Mikrotom denilen aletle doku parçasını içeren parafin bloklarından 5-10 m kalınlıklarında kesitler alınır.

Bunun için, mikrotomda kullanılan bıçağın çok keskin olması ve uygun açıda kullanılması şarttır. Kesitler,

jelatin solusyonu ihtiva eden 4O-50 C lik su banyosuna atılırlar. Jelatin, kesitlerin lamlara yapışmasına

yardım eder. Böylece su banyosuna atılan kesitler ısının tesiri ile açılırlar. Sonra birer birer lamlara alınarak

kurumaya terkedilirler.

Kesit Alırken Meydana Gelen Hatalar:

1. Mikrotom bıçağı keskin olmazsa bıçakta mevcut olan çentikler yer yer şeritler halinde yırtılma ve

ezilmelere sebep olur.

2. Eğer su banyosu çok sıcak olursa parafin erir, doku kesiti gerilir.

3. Su banyosu yeter derecede sıcak değilse , kesitler açılamadığından buruşukluklar meydana gelir.

7-BOYAMA (Staining)

Boyanmamış preperatlarda çoğu doku elemanları renksizdirler. Değişik kırma indeksine sahip

olmaları nedeniyle ışık mikroskobu ile hücresel detayı görmek güçtür. Farklı morfolojik kısımların, farklı

boyalarla boyanması gereklidir. Bu durumda çekirdek sitoplazmadan, kas bağ dokusundan farklı

boyanarak, morfolojik inceleme kolaylaşır. Boyalar histokimyasal işlemlerle, dokuların kimyasal

reaksiyonlarını ortaya koyar.

Histolojik Boyamanın Kimyasal Temeli:

Genel olarak kesitler iki boya ile boyanırlar. Bazik ve asit boyalarla boyanan kesitleri mikroskop altında

incelediğinde bazik ve asit boyaların bazı doku elemanlarını boyadıkları görülür. Bazik boya ile boyanan

doku elemanları "bazofilik'' asit boya ile boyananlar ise "asidofilik" olarak adlandırılırlar. Bazı doku

elemanları bazik, bazıları ise asit boyaları tutmaktadır. Genel olarak kullanılan bazik boyalar doku

elemanları ile mavi-mor, asit boyalar ise pembe-kırmızı renk verirler.

Boyalar sulu bir solusyon içinde anyon ve katyonlara ayrılırlar. Boyaların renk verme kabiliyeti,

anyon ve katyonlardaki boya taşıyan organik gruplara bağlıdır. Eğer boya taşıyan grup katyonda ise boya

bazik (katyonik) , anyonda ise asit ( anyonik) bir boyadır.

Boyaların doku elemanlarına bağlanma mekanizması genel olarak şöyledir: Doku kesitlerindeki

protein, lipoprotein ve glikoproteinler amphoteric' tirler. Yani pH'ya ve çevrelerindeki çeşitli diğer şartlara

bağlı olarak iyonize olabilirler. Bir protein,sahip olduğu elektrik yüküne ve boyanmanın meydana geldiği

pH' da geldiği ( - ) ve (+ ) yüklerin cebirsel toplamına bağlı olarak asit veya baz olarak hareket eder. Bu

her iki tür proteinin (-) ve (+) yük sayılarının eşit olduğu bir pH vardır. Bu pH' ya o proteinin

"izoelektrik noktası'' denir. Bu pH'da o protein çok az boyanır. Fakat izoelektrik noktanın üstünde

26

proteinin anyonik gruplarının iyonizasyonu kolaylaşır ve protein, metilen mavisi veya bazik fuksin gibi

bazik boyalara bağlanır. Bu izoelektrik noktasının altında, aynı protein, pozitif yüke sabiptir ve bu durumda

eosin, orange G veya light green gibi asidik ( anyonik) boyalarla birleşirler. Dokulardaki proteinlerin

amino asitleri nisbi miktar bakımından oldukça farklıdırlar ve farklı izoelektrik noktalarına sahiptirler.

Dolayısıyla histolojik boyama için kullanılan mutat pH' da, bazı elemanlar daha çok bazik boyaları alarak

bazofilik, bazıları ise aynı pH' da asit boyalarla asidofilik olarak boyanır. Eritrositler, eosinofilik

lökositlerin granülleri ve midedeki parietal hücrelerin sitoplazmaları pH 6' da asit boyalarla boyanırlar.

Buna karşılık çekirdek kromatini sinir hücrelerinin sitoplazmaları ve kıkırdak dokusunun ara maddesi ise

bütün bazik boyalarla boyanmaktadır. Dokuları boyamak için ilk girişim, Leuwenhoek(l7l9) tarafından

safran kullanılarak yapılmıştır. Bu girişim başarılı olmadığı gibi diğer araştırıcılar tarafından da takip

edilmemiştir.

l9. yüzyıl ortalarında dokuların mikroskobik yapıları ayrıntılı olarak açıklanmaya başlanmıştır

(Kölliker, l852). Bu dönemde boya endüstrisi gelişmiştir. Histolojide ticari boyaların uygulanması,

önceden görülemeyen hücresel yapı detaylarını saptamayı, görülmesini ve çalışılmasını sağlamıştır. Boya

teknikleri son yüzyılın ikinci yarısında gelişmiştir ve birçok yöntem o zamandan beri çok az değişikliğe

uğramıştır. İki botanikçi ilk kez Carmin boyama yöntemini tanıtmışlardır ancak bu yöntemle sadece

dokuların hafifçe renklenmesini sağlayabilmişlerdir. Seçici çekirdek boyamasının ilk kullanımının, sinir

hücrelerini boyamaya çalışan Gerlach (l858) tarafından yapıldığı kabul edilmektedir. Başlangıçtaki

başarısızlıktan sonra potasyum bikromatta sertleştirilen bir cerebellum kesiti yanlışlıkla fazlasıyla seyreltik

amonyaklı carmin solusyonunda bırakılmış ve 24 saat sonra bulunduğunda çok güzel boyanmış olduğu,

sinir fibrilleri ve sinir hücrelerinin ayrılabildiği görülmüştür. Gerlach aynı zamanda zayıf asetik asitle

differansiyasyonla gerileyen (çekinik) boyanmayı da keşfetmiştir. Hematoksilen ilk kez yetersiz sulu

ekstrak olarak kullanılmıştır. Fakat iki yıl sonra Böhmer (l865), hematoksileni bir mordant olarak alumla

(şapla) karıştırmıştır ve daha spesifik boyanma elde etmiştir.

Endüstriyel kullanım için anilin boyalar geliştirildikten sonra bu boyalar, hematoksilenle birlikte

hala histolojide çok yaygın kullanılmaktadır. Eski boya yöntemlerinin büyük bölümü hala kullanılmaktadır.

Carmin , histolojide daha az kullanılmakla beraber, zoologlar tarafından günümüzde bütün haldeki

cestodlar, medusalar vs gibi hayvanların boyanmasında kullanllmaktadır.

Günümüzdeki boyama yöntemleri genellikle klasik yöntemlerin modifikasyonlarıdır. Son yöntemler

genellikle spesifik kimyasal yapıların ve enzimlerin tayini için renkli reaksiyonlar veren histokimyasal

yöntemlerdir.

HİSTOLOJİK BOYAMA YÖNTEMLERİNİN HEDEFİ

.Doku bileşenlerinin ayırt edilmesi için kullanılan başarılı histolojik teknikler, dokularda genel

olarak iki değişikliğe yol açar. Bunlar:

a-Ya kontrastta değişiklik

b-Ya da renkte bir değişikliktir.

27

Doku kontrasttındaki değişiklikler faz-kontrast veya polarize ışık kullanımı gibi mikroskobik yöntemlerle

de oluşturulabilir doku parçaları gri veya siyah olur. Aynı sonuç çöktürme yöntemleri ile de başarılabillr.

Şöyleki, opak gümüş veya diğer metalik bileşikler çoğunlukla fibrillerin, hücrelerin yüzeyinde depolanırlar.

Histolojik boyama yöntemleri sıklıkla boya-boyanması ile dokularda renk oluşturmaya

dayanmaktadır. Bu; boyanmış doku içinden geçen ışığın dalga boyunu değiştirir. Boya solusyonlarında

kullanılan boyalarla dokuların renklendirilmesi, boya yolu ile ışığın absorbsiyonudur. Başarılı boya

yöntemleri hem SPESİFİK tir hem de HASSAS tır. Spesifiklik veya seçicilik, tek tek doku

kompenentleri arasındaki farkı ayırt etmeyi ve bu yapılardan birini veya birkaçını renklendirerek,

boyanmamış diğer yapılardan ayırt etmeyi sağlar. Eğer kişi sadece özel bir yapıyı göstermek isterse; boya

sadece bu yapıyı seçmeli, diğerlerine yerleşmemelidir.

HASSASİYET ise boyanın düşük konsantrasyonda bir doku elemanını gösterebilme kapasitesidir. Tüm

boyama yöntemlerinde bileşenlerin bu değerin altında gösterilebilmesinin mümkün olmadığı bir eşik

değerine sahiptir. Eğer bir boyama tekniğinin eşik değeri yüksekse, bu hassasiyetin düşük olduğunu ve

doku kompenentlerinin bir bölümünün var olmalarına karşın bu teknikle gösterilemiyeceğini ortaya

koymaktadır. Tatmin edici bir boyam yöntemi yüksek hassasiyeti, yüksek seçicilikle biraraya getiren bir

yöntemdir.

HİSTOLOGLARCA UYGULANAN BOYAMA İŞLEMLERİ

Histologlarca kullanılan temel boyama teknikleri aşagıdaki tabloda verilmiştir.

Tablo :Histolojide Kullanılan Boyama Süreçlerinin Esas Tipleri

BOYAMA YÖNTEMİ BELİRLEDİĞİ YAPILAR NEREDE NE İLE

1- Vital Boyama

a-partiküllerin Makrofaj sistemi. canlı dokular trypan mavis

fagositozu

b-canlı yapıların Mitokondri canlı hücreler Janus green

spesifik boyanması

2- Seçilen Çözünebilirlik yağ damlacıkları dondurma kesitler Sudan boyaları gibi lizokromlar

3- Renkli kimyasal madde-

lerin yapımı

a-Stabil bileşikler Ferrik demir tüm kesitler Perls' yöntemi

b-Stabil olmayan bi- Enzimler özel hazırlanmış kesitler Histokimyasal Yön.

4 -Metal Çöktürme

a-Intrasellüler yapılar Melanin tüm kesitler Fontana gümüş

b-Fibriller Reticulin tüm kesitler Gümüş yöntemi

28

5- Boyalarla Boyama

a-Genel kimyasal ve Doku yapıları tüm kesitler H+E

fiziksel hareketler

b-Metakromazi kıkırdak, amyloid " " Thionin, crystal violet

c-Bir boyanın lokal DNA parafin kesit Feulgen reak.

Şekillenmesi

Enzim histokimyasından, gumüş çöktürme yöntemine kadar tüm yöntemlerin fizikokimyasal temelleri

aynıdır. Bütün boyama yöntemlerinde sorulacak en önemli sorular şunlardır:

a-Doku kompenentleri neden boyanır?

b-Neden boyanmış kompenentler boyalı olarak kalırlar?

c-Neden tüm kompenentler boyanmazlar?

NEDEN BOYALAR DOKULARCA ALINMAKTADIR?

Belki de alınmamaktadır. Negatif boyamada yapıların şekilleri boyanın penetre olrnasından değil boya ile

çevrelendiğinden gösterilmektedir. Bazen boyalar yenir. Daha kusursuz olarak, boya reaktifleri

organizmanın fizyolojik aktivitelerine bağlı olan değişik yollarla canlı hücre içine alınabilir. Bu ise vital

boyama ve supra-vital boyama olarak adlandırılır.Daha da genellersek, boya alınımı, boya-doku veya

reaktif-doku affiniteleri nedeniyledir. Bazı doku kompenentlerinin bazı boyalar için yüksek bir affiniteye

sahip olduğu söylendiğinde, spesifik kullanım şartlarında-kompenent yoğun olarak boyanacaktır. Öte

yandan dokuya boyayı bağladığı düşünülen Coulomb, hidrojen bağı ve diğer bağlar gibi çekici kuvvetleri

de açıklamak için de kullanılmaktadır. Bu yüzden affinite, bir boya maddesini boya banyosundan bir kesite

transfer olma eğiliminin bir ölçümü olarak düşünülebilir ve affinitenin önemi (büyüklüğü), bu prosese

eklenen veya engellenen her faktöre bağlıdır.

1-VİTAL BOYAMA

Canlı hücreler, boyama sıvılarındaki ayrışma ile (supra-vital boyama) veya canlı organizma içine boyanın

enjeksiyonu ile (intra-vital boyama) boyanabilirler. Bu yöntemler, tespit edilmiş dokudan alınan kesitlere

uygulanmaz. Fakat boyanmış kesitlerin karşılaştırılmasında değerli bir kontrol olarak kullanılabilirler.

Canlı hücrelerin boyanması için ilk uygulama, önce metilen blue'yu (l887), daha sonra nötral red'i (l894)

kullanan Paul Ehrlich' ten gelmiştir. Vital boyamada önce sitoplazmik yapılar ortaya konur. Canlı

hücrelerin çekirdek zarı boyalara geçirgen değildir ve canlı çekirdeği boyamak mümkün değildir. Trypan

mavisi ile makrofaj sistem hücrelerinin vital boya ile gösterimi, sitoplazmik fagositoza bir örnek oluşturur.

Bu boya kolloidaldir. Çini mürekkebi gibi ince süspansiyonlar, Makrofaj Sistemi hücreleri ve diğer

hücrelerce fagositik kapasiteleri ile alınmaktadır. Hücresel bileşenlerin gerçek vital boyanması,

mitokondrilerin Janus green ile gösterilmesidir.

29

2-SEÇİLEN ÇÖZÜNURLUKLE BOYAMA

Su, hücrenin her tarafında geniş olarak dağıldığı için sulu boyalar uygun değildir ve boyama çok gevşek

olacaktır. Dokularda çözünen maddeler ''Lysochrom'' lar olarak bilinmektedir. Hemen hemen tüm

lysokromlar lipidde çözünür ve doku kesitlerinde lipidlerin gösterimi için histolojide kullanılırlar. Yağ

damlacıkları, eğer boya yağda alkolden daha çözünürse, alkolik solusyonlardaki (sıklıkla % 70' lik)

boyalarla seçici olarak renklenirler. Solusyonla başarılı histolojik boyama esas olarak yağ boyaları ile

sınırlandırılmıştır ve lysokromlar, parlak renkli, lipidlerde yüksek çözünür olmalı ve seçilen tercihli

çözünürlükler hariç diğer hücresel yapıların hiçbirine affinitesi olmamalıdır.

3-DOKULARDAKİ RENKLİ MADDELERİN KİMYASAL URUNLERİ İLE BOYAMA

Bazı boyama yöntemlerinde, doku kompenentleri ile reaksiyona girip renkli maddeler üretecek soluk veya

renksiz solusyonlar kullanılır. Bu reaksiyonların sonunda oluşan renkli ürünler ya gerçek boyalar veya

boya olmayan renkli kimyasal ürünlerdir.

Birinci gruba örnek olarak PAS reaksiyonunda kullanılan Schiff reaktifi ve Feulgen reaksiyonu

verilebilir. Saman renkli veya renksiz solusyon, dokulardaki aldehitlerin varlığı ile mor renge dönüşür.

Histokimyasal reaksiyonların ikinci grubu renkli olan fakat bir boya olmayan final ürününe sahiptir.

Reaksiyona örnek olarak demirin gösteriminde kullanılan Perls' reaksiyonu verilebilir. Potasyum

ferrosiyanid, potasyum ferric ferrosiyanid (prusya mavisi) oluşturmak için demir iyonları ile birleşir (+3

değerlikli Fe). Bu basit bir kimyasal reaksiyondur. Ürün olan Prusya mavisi bir boya değildir ve boya

olarak kullanılmaz. Fakat görülebilen, koyu boyanmış çözünmeyen bir birikimdir. Dokuların böylesi

renklendirilmesinin bir diğer değişik tipi enzim histokimyasında görülmektedir. Enzimler, renkli son

ürünler oluşturmak üzere kimyasal substratlarla birleşmezler ya enzim aktivitesi olan alanlarda substratları

renkli maddelere dönüştürerek ya da iki basamaklı bir reaksiyonda renkli bir bileşikle yer değiştirebilecek

renksiz bir ürün oluşturarak substratları üzerine etki yaparlar. Renkli bir final reaksiyon bileşiği üretimi ile

ilgili tüm bu yöntemlerin sonuçları benzerdir. Reaksiyonun yoğunluğu, dokulardaki aktif reaktifin miktarı

ile orantılıdır. Histolojik kesitlerdeki bu kimyasal reaksiyonların başarısı, aktif hücresel yapıların hücre

içindeki orijinal yerlerinde ve orijinal konsantrasyonlarında korunmasına bağlıdır; glikojen veya enzimler

gibi stabil olmayan maddelerin kaybından kaçınmak için özel önlemler alınmalıdır. Ayrıca son ürünler

opak veya koyu boyanmış olmalıdır.

4-METALİK ÇÖKTÜRME

Bazı metalik bileşikler dokular tarafından opak, genellikle siyah birikinti oluşturarak metalik duruma

indirgenebilirler. Kolayca indirgendiğinden ve depo edilmiş gümüş stabil olduğundan Ag(NH3)20H

çözeltileri histoloji için çok uygundur. Melanin gibi tyrosin türevleri ve intestinal bezlerin Kultschitzky

hücre granüllerinde bulunan fenolik bileşikler, görülebilen birikinti oluşturmak üzere Ag(NH3)2)OH’ı

indirgeme kapasitesine sahiptir. Bu tip hücreler arjentaffin hücreler bilinirler. (Ag(NH3)2)OH’ ı direkt

olarak indirgeyemeyen fakat bunu dışarıdan ilave edilen bir indirgeyicinin eklenmesi ile gerçekleştiren

hücreler argirofil hücreler olarak bilinir.

30

Metalik çöktürme aynı zamanda fibrillerin gösterilmesinde kullanılan standart bir yöntemdir. Sinir

fibrilleri ve retiküler fibriller gibi diğer fibril1er Ag(NH3)2OH ile birleşirler ve bu transparan

indirgenmemiş gumüş, bir fotografik developer tarafından veya tekniğin ikinci basamağındaki diğer bazı

indirgeyici ajanlar tarafından opak metalik gümüş olarak fibril1er üzerinde birikebilir. Metalik çöktürme

ile boyama, dokulardaki indirgeyici ajanlar yeterli güçte ise tek basamaklı bir teknik olabilir. Fakat

fibrillerin impregrasyonla gösteriminde, argirofil hücrelere benzer olarak genellikle iki basamaklı

indirgenmeye gereksinim olacaktır. Hassaslaştırıcı ajanların ve gümüş yöntemlerinin varyasyonlarını

kullanarak, birçok hücresel yapı, pigmentler, spiroketler ve funguslar metalik impregnasyonla

gösterilebilir.

5-DOĞAL VE YAPAY BOYALARLA BOYAMA

Boyama tekniklerinin büyük bölümü bu gruba girmektedir. Ticari boyalara ait bilgilerin histolojiye

aktarımı, dokularla boya kombinasyonları ile ilgili birçok faktörü anlamamıza yardım etmiştir.

Histolojide Kullanılan Boyalar

Histolojide iki tip boya kullanılmaktadır. Bunlar:

a-Doğal boyalar b-Yapay (sentetik) boyalar dır.

Doğal Boyalar: Örnek/ Carmin ve Hematoksilendir. Carmin boyası, Orta Amerika sulak ormanlarında

yaşayan Dactylopius cacti türü dişi böceğin (kırmız böceği) kurutulmuş gövdelerinden elde edilir.

Carminik asit, kırmız böceğinin suda kaynatılması ile ve kimyasal saflaştırmayı takiben ekstre edilmesi ile

elde edilmektedir. Kaba form olan Carmin, kırmızın potasyum alimunyum sulfatla çöktürülmesi ile

hazırlanır.

Hematoksilen ise Meksika'dan orijin almış ve Jamaika'da ıslah edilmiş Haematoxylen

campechianum türü küçük bir ağacın tahtalarından ekstrakte edilmektedir. Hematoksilen histolojide en

çok kul1anılan boyalardandır. Hematoksilenin doğal formunun boyama yeteneği çok azdır veya yoktur.

Bu nedenle ya hava ile temas ederek doğal yoldan ya da sodyum iodat veya mercuric oksit gibi oksitleyici

ajan kullanarak kimyasal yoldan hemateine okside olması gerekmektedir.

Yapay Boyalar: Kömür-gaz endüstrisinde kömürden elde edilen organik bileşiklerdir. Son yıllarda petrol

yağları önemli bir alternatif kaynak haline gelmiştir. Benzen, toluen ve naftalin gibi hidrokarbonlar; fenol

ve cresol' ler gibi fenoller primer ürünlerdir. Yapay boyaların büyük bir bölümü üç olası alternatif yapısal

formülü bir türevli moleküldür (Şekil )

Şekil :Boya bileşiklerinin benzen halka yapısı

31

a-Benzen b-Quinone c-Anilin

Resonans, ışığın absorbsiyonu ve renk oluşumu ile ilgilidir. Benzen renksiz bir bileşik olmasına

rağmen, ultraviyole bandında bir absorbsiyon bandına sahiptir ve eğer gözlerimiz ultraviyole ışığa duyarlı

olsaydı benzen renkli görünecekti. Benzenden renkli bir bileşik yapmak için, bazı kimyasal değişiklikler

yapmaya gereksinim vardır ve renk oluşturan kimyasal konfügirasyonlar "kromofor ‘ lar olarak

bilinmektedir. Üç esas tip chromofor vardır (Şekil ). Bunlar:

l-Quinonoid halka (genellikle paraquinonoid, bazen orto-quinonoid)

2-Azo-eşlenme

3-Nitro-gruplanma, NO2

Şekil : Kromoforlar a-Paraqulnonoid halka b-ortoquinonoid halka c-Azo-eşlenme

d-Nitro-gruplanma(nitrobenzen)

QİNONE, sarı renkte, önemli bir kromofor içeren bileşiktir. Daha kompleks organik bileşiklerde bir

quinonoid halkanın bulunuşu, parlak daha koyu renkler oluşturur. Kromoforları içeren bileşikler '

Kromojen' ler olarak bilinirler. Dokuları ve kumaşları renklendirirler. Oluşan renkler sabit değildir ve

basit solusyonlarda yıkama ile kolaylıkla uzaklaşabilirler. Kromojenler solusyonlarda moleküller

oluşturarak çözünürler. Halbuki tatmin edici boyalar iyonlar şeklinde çözünürler. Bir kromojeni gerçek bir

boyaya çevirmek için iyonize edici bir grubun ortama verilmesine gereksinim vardır.Bu iyonlaştırıcı

gruplar ''auxokrom'' lar olarak bilinirler ve rengin yoğunluğunu artırırlar. Auxokromlar ya asidik veya

baziktirler ve tüm molekülün boyanma hareketini belirleyen boya parçalarıdır.En önemli bazik auxokrom,

amino-qrubu (-NH2) dur. Boya endüstrisinin temelini oluşturan anilin halkayı içeren boyalar (Şekil-c),

histolojide birçok boyama tekniğinde hala kullanılmaktadır.

Asidik auxochromlar ise şunlardır:

sülfür grubu (-SO3)

karboksil grubu (-COOH)

hidroksil grubu (-OH)

32

Bir boya bileşiği içeren asidik veya bazik auxokromların büyük bir bölümü, bazik (katyonik) veya

asidik (anyonik) boya karakterlerinin gücünü belirler. Bir bazik ve bir asidik gruba sahip boyalar baziktir

ve bazik grup predominanttır fakat asidik grubun varlığı ile boyama özelliği zayıflamıştır. Boyalar

modifier ' ler olarak adlandırılan ve boyanın rengini değiştirme etkisine sahip ek kimyasal gruplar içerirler.

Bunlar metil (-CH3) veya etil (-C2H5 grupları olabilir ve boyanın rengini daha belirginleştirirler.

Rosanilin, pararosanilin' den rengi biraz daha mavi yapan bir metil grubuna sahip olması ile ayrılır. Eğer

bazik amino-auxochromların hidrojenleri metil veya aril grupları ile yer değiştirirse, boya daha mavi olur.

Kristal viyole birden fazla modifiere sahip boyalara örnek olarak verilebilir. Şöyleki, bir koromofor ile

renklenmiş ve bir auxokrom ile iyonize edilmiş organik bileşikten oluşmuş bir boyanın final rengi, bir

modifier ile değiştirilir veya kuvvetlendirilir. Örnekler aşağıda verilmiştir.

QUİNONOİD ROYALAR:

Asit ve bazik fuksin

Krista1 viyole

Anilin blue

Eozin

Thionin

Metilen blue

Nötral red

Doğal boyalardan hematein ve karminik asit

AZO BOYALAR : Küçük bir boya grubudur .

Orange G

Congo Red

Trypan blue

NİTRQ BOYALAR :En küçük boya grubudur.

Pikrik asit (trinitrofenol)

Aurantia

Şekil:Boyaların Yapıları

a-Quinoid boya (hematein) b-Azo boya (Orange G) c-Nitro-boya (Pikrik Asit)

33

ASİDİK- BAZİK VE NÖTRAL BOYALAR

Asidik ve bazik boyalar, solusyon hazırlandığında iyonize olurlar.Tipik bir bazik boya, katyonik

veya pozitif yüklü boya iyonları ve negatif yüklü, renksiz klorid iyonları oluştururlar. Halbuki asidik bir

boya anyonik veya negatif yüklü renkli boya iyonları ve pozitif yüklü renksiz sodyum iyonları

oluştururlar. Boyalara uygulanan bu ''asidik'' ve ''bazik'' terimleri pH ile ilgili değildir ve bazik boya için

katyonik boya; asidik boya içinse anyonik boya terimlerini kullanmak daha iyi olacaktır. Uygulamada,

katyonik bazik boyalar reaksiyonda klorid köklerinden dolayı kısmen asit olarak bulunurlar. Asit boyalar

ise sodyum tuzlarıdır ve kısmen alkali olabilirler.

Bazik fuksin , renkli rosanilin temele ve renksiz asidik Cl köküne sahip bir bazik boyadır (Şekil a).

Boya molekülünün asidik kısmı renkli olan, temeli ise renksiz ve genellikle sodyum olan boya ise

asidofilik ' tir. Asit fuksin; rosananilin bir asidik sulfonat türevinin sodyum tuzudur.

Şekil : Bazik ve asidik boyalar

a-Bazik fuksin

b-Asit fuksin

Nötral bir boya; bir asidik ve bir bazik boyanın etkileşimi ile olur. Hem katyon hem de anyon

chromophorik gruplar içerirler ve boya molekülünün her iki kısmında renkli bir boya vardır. Büyük

moleküllerin kombinasyonundan dolayı, nötral boya solusyonları sıklıkla kolloidaldir. Nötral boyalar

alkolde çözünürler, suda ise nadiren çözünürler. Halbuki asidik ve bazik boyalar genel1ikle her ikisinde

de çözünürler. Nötral boyalara en iyi bilinen örnek Romanowsky boyalarıdır ve polychrom metilen blue

ve eozinin etkileşimi ile şekillenirler; bu boyalar kan boyaması için çok kullanılırlar. Metilen mavisinin

metilen azure oksidasyonu boyaya özel seçicilik özelliğini vermektedir. Bu oksidasyon hematoksilen gibi

diğer boyaların olgunlaşmasına analogtur.

Amfoterik bir boyama; belli bir pH'nın altında (izo-elektrik nokta) katyonik; bu pH'nın üstünde anyonik

olan bir boyadan yapılır. Carminik asit izo-elektrik noktası pH-4.5' de olan bir amfoterik boyadır.

Bazik boyalar; nukleuslar gibi asidik doku kompenentlerini renklendirirler. Asidik boyalar ise

sitoplazma gibi bazik yapılarla birleşirler. Nötral boyalar ise hücredeki asidofilik ve bazofilik elementlere

ilgi duyarlar ve bazı doku kompenentleri aynı zamanda üçlü boyama etkisi veren bileşik nötral boya ile

reaksiyona girerler.

34

RENKSİZ LEUCOBAZLAR

Bazı boyalar kolaylıkla indirgenebilirler ve eğer bu süreçte kromofor haraplanırsa, boya rengini kaybeder.

Böylesi leuco-boyalar (örnek: leuco-metilen blue), vital bir boya yönteminde oksidasyonla tekrar

renklenirler. Buna karşılık eğer oksijen gerilimi düşerse metilen mavisi ile vital olarak boyanan hücre

yapıları renksiz hale (leucobaza döner) gelir ve oksijene maruz bırakarak tekrar renklenebilir. Oksitleme

ajanı için bir test olarak kullanılmadığından Schiff reaktifi ( bir leuco-fuksin) gerçek bir leucobaz değildir.

Halbuki kromoforun tekrar yapımı ile renkli hale geldiğinden leucobazlara benzemektedir.

METAKROMATİK BOYANMA

Bazı doku kompenentleri boyalarla birleştiklerinde boyanın orijinal renginden ve dokunun diğer

bölümünde oluşan renkten farklı bir renk oluştururlar. Bu olay metakromazi olarak adlandırılır. Bu şekilde

hareket eden boyalar ise metakromatik olarak adlandırılmaktadır. Metakromatik boyanın rengini

değiştirebilen madde ise 'Kromotrop'' olarak bilinir. Ortokromatik terimi ise metakromazi göstermeyen

doku veya metakromatik olmayan bir boya için kullanılabilir. Metakromatik boyaların birden fazla

absorbsiyon spektrumu vardır ve bunlar ortokromatik ve metakromatik doku-boya bileşikleri arasında göze

çarpan kontrastı vermek için yeteri kadar farklı olmalıdır. En önemli metakromatik doku kompenentleri

kıkırdak, bağ dokusu, epitelyal musin, mast ve bazofil hücre granülleri ve amyloid' tir. Metakromatik

olan boyalar esas olarak toluidin blue, thionin gibi thiazinlerdir (Şekil ). Metil viyole de yaygın olarak

kullanılmaktadır.

Şekil :Thiazine boya yapısı (thionin)

Bu boyalarda kullanılan renk kontrastı mavi-kırmızıdır. Ortokromatik doku ile Toluidin blue nun

absorbsiyon spektrumu yaklaşık 630 nm de maksimumdur ve ortaya çıkan renk mavidir; metakromatik

madde ile ise maksimum absorbsiyon 480-540 nm dir ve renk kırmızıdır. Gamma metakromazi olarak

bilinen kırmızı boyanmaya ek olarak, Toluidin blue dokuları menekşe veya mor renge boyar ve beta

metakromazi olarak bilinir.

Alfa................. mavi; negatif

Beta................. menekşe veya mor; kısmen pozitif

Gamma ...........kırmızı ; kuvvetli pozitif

35

Metakromazinin ortaya çıkması için, dokunun yüzeyinde serbest elektronegatif gruplar (genellikle

sülfat veya karboksil ) bulunmalıdır. Bu gruplar bol sülfatlı asidik polisakkaritlerde mevcuttur. Asidik

grupların sayısında bir düşüş veya protein bağlanması ile bunların kaybı metakromazide düşüşe yol açar.

Metakromazinin ilginç bir özelliği ise, alkolün, boyanın polimerize (metakromatik) şeklini, monomerik

(ortokromatik) forma dönüştürmesidir. Eğer kesit, boyamadan sonra alkolle dehidre edilirse metakromazi

genelikle kaybolur. Hughesdon tekniğinde metakromazi kaybolmaz. Su, metakromatik boyaların büyük

bölümü için gereklidir.

FLORESANS BOYAMA

Fluorochromlar, asidik veya bazik boyalar olarak hareket eden kromoforlu ve auxokromlu

quinonoid boyalardır. Bu boyalar dokularla birleştiklerinde ultraviyole ışığı, görünen ışığa çevirme

kapasitesine sahiptirler. Ultraviyole ışığın kullanımı ile fluorokromla birleşmiş dokuları tanıyabilirken;

dokuları gün ışığında oluşan renkle tanıyamayız. Flurokromlar, floresans olmayan boyalardan daha

spesifik değildirler ancak çok hassastırlar. Floresans, bazı maddelerin belirli bir dalga boyunda

aydınlatıldığında farklı ve daha uzun ışınları yayma özelliğidir. Floresans teknikler çok kullanılır.

Flurokrom boya yöntemleri ise doku bileşenlerinin, bakterilerin, fungusların , ağır metallerin gösteriminde,

eksfolyatif sitolojide malign hücrelerin tanınmasında rutin olarak kullanılmaktadır. Floresans mikroskopi,

dokulardaki ve serumlardaki antijen ve antikorların gösteriminde kullanılan immüno floresan tekniklerin

temelini oluşturmaktadır.

İki tip floresan vardır:

1-Primer Floresans (doğal-otofloresans): Vitamin A, riboflavin, porfirin, kloroplast gibi biyolojik

materyelin kendi özelliğidir. Dokular, genel mavi floresansa sahip olabilirler ve bu elastik fibrillerde

kuvvetlidir. Civa, demir ve iodine gibi bazı maddeler doğal floresansı ortadan kaldırır.

2-Sekonder Floresans (yapay-indüklenmiş): Doğal floresans olmayan maddelerin acridin orange,

auramine, thioflavine-T vb bir flurokrom boya ile etkileşimden sonra ortaya çıkar. Yapay floresanla

malign hücreler, acridine orange ile birleştiğinde çok hızlı gösterilebilir. Floresan mikroskopi tekniklerinde

indüklenerek oluşturulan yapay floresansın birçok avantajı vardır. Çok az bir floresans materyel görülebilir

floresans üretir. Çok düşük konsantrasyondaki doku bileşenlerinin çok az floresan boya ile gösterilebilir.

Floresan boyalar toksik etki yaratmaksızın canlı hücrelere de verilebilir. Yöntem çok hassastır ve iyi

kontrast verir. Yapay floresans da ağır metallerle haraplanır. Bazı tekniklerle başarılı sonuçlar için

tamponlanmış flurokrom boya solusyonları gereklidir.

TESPİT EDİLMİŞ DOKULARI BOYAMADAKİ GENEL FAKTÖRLER

1-Fiksasyonun Boyama Üzerine Etkileri: Fiksasyon, dokularla boyaların etkileşimine yardım

eder. Formaldehit ve civa klorür, bazik boyaları tercih ederken, trikloroasetik asit, pikrik asit ve krom

36

bileşikleri asidik boyaların hareketini kolaylaştırır. Etil alkol veya asetik asitle fiksasyondan sonra hem

asidik hem de bazik boyalar dokular tarafından kolaylıkla alınır.

Çekirdek boyası olan carmalum, civa klorür fiksasyonundan sonra daha çok, formalinden sonra ise

daha az boyar. Bazen tespit edici ajan, özel bir doku bileşeni ve boya arasında direkt olarak hareket eder.

Bu durumda iken fiksatifin bir mordant olarak hareket ettiği söylenir. Örnek olarak, hematoksilenle

miyelinin gösterilmesinde başlangıç basamağı olarak dokunun potasyum dikromatla muamelesi verilebilir.

2-Progressif ve Regressif Boyama: Progresif boyama tekniği, dokulardaki farklı elementlerin sıra

ile renklendiği ve boyama solusyonunda uygun sürenin sonunda dokuların tatmin edici differensiyel

renklenmesinin başardığı bir tekniktir.

Regressif teknikte ise dokular önce fazla boyanırlar, hücresel ayrıntılar yok olur. Sonra dokunun

istenmeyen kısımlarından fazla boyanın uzaklaştırılması ile boyanın alındığı veya differensiye edildiği bir

tekniktir. Regressif boyama eski progressif yöntemlerden daha çok uygulanmaktadır. Çünkü diğer hücre

yapılarının bir miktar boyanması olmaksızın bir hücrenin bir kısmının yeterli yoğun progressif boyanması

olmaksızın hücre bölümlerini yeterli yoğun progressif boyanmasını elde etmek zordur. Regressif boyama

ise ayrıntıları örten diffüz sonuç verir. Differansiyasyonla daha açık renkte boyanmış alanlardan boyaların

uzaklaştırılması olasıdır. Differansiyasyondan sonra hala diğer yapılarda seçici ve açık biçimde ayrıntılı

sonuçlar için yeterli miktarda boya kalmaktadır.

3- Direkt ve İndirekt Boyama: Anilin boyaların bir çoğu ( metilen mavisi, eozin gibi) boyanın

basit sulu veya alkolik solusyonlarına konursa dokuları mükemmel olarak boyar ve direkt boyama olarak

bilinir (Şekil a). Hematoksilen gibi birçok boya ise dokularda tatmin edici bileşimin oluşması için

mordant olarak bilinen ara bir maddeye gereksinim duyarlar. Bu olay indirekt boyama olarak bilinir.

Boya ve mordant ünitesi renkli bir göl şekillendirmek için ve mordantlanmış boya, bir doku-

mordant-boya kompleksini oluşturmak üzere doku ile birleşirerek sonraki zıt boyamanın ve dehidrasyonun

kolaylıkla yapılmasına izin verir. Histolojik boyama yöntemlerinde boya ve mordant ya birlikte (örn/

Erlich hematoksileninde hematoksilen potasyum alum ile) veya mordant doku boya solusyonuna

aktarılmadan önce ( örn; Heidenhein hematoksileninden önce iron alum banyosu) kullanılabilir. Demir,

alimünyum ve krom bileşikleri boyalarla bazik boyalar oluşturmak üzere birleşen mordantlardır. Metalik

mordant; kimyasal bağlarla kendini hem boyaya hem de dokuya bağlar.

Accentuator-Vurgulayıcılar: Mordantlardan farklıdırlar ve kullanıldıkları boyanın boyama gücünü

artırırlar. Boyalarla göller oluşturmazlar ve boyanın doku ile kimyasal birleşmesi için esasi değildirler.

Loeffler' in metilen mavisindeki potasyum hidroksit ve karbol thionin ve karbol fuksindeki fenol; boyanın

yoğunluğunu ve seçiciliğini artırarak accentuator olarak hareket ederler. Accentuatorlar sırası ile anyonik

(asidik) ve katyonik (bazik) boyalara eklendiklerinde sıklıkla asit ve alkalidirler. Bir anyonik boyaya

asidin eklenmesiyle; dokuların bazik gruplarının iyonlaşmasının artmasıyla boyama yoğunlaşır. Eğer bir

katyonik boyaya alkali eklenirse, asidik gruplarının iyonizasyonu artar. Fenol, karbol thionin ve karbol

fuksinde accentuator olarak kullanılır fakat hareket tarzı tam olarak anlaşılamamıştır.

37

Şekil : Direkt ve indirekt boyama

a- Direkt boyama

b- Mordant ile indirekt boyama

c- Accetuator ile indirekt boyama

Sinir sistemi için metalik impregnasyon yöntemlerini de kullanılan Acceleratörlerin

(hızlandırıcılar) (örn/ Cajal yöntemlerindeki chloral hidrat ve veronal) de aynı zamanda accentuatorlar gibi

aynı yolla hareket ettikleri görülmektedir. Trapping(tuzağa düşüren ajanlar), boyaları dokularla ve

bakterilerle birarada tutar; tannik asit ve iodin örnek olarak verilebilir. Metilen mavisi/ eozinle seçici olarak

boyanan bir kan smeari, tannik asitle muamelesinden sonra krornatindeki metilen mavisini tutar. Gentian

viyole ve iodin ile boyanan bakterilerin ve alkolik deklorizasyona dayanması da aynı zamanda bakteri-boya

kompleksine iodinin trapping hareketi yüzündendir. İodinin boyanın bakteriler ile reaksiyona girme

kapasitesini değiştirmediğine, fakat boyayı tutmaya meyilli olduğuna ve differansiyasyon sırasında

dokudan kaçışına engel olduğuna inanılmaktadır.

4-Differansiyasyon: Regressif bir teknikteki aşırı boyanmış dokunun differansiasyonu veya boyanın geri

alınımı (de-staining), basit solusyonlarda yıkama ile veya asitler ve oksitleyici ajanların kullanımı ile

sağlanabilir. Mordantlar ve bazı boyalar aynı zamanda differansiasyon ajanları gibi hareket edebilirler.

Suda veya alkolde yıkama, differensiasyonun temelidir ve boyanın içinde çözünebileceği herhangi bir

solvent de kullanılabilir; differensiasyon sıvısı basit çözünebilirlikle hareket eder. Dokularla sıkı kimyasal

birleşme ile birleşen boyalar, bu yolla kolaylıkla differansiye olamazlar fakat onların doku-boya linkajları

asitlerin hareketi ile parçalanabilir. Differansiasyon ajanı ya doku ve mordant arasındaki birleşimi ya da

mordant ve boya arasındaki bağları koparır. Asitlerle hematoksilen boya göllerinin differansiasyonu;

mordantla birleştiğinde kaybolan boyadaki hidroksil grubun yeniden oluşumu ile mordant-boya hattını

kırar; asit aynı zamanda dokulardaki asidik grupların iyonizasyonunu baskılar. Doku-mordant bağı da

kırılır. Oksitleme ajanları farklı olarak hareket ederek boyayı renksiz bir bileşiğe oksitlerler.

Differensiasyon için kullanılan mordantlar; çözünmeyen boya mordant doku kompleksini, bir boya olarak

dokuda boyanın sadece bir bölümünü bırakarak, boyanın kismi redistribution yolu ile differensiasyon

sıvısında dağılan çözünebilir boya-mordant gölüne dağıtır. Boyalar, kullanılan boyalardan doku

kompenentleri için daha kuvvetli bir affiniteleri olduğunda differentiatör olarak işlev görürler. Orange G

38

gibi daha kuvvetli bir boya, diğer daha az hırslı boyayı yerinden çıkarır ve basit de-staining gibi aynı etkiyi

yaratır.

Boyama Solusyonlarının Olgunlaşması: Bazı boyama solusyonları sadece haftalarca veya aylarca

havaya, ışığa ve (sıklıkla) ısıya maruz kaldıktan sonra etkilidir. Hematoksilen iyi bilinen bir örnektir. Taze

hazırlandığında nukleus boyası için kullanışsızdır fakat stoklandıktan birkaç hafta sonra aktifleşir.

Hematoksileni hemateine okside olur. Oksitleme ajanlarının (sodyum iodat, merküri oksit, potasyum

permanganat gibi) eklenmesi ile hızlandırılabilir. Hematoksilenin bir kısmının boyama solusyonunda suni

olarak fazla hematoksilenin ise doğal olarak olgunlaştırılmasının mümkün kılınması önerilmektedir. Bu,

boyanın bir kerede kullanılmasına izin verir fakat devam eden oksidasyon boyanın aktivitesinin birkaç ay

sürmesini sağlar; yoksa tamamen olgunlaşmış solusyon daha ileri oksidasyonla inaktif bileşiklere

dönüşerek hızla etkisiz hale gelir. Boyaların hazırlandığı günün tarihini etiketle belirlemek akıllıca

olacaktır.

BOYALARIN SINIFLANDIRMASI VE STANDARDİZASYONU

Histolojide kullanılan boyaların büyük bölümü 3 temel chromoforik gruptan (quino-noid halka, azo-

grup veya nitro grup) tan birine dahildir. Quinonoid boyalar çok geniş ve önemli bir gruptur ve quinonoid

yapının özel tiplerine bakılarak alt gruplara ayrılırlar.

Histolojide boyalar ya boyaların uygulama tarzlarına bakılarak direkt veya mordant boya; ya da

genel kimyasal özelliğine bakılarak asit veya bazik boya olarak sınıflarıdırılırlar. Bazı boyalar light green

(açık yeşil) gibi rengi açıklayan isimlere, bazıları ise kimyasal açıklamayı da içeren isme sahiptirler (örn/

Anilin mavisi). Birçok boyanın sonunda ise sayılar ve harfler bulunur. Bir boyanın adından sonraki R

harfi, ilgili bir boyadan daha kırmızı olduğunu gösterir. 2 R ise daha da kırmızı olduğunu gösterir. B ise

genellikle mavimsi bir rengi G (gelb) ve Y her ikisi sarımsı bir rengi belirler. Boyalar için uniform bir

adlandırrna, bir boya için birçok sinonimin bulunmasından dolayı özellikle önemlidir. Örneğin lipid boyası

olan Sudan IV aynı zamanda Scarlet red, Scharlach R, Oil red IV, fat ponceau R veya LB veya cerotine

ponceau 3B olarak da adlandırılmaktadır. Orange G' nin de birçok sinonimi vardır. Phloxine G ve Phloxine

B gibi benzer isimli diğer boyalar birbirlerine benzer değildir. Colour Index kullanımı ile bu karışıklık

önlenebilir.

BOYA İNDEKSİ

Bazı boyaların Colour Index' teki numaraları ve varsa sinonimleri aşağıdaki

listede verilmiştir.

-

CI Number Dye Synonym

42685 Acid fuchsin acid magenta. acid violet 19

42005 Acridine orange basic orange 14

45000 Acridin red

74240 Alcian blııe 8GX Ingrain blue 1

39

- Alcian green 2GX Ingrain green 2

58005 Alizarin red S mordant red 3

42755 Aniline blue WS water blue. soluble blue.

acid blue 22

41000 Auramine basic yellow 2

52005 Azur A

520010 Azur B

- Azur

- Azur I

- Azur II

425l0 Basic fuchsin magenta. basic violet 14

26905 Biebrich scarlet acid red 66

21000 Bismark brown Y basic brown 1

16250 Brillian crystal scarlet 6R acid red 44. crystal

ponceau 6R. naphthalene

scarlet 6R. ponccau 6R

75470 Carminc natural red 4

75470 Carminic acid

51050 Celestine blue B mordant blue 14

28160 Chlorantine rast red Sirius red 4B

16570 Chromolrope 2R acid red 29

22120 Congo red direct red 28

-- Cresyl fast violet cresyl echt violet

42555 Crystal violet

42530 Dahlia Hofmanns violet

- Direct blue 109 Durazol brilliant blueB

741 80 Durasol fast blue 8G

45400 Eosin B eosin. bluish. acid red 91

45380 Eosin Y eosin yellowish, acid red 1l7

45430 Erythrosin B acid red 51

Dianozin salts

37245 Fast black B

37235 Fast blue B

37210 Fast garnet GBC

40

37150 Fast red ITR

37085 Fast red ITR

42053 Fast green FCF Food green 3

45350 Fluorescein acid yellow 73

51030 Gallocyanin mordant blue 10

Histoloji laboratuvarlarının çoğu boyaların tespiti ve analizleri ıçin olanaklara sahip değildir. Çünkü

bunun için spektrofotometrik, kromotografik ve elektroforetik yöntemler gereklidir.

Boyalar ve dokuların her ikisi de iyonize olurken birbirleri ile reaksiyona girecektir ve doğaldır ki

bu direkt boyama yöntemlerinde olacaktır; elektropozitif boyalar elektronegatif boyalarla ve karşılıklı

olarak birleşir. Mordantlanmış boyalar indirekt boyama yöntemlerindeki bazik boyalar gibi hareket ederler.

Asitlerle ve alkalilerle bazik ve asit boyamanın differansiasyonu; pH daki değişikliklerle meydana çıkan

iyonik değişiklikler nedeni iledir. Hem boya hem de doku etkilenecektir. Bir boyanın yoğunluğu ve hızı

veya tutunması doku kompenentleri için iyonize radikallerinin arzusuna bağlıdır. Karboksil gruplar sadece

zayıf asidiktir. Fosforil gruplar ve sülfüril gruplar daha kuvvetlidir. Sülfonlanmış boyalar (asit fuksin,

Orange G) proteinlerin bazik gruplarına kuvvetli ilgiye sahiptirler ve kuvvetli differansiasyon isteyen güçlü

bağlar oluşturmak üzere onlarla bağlanacaklardır. Mordantlanmış boyalar, direkt bazik boyalar gibi aynı

yol1a dokuyla birleşecektir fakat metalik mordant sabit bir doku-metal-boya linkajı şekillendirir. Kimyasal

etkileşimle başarılı boyama; birbiri için bir affiniteye sahip farklı ve zıt yüklü radikalli boya solusyonlarına

iyonize kimyasal gruplu tespit edilmiş dokuların bir gösterimi olarak kısaca açıklanabilir.

BOYA İLE BOYANMANIN HAREKET TARZI

Kimyasal ve fiziksel reaksiyonlar dokuların boyanmasını sağlarlar. Her iki olay da

çoğunlukla aynı zamanda ortaya çıkar.

A-Boyamadaki Kimyasal Reaksiyonlar: Bir boya renkli bileşikler oluşturmak üzere proteinlerle

ve diğer doku elemanları ile birleşme yeteneğinde olan renkli katyonlar ve anyonlar oluşturmak üzere

solusyonlarda iyonize olmalıdır. Tipik bir bazik boya histolojide kullanılan pH oranlarında pozitif yüklüdür

(Katyonik) , asidik boya ise negatif yüklüdür (Anyonik). Amfoterik bir boya ise PH ranjında yüksüz

noktaya (izoelektrik nokta) sahiptir ve bu pH' nın altında bazik, üstünde ise asidiktir

Tablo : Bazik, Asidik, ve Amfoterik Boyaların İyonizasyonu

41

pH 3 4 5 6 7 8 9 10

KRİSTAL VİYOLE + + + + + + + + Bazik boya ( Katyonik)

ORANGE G - - - - - - - - - - Asidik boya (Anyonik)

HEAMATEİN + + + + - - - - Amfoterik boya

Aynı şekilde elektrik yüklü gruplar proteinlerde ve dokuların diğer kompenentlerinde bulunur.Alalede

pH ranjında doku kısımları boyalara benzer olarak asidik, bazik veya amfoteriktir (Tablo ). DNA, RNA ve

fosfolipid, fosforil gruplarından dolayı asidik; mast hücreleri, kıkırdak ve bezlerin bazı mukoz salgıları ise

asidik sülfüril ve karboksil grupları içerirler. Kollajen, eritrositler ve eozinofillerin granülleri bazik amino

gruplarının baskın olmasından dolayı bazik tirler. Halbuki hücre sitoplazmasının amfoterik proteinleri ve

kasta asidik karboksil ve hidroksil grupları ve bazik amino grupları arasında bir denge mevcuttur. pH' daki

küçük değişiklikler dokulardaki amfoterik maddeleri asidik veya bazik yapar; daha büyük değişiklikler ise

bazik veya asidik doku kompenentlerinin elektrik yüklerini değiştirir.

Tablo : Doku Kompenentlerinin İyonizasyonu

BAZİK(+) ASİDİK(-) AMFOTERİK

kollojen DNA, kromatin Sitoplazma, kas

eritrosit RNA

eozonofillerin Miyelin, kıkırdak,

granülleri Mukoz salgılar,

Mast hücre granülleri

A-Boyamadaki Fiziksel Reaksiyonlar: Boyalar dokularla, katı maddelerin bir özelliği olan absorbsiyon

ile birleşebilir ve özellikle ince kesi durumlarında onları çekerek serbest yüzeylerinde diğer maddeleri

tutarlar. Böyle boyalar suda veya alkolde differansiye olurlar. Önemli olan fiziksel faktörler dokuların

densitesi ve permiabilitesi dir. Her birim hacim başına fazla miktarda protein zincirine sahip dens doku

maddeleri fazla miktarda boya alır ve bu dens dokular daha az dens dokular differansiasyonla deklorize

edildikten sonra renkli kalacaklardır. Benzer olarak çok geçirgen dokular hızla boyanacaktır ve hızla

differansiye olacaktır. Daha az geçirgen olan maddeler boyayı almak için daha uzun süreye gereksinim

duyacaktır. Ayrıca differansiasyona da daha dirençli olacaktır. Sıkı dokunmuş dokular, incelikle boyanın

penetrasyonuna, daha sonra boyanın differansiasyonuna dirençli moleküler protein zincirlerin sıkı bir

şebekesine sahiptir. Bundan başka, doku maddeleri yaşa bağlı permiabilitelerini değiştirebilirler; Farklı

yaşlardaki fibrin için boyama yöntemleri açıklamışlardır. Fibrinin ince yapısı fibrin yaşlanırken daha açık

42

hale gelir. Böylece büyük moleküllü boyaları daha fazla tutar. Bu prensip aynı zamanda amyloid

boyanmasına da uygulanmıştır. Boya boyanması bazen çözünebilirlik nedeniyledir. Bunlara en iyi örnek

Sudan yağ boyalarıdır. Boyama genellikle boya ve doku yapıları arasındaki fiziksel ve kimyasal

afinitelerinin bir karışımı sağlanır.

BOYAMA YÖNTEMLERİNİN BİLİMSEL KONTROLU

Histolojik boyamanın kesin kimyasal reaksiyonlarla başarılabildiği gösterilmiştir, fakat daha az

kesinlik kazanmış kimyasal ve fiziksel proceslerle başarılmaktadır. Bu; boyama yöntemlerinin çok sayıdaki

farklı faktörlere göre oldukça değişeceği anlamına gelmektedir. Bu aynı zamanda geliştirilen boyama

tekniklerinin çokluğunun nedenini ortaya koymaktadır. Fakat her histoloğun bu yöntemlerde başarısızlığa

uğradığı olmuştur. Bunun nedenleri şunlar olabilir:

l-Dokuların reaktif olmaması,

2-Uygun olmayan fiksasyon,

3-Boyaların kompozisyonundaki ve çözünürlüğündeki farklılıklar,

4-Yetersiz olgunlaşma veya bozulma {boya solusyonunun),

5-Boyanın ve çeşme suyunun PH' sındaki veya ısısındaki değişmeler,

6-Birçok diğer faktör olabilir.

Boyamadaki bilimsel kesinliğin eksikliği, histoloğun en iyi sonuçları elde etmek için kendi

yöntemlerini kontrol etmesi gerektiği anlamına gelmektedir. Eğer çeşme suyunun pH' sı veya yapısı

değişirse veya iklimsel durumlar farklıysa, bir ülkede iyi çalışan bir yöntem diğer bir ülkede hatta aynı

ülkenin bir başka bölümünde tatminkar olmayabilir. Bir boyama yönteminde verilen direktifler dikkatli

olarak takip edilmelidir ancak değiştirilemez diye de düşünülmemelidir. Laboratuvar, özel doku

elementleri, patolojik değişiklikler, bakteriler, metaller gibi maddeleri içerdiği bilinen dokuların kapatılmış

boyanmamış parafin kesitlerin bir stoğunu bulundurmalıdır. Bunlar kontrol kesitler olarak kullanılmalıdır.

İncelenecek kesitle aynı anda ve aynı yolla boyanmalıdır. Bu kontroller, glikojen veya asit-fast basiller gibi

özel yapıların boyanmasındaki aksiliklerden uzak kalır ve sonradan dokunun glikojen veya asit fast basiller

içerip içerrnediği mi yoksa tekniğin mi yetersiz olduğunu söylernek mümkün olamaz. Kontrol kesitine bir

göz atmakla buna karar verilecektir. Her laboratuvar çalışanı bir tekniğin kontrol edilmiş varyasyonlarını

yapma becerisinde olrnalıdır. Bir boyama yönteminin rastlantılara dayanan çok sayıdaki farklı şekilleri,

şans eseri mükemmel sonuçlar verebilir fakat sonradan genellikle tekniği tekrar etmek mümkün değildir.

Aynı doku bloğundan çok sayıda kesit alınmalı ve yöntemin her basamağındaki değişikliklerin bir serisi,

teker teker ve her kesitte sadece bir değişiklik yapılarak yapılmalıdır. Tekniğin geri kalan bölümünü sabit

tutarak, bu kesitlerle yöntemin hangi kısmında bu kesitlerin kusurlu olduğu ve nasıl düzeltilebileceği

görülecektir. Ara sıra normal dokularda ve laboratuvardaki kontrol kesitlerde sezilebilir miktarda

bulunrnayan nadir bir patolojik değişikliği veya yabancı bir maddeyi boyamak gerekir. Bu durumlarda bir

43

suni doku bloğu incelenecek maddeyi içeren jelatinden yapılabilir veya materyel bir laboratuvar hayvanına

enjekte edilebilir ve dokular kontrol kesitler olarak kullanılabilir.

HEMATOXYLİN-EOZİN BOYASI

Histolojik preparasyonlar için ençok kullanılan boyalar hemotaxylin ve eosin boyalarıdır. Buna

kısaca H.E. boyası denir. Hemotoxylin bazik bir boya olarak kabul edilirse de kendisi bizzat boya

değildir. Boya olarak tesir etmesi için zincirlerinden birinde bulunan guioid' in hematein' e okside olması

lazımdır. Hemotaxylin hematein'e okside olması sulu bir solusyon içinde bir aydan fazla bir zamana ihtiyaç

gösterir. Oksidasyon, sodium iodate veya mercuri choloride ilave etmekle hızlandırılabilir. Fakat hematein'

in ileri bir oksidasyonunda solusyon boyanma yeteneğini kaybeder.

Hematein zayıf , anyon yüklü, kırmızımtrak sarı bir boyadır. İzoelektrik noktası takriben 6.5' tur.

Zayıf bir boyadır. Fakat bir mordant ile kullanılırsa koyu ve devamlı bir boya olur. Mikroteknikten

hemateinle mordant olarak kullanılan maddeler genellikle aluminum ve demir tuzları, aluminum ve demir

şaplar. ( alum) dır. En çok kullanlan şaplar

Potasyum alum : K2S04Al2 (SO4)3 24 H2O

Ammonium alum : (NH4)2 SO4'A12 (SO4)324 H2O

Demir alum : (NH4)2SO4 Fe2(SO4)324 H20 dur.

Aliminum ile demirin verdiği renk morluğu birbirinden farklıdır. Aluminyum mavi-mor bir renk verir.

Suda erir,dokuya temas ettikten sonra ne su ne de etil alkol onu tekrar çıkartabilir. Aluminyumla hematein,

bazik boya gibi etki eder (yani katyonik bir boya vazifesi görür). Demirli hematein ise siyah veya lacivert

renk verir , fakat etkisi birincisi kadar basit değildir. Rutin teknikte, kesitler önce mordantlanır sonra boya

ile ( hematein) muamele edilir, fazla mordant solusyonda differansiye edilir. Bu şartlar altında hematein

bazik boya olarak tesir eder.

Eosin: Eosin, fluorescein' in tetra broma türevidir. Zayıf asidik anyonik bir boyadır.

Hemataxylin-Eosin boyası ile hücre ve doku elemanları aşağıda gösterildiği gibi boyanır.

Çekirdek Mavi,siyah ve koyu mavi

Sitoplazma Pembe

Eritrositler Kırmızı

Kas Kırmızı

Fibröz Doku Açık pembe

Kıkırdak Açıktan koyu maviye kadar renk tonlarında

Mükoz Mavimtrak ( metakromatik)

Kalsifiye Doku Koyu mavi

Protein çökelekleri Pembe

ödem sıvısı)

44

Bakteri toplulukları Koyu mavi

Çekirdeklerin mavi-siyah renkte boyanmasının nedeni polianyonik DNA konsantrasyonunun fazla

olması ve bazik hematein-mortantla kuvvetli bir şekilde etkilenmesidir. Durum kıkırdakta da aynıdır.

Yalnız burada anyonik glikozaminoglikan daha yüksek konsantrasyondadır. Sitoplazma, her ne kadar

pembe olarak tarif edilirse de mikroskopta maviye çalar pembe tonda görülmektedir. Sitoplazmadaki RNA

hematein-mortantla birleşerek bu rengi alır. Eğer RNA çoksa mavilik daha belirgindir. Aynı durum

anyonik polisakkaritlerden zengin mucin salgılayan hücreler için de sözkonusudur. Böylece diğer

subselüler ve doku elemanlarının kimyasal yapısını gözönüne alarak bunların değişik renk alış nedenlerini

açıklıyabiliriz.

1-HEMATOKSİLEN BOYA ÇÖZELTİSİ

Harris' s Alum haematoxylen 5.0 gr

Absolu alkol 5 0 cc

Aliminyum amonyum sulfat 100 gr

Distile su 1000. 0 cc

Merkurik asi t ( oksi t ) 2.5 gr

Hematoksileni alkol içinde hafif ısı yardımıyla erit. Alumu ısı yardımıyla distile su içinde erit. Herbiri

tamamen eridikten sonra iki solusyonu bir geniş erlenmayer içinde karıştır. Karışım süratle kaynar hale

getir, ateşi söndür. Kabarcık1ar çıkarken merkurik oksiti yavaşca (azar azar) ilave et. Çözelti koyu mor

renk alınca cam kabı soğuk su altına (dıştan) tutarak çözeltiyi soğut. Soğuyunca boyama için hazırdır.

Fakat 2-3 gün kalsa daha olgunlaşır. Olgunlaşma, cam kabın ağzı gevşekce kapatılıp güneş ışığı alan bir

yere bırakılarak sağlanır. Olgunlaşmış çözelti, koyu renkli şişelere alınıp, ağzı sıkıca kapatılarak karanlık

yerlerde saklanır.

2-ERLİCH ASİT HEMATOKSİLENİ

Hemotoksilen 6.4 gr

Ammonium alimunyum sulfat 40 gr

Etil alkol 322 ml

Gliserol 322 ml

Distile su 322 m1

25C'de 6-8 hafta beklenilir. Hemen olgunlaştırmak için 0.64 gr sodyum iodat eklenir.

3-ERLICH HEMATOKSİLENİ

Hemotoksilen 4 gr

45

% 95 Alkol 200 cc

Distile su 200 cc

Gliserin 200 cc

Amonyum veya potasyum aluminyum 6 gr

Glacial asetik asit 20 cc

2 hafta veya daha fazla süre hava ve ışığa açık tuturak olgunlaştır. Hemen kullanmak istenirse 0.6 gr

sodyum iodat eklenir.

4- %1 ‘lik ALKOLİK EOZİN

Eozin Y 10 g

Distile su 50 ml

Eozini distile suda erit, % 95’lik etil alkolden 940 ml ilave et. Bu eozin stok olarak kalır ve eşit miktarda

% 95 etil alkol ilavesi ile kullan.

5-% 0.5 lik Sudaki EOZİN

Eozin Y 5 g

Distile su 1000 cc

Eozini suda erit. Koyu ton arzu edilirse her 100 cc’lik solusyon için 0.5 cc glacial asetik asit ilave edilir.

6-HARRİS ALUM HEMATOKSİLENİ

Hematoksilen 5 g

Absolu alkol 50 cc

Alkolde ısıtalarak eritilitr.

Amnium veya potasyum alum 100 g

Distile su 1000 cc

Suda ısıtarak alumu erit. Soğutulan 2 karışım birbirleri ile karıştırılıp tekrar süratle kaynayana kadar ısıtılır

ve alev üzerinden alınır. Sonra yavaş yavaş mercury oksit ilave edilir ve tekrar ısıtılır. Menekşe rengini alır

almaz soğuk su bulunan kap içersine oturtulur. Boya kullanılacağı zaman % 4 asetik asit glasiyal eklenir.

7-EOZİN

Eozin yellowish 1 g

Distile su 100 cc

Thymol 1 küçük kristal

8-ERLİCH HEMATOKSİLENİ

Hematoksilen 80 g

Alkol (% 95) 2400 cc

Potasyum alum (Alimunyum potasyum sulfat ) 240 g

Distile su 1200 cc

Glycerol 1200 cc

46

Glasiyal asetik asit 120 cc

1-Ksilol 30 dk.

2-Ksilol 30 dk.

3-Absolü Alkol Çalkalama

4-% 95’lik etil alkol Çalkalama

5-% 80’ lik alkol Çalkalama

6-% 70’ lik alkol Çalkalama

7-% 50’lik alkol Çalkalama

8-% 30’ luk alkol Çalkalama

9-Distile su Çalkalama

10-Hematoksilen 5-8 dk

11-Akarsu

12-Asit-Alkol Daldırıp-çıkarma

13-Akarsu

14-Amonyak 30 saniye

15-Akarsu

16-Eozin 3-5 dk

17-% 30’ luk alkol Çalkalama

18-% 50’lik alkol Çalkalama

19-% 70’lik alkol Çalkalama

20-% 80’ lik alkol Çalkalama

21-% 95’lik etil alkol Çalkalama

22-% 100’lük etil alkol Çalkalama

23-% 100’lük etil alkol Çalkalama

24-Ksilol

25-Ksilol (1 gece bekletilirse iyi olur)

Hematoksileni alkolde çözün. Alumu sıcak su içinde çözüp gliserolü ekleyin, soğumaya bırakın. Azar azar

aluma hematoksileni ekleyerek karıştırın. Bu solusyon temiz bir kapta olgunlaşmaya bırakılır. Ağzı

hafifçe kapatılır. Olgunlaşma 6-8 hafta sürer ve solusyon boyama özelliğini yıllarca korur. Hematoksilende

45 dk. boyanır.

9- WEİGERT HEMATOKSİLENİ

Solusyon A: Hematoksilen 1 g

Alkol 100 cc

4 hafta olgunlaştırılır.

Solusyon B:

% 30 luk ferrik klorür-sulu 4 cc

47

Konsantre HCl 1 cc

Solusyon A ve B den eşit miktarda karıştırılıp 30 dakika içinde kullanılır ( 15-20 dak)

10-HEİDENHEİN HEMATOKSİLENİ

Demir Alum Çözeltisinin Hazırlanışı

Ammonium ferric sülfat 5 gDistile su 100 cc

Hematoksilen Çözeltisinin HazırlanışıHematoksilen 0.5 gAbsolü alkol 10 ccDistile Su 90 cc 4 hafta olgunlaşmaya bırakın

Uygulama

1-Kesitler suya indirilir2-Demir alumda 30 dakika –24 saat arasında bırakılır3-Akar suda çalkalama4-Heidenhein hematoksilende 30 dakika –24 saat arasında boyanır.5-Suda çalkalayın6-Demir alumda 1-30 dk. mikroskopla kontrol edilerek differansiye edilir.7-En az 10 dk. akar suda yıka8-Karşıt boyalar Van Gieson ve modifiye şekilleridir.

11-CARAZZİ HEMATOKSİLENİHematoksilen 0.5 gGlyserol 100 ccAluminyum potasyum sulfat 25 gDistile su 400 ccPotasyum iodat 0.1 g

Hematoksileni gliserol ile karıştırın. Isı kullanmadan distile suda potasyum alumu çözün. Çözünme uzun

zaman alabilir. Hematoksilene alumu karıştırarak yavaş yavaş ekleyin. 10 cc suda potasyum iodatı iyice

karıştırarak çözün. 4-6 ay boyunca solusyon boyanma özelliğini korur.

HEMATOKSİLEN - EOZİN BOYA TEKNİĞİ

1- Ksilol 30 Dakika

2- Ksilol 30 Dakika

3- Absolü Alkol Çalkalama % 100 Alkol

4- %95'lik Alkol Çalkalama

5- %80'lik Alkol Çalkalama

6- %70 'lik Alkol Çalkalama

7-%50' lik Alkol Çalkalama

8-%30' luk Alkol Çalkalama

9- Dis ile su Çalkalama

10-Hematoksilen Çalkalama

48

11- Akarsu Çalkalama

12- Asit- Alkol Daldırıp çıkarma

13- Akarsu Çalkalama

14- Amonyak 30 saniye çalkalama

15- Akarsu Çalkalama

16- Eozin 3-5 dakika

Suda çalkalama

17- %30 'luk Alkol Çalkalama

18- %50'lik Alkol Çalkalama

19- %70'lik Alkol Çalkalama

20- %80'lik Alkol Çalkalama

21-%95'lik Alkol Çalkalama

22-Absolü Alkol (%100 Alkol) Çalkalama

23- Ksilol 30 dakika

24- Ksilol (Bir gece bekletilirse daha iyi şeffaflanır.)

Asit-Alkolün Hazırlanışı

% 80’lik etil alkol 500 cc

Hidroklorik asit 5 cc

Amonyağın Hazırlanışı

Distile su 500 cc

Amonyak 5cc

8-KAPATMA (Mounting)

Boyanan kesitler 1 damla Kanada balzamı veya entellan damlatarak lamel kapatarak kurumaya

bırakılır. Bu maddeler hem mikroskopta kolay incelenmeyi sağlar hem de boyanmış kesitlerin yıllarca

korunmasını sağlar

RUTİN EL TAKİBİ ( 3-5mm kalınlığındaki bloklar için)

1- Tespit

2- Eğer gerekli ise suda yıkamak

3-%70'lik alkolde gün boyunca (3-8 saat)

4- % 90' lık alkolde bir gece (16 saat)

5- Absolu alkol I de iki saat

6- Absolu alkol II de üç saat

7- Absolu alkol III de üç saat

8- Toluene veya kloroform da gece boyunca ( 16 saat )

9- Her birinde birer saat olmak üzere üç kez erimiş parafinden geçirmek}:

49

10-Parafine gömmek

HIZLI EL TAKİBİ ( 3 mm den kalın olmayan bloklar için )

1- Carnoy- fiksatıtifinde 30- 60 dakika tespit

2- Absolu alkol I de 30dk

3- Absolu alkol I de 30 dk

4- Absolu alkol III de 30 dk

5- Ksilen veya. toluenle 15- 30 dk ( şeffaflanıncaya kadar )

6- Vakum fırınında herbirinden yirmişer dk. olmak üzere üç kez erimiş parafinden

geçirme

7- Gömme

RUTİN OTOMATİK TAKİP ( 3-5 mm kalnlığındaki bloklar için )

1- %70' lik akolde üç saat

2-% 90' lik alkolde üç saat

3- Absolu alkolde ( I'de ) 1 saat

4- Absolu II'de 1 saat

5- Absolu alkol III ' de 2 saat

6- Absolu alkol IV de 2 saat

7- Toluen I' de 1.5 saat

8- Toluen II' de 2.5 saat

9- Erimiş parafin I' de 3 saat

10- Erimiş parafinde II ' de 3 saat

11-Gömme

Toplam: 22 saat

48 SAATLİK OTOMATİK TAKİP (3-5 mm kalınlığındaki bloklar için )

1-% 10’ luk formal salin 4 saat

2-% 10’ luk formal salin 4 saat

3-% 70 lik alkol 4 saat

4-% 90’lık alkol 4 saat

5- Absolu alkolde I'de 4 saat

6- Absolu II'de 4 saat

7- Absolu alkol III ' de 4 saat

8- Absolu alkol IV de 4 saat

9-Kloroform I 4 saat

10-Kloroform II 4 saat

50

11-Erimiş parafin I 4 saat

12-Erimiş parafin II 4 saat

EL İLE HIZLI TAKİP

1-Bouin fiksatifi ile tespit 6-7 saat

2-Çeşme suyunda yıkama

3-% 70’lik alkol 60 derecelik etüvde 1 gece

4-% 96’ lık alkol 60 derecelik etüvde 1 saat

5-% 96’ lık alkol 60 derecelik etüvde 1 saat

6- Absolu alkolde ( I'de ) 60 derecelik etüvde 1 saat

7- Absolu II'de 60 derecelik etüvde 1 saat

8- Ksilol 60 derecelik etüvde 1 saat

9-Ksilol 60 derecelik etüvde 1 saat

10-Parafin 60 derecelik etüvde 1 saat

11-Parafin 60 derecelik etüvde 1 saat

12-Gömme

EL İLE HIZLI TAKİP

1-Tamponlanmış nötral formalin ile tespit

2- %50‘lik alkol 60 derecelik etüvde 30 dakika

3-% 70’lik alkol 60 derecelik etüvde 30 dakika

4-% 80’lik alkol 60 derecelik etüvde 30 dakika

5-% 96’ lık alkol 60 derecelik etüvde 1 saat

6-% 96’ lık alkol 60 derecelik etüvde 1 saat

7- Absolu alkol I 60 derecelik etüvde 1 saat

8- Absolu II 60 derecelik etüvde 1 saat

9- Ksilol 60 derecelik etüvde 1 saat

10-Ksilol 60 derecelik etüvde 1 saat

11-Parafin 60 derecelik etüvde 1 saat

12-Parafin 60 derecelik etüvde 1 saat

13-Gömme

PARAFİN TEKNİK ( SCHEFIELD UNİVERSİTESİ ) (3-4 m’lik )

1- Fiksasyon

2- % 70’lik etil alkol 2 saat

3- %80’ lik alkol 1 saat

4- % 90’lık alkol 1 saat

51

5- % 100’ lük alkol 1.5 saat

6- %100’ lük alkol 1.5 saat

7- Kloroform 1 gece

8- Kloroform 1.5-2 saat

9- Erimiş parafin 1.5 saat

10- Erimiş parafin 1.5 saat ( vakumla )

11- Gömme

JB-4 TEKNİĞİ

Sert bloklardan veya geniş yüzeyli bloklardan daha ince kesitler alınmasında kullanılır.

JB-4 Gömme Kiti içinde sol A, sol B ve katalizör bulunmaktadır. Polysciences INC-İngiltere’den satın

alınabilir.

1-Formaldehit veya gluteraldehitle fiksasyon

2-İnfiltrasyon Çözeltisi

50 cc JB-4 solusyonu

0.45 gr katalizör

Çeker ocakta, eldivenle çalışılır. Katalizörün erimesi için hafifçe 30 dakika karıştırın .

Gömme Çözeltisi

25 cc katalizlenmiş JB-4 solusyonuna 1 cc JB-4 solusyon B eklenir. Hafifçe çalkalanır ve 10-15

dakika içinde kullanılmalıdır.

Yöntem

1-% 70’lik etil alkol 90 dakika ( az olmayacak )

2-% 80’ lik etil alkol 60*-90 dakika

3-% 90’ lık etil alkol 60-90 dakika

4-% 95’ lik etil alkol 90 dakika ( az olmayacak )

5-% 100’ lük etil alkol 60 dakika

6--% 100’ lük etil alkol 60 dakika

7- Katalizlenmiş sol-A 1 gece

8-Gömme çözeltisine gömülür.

9-Sertleşene kadar (1-2 saat ) beklenir. Kesit alınır.

52

Not: Tüm kit aynı gün açılıp kullanılmalıdır. Dokuyu gömerken eğer büyükse çeker ocakta trimlenir. JB-4

‘ü gömme bloklarına dök, dokuları yerleştir. Üzerine takozları yerleştir. Buzdolabında 1-2 saat polimerize

olmasını bekle.

JB-4 KESİTLER İÇİN ASİT FUKSİN-TOLUİDİN BLUE BOYAMA YÖNTEMİ

1- % 1’ lik sulu asit fuksin 2 dakika

2-Distile suda yıkama 1 dakika

3-% 0.05’lik toluidin blue ( pH=4.4 olan asetat tamponu ile hazırlanmış ) 2 dakika

4-Distile suda yıkama 30 saniye

5-Havada kurutma

6-Entellan ile kapatma

JB-4 TEKNİĞİ İÇİN GEREKLİ ARAÇLAR

KNIFE-MAKER: LKB (BROMMA ) 2078 HISTO KNIFE-MAKER )

1-E.m için kullanılan aynı cam bıçaklar kullanılır.

2-Açı 25 derece olmalıdır (38 derece değil ).

3-Camı 0 ile 5 arasındaki ikinci düğmeye getir ve birinci 0’ a getir ve kes ( Bu son basamaktan önce

bıçağın ters tarafını knife-makere yerleştir ( çevir ).

4-Bıçak hazırdır. Masaya koyduğunda bıçağın keskin kenarı üstte olmalıdır.

JB-4 MİKROTOMU: ( LKB BROMMA ) 2218 HISTORANGE MICROTOME )

1-Kesit kalınlığı 2-2.5 m olmalıdır.

2-Blokları mikrotoma şu şekilde yerleştir.

3-Bıçağı yerleştir. Kesi zonunu ayarla.

4-Blok ve bıçak paralel olmalıdır.

5-Kesit hızı (mm/sec ) sağ taraftan ayarlanmalıdır.

JB-4 PLASTİK KESİTLERDE GLİKOJEN İÇİN PAS BOYAMA TEKNİĞİ

1- % 1’ lik periyodik asit ile 5 dakika

2- İyice yıka ( 1 dakikadan fazla olmasın ).

53

3- Schiff reaktifi ile oda ısısında 15 dakika tut.

4- Akarsu altında 15 dakika yıka.

5- Hematoksilen ile ( Gills Hematoksileni) 2 dakika boya

6- Suda çalkala.

7- Doymuş lityum karbonat ile 1 dakika dokuları mavileştir ( Gerekli değil ).

8- Suda çalkala.

9- Alkol serilerinde dehidre et, kurumaya bırak.

10- Kesitleri ksilol ile muamele et

11- Kapat

Sonuç: Glikojen partikülleri pembe boyanır.

KONTROL KESİTLER İÇİN ( GLİKOJEN SİNDİRİMİ )

1-Her 1 cc distile su için 1 mg -amylase kullan.

2-Kesitleri 37 derecede beta amilaz içine en az 3 dakika (saatler ) bırak.

3-PAS ile boya. Amilaz glikojeni sindirdiği için glikojen olan alanlar ortadan kalkacaktır.

BAZI ÖZEL PREPATATLARIN YAPIMI

1-KAN PREPARATI: Omurgalı kanı iki türlü incelenir.

a-Canlı olarak

b-Tespit edilmiş ve boyanmış olarak

a.Canlı olarak preparat hazırlanması: Doğrudan doğruya parmaktan lama alınan kan incelenir veya %

0.9’luk fizyolojik su içine kan damlatılıp , incelenir. Eritrositler birbirinden ayrıldığı için iyi görülür.

Ayrıca 300 mg Ruj.nötr 100 cm3 saf suda eritilir. Bir damla lam üzerine konur sonra diğer bir lamın kısa

kenarı ile bu sıvı lam üzerine yayılır ve kurutulur. Sonra bir damla kan konur ve lamel kapatılır. Bir süre

sonra kan hücrelerinin bu boyayı alarak çeşitli renklerde oldukları görülür. Eritrositler bu boyayı almazlar.

Sıcak kanlı hayvanların lökösitlerin ameboid hareketlerini görmek için lam hafifçe ısıtılır. Soğuk

kanlılarda oda sıcaklığında bu hareketi görebiliriz.

b- Tesbit edilmiş ve boyanmış olarak: Alkolde temizlenen parmak ucundan sterilize iğne ile çıkarılan kan

temiz bir lam üzerine konur. Başka bir lamın kısa kenarı ile iyice yayılır. Biraz kuruması beklenir, sonra

metil alkol içinde 3 dakika bekletilir. Daha sonra lam üzerine saf su damlatılır. Biraz bekletilir, suyu

akıtıldıktan sonra bir kap içindeki Giemza boyasına konur (10 cc distile su+1 cc Giemsa ). 30 dakika

bekledikten sonra çeşme suyunda yıkanır, kurutulur, incelenir.

2-MİTOZ BÖLÜNME PREPARATI

1- Kuru soğan ya da arpacık soğanı kökleri su içine gelecek şekilde suyun içine konur.

2- Üç hacim absolü alkol+1 hacim glasiyal asetik asit içine uzayan köklerin uç kısımları kesilerek

biriktirilir.

54

3- Bu karışımdan çıkan kökler 3 N HCl içinde 2-3 dakika bırakılır ( 24 cc HCl alınır. 100 cc ye

distile su ile tamamlanır.

4- 100 cc % 50’ lik asetik asit içine 1 gr orcein konur. Asitten çıkarılan kökler boya içinde 1.5 saat

bekletilir.

5- Lam üzerine 1 kök konur. Üzerine 1 damla % 45’ lik asetik asit damlatılır.

6- Üzerine lamel kapatılır. Gazlı bez yardımıyla üstten bastırılarak yayılır ve mikroskopta

incelenir.

3-MAYOZ BÖLÜNME PREPARATI

1-Çekirge testisleri çıkarılır.

2-3 hacim alkol+1 hacim glasiyal asetik asit içersinde 24 saat buzdolabında fikse edilir.

3-Saklamak için % 70 ‘lik alkol kullanılır.

4-Boya 1 gr orcein

100 ml % 50 ‘lik Asetik asit içinde çözülür 30 ‘ dakika

5-% 45 ‘lik asetik asit damlatılıp ezilir.

6-Mikroskopta incelenir.

4-DÜZ KAS PREPARATI ( KURBAĞA MESANESİNDEN )

Araç ve Gereçler

Kurbağa

Şişe mantarı

Lam, lamel, makas, pens, küvet

Bouin, etil alkol, eter veya kloroform

Bouin Çözeltisi

9 gr pikrik asit 75 cc distile suda çözülür ( %74’ lük )

% 40’ lık formol...........25 cc

Glasiyal asetik asit.......5 cc

Bouin taze hazırlanır. Asetik asit buharlaştığından çözeltinin yapısı bozulabilir. İyi saklanırsa uzun

süre kullanılabilir. Mesaneyi iyi fikse ettiği gibi sertleştirerek kolay boyanır hale getirir. Hemalum % 1’

lik suda hazırlanmış olarak kullanılır. Eozinin ise % 70’ lik etil alkolde hazırlanmış % 1 ‘ lik çözeltisi

kullanılır.

Kurbağa bayıltılır. Mesanesi kesilerek alınır. Parafinde kaynatılmış veye doyurulmuş, ortası delik

mantarın delik kısmı üstüne iğne ile gerilir. Bouin çözeltisine aktarılır. Mesane alt yüzeyde olmalı ve

Bouin ile temas etmelidir. 1-2 saat sonra mesane sarı renk alır ve sertleşir. % 70’ lik alkole aktarılır.

Objenin rengi giderilinceye kadar alkol değiştirilir. Sonra hemen hematoksilen ile istenilen mor renk

alınıncaya kadar boyanır. Eozin ile 15 dakika boyanır. % 70-90-100’lük etil alkollerde 10’ ar dakika

dehidre edilir. Ksilolde 5 dakika tutulur. Pensle çıkarılan materyel filtre kağıdı üzerine alınır. Mesane

küçük parçalara ayrılarak lam üzerine alınır. Entellan damlatılarak lamel kapatılır. Kurutulur ve incelenir.

55

5-ÇİZGİLİ KAS PREPARATI (Çekirgeden): Çekirgenin abdomeni açılır. 2 kas demeti görülür.

Steromikroskop altında kas çıkarılır. % 0.6’ lık fizyolojik sıvıya konur (NaCl ile hazırlanmış ). Buradan 1

hacim asetik asit+3 hacim % 96’ lık etil alkol içeren tespit çözeltisine aktarılır. Burada demet halindeki

kaslar iğne veya pensle küçük parçalara ayrılır. 1 kas lifi lama alınır. Üzerine 1-2 damla asetocarmin

damlatılır, 1-2 dakika beklenir. Üzerine lamel kapatılır ve hafifçe bastırılır. Sonra lamelin bir tarafından

asetocarmin çekilip diğer taraftan % 96’ lık alkol eklenir. Bu işlem 2 defa tekrarlanır. Lameli yavaşça

kaldırıp 1 damla kanada balzamı veya entellan damlatılır ve lamel kapatılır. Bu işlemlerin lamel

kapatılarak yapılmasının nedeni kas üzerinde baskı yapmaktır. Baskı olmadığı zaman kas büzülür.

6-KEMİK PREPARATI

Araç ve Gereçler

% 5- % 7.5’ lik Nitrik asit ( 100 cc % 65’lik nitrik asit+1200 cc distile su)

% 5’ lik sodyum sülfat

Etil alkol

Kreozot (karanfil yağı )

Uzun kemik (3-5 cm boyunda )

Preparasyon 2 teknikle yapılabilir.

1-Yumuşatma: Gerekli maddeler bulunduğu takdirde daha kolay ve uygun bir tekniktir.

2-İnceltme: Daha çok el becerisine dayanır.

a-Kemiğin yumuşatılarak preparat hazırlanması: Uzun kemik parçasının üzerindeki yağ, kas

kısımları bistüri ile temizlenir. Kemiğin anorganik yapısını eritmek için % 5 veya 7.5 lik seyreltilmiş

nitrik asit içine konur., 24-48 saat bırakılır. Sık sık çalkalanır. 5 saatte bir çözelti tazelenir. Kemikler

jiletle kesilecek kadar yumuşayınca çıkarılır.. 24-48 saat kadar % 5’lik sodyum sülfat içinde bırakılır.

Sonra asitin giderrilmesi için çeşme suyunda 1-2 gün yıkanır.

Keskin jiletle yumuşamış ve yıkanmış kemikten çok ince kesitler alınarak % 50 ve % 70’ lik alkol

bulunan petri kaplarında 10-60 dakika bekletilir. Kreozot içine alınarak 15-20 dakika şeffaflandırılır.

Temiz bir lam üzerine alınan kemik kesiti üzerine entallan damlatılarak lamelle kapatılır.

Kesitler düzgün ve yeterli incelikte alınmışsa Havers kanalları ve konsantrik lameller izlenir.

Boyuna alınan kesitlerle de Volkman ve Havers kanalları ve lameller izlenir. Mikroskopta inceleme

yaparken diyafram kısılırsa daha iyi görüntü alınır.

b-Kemiğin inceltilmesi ile preparat yapımı: Uzun kemiklerden kemik testeresi ile enine parçalar

kesilir. Bunlar döner zımpara taşlarında ( elektrikli veya kolla dönen ) mümkün olduğu kadar inceltilir.

Daha sonra kesilen bir tahta üzerine koyarak ince dişli demir eğici ile çalışarak inceltmeye devam edilir.

Bu arada kesitler incelendikce daire şeklindeki kesitten kopmalar olur. Kopan parçalar ponza taşında tekrar

inceltmeye devam edilir. Ponza taşı üzerinde düzgün bir yüzey elde edilir. Bu yüzey üzerine su damlatılır.

Ve kesitler parmak ucu ile taş üzerine sürtülerek daha da inceltilir.

56

Parmak ucunda tutulan kesitlerden parmağın izleri görünüyor ise kemik parçaları yeteri kadar incelmiş

demektir.

İnceliği uygun görülen kesitler 5-10 ‘kadar HNO3 de bekletilir. Sonra damıtık suda birkaç değiştirme

ile iyice yıkanır. Filtre kağıdından suları süzülür. Dikdörtgen veya kare şeklinde kesilerek lama yerleştirip

lamel kapatılır.

Kesiler saydam olduğu için kanada balzamının ksilol ile seyreltilerek kullanılması tercih edilir.

7-KIKIRDAK PREPERATI

Kurbağanın ön ve arka ekstremitelerinin eklem yerlerindeki kıkırdak kullanılır. Hayvan eter veya

kloroformla bayılttıktan sonra ekstremitlerinden biri eklem yerinden kesilir. Kasları kemikten ayrılır.

Temizlenmiş olan kemik fizyolojik suya konur (%0.8 NaCl).

Keskin bir jiletle uzun kemiklerin uçlarındaki mavimsi renkli kıkırdaktan ince kesitler alınıp, fizyolojik

suda lamel altında incelenir. Kıkırdak ara maddesi bu bölgede homojendir.

a- Kapsülde genellikle bir kıkırdak hücresi bulunur. Ara maddeleri açık gri kapsül beyaz renkli ,

plazma ve nukleus mavimtrak görünür. Bunu boyamak için Karmin- Asetik Bunu boyamak için

Karmin -Asetik asit kullanılır. Bu boya fiksatiftir. Onun için kesit lam üzerine konan 1-2 damla

asetokarmin içinde 1-2 dakika bekletilir, lamel kapatılır. Bu arada materyal tespit edildiği için

hücreler büzülür. Nukleus kırmızı, plazma pembe boyanır. Kapsül ve ara madde az boyanır veya

hic boyanmaz.

Preparatın devamlı olması için : Boyanan kesit % 96 lık alkolde 5 dakika tutulur. Sonra kreozt veya

karanfil yağı içine konur. En fazla yarım saatte bu kesiler şeffaflaşır. Temiz bir lama bir damla Kanada

balzamı veya entellan damlatılır. Kesit bunun üzerine yerleştirilir ve lamel kapatılır.

b- Kıkırdak pikrik asit içermeyen herhangibir fiksatif içinde tespit edilir. Sonra iyice yıkanır. Aşağıda

formülü verilen Von Wijre boyasında 24 saat boyanır.

%70’ lik etil alkol.......................100 cc HCL.............................................0.1 cc Toluidin mavisi ........................ 0.1 gr

Boyadan sonra % 70 alkol içinde (0.001 HCL li) hiç boyası çıkmayıncaya kadar kalacak, % 70-80 -90-

100 alkol serilerinde dehidrasyon yapılarak şeffaflaştırıcı (kreozot) içine aktarılır. Lam üzerine alınınca

1 damla Kanada balzamı veya entellan eklenerek lamel kapatılır.

8- KURBAĞA DERİSİ

1- Kurbağanın sırt derisi kesilerek delikli bir mantar üzerine gerilir. Bouin de 3-4 saat tesbit edilir.

İğneleri çıkartılarak ufak parçalara bölünür. Sarı rengi giderilinceye kadar % 70 alkolde yıkanır.

2- % 80’lik etil alkolde 1 saat

57

3- % 90’lik etil alkolde 1 saat

4- % 100’ lık etil alkolde 1 saat

5- Ksilol + %30’luk alkolde 15-30'

6- Ksilolde 30 dakika

7- Ksilol+parafinde 30 dakika

8- Etüvdeki parafinde 24 saat

9- Bloklanır. Daha sonra mikrotomda 12 m’lik kesitler alınır. Kesitler bir gün bekletilir.

10- Ksilolde 5-10 dakika

11- Alkol serilerinde (% 100-96-80-80 ) beşer dakika

12- Hematoksilen

13- Akarsuda 15 dakika boyama

14- Eosin (Eosin su ile yapıldıysa akarsudan sonra . %80’ e kadar alkol serilerinden geçirilir sonra eosinle

boyanır ).

15- % 96 - %100’ lik alkol 1-2 dakika

16- Ksilol 2-3 dakika

17- Kanada balzamı ve lamel kapatılması

9-DEV KROMOZOMLARIN PREPARATI: Bu teknikte absolü metil alkol sadece tespit ve lamel

kapatma sırasında çözücü olarak kullanılır. Ringer çözeltisi içine alınan ganglion veya tükrük bezi temiz

bir lam üzerine alınır. Üzerine 1 damla % 45’ lik asetik asit eklenerek 3-4 dakika tespit edilir. Fazla

tutulursa parçalanır. Lamel kapatılır. Fiksatifin fazlası emdirilir.

Kullanılan lam daha önceden albümin veya başka bir yapıştırıcı sürülmüş ve kurutulmuş olmalıdır.

Lam ve lamel içinde alkol bulunan bir kaba aktarılır. 12 saat ya da daha fazla bekletilir. Lamel

kendiliğinden düşmemişse ince bir iğne yardımı ile lamel alınır. Üzerine tükrük bezi yapışmış lam alkolde

doyurulmuş amonyum ferri sülfat bulunan kaba taşınır. 12 saat bekledikten sonra biraz hematoksilen

kristali boyaya aktarılır. Alkol banyosundan sonra 5-10 dakika alkolde doyurulmuş lityum karbonat

çözeltisinde bekletilir. Kırmızı bir boyama yapılacaksa 1-3 saniye alkolik eozinde ( 100 cc % 90’ lık

alkol+ 0.5 gr eosin ) bekletilir. Entellan damlatılarak lamel kapatılır.

LABORATUVARDA KULLANILAN BAZI ÇÖZELTİLER

A-Cam Kapları Yıkamak İçin

Cam eşyadaki kaba kir bildiğimiz gibi sabun veya herhangibir temizleme

tozu ve sıcak su ile temizlenir.Saf su ile çalkalanır ve kurutulur

Reçine ve parafin ile kirlenmiş camlar önce toluen veya ksilol ile

yıkandıktan sonra sıcak su ve sabun ile yıkanmalıdır. Bu nedenle

boyalarda kullanılan artık ksilol veya toluol saklanmalıdır. Erimeyen

58

organik kalıntılar, boya çöküntüleri veya metalik tuzlar cam kaplar

aşağıdaki çözeltilerle temizlenebilir.

1-Potasyum dichromate-sulfuric acid temizleme sıvısında yıkayarak

temizlenir. Bunun için birkaç dakikadan birkaç güne kadar bu sıvıda

bırakılır. Daha sonra asit kalıntısını kaldırmak için su ile iyice yıkanır.

Potassium dichromate 200 gm.

Su 1 litre

Konsantre Sulfuric asit 750 cc

Çözeltiyi sıcağa dayanıklı bir cam kavanozda yap. Önce potassium

dichromate’ı suda erit, çabuk erimesini istiyorsan ısıt. Soğuduğu

zaman, bir taraftan cam bir çubuk ile karıştır ve sülfirik eşiti yavaşça

ilave et. Isı yükselecektir. Koyu yeşil oluncaya kadar birçok defa

kullanılabilir.

2-Potasyum bikromat...................60 gr

Sülfürik asit..............................1000 cc

3-Potasyum permanganat...............10 gr

Sodyum hidroksit.......................10 gr

Distile su....................................100 cc

4-Kral Suyu

Hidroklorik asit..........................3 birim

Nitrik asit...................................1 birim

B-Lam ve Lamellerin Temizlenmesi: Yeni lam ve lameller % 90 veya 95’lik

alkolde bırakılır, sonra buradan teker teker alınan lam veya lameller temiz

eski bir mendil veya pamuklu bir bez ile iyice kurulanır Temizliğini kontrol

için pipet ile üstüne su damlatılır. Su dağılırsa lam ve lameller

temizlenmiştir, su damla halinde kalırsa halen kirli demektir. Böyle camları

temizlemek için 15 dakika kadar yarı yarıya eter ve saf alkol karışımına

bırakılır. Kullanılmış lam ve lameller- Eğer üzerlerine balsam ve sakız

yapışmamışsa sıcak su ve yıkama tozları ile iyice yıkanır ve suda

çalkandıktan sonda % 90 veya 95’lik alkolde bırakılır. Silinip

kurutulduktan sonra kullanılmağa hazırdır. Lam ve lameller bu yöntemle

temizlenmezse bir veya iki gün temizleme solusyonunda bırakılır sonra suda

59

yıkanır ve ammonium hidroksit ile alkalize edilmiş suda birkaç saat

bırakılır. Suda yıkanır, alkolde bekletildikten sonra kurulanır. Balsam veya

sakızlı lam veya lamelleri ise bahsettiğimiz yıkamadan önce ksilol veya toluol

içinde bırakmalıdır.

Lamları Jelatinleme Yöntemi

Gelatine powder........................................5 gr

Kalium chrom (III) sülfat rein....................0.5 gr

Distile su................................................... Distile su

LABORATUVARDA KULLANILAN BAZI BOYA ÇÖZELTİLERİ

A-Nötral Red (nötral kırmızısı): Bir şişe saf suya rengi kırmızı oluncaya kadar bu boyadan karıştırınız.

Çözeltinin saydam olması şarttır.

B-Sirke asitli metilen yeşili: 100 cc saf suya 2 gr sirke asidi ve bir miktar da metilen yeşilinden

karıştırınız. Çözeltinin rengi mavimsi yeşil olmalıdır.

C-Karmin - sirke asidi: 45 hacim saf ve yoğun sirke asidini 55 hacim saf su ile karıştırınız. Buna biraz

(örneğin %45 yoğunluğundaki 100 cc sirke asidine 5gr ) saf carmin ekleyin ve dar boyunlu bir cam kap

içinde bir baget ile hafifçe kaynatınız. Çözelti soğuduktan sonra bunu bu filtre kağıdıyla süzünüz ve

damlalıklı şişelerde saklayınız. Filtre kağıdında kalan kısmını tekrar kullanılabilir. Karmin-sirke asidini

ağzı iyice kapanan şişelerde uzun zaman bozulmadan saklanabilir.

LABORATUVARDA KULLANILAN BAZI FİZYOLOJİK SIVILAR

A- Basit tuz eriyiği: Kurbağa için Memeliler için NaCl...............................6,5 gr. NaCl...............................8-9 gr. Saf su .............................1000 cm3 Saf su .............................1000 cm3

B- Ringer eriyiği

Kurba ğa için Memeliler için

Saf su ..........................1000 cm3 Saf su ..........................1000 cm3

NaCl ..................................6gr NaCl.............................. 9gr CaCl2 .............................. 0,2gr CaCl2 .............................0,2grKCl................................... 0,2 gr KCl ................................ 0,2grNaHCO3...........................0,1 gr NaHCO3 ...........................0,1gr

60

NORMALİTE-MOLARİTE

Normalite: Çözeltinin litresindeki eşdeğer gram sayısıdır.

Molarite : Çözünmüş maddenin, çözeltinin litresindeki mol veya formül

gram sayısına denir ve M ile gösterilir.

Konsantrasyon:Çözelti veya çözgenin belirli bir miktarındaki çözünmüş

madde miktarına denir. BU miktarlar amaca uygun değişik

birimlerle ifade edilebilir.

Yüzdesel konsantrasyon: Çözelti veya çözgenin 100 cc veya 100 gramındaki çözünmüş madde miktarıdır. Bir

çözeltinin yüzdesi verildiğinde, genel olarak o çözeltinin 100 gramındaki madde miktarı anlaşılır.

Çözücü : Saf halde bulunan çözücü ( Su, alkol, aseton ).

61

Çözelti: Çözünen madde + çözücü

62

Normalite= Molarite X Tesir değerliği

63

64

65