Embed Size (px)
Citation preview
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
NGUYỄN THỊ HIỂN
NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH
GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT
CÓ CẤU TRÚC LAI TỪ BETULIN
Chuyên ngành : Hóa hữu cơ
Mã số : 9.44.01.14
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Hà Nội – 2017
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ -
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Nguyễn Văn Tuyến
Phản biện 1: GS.TS Trần Văn Sung
Phản biện 2: PGS.TS Lê Thị Anh Đào
Phản biện 3: PGS.TS Hoa Hữu Thu
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học
viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm
201….
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
1
A-GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Lý do chọn đề tài
Thuật ngữ “lai hóa thuốc” (pharmacophone hybridation) – trong đó hai hoặc
nhiều thành phần có hoạt tính sinh học được liên kết thành một phân tử lai duy nhất
được biết đến như một phương pháp hiệu quả và tiện lợi để tạo ra các hợp chất mới
có hoạt tính chống ung thư. Sự lai ghép phân tử có thể đem lại lợi thế tổng hợp thông
qua việc thay đổi hóa học có chọn lọc của thành phần trong hệ thống lai. Hơn nữa,
khi các tác nhân có hoạt tính sinh học được kết hợp với nhau, các cấu trúc lai mới có
thể mang lại cả lợi ích sinh học và tổng hợp. Trong nghiên cứu tổng hợp nhằm tìm
kiếm các hợp chất mới có hoạt tính tiềm năng, việc lựa chọn các phân tử với hoạt tính
sinh học cao để lai tạo đóng một vai trò quan trọng. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ
ra rằng việc đưa các axit dicacboxylic (hoặc anhydrit dicacboxylic) như succinic,
maleic, glutaric, và các chất tương tự vào khung tritecpen của betulin ở các nhóm tại
C-3 hoặc C-28 có thể tạo ra nhiều dẫn xuất mới có hoạt tính tốt hơn [5, 41, 88–94].
Nhiều hợp chất lai giữa axit betulinic, axit ursolic, axit oleanolic và các dẫn xuất của
nó với zidovudin (AZT) hoặc với lamivudine (3TC) thể hiện hoạt động chống HIV
cao [102], một số hợp chất lai của các tritecpenoit và dẫn xuất của nó với AZT qua
cầu nối triazole thể hiện như là các tác nhân chống HIV tiềm năng cũng như các chất
ức chế tế bào ung thư [38, 40]. Từ ý tưởng trên, luận án này nghiên cứu tổng hợp các
hợp chất mới có cấu trúc lai của betulin, một tritecpenoit khung lupan tiêu biểu, với
AZT qua cầu nối este-triazole hoặc qua cầu nối amit-triazole, luận án cũng thực hiện
tổng hợp các hợp chất lai giữa betulin và d4T; 3TC qua cầu nối este; đồng thời
nghiên cứu thử hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2),
ung biểu mô (KB) của các sản phẩm lai tổng hợp được nhằm tìm kiếm các hợp chất
mới có hoạt tính sinh học lý thú.
2. Đối tượng và nhiệm vụ của luận án
2.1. Đối tượng nghiên cứu của luận án
Các hợp chất lai của betulin với thuốc chống HIV là AZT, d4T và 3TC qua cầu nối
este và cầu nối triazole.
2.2. Nhiệm vụ của luận án
2.2.1. Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất betulin-diaxit cacboxylic (với các anhydrit của
axit succinic; axit glutaric, axit metylglutaric, axit metylsuccinic, axit maleic và axit
1,2,3,6-tetrahydrophtalic).
2.2.2. Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất este propagyl của các axit betulin-diaxit
2.2.3. Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất amit propagyl của các axit betulin-diaxit
2.2.4. Nghiên cứu tổng các dẫn xuất lai của betulin với AZT qua cầu este-triazole
2.2.5. Nghiên cứu tổng các dẫn xuất lai của betulin với AZT qua cầu amit-triazole
2.2.6. Nghiên cứu tổng các dẫn xuất lai của betulin với d4T qua liên kết este
2.2.7. Nghiên cứu tổng các dẫn xuất lai của betulin với 3TC qua liên kết este
2.2.8. Xác định hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất lai
Các dẫn chất lai của betulin được thử hoạt tính gây độc tế bào trên 2 dòng tế bào ung
thư: tế bào KB (ung thư biểu mô), tế bào Hep-G2 (ung thư gan).
3. Phương pháp nghiên cứu
Các chất được tổng hợp theo các phương pháp tổng hợp hữu cơ hiện đại đã biết, có
cải tiến và vận dụng thích hợp vào các trường hợp cụ thể. Sản phẩm phản ứng được làm
2
sạch bằng phương pháp sắc kí cột. Cấu trúc của sản phẩm được xác định bằng các phương
pháp phổ như: IR, 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC, HSQC, NOESY và HRMS.
4. Những điểm mới của luận án
1. Luận án đã thiết kế và tổng hợp thành công 22 hợp chất lai mới giữa betulin
và các thuốc HIV (AZT, d4T, 3TC) và 11 hợp chất trung gian có nhóm ankin và 6 dẫn
xuất este giữa betulin và các axit dicacboxylic, bao gồm:
* 6 dẫn xuất este giữa betulin và các axit dicacboxylic khác nhau 121a-f.
6 dẫn chất trung gian mới 122a-f, là các betulin-este-propagyl có chứa liên
kết -C≡CH.
5 dẫn chất trung gian mới 124a-f, là các betulin-amit-propagyl có chứa liên
kết -C≡CH.
Các dẫn xuất này có thể tham gia phản ứng click với các thuốc hoặc các chất có hoạt
tính khác chứa liên nhóm azit –N3 để tổng hợp các hợp chất lai mới.
6 hợp chất lai mới giữa betulin và AZT qua cầu nối este-triazol 123a-f.
* 5 hợp chất lai mới giữa betulin và AZT qua cầu nối amit-triazol 125a-e.
6 hợp chất lai mới giữa betulin và d4T qua cầu nối este 126a-f.
5 hợp chất lai mới giữa betulin và 3TC qua cầu nối este 127a-e.
2. Đã khẳng định được cấu trúc của các hợp chất lai mới từ kết quả phân tích dữ
liệu phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR,
HMBC, HSQC và NOESY) và phổ khối lượng (HRMS).
3. Đã đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của 22 hợp chất lai mới trên 2
dòng tế bào ung thư ở người, tế bào Kb (ung thư biểu mô) và tế bào Hep-G2 (ung
thư gan), trong đó có 19 hợp chất có khả năng gây độc tế bào ung thư khảo sát, trong
đó có 6 hợp chất thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh với giá trị IC50 < 5
µM là 123b-f và 126f.
4. Đã tổng hợp được 2 hợp chất lai mới có giá trị IC50 tốt hơn chất chuẩn đối
chứng Ellipticine: 123f : IC50 = 0,38 µM (KB); 1,32 µM (Hep-G2); 126f : IC50 =
0,87 µM (KB); 2,8 µM (Hep-G2). Hợp chất 123c có giá trị IC50 tương đương với chất
chuẩn Ellipticine, IC50 = 1,38 µM (KB).
5. Bố cục của luận án
Luận án được trình bày trên 134 trang đánh máy với 36 sơ đồ, 39 hình và 17
bảng. Phân bố cụ thể như sau: Mở đầu: 3 trang; Tổng quan: 26 trang; thực nghiệm:
32 trang; Kết quả và thảo luận: 57 trang; kết luận: 1 trang; Danh mục các công trình
của tác giả: 1 trang; Tài liệu tham khảo: 12 trang. Ngoài ra còn có phần phụ lục 71
trang gồm các phổ đồ.
Chương 1. TỔNG QUAN
Tổng quan gồm 26 trang, tổng kết tài liệu về tình hình nghiên cứu về Betulin,
tổng hợp các dẫn chất lai của tritecpenoit và các hợp chất lai của betulin với các hợp
chất thuốc đã biết của các tác giả trong và ngoài nước.
Chương 2. THỰC NGHIỆM
Thực nghiệm gồm 32 trang, trình bày chi tiết về các phương pháp nghiên cứu,
quy trình tổng hợp, tinh chế, các tính chất vật lý của các sản phẩm nhận được như:
điểm chảy, hình thái, màu sắc, hiệu suất phản ứng và dữ liệu chi tiết các phổ HRMS,
IR, 1H NMR, 13C NMR và một số phổ tương tác HMBC, HSQC, NOESY.
3
Đã đưa ra quy trình tổng hợp thành công các dãy hợp chất sau đây:
1. Các dẫn xuất este của betulin với các anhydrit axit dicacboxylic 121a-f.
2. Các dẫn xuất propargyl este 122a-f của của các hợp chất 121a-f.
3. Các dẫn xuất propargyl amit 124a-e của của các hợp chất 121a-e.
4. Các hợp chất lai 123a-f của dẫn xuất-betulin với AZT qua cầu este-triazole.
5. Các hợp chất lai 125a-e của dẫn xuất-betulin với AZT qua cầu amit-triazole.
6. Các hợp chất lai 126a-f của dẫn xuất-betulin với d4T qua cầu este.
7. Các hợp chất lai 127a-e của dẫn xuất-betulin với 3TC qua cầu este.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Để thực hiện các mục tiêu của luận án, trước tiên nhóm OH của C-28 được chuyển
hóa thành chức este khi phản ứng với các anhidrit axit dicacboxylic.
Từ các axit 121a-f, nhóm chức axit -COOH được chuyển hóa thành nhóm cầu nối
este với thành phần hoạt tính thứ hai là stavudin và lamivudin (d4T và 3TC).
Hướng thứ hai là chuyển hóa nhóm axit -COOH của các axit 121a-f thành các
propagyl este hoặc propagyl amit, thực hiện phản ứng “Click” giữa AZT và các
propagyl este và propagyl amit được các hợp chất lai mới qua cầu nối triazol. Tổng
hợp được các chất lai giữa betulin và AZT qua cầu nối triazol.
4
3.1. Tổng hợp các hợp chất lai giữa betulin và AZT qua cầu este-triazol
Các hợp chất lai của betulin và AZT qua cầu este-triazol được tổng hợp theo sơ đồ
3.1.
[
Sơ đồ 3. 1. Tổng hợp các chất lai betulin và AZT qua cầu este-triazol
Sản phẩm este hóa nhóm OH ở C-28 được chứng minh bằng phổ hồng ngoại và phổ
cộng hưởng từ proton. Khi phân tích phổ cộng hưởng từ proton của các hợp chất
nghiên cứu, khung lupan được đánh số theo quy định, nhánh cầu nối chúng tôi quy
định đánh số từ nguyên tử C nhóm C=O trong nhóm este với OH ở C-28 là C-1’ và
tiếp tục đến nguyên tử C nhóm COOH (hình 3.1). Kết quả phân tích phổ proton của
các hợp chất trong dãy được tổng hợp ở bảng 3.1.
Phổ hồng ngoại (IR) của các hợp chất 121a-f có vân hấp thụ ở vùng 1680-1730 cm-1
với cường độ mạnh, đặc trưng của nhóm C=O trong chức axit và este mới được tạo
thành mà trên phổ của betulin không có các vân hấp thụ này.
5
Hình 3. 1. Công thức cấu trúc và một số đặc trưng vật lí của các hợp chất 121
Bảng 3. 1. Một số tín hiệu đặc trưng của khung lupan trong các hợp chất 121a-f
Betulin 121a 121b 121c 121d 121e 121f
H-3 3,20; dd,
11; 5 Hz
3,19; dd,
11; 5 Hz
3,19; dd,
11; 5 Hz
3,19; dd;
11; 5 Hz
3,19; dd;
11; 5 Hz
3,19; dd,
11; 5 Hz
3,19; dd,
11; 5 Hz
Ha-28 3,79; d,
10,5 Hz
4,31; d,
11,0 Hz
4,27; d,
11,0 Hz
4,27; d,
11,0 Hz
4,30; d,
11,0 Hz
4,34; 0,5H;
4,22; 0,5H;
3,90; 0,5H;
3,79; 0,5H;
d, J=11 Hz
4,51; d,
11,0 Hz
Hb-28 3,33; d,
10,5 Hz
3,90; d,
11,0 Hz
3,85; d,
11,0 Hz
3,85; d,
11,0 Hz
3,88; d,
11,0 Hz
4,07; d,
11,0 Hz
Ha-29 4,67; s 4,68; s 4,68; s 4,72; s 4,69; s 4,67; s 4,71; s
Hb-29 4,57; s 4,35; s 4,58; s 4,62; s 4,59; s 4,57; s 4,62; s
H-30 1,67; 3H, s 1,68; 3H, s 1,67; 3H, s 1,68; 3H, s 1,68; 3H, s 1,67; 3H, s 1,69; 3H, s
H-19 2,37-2-39;
1H, m
2,40-2,46;
1H; m
2,40-2,46;
1H; m
2,40-2,46;
1H; m
2,40-2,44;
1H; m
2,40-2,46;
1H; m
2,40-2,46;
1H; m
H-26 1,02; 3H; s 1,02; 3H, s 1,02; 3H, s 1,02; 3H, s 1,02; 3H, s 1,01; 3H, s 1,04; 3H, s
H-27 0,97; 3H, s 0,97; 3H, s 0,97; 3H, s 0,97; 3H, s 0,97; 3H, s 0,96; 3H, s 0,99; 3H, s
H-23 0,96; 3H, s 0,96; 3H, s 0,96; 3H, s 0,96; 3H, s 0,96; 3H, s 0,95; 3H, s 0,97; 3H, s
H-25 0,81; 3H, s 0,82; 3H, s 0,82; 3H, s 0,82; 3H, s 0,82; 3H, s 0,81; 3H, s 0,84; 3H, s
H-24 0,75; 3H, s 0,75; 3H, s 0,75; 3H, s 0,78; 3H, s 0,76; 3H, s 0,75; 3H, s 0,77; 3H, s
CH3
khác
1,00; 3H, s 1,27; 3H, s
Khi phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 121f, hai proton anken trong hợp
phần maleic ban đầu có hằng số tương tác vô hướng là 13 Hz và 12,5 Hz, vì chưa
khẳng định được cấu hình của nhóm anken này nên chúng tôi đã phân tích phổ tương
tác proton NOESY, trên phổ NOESY của hợp chất 121f không thấy có tín hiệu tương
tác của hai proton này H-2’ và H-3’, điều đó chứng tỏ hai proton này ở cách xa nhau
về mặt không gian, như vậy cấu hình phù hợp là trans .
Các hợp chất 121a-f tham gia phản ứng với propagyl bromua tạo thành các
este trong sự có mặt của Cs2CO3. Phản ứng này xảy ra nhanh và có hiệu suất cao, sản
phẩm của phản ứng rất chọn lọc.
Cấu trúc của các sản phẩm este 122a-f được khẳng định bằng dữ liệu phổ cộng hưởng
từ 1H và 13C. Một số tín hiệu cộng hưởng đặc trưng trên phổ 1H-NMR của các
propagyl este 122a-f được tổng hợp trong bảng 3.2.
H Chất
6
Bảng 3. 2. Các pic cộng hưởng đặc trưng của các este 122a-f Hợp chất 122a 122b 122c 122d 122e 122f
H-C≡ 2,47 ppm 2,47 ppm 2,47 ppm 2,47 ppm 2,45 ppm 2,51 ppm
CH2-C≡ 4,70; s 4,69; s 4,68; s 4,70; s 4,72; s 4,79; s
H-3 3,18; dd,
11,0; 5,0 Hz
3,18; dd,
10,5; 4,5 Hz
3,18; dd,
11,5; 4,5 Hz
3,18; dd,
11,5; 5,0 Hz
3,19; dd,
11,5; 4,5 Hz
3,18; dd,
11,0; 5,0 Hz
Ha-28 4,29; d,
10,5 Hz
4,28; d,
11,0 Hz
4,28; d,
11,5 Hz
4,32 và 4,26
(1H); 3,85 và
3,91; (1H); d,
11 Hz
4,12 (0,5H);
4,01 (0,5H);
3,68 (0,5H);
3,57 (0,5H);
4,38; d,
11,0 Hz
Hb-28 3,89; d,
10,5 Hz
3,86; d,
11,0 Hz
3,86; d,
11,5 Hz
3,99; d,
11,0 Hz
Ha-29 4,69; s 4,68; s 4,68; s 4,45; s 4,68; s 4,69; s
Hb-29 4,59; s 4,59; s 4,59; s 4,35; s 4,58; s 4,59; s
H-30 1,68; 3H, s 1,68; 3H, s 1,68; 3H, s 1,68; 3H, s 1,67; 3H, s 1,68; 3H, s
H-26 1,03; 3H, s 1,03; 3H, s 1,03; 6H, s 1,03; 6H, s 1,02; 3H, s 1,04; 3H, s
H-27 0,972;3H, s 0,973;3H, s 0,974;3H,s 0,971;3H,s 0,97; 6H, s
0,98;3H,s
H-23 0,967;3H, s 0,967;3H, s 0,967;3H,s 0,967;3H,s 0,97;3H,s
H-25 0,82; 3H, s 0,83; 3H, s 0,82; 3H, s 0,82; 3H, s 0,82; 3H, s 0,83;3H,s
H-24 0,76; 3H, s 0,76; 3H, s 0,76; 3H, s 0,76; 3H, s 0,76; 3H, s 0,76;3H,s
H-19 2,42-2,45,
1H, m 2,39-2,45,
5H, m (1H-
19; 2H-2’;
2H-4’)
2,40-2,52;
4H, m;
2,24-2,32;
2H, m
2,40-2,49;
2H, m;
2,77-2,82,
1H, m;
2,39-2,44;
m
2,42-2,47,
1H, m
H-2’
2,69; 4H, s
3,08-3,11;
m
6,31; 1H, d,
11,5Hz
H-3’ 2,95-2,99,
1H, m
6,26; 1H, d,
11,5Hz
H-4’ H-3’: 1,94-
2,01; m
5,68; s
H-5’
khác 1,25; 3H-5’,
d, J=7Hz
2,39-2,44;
m, H-7’
Hình 3. 2. Cấu trúc hóa học và một số đặc trưng vật lí của các hợp chất 122a-f
7
Các tín hiệu cộng hưởng trên phổ 13C-NMR của các hợp chất 122a-f được trình bày ở
bảng 3.3. Kết quả phân tích ở bảng 3.3 cho thấy các tín hiệu cộng hưởng của 30
nguyên tử C trong khung lupan ít thay đổi. C-28 có nhóm chức bị biến đổi trực tiếp nên
độ dịch chuyển thay đổi lớn nhất, của betulin δC-28 = 60,75 ppm [1, 106], cacbon này
chuyển dịch về phía trường yếu hơn khi nhóm OH được chuyển thành nhóm este δC-28
= 63,1-63,3 ppm, rất ít thay đổi giữa các hợp chất trong dãy.
Bảng 3. 3. Một số tín hiệu đặc trưng phổ 13C-NMR của các hợp chất 122a-f
C 122a 122b 122c 122d 122e 122f C 122a 122b 122c 122d 122e 122f
C-1 37,6 37,6 37,6 37,6 37,6 37,6 C-21 29,6 29,6 29,6 29,6 29,6 29,6
C-2 27,4 27,4 27,4 27,4 27,4 27,4 C-22 29,6 29,6 29,6 29,6 29,6 29,6
C-3 79,0 79,0 79,0 79,0 79,0 79,0 C-23 28,0 28,0 28,0 28,0 28,0 28,0
C-4 38,9 38,9 38,9 38,9 38,9 38,9 C-24 15,4 15,4 15,4 15,4 15,4 15,4
C-5 55,3 55,3 55,3 55,3 55,3 55,3 C-25 16,1 16,1 16,1 16,1 16,1 16,1
C-6 18,3 18,3 18,3 18,3 18,3 18,3 C-26 16,0 16,0 16,0 16,0 16,1 16,1
C-7 34,5 34,5 34,5 34,5 34,5 34,6 C-27 14,8 14,8 14,8 14,8 14,8 14,8
C-8 40,9 40,9 40,9 40,9 40,9 40,9 C-28 63,2 63,2 63,2 63,1 64,1 64,1
C-9 50,4 50,4 50,4 50,4 50,4 50,4 C-29 109,9 109,9 109,9 109,9 109,9 109,9
C-10 37,2 37,2 37,2 37,2 37,2 37,2 C-30 19,2 19,2 19,2 19,2 19,2 19,2
C-11 20,8 20,8 20,8 20,8 20,8 20,8 C-1’ 172,3 173,2 172,3 175 173,4 165,5
C-12 25,2 25,2 25,2 25,2 25,2 25,2 C-2’ 29,1 33,3 40,9 35,7 39,9 130,9
C-13 38,7 38,7 38,7 38,7 38,7 38,7 C-3’ 29,0 20,1 27,5 35,9 26,0 128,6
C-14 42,7 42,7 42,7 42,7 42,7 42,7 C-4’ 171,5 33,0 40,5 172 125,3 164,3
C-15 27,0 27,0 27,0 27,0 27,0 27,0 C-5’ 172,1 171,5 17,0 125,0
C-16 34,2 34,2 34,2 34,2 34,2 34,2 C-6’ 19,8 25,7
C-17 48,8 48,8 48,8 48,8 48,8 48,9 C-7’ 39,6
C-18 46,4 46,4 46,4 46,4 46,4 46,4 C≡ 77,5 77,6 77,5 77,5 77,6 77
C-19 47,7 47,7 47,7 47,7 47,7 47,7 ≡CH 75,0 74,9 75,0 75,0 74,9 75,5
C-20 150,1 150,1 150,1 150,1 150,1 150 CH2 52,2 52,3 51,8 52,2 52,1 52,7
C-8’ 172,4
Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 122d có một số tín hiệu cộng hưởng kiểu “cặp”.
Proton Ha-28 tách thành hai tín hiệu duplet cạnh nhau với tổng cường độ bằng 1H,
bao gồm 0,76 H tại δ = 4,27 ppm và 0,27 H tại δ = 4,42 ppm. Phổ 13C-NMR của hợp
chất 122d và 123d đều thấy có hai pic tương ứng với tín hiệu cộng hưởng của hai
nguyên tử cacbon nhóm cacbonyl este. Cặp tín hiệu thứ nhất 175,2 và 174,4 ppm, cặp
thứ 2 là 171,9 và 171,0 ppm. Như vậy phản ứng giữa betulin và anhydrit axit 2-metyl
succinic tạo ra sản phẩm gồm hai đồng phân với tỉ lệ 1:3. Theo cơ chế phản ứng este hóa
xúc tác bazơ AcB2, tác nhân RCH2O dễ tấn công vào nhóm C=O ít bị cản trở không
gian hơn nên sản phẩm 121d mà nhóm CH3 của cầu nối ở xa khung lupan hơn chiếm ưu
thế hơn so với 121d1. Kết quả này được khẳng định khi phân tích phổ HMBC và HSQC
của hợp chất 123d.
8
Các hợp chất lai 123a-f được tổng hợp bằng phản ứng “Click” giữa các
propagyl este 122a-f với 0,7 đương lượng AZT trong dung môi t-butanol ở 70 oC,
xúc tác CuI (0,2 đương lượng) trong 12. Cấu trúc hóa học, một số đặc trưng vật lí và
đánh số nguyên tử C của các hợp chất lai của betulin và AZT qua cầu nối este-triazol
123a-f như hình 3.3 dưới đây.
Hình 3. 3. Cấu trúc hóa học và một số đặc trưng vật lí của các hợp chất 123a-f
Cơ chế phản ứng “Click” giữa nhóm azit N3- và ankin C≡C với xúc tác CuI được mô
tả theo sơ đồ 3.2 [107–111]. Phản ứng này có độ chọn lọc và hiệu suất cao.
Sơ đồ 3. 2. Cơ chế phản ứng “Click” tổng hợp các hợp chất lai 123a-f
9
Cấu trúc dự kiến của các hợp chất lai 123a-f được khẳng định bằng các dữ kiện phổ
IR, MS, 1H-NMR và 13C-NMR của chúng. Bảng 3.4 và 3.5 trình bày kết quả phân
tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR của 6 hợp chất lai 123a-f, ở hợp phần AZT và cầu
nối. Kết quả phân tích phổ được dựa trên phổ tương tác cacbon-hydro của hợp chất
123d. Bảng 3. 4. Các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng phổ 1H của các hợp chất 123a-f
123a 123b 123c 123d 123e 123f
H-triazol 7,71; s; 1H 7,77; s; 1H 7,72; s; 1H 7,76; s; 1H 7,72; s; 1H 7,81; s; 1H
H-thyidin 7,35; s; 1H 7,44; s; 1H 7,36; s; 1H 7,41; s; 1H 7,37; s; 1H 7,41; s; 1H
H-1” 6,19; t, 6,5
Hz; 1H
6,22; t, 6,5
Hz; 1H
6,19; t, 6,5
Hz; 1H
6,21; t, 6,5 Hz;
1H
6,19; t, 6,5
Hz; 1H
6,21; t, 6,5
Hz; 1H
H-2”a 3,0-3,06; m;
1H
2,97; d,
11Hz; 1H
2,99-3,02;
m; 1H 2,91-3,01; m;
2H
3,0-3,06;
m; 1H 2,95-3,0;
m; 2H H-2”b 2,92-2,97; m;
1H
2,96; d,
11Hz; 1H
2,94-2,98;
m; 1H
2,94-3,02;
m; 1H
H-3” 5,39-5,43; m,
1H
5,42-5,46;
m, 1H
5,39-5,43;
m, 1H
5,41-5,45; m,
1H
5,39-5,42;
m, 1H
5,44-5,47;
m, 1H
H-4” 4,43-4,45; m;
1H
4,42-4,44;
m; 1H
4,42-4,45;
m; 1H
4,41-4,43; m;
1H
4,41-4,42;
m; 1H
4,44-4,45;
m; 1H
H-5”a 4,03; d, 12,5;
1H
4,01; d,
12,5; 1H
4,03; d,
12,5; 1H
4,01; dd, 12,5;2,
Hz; 1H
4,02; d,
12,5; 1H
4,02; dd,
12,5;2Hz; 1H
H-5”b 3,76-3,81; m;
1H
3,78; d,
12,5Hz; 1H 3,76-3,81;
m; 1H
3,79; dd; 12;2
Hz; 1H
3,80; d,
12,5Hz; 1H
3,78; dd;
12,5;2Hz;1H
CH2-triazol 5,26; s; 2H 5,22; s; 2H 5,24; s; 2H 5,22-5,26; m; 2H 5,30; s; 2H 5,35; s; 2H
CH3-AZT 1,95; s; 3H 1,95; s; 3H 1,95; s; 3H 1,95; s; 3H 1,95; s; 3H 1,95; s; 3H
NH 8,25; s; 1H 9,20; s; 1H 8,39; s; 1H 8,25; s; 1H 8,25; s; 1H 9,18; s; 1H
H-2’
2,67,; s; 4H
2,36-2,45;
m; 2H-2’
và 2H-4’;
1,94-1,98;
m; 2H-3’
2,36-2,48;
m; 3H và
2,23-2,30;
m; 2H
2,91-3,01; m;
1H; 2,73-2,79;
m; 1H; 2,38-
2,49; m; 1H.
3,09-3,11;
m; H-2’ và
3,0-3,06;
m; H-7’
6,90; d,
16Hz; 1H
H-3’ 6,83; d,
16Hz; 1H
H-4’
5,66; s; 2H
H-5’ 1,22; d, 5Hz;
3H
H-6’ 1,59; s; 3H 2,51-2,58;
m; và 2,35-
2,43; m
(2H-3’ và
2H-6’)
H-7’
Trên phổ 13C-NMR của các hợp chất 123a-f xuất hiện đầy đủ số tín hiệu cộng hưởng
tương ứng với số nguyên tử cacbon trong phân tử.
10
Bảng 3. 5. Tín hiệu cộng hưởng 13C đặc trưng của các hợp chất 123a-f
123a 123b 123c 123d 123e 123f
CO-NH 163,5 163,7 163,5 163,5 163,2 163,7
NCONH 150,3 150,4 150,1 150,3 150,2 150,4
=CH thymidin
138,0 137,8 138,0 137,9 138,0 137,9
=C thymidin 111,4 111,3 111,4 111,4 111,4 111,4
C-1” 89,6 88,8 89,6 89,1 89,4 89,0
C-2” 37,3 37,5 37,3 37,4 37,2 37,5
C-3” 59,4 59,3 59,4 59,3 59,4 59,4
C-4” 85,3 85,2 85,3 85,3 85,4 85,3
C-5” 61,8 61,6 61,8 61,6 61,8 61,6
=C triazol 143,3 143,2 143,3 143,3 143,6 143,3
=CH triazol 123,8 123,9 123,8 123,8 123,6 123,8
CH2-triazol 58,4 58,3 58,4 58,4 58,4 58,3
2 C=O
cầu nối
172,6 173,3 172,8 175,1 173,6 165,1
172,2 172,8 172,2 172,1 171,2 164,8
CH3-AZT 12,5 12,4 12,5 12,4 12,5 12,4
C khác 29,0; 29,1
(C-2’; C-
3’)
20,1 C-3’;
33,4; 33,2
(C-2’;C-4’)
19,8 C-6’;
27,5 C-3’;
40,9; 40,5
(C-2’; C-4’)
17,0 (C-
5’); 35,9;
35,7 (C-2’,
C-3’)
125,2; 125,1 (C-
4’, C-5’) 39,9;
39,7 (C-2’; C-7’);
25,9; 25,7 (C-3’,
C-6’)
134,7;
132,7
(C-2’;
C-3’)
Hợp chất 123f, hai tín hiệu cộng hưởng của 2 C nhóm C=O cầu nối (C-1’ và C-
4’) cộng hưởng ở trường mạnh hơn so với tất cả các hợp chất khác trong dãy, nguyên
nhân do hai nhóm C=O này liên hợp với nhau và với liên kết anken C=C, vì liên kết
có cấu hình trans nên sự liên hợp càng mạnh; các vị trí khác gần như không có sự
thay đổi. Để khẳng định việc quy kết các tín hiệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các
hợp chất, chúng tôi phân tích phổ HMBC và HSQC của hợp chất 123d. Trên phổ
cộng hưởng từ proton của hợp chất 123d nói riêng và các hợp chất lai nói chung có
rất nhiều tín hiệu của chồng lấp nhau, nhiều tín hiệu của proton liên kết với các
nguyên tử Csp3 của khung lupan cộng hưởng ở vùng trường mạnh rất khó nhận biết.
Việc quy kết tín hiệu cộng hưởng của 6 nhóm metyl H-23; H-24; H-25; H-26; H-27
và H-30 của hợp phần betulin chỉ được khẳng định khi phân tích phổ HMBC và
HSQC. Trên phổ cộng hưởng từ proton của hợp chất 123d cũng như các hợp chất
khác trong dãy, nhiều tín hiệu dễ nhận thấy như Ha-29, Hb-29, Ha-28, Hb-28, H-3,
H-19. Tương tự như vậy trên phổ cộng cộng hưởng từ 13C dễ nhận được các tín hiệu
C-1’, C-4’, C-20, C-29, C-3, C=O của nhân thymidin, các nguyên tử C trong liên kết
C=C, C=N. Tuy nhiên, khi phân tích phổ 2 chiều đã quy kết chính xác các tín hiệu
này. Kết quả như trong bảng 3.6 và bảng 3.7.
11
Bảng 3. 6. Phân tích phổ HMBC và HSQC của hợp chất 123d phần khung lupan Cacbon Tín hiệu tương tác với proton trên phổ HMBC HSQC
C δ (ppm) H (δ, ppm)
C-1 37,6 H-25 (0,80; s)
C-2 27,0
C-3 80,0 H-23 (0,95; s), H-24 (0,74; s) 3,18; dd
C-4 38,9 H-3 (3,18, dd; 4,5; 11Hz); H-24 (0,74; s) yếu
C-5 55,3 H-23 (0,95; s), H-24 (0,74; s), H-25 (0,80; s)
C-6 18,3
C-7 34,5 H-26 (1,00; s)
C-8 40,8 H-27 (0,95; s), H-26 (1,00; s)
C-9 50,3 H-25 (0,80; s), H-26 (1,00; s)
C-10 37,1
C-11 20,8
C-12 25,2
C-13 38,7 H-27 (0,95; s)
C-14 42,7 H-26 (1,00; s), H-27 (0,95; s)
C-15 27,0 H-27 (0,95; s)
C-16 34,2 Ha-28 (4,26, d, 11Hz); Hb-28 (3,88; d, 11Hz)
C-17 48,8 H-19 (2,38-2,42, m)
C-18 46,4 Ha-28 (4,26, d, 11Hz); Hb-28 (3,88; d, 11Hz)
C-19 47,7 Ha-29 (4,67, s); Hb-29 (4,57, s) 2,38-2,42; m
C-20 150,2 Ha-29 (4,67, s); Hb-29 (4,57, s); H-30 (1,66; s)
C-21 29,7
C-22 29,6 Ha-28 (4,26, d, 11Hz); Hb-28 (3,88; d, 11Hz); H-19 1,90-1,93; m
C-23 28,0 H-3 (3,18, dd; 4,5; 11Hz); H-24 (0,74; s) 0,95; s
C-24 15,4 H-3 (3,18, dd; 4,5; 11Hz); H-23 (0,95; s) 0,74; s
C-25 16,1 H-5 (0,66; br.d) 0,80; s
C-26 16,0 1,00; s
C-27 14,7 0,95; s
C-28 63,2 4,26; 3,88
C-29 109,9 H-19 (2,38-2,42, m); H-30 (1,66; s) 4,67; 4,57
C-30 19,1 H-19 (2,38-2,42, m); Ha-29 (4,67, s); Hb-29 (4,57, s) 1,66; s
Bảng 3. 7. Phân tích phổ HMBC và HSQC của hợp chất 123d phần AZT và cầu nối
Cacbon Tương tác chính C-H trên phổ HMBC HSQC
C δ (ppm) H_δ (ppm) δ (ppm)
C-1’ 172,2 Ha-28 (4,26, d, 11Hz); Hb-28 (3,88; d, 11Hz)
C-2’ 37,7 H-5’ (1,23, s); H-3’ (2,91-3,01, m, overlap) H-2’a; H-2’b
C-3’ 35,8 2,01-3,01; m
C-4’ 175,1 H-2’a (2,73-2,79); H-2’b (2,44-2,48); H-3’, H-6’
C-5’ 17,0 H-2’a (2,73-2,79); H-2’b (2,44-2,48) 1,23; s (CH3)
C-6’ 58,4 =CH-triazol (7,75) 5,22-5,29; m
C-1” 89,1 H-3” (5,41-5,45; m); =CH-thymidin (7,41, s) 6,20-6,22; m
C-2” 37,4 H-4” (4,41-4,43; m); 2,91-3,01; m
C-3” 59,3 H-5”a (4,01, dd, 2,0; 12,5 Hz); H-5”b (3,79; dd, 2,0;
12,5 Hz); H-1” (6,20-6,22; m)
5,41-5,45; m
C-4” 85,3 H-5”a (4,01, dd, 2,0; 12,5 Hz); H-2” (2,91-3,01; m) 4,41-4,43
12
C-5” 61,6 H-3” (5,41-5,45; m); H-5”a; H-5”b
=CH triazol 123,8 H-6’ (5,22-5,29; m); H-3” (5,41-5,45; m) 7,75; s
=C triazol 143,4 H-6’ (5,22-5,29; m); =CH-triazol (7,75)
C=O thymidin 163,5 =CH-thymidin (7,41, s)
NCON 150,3 =CH-thymidin (7,41, s); H-1” (6,20-6,22; m)
=C thymidin 111,3 =CH-thymidin (7,41, s)
=CH thymidin 137,9 H-1” (6,20-6,22; m) 7,41; s
Như vậy, qua phân tích dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13C và kết hợp
phổ tương tác cacbon-hydro, cấu trúc của 6 sản phẩm lai betulin-este-triazol-AZT dự
kiến đã được khẳng định.
3.3. Tổng hợp các hợp chất lai của betulin và AZT qua cầu nối amit-triazol Các hợp chất lai giữa betulin và AZT qua cầu nối amit-triazol được tổng hợp từ
dẫn xuất axit 121a-e theo sơ đồ 3.3. Hiệu suất tổng hợp đạt từ 50% đến 68%.
Bằng các phương pháp phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân đã chứng
minh được cấu trúc của các propagyl amit tổng hợp được.
Sơ đồ 3. 3. Tổng hợp các chất lai betulin và AZT qua cầu amit-triazol
Hình 3. 4. Cấu trúc hóa học và một số đặc trưng vật lí của các hợp chất 124a-e
13
Bảng 3. 8. Một số tín hiệu đặc trưng phổ 1H-NMR của các hợp chất 124a-e Hợp chất
124a 124b 124c 124d 124e
NH - 5,93; br.s 5,93; br.s 5,94; br.s 6,15; br.s
H-C≡ - 2,22; s 2,23; t; 2,5Hz 2,22; s 2,21; t; 2,5Hz
2H, CH2-
C≡
4,02-4,07; m;
1H; 3,68-3,69;
m; 1H
4,02-4,07; m;
1H; 3,68-3,69;
m; 1H
4,04; d, 2Hz 4,05;
d; 2Hz
4,19-4,28; m;
2H
4,35; d; 11Hz;1H
3,95; d, 11Hz;
1H
H-3 3,18; dd, 11,0
và 5,0 Hz
3,18;dd, 10,5
và 4,5 Hz
3,18; dd, 11,0
và 4,5 Hz
3,18; dd, 11,5
và 4,5 Hz
3,18; dd, 11,0
và 4,5 Hz
Ha-28 4,32; d, 11Hz 4,08; d, 1Hz 4,27; t, 10 Hz 4,08; d, 17Hz 4,24; d; 10,5Hz,
Hb-28 3,85; d, 11Hz 3,96; d, 11Hz 3,86; d, 10 Hz 3,99; d, 17Hz 3,84; d, 11Hz;1H
Ha-29 4,69; s 4,68; s 4,68; s 4,68; s 4,68; s
Hb-29 4,59; s 4,59; s 4,58; s 4,58; s 4,58; s
H-30 1,66; 3H, s 1,68; 3H, s 1,67; 3H, s 1,67; 3H, s 1,67; 3H, s
H-26 1,03; 3H, s 1,03; 3H, s 1,03; 6H, s 1,02; 3H, s 1,02; 3H, s
H-27 0,97; 3H, s 0,973; 3H, s 0,97; 3H, s 0,97; 6H, s 0,97; 6H, s
H-23 0,96; 3H, s 0,967; 3H, s 0,96; 3H, s
H-25 0,82; 3H, s 0,83; 3H, s 0,82; 3H, s 0,82; 3H, s 0,85; 3H, s
H-24 0,76; 3H, s 0,76; 3H, s 0,76; 3H, s 0,77; 3H, s 0,76; 3H, s
H-19 2,39-2,45, 1H,
m 2,39-2,45, 5H,
m (1H-19; 2H-
2’; 2H-4’)
2,39-2,48; 3H,
m
2,40-2,49; 2H,
m; 2,77-2,82,
1H, m;
2,39-2,44; m
H-2’ 2,66-2,70; 2H,
m; 2,72-2,77;
m; 2H
3,06-3,09; m
H-3’ 2,10-2,14; 1H,
m
2,95-2,99, 1H,
m
2,37-2,57; m;
4H (H-3’; H-6’)
H-4’ H-3’: 1,94-
2,01; m
2,27-2,32; 2H,
m
5,73; s
H-5’
Khác 3H-6’ (1,03ppm) 1,25; 3H-5’, d,
J=7Hz
2,94-2,98; m,
H-7’
Trên phổ cộng hưởng từ proton của các hợp chất 124a-e đều tìm thấy píc cộng
hưởng đặc trưng của nhóm NH rộng, tù với độ chuyển dịch khoảng 6-9 ppm. Phổ 1H
NMR của các hợp chất dãy amit 124a-e được phân tích và tổng hợp trong bảng 3.6.
Cơ chế phản ứng amit hóa của các hợp chất 124a-e với propagyl amin với xúc
tác DCC và HOBt được đề xuất theo sơ đồ 3.4 [112–114].
Sơ đồ 3. 4. Cơ chế phản ứng amit hóa tổng hợp các propagyl amit 124a-e
14
Phản ứng “Click” tiếp tục được sử dụng để tổng hợp các hợp chất lai giữa betulin và
AZT qua cầu amit-triazol. Tỉ lệ các chất tham gia phản ứng, tỉ lệ xúc tác và điều kiện
phản ứng được giữ nguyên như phản ứng tổng hợp các chất lai 123a-f. Cấu trúc của
các chất lai cũng được chứng minh bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân và khẳng định
sau khi phân tích phổ khối lượng MS.
Hình 3. 5. Cấu trúc hóa học và một số đặc trưng vật lí của các hợp chất 125a-e
Bảng 3. 9. Một số tín hiệu cộng hưởng proton đặc trưng của các chất lai 125a-e
Hợp phần proton 125a 125b 125c 125d 125e
Khung
tritecpenoit
H-3 3,18 3,16-3,17; m 3,18; dd; J =
11,0 và 4,5 Hz
3,18; dd; J =
11,0 và 4,5 Hz
Ha-28 4,25; t, 11Hz 4,25; t, 10Hz 4,25; t, 10Hz 4,25 (0,3H)
4,20 (0,7H)
4,32 (0,5H)
4,20 (0,5H)
Hb-28 3,88; t; 11Hz 3,85; t; 10Hz 3,82; t; 10Hz 3,94 và
3,89 (1H)
3,94 (0,5H)
3,80 (0,5H)
Ha-29 4,68; s 4,67; s 4,66; s 4,67; s 4,67; s
Hb-29 4,58; s 4,57; s 4,56; s 4,57; s 4,57; s
CH3 1,67 (3H);
1,02 (3H);
0,97 (3H);
0,96 (3H);
0,87 (3H);
0,86 (3H)
1,66 (3H);
1,01 (3H);
0,95 (6H)
0,80 (3H);
0,74 (3H)
1,65 (3H);
0,99 (3H);
0,95 (3H)
0,94 (3H)
0,79 (3H);
0,73 (3H)
1,66 (3H);
0,99 (3H);
0,96 (3H)
0,95 (3H)
0,79 (3H);
0,74 (3H)
1,66 (3H);
1,01 (3H);
0,95 (6H)
0,80 (3H);
0,74 (3H)
Gốc điaxit 2,70; s; 2H;
2,53; s; 2H
0,97; d; 6,5 Hz
(3H-6’)
1,0; d; 6 Hz
(3H-5’)
5,71; t; 2H (H-
4’; H-5’)
NH-CH2-
triazol
CH2 4,50; br.s 4,48; s và 4,47; s 4,47; s 4,48-4,49; m 4,45-4,55; m
=CH 7,76; s 7,85; s 7,88; s 7,85; s 7,78; s
NH 6,70; br.s 6,96; br.s 7,14; br.s 6,96; br.s ?
Hợp phần
AZT
H-1” 6,24; s 6,29; t; 6,5Hz 6,31; s 6,31; s 6,25, t, 6Hz
H-4” 5,41; br.s 5,42; m 5,44; s 5,44; s 5,38-5,4; m
2 H-5” 3,99; d, 11,5Hz
3,79; d, 11,5Hz
3,97; d; 11Hz
3,85; d; 11Hz
3,96; d; 10Hz
3,80; d; 10Hz
3,96; d; 10Hz
3,80; d; 10Hz
3,78-3,81; m
=CH 7,47; s 7,57; s 7,62; s 7,62; s 7,52; t; 6Hz
CH3 1,92; s 1,88; s 1,87; s 1,89; s 1,92; s
NH 9,18; br.s 9,84; br.s 10,0; br.s 9,70; br.s 9,28; br.s
15
Bảng 3. 10. Tín hiệu cộng hưởng 13C đặc trưng của các hợp chất 125a-e
Cacbon 125a 125b 125c 125d 125e
CO-NH 163,5 164,2 164,1 164,1 163,9
NCONH 150,3 150,6 150,6 150,6 150,1
=CH thymidin 138,0 137,3 137,3 137,4 137,5
=C thymidin 111,4 111,1 111,1 111,1 111,2
C-1” 89,6 87,2 87,4 87,5 88,0
C-2” 37,3 37,7 37,6 37,1 37,2
C-3” 59,4 59,4 59,3 59,4 59,3
C-4” 85,3 85,2 85,2 85,2 85,3
C-5” 61,8 61,4 61,4 61,4 61,4
=C triazol 143,3 137,9 145,2 145,3 145,5
=CH triazol 123,8 121,5 122,7 122,7 125,9
CH2-AZT 57,8 55,3 53,5 57,8 59,2
2 C=O
cầu nối
172,6
172,2
173,7
172,8
173,2 172,3 175,1
172,1
174,4 174,3
CH3-AZT 12,5 12,4 12,5 12,5 12,5
C khác 19,9(C-3’) 17,3 (C-5’) 124,7; 124,8 (C-
4’, C-5’)
Đi từ các các hợp chất 121a-e có nhóm chức axit, thực hiện chuyển hóa theo sơ
đồ 3.6 luận án tổng hợp được 5 hợp chất lai giữa betulin và AZT qua cầu nối amit-
triazol 125a-e.
3.3. Tổng hợp các hợp chất lai giữa betulin và Stavudin (d4T) Các dẫn xuất 121a-f phản ứng với 1,5 đương lượng mol của Stavudin (d4T)
trong dung môi dimetylfoocmamit với xúc tác DCC, HOBt ở nhiệt độ phòng trong 20
giờ theo sơ đồ 3.5. Hiệu suất tổng hợp các hợp chất 126a-f đạt từ 42% đến 68%.
Kiểm tra phản ứng bằng sắc kí bản mỏng với pha động là hệ n-hexan : etyl axetat
(3:7), sản phẩm có đặc điểm là hấp thụ UV giống Stavudin với Rf gần sát với d4T
nhưng khi hiện màu bằng Ce(SO4)2 thì có màu xanh đậm.
Sơ đồ 3. 5. Tổng hợp các hợp chất lai 126a-f giữa betulin và d4T
Cấu trúc của các hợp chất lai được khẳng định khi phân tích phổ cộng
hưởng từ hạt nhân 1H và 13C. Kết quả phân tích được khẳng định khi phân tích phổ
HMBC và HSQC của hợp chất 126b. Thực hiện phản ứng lần lượt với các axit 121a-f,
thu được 6 sản phẩm lai tương ứng 126a-f. Cơ chế phản ứng este hóa được đề xuất
tương tự cơ chế phản ứng amit hóa tổng hợp các hợp chất 124a-e, tác nhân
nucleophin trong phản ứng này là đôi electron trên nguyên tử oxi nhóm OH của d4T
thay cho cặp electron của N-propagylamin (Sơ đồ 3.6) [112–114].
16
Sơ đồ 3. 6. Cơ chế phản ứng tổng hợp các chất 126a-f
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cũng được sử dụng để xác định cấu trúc của các sản
phẩm lai 126a-f. Trên phổ 1H-NMR của các hợp chất dãy này xuất hiện đầy đủ các
tín hiệu đặc trưng của hợp phần tritecpenoit, hợp phần d4T, đặc biệt có hai proton
anken trong vòng 2,5-dihydrofuran của hợp phần d4T và một proton thơm thymidin
rất dễ nhận biết. Các tín hiệu trên phổ 13C-NMR như C-20, C-29, C-3, C-28 là các tín
hiệu cộng hưởng đặc trưng của khung lupan, tín hiệu đặc trưng của hợp phần d4T là
2C nhóm C=O amit, 2C anken và các tín hiệu C trong nhóm este đều được tìm thấy
trên phổ 13C của các hợp chất lai 126a-f. Kết quả phân tích phổ được tổng hợp trong
bảng 3.11 và bảng 3.12.
Bảng 3. 11. Tín hiệu cộng hưởng 13C hợp phần d4T của các hợp chất 126a-f
Cacbon 126a 126b 126c 126d 126e 126f
CO-NH 165,9 163,7 163,5 166,3 164,2 164,3
NCONH 152,7 151,0 150,1 151,4 150,0 150,9
=CH thymidin 137,5; 135,5 135,4; 137,9; 135,5; 133,1;
=C thymidin 111,7 111,2 110,8 111,6 111,2 110,8
C-1” 91,4 90,0 89,6 91,4 90,1 89,6
C-2” 127,2 127,4 126,9 127,8 126,9 128,0
C-3” 135,5 133,3 133,1 134,9 133,6 133,9
C-4” 84,2 84,3 83,9 85,3 84,3 85,6
C-5” 64,9 64,9 64,5 66,3 65,1 66,5
CH3 thymidin 12,5 12,7 12,2 12,7 12,3 12,7
17
Hình 3. 6. Cấu trúc hóa học và một số đặc trưng vật lí của các hợp chất lai 126a-f
Bảng 3. 12. Các tín hiệu đặc trưng phổ 1H-NMR của các chất 126a-f Hợp
phần proton 126a 126b 126c 126d 126e 126f
Khung
tritecpen
oit
H-3 3,05; t, 11
Hz
3,09; t, 11
Hz
3,04; t, 8,5 Hz 3,18; dd; 11,5
và 4,5 Hz
3,07-3,09; m 3,19; dd, 10;
5 Hz
Ha-28 4,22; d,
11Hz
4,22; d, 11Hz 4,17; d, 11Hz 4,35 và 4,27
1H;11,5Hz
4,32(0,5H)
4,20 (0,5H)
4,40; d,
11Hz
Hb-28 3,77; t;
11Hz
3,78; t; 11Hz 3,74; t; 11Hz 3,83 và 3,88
1H;11,5Hz
3,83 (0,5H)
3,73 (0,5H)
3,99; d;
11Hz
Ha-29 4,58; s 4,62; s 4,57; s 4,68; s 4,60; s 4,70; s
Hb-29 4,48; s 4,51; s 4,47; s 4,58; s 4,50; s 4,60; s
CH3 1,57 (H30);
0,93 (3H);
0,87 (3H)
0,84 (3H);
0,72 (3H)
0,64 (3H)
1,61 (H-30);
0,99 (3H);
0,90 (3H)
0,87 (3H);
0,76 (3H)
0,68 (3H)
1,56 (H-30);
0,91 (6H);
0,86 (3H) 0,83
(3H); 0,71
(3H) 0,63 (3H)
1,67 (H-30);
1,02 (3H);
0,96 (6H)
0,82 (3H)
0,76 (3H);
1,59 (H-30);
0,94 (3H);
0,90 (3H)
0,87 (3H);
0,74 (3H)
0,67 (3H)
1,68 (H-30);
1,03 (3H);
0,98 (3H);
0,97 (3H)
0,83 (3H);
0,76 (3H)
Gốc
điaxit
2,52-2,60;
m; 4H (2H-
2’; 2H-3’);
2,30-2,37; m;
5H (H-19; 2H-
2’; 2H-4’)
0,91; trùng với
H-tritecpen
1,25; s; (3H-5’) 5,61 và 5,58;
t; 2H (H-4’;
H-5’);
6,93; d, 16
Hz; H-2’;
6,85; d, 16
Hz; H-3’
Hợp
phần
d4T
H-3” 6,18-6,2; m 6,23-6,25; m 6,18-6,20; m 6,26-6,30; m 6,22-6,27; m 6,31; d, 6Hz
H-1” 6,86-6,87; m 6,85; br.s 6,89-6,90; m 6,97-6,99; m 6,86-6,87; m 7,0; br.s
H-2” 5,8-5,81; m 5,80-5,81; m 5,83-5,85; m 5,89-5,92; m 5,85; br.s 5,93; d; 6Hz
H-4” 4,93; br.s 4,93; br.s 4,98; br.s 5,04; br.s 4,94; br.s 5,09; br.s
2 H-5” 4,34; dd;
12,5; 4 Hz;
4,12; dd;
12,5; 3 Hz
4,31; dd;
12,5; 4,5
Hz 4,16;
dd; 12,5;
4,5Hz
4,25-4,29; m;
4,09-4,12; m
4,31; dd; 12,5;
4,5 Hz 4,16;
dd; 12,5;
4,5Hz
4,15 và 3,30
(overlap)
4,50; dd;
12,5; 4 Hz;
4,40; dd;
12,5; 3 Hz
=CH 7,18; s 7,15; s 7,11; s 7,21; s 7,14; d;
7,5Hz
7,12; s
CH3 1,78; s 1,83; s 1,83; s 1,91; s 1,82; s 1,90; s
NH - - - 8,36; br.s - 8,26; s
18
Khi phân tích phổ tương tác proton-cacbon của hợp chất 126b chúng tôi nhận
được kết quả phù hợp với kết quả phân tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất
này. Trong đó, hợp phần betulin các tín hiệu cộng hưởng proton và cacbon hầu như
không có sự thay đổi. Kết quả phân tích phổ HMBC và HSQC hợp phần d4T của hợp
chất 126b được trình bày trong bảng 3.13.
Việc quy kết các tín hiệu proton trong vòng 2,5-dihydro furan sẽ không được chính
xác vì các tín hiệu này đều cộng hưởng ở phía trường yếu và khá gần nhau, hình dạng
phân phổ không rõ và đều là các tín hiệu multriplet. Trên phổ HMBC, tín hiệu H-1”
có tín hiệu tương tác với =CH-thymidin, C-1” và C-4” đều có tín hiệu tương tác với
H-2” và H-3”, đồng thời các nguyên tử cacbon và hydro ở vị trí 2” và 3” còn tương
tác chéo lẫn nhau, tuy nhiên C-3” có tín hiệu tương tác với H-5”a và H-5”b. Vì vậy,
kết hợp với phổ HSQC xác định được đúng các tín hiệu C-3”, C-2”, C-1”, C-4” và
các tín hiệu proton tương ứng.
Các hợp chất lai 126a-f sẽ được nghiên cứu thử hoạt tính gây độc tế bào trên hai dòng
tế bào ung thư ở người là tế bào KB (ung thư biểu mô) và HepG2 (ung thư gan) cùng
với các hợp chất lai dãy 123a-f, 125a-e và 127a-e.
Bảng 3. 13. Phân tích phổ HMBC và HSQC hợp phần d4T và cầu nối của 126b
Cacbon Tương tác chính C-H trên phổ HMBC HSQC
C δ (ppm) H_δ (ppm) δ (ppm)
C-1’ 173,3 Ha-28 (4,22, d, 11Hz); Hb-28 (3,78; d, 11Hz)
C-2’ 33,3 H-2’= H-4’= H-19 (2,31-2,39, m) H-2’a; H-2’b
C-3’ 20,1 H-2’= H-4’= H-19 (2,31-2,39, m), yếu 2,01-3,01; m
C-4’ 33,2 H-2’= H-4’= H-19 (2,31-2,39, m)
C-5’ 172,7 H-5”a (4,31; dd; 4,5; 12,5Hz); H-5”b (4,16; dd; 3,0;
12,5Hz)
1,23; s (CH3)
C-1” 90,0 H-2” (5,83-5,85; m); H-3” (6,23-6,25; m); =CH-
thymidin (7,15, s)
6,89-6,90; m
C-2” 127,4 H-3” (6,23-6,25; m); 5,83-5,85; m
C-3” 133,3 H-5”a (4,31; dd; 4,5; 12,5Hz); H-5”b (4,16; dd; 3,0;
12,5Hz); H-2” (5,83-5,85; m)
6,23-6,25; m
C-4” 84,3 H-2” (5,83-5,85; m); H-3” (6,23-6,25; m); H-5”b (4,16;
dd; 3,0; 12,5Hz)
4,97-4,99
C-5” 64,9 4,31; 4,16
C=O thymidin 163,5 =CH-thymidin (7,15, s); CH3-thymidin (1,83; s)
NCON 151,0 =CH-thymidin (7,41, s); H-1” (6,20-6,22; m)
=C thymidin 111,2 =CH-thymidin (7,41, s); CH3-thymidin (1,83; s)
=CH thymidin 135,5 H-1” (6,89-6,90; m) 7,15; s
CH3 thymidin 12,7 =CH-thymidin (7,41, s) 1,83; s
3.4. Tổng hợp các hợp chất lai betulin và Lamivudin (3TC) Tiếp nối thành công khi tổng hợp các hợp chất lai giữa betulin và Stavudin
bằng phản ứng este hóa, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng của các dẫn xuất axit
121a-f với 3TC trong điều kiện phản ứng và tỉ lệ tác nhân tương tự quy trình tổng
hợp các hợp chất 126a-f (sơ đồ 3.7). Kết quả thu được 5 hợp chất lai mới 127a-e. Cấu
trúc và đánh số cacbon của các sản phẩm như hình 3.7, các cấu trúc này được chứng
minh bằng phương pháp phổ IR, phổ MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C,
đồng thời chúng tôi cũng phân tích phổ HMBC và HSQC của hợp chất 127a để
khẳng định tính chính xác của các tín hiệu quy kết.
19
Sơ đồ 3. 7. Tổng hợp các hợp chất lai 127a-e giữa betulin và Lamivudin
Hình 3. 7. Công thức cấu trúc của các hợp chất 127a-e và đánh số nguyên tử C
Dữ liệu phân tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR của các hợp chất 127b-e được
tổng hợp ở bảng 3.14 và 3.15, các tín hiệu tương tác proton-cacbon của hợp chất
127b được tổng hợp trong bảng 3.16. Kết quả này cho phép khẳng định cấu trúc
dự kiến của các hợp chất tổng hợp được.
Bảng 3. 14. Một số tín hiệu đặc trưng phổ 13C-NMR của các hợp chất 127a-e
Cacbon 127a 127b 127c 127d 127e
CO-pyrimidin 162,6 162,7 162,6 162,6 162,8
=Ca 96,4 96,6 96,5 96,4 96,5
=Cb 145,2 145,1 145,1 145,1 144,8
C=N 155,0 155,9 155,7 155,1 155,8
C-1” 88,1 88,3 88,3 88,2 88,2
C-2” 38,9 38,8 38,9 38,8 38,9
20
Bảng 3. 15. Một số tín hiệu đặc trưng phổ 1H-NMR của các hợp chất 127b-e
Hợp
phần proton 127b 127c 127d 127e
Khung
lupan
và cầu
nối
H-3 3,19; br.s 3,11-3,13; m 3,17; dd; 11,5; 5,0
Hz
2,97-3,0; m
Ha-28 4,21; d, 11Hz 4,24; dd, 11;4Hz 4,26 và 4,22 (1H);
d, 11Hz
4,11 và 4,0 (1H);
d, 11Hz; 3,71 và
3,62 (1H); 11Hz
Hb-28 3,79; t; 11Hz 3,82; dd; 11; 4
Hz
3,83 và 3,89 (1H);
d; 11Hz
3,79; t; 11Hz
Ha-29 4,61; s 4,65; s 4,66; s 4,45; s
Hb-29 4,51; s 4,54; s 4,57; s 4,35; s
3H-30 1,61 (H-30); 1,64 (H-30); 1,65 (H-30); 1,44 (H-30);
2,35-2,44; m;
5H (H-19; 2H-
2’; 2H-4’)
2,36-2,52; m;
4H (2H-2’; 2H-
4’); 2,26-2,32;
m;H-19 và H-3’;
1,01 (d, 7Hz,
3H-6’).
2,35-2,44; m; 5H
(H-19; 2H-2’;
2H-4’)
2,18-2,26; m; 4H
(2H-3’; 2H-6’);
Hợp
phần
3TC
=CH-N 8,38; d, 7,5 Hz 8,39; d, 7,5 Hz 8,33-8,36; m 8,24; d, 7,5 Hz
=CH- 7,37; d, 7,5 Hz 7,41; d, 7,5 Hz 7,37-7,41; m 7,23; d, 7,5 Hz
H-1” 6,21-6,23; m 6,25-6,27; m 6,32-6,34; m 6,06-6,09; m
H-2”a
3,07-3,14; m;
2H
3,57; dd; 12,5;
5,0 Hz
3,60-3,64; m;
H-2”b 3,16; dd; 12,5;
3,0 Hz
3,20-3,24; m
H-4” 5,24-5,25; m 5,27-5,29; m 5,34-5,35; m 5,10-5,13; m
H-5”a 3,98-4,05; m 4,05; dd; 12,5;
3,0 Hz m
4,12; dd; 12,5; 3,0
Hz m
3,89-3,92; m
H-5”b 3,83-3,86; m 3,82; dd; 12,5;
4,0 Hz
3,95; dd; 12,5; 3,5
Hz
3,69-3,73; m
NH2 - -
C-4” 88,0 87,9 87,9 88,1 87,8
C-5” 62,9 62,2 62,3 62,9 62,0
C-1’(C=O) 172,8 173,6 172,9 175,7 174,0
C=O thứ 2 172,1 173,1 172,4 175,6 173,8
C-3 80,0 78,7 78,7 79,0 78,3
C-20 150,0 150,0 150,0 150,0 149,7
C-28 63,2 62,8 62,8 63,3 63,0
C-29 109,9 109,7 109,7 109,9 109,4
21
Kết quả cho thấy các tín hiệu cộng hưởng của hợp chất 127e đều dịch chuyển về phía
trường mạnh hơn so với của các hợp chất khác. Nhìn chung các tín hiệu cộng hưởng
của khung lupan và 3TC thay đổi không nhiều giữa các hợp chất trong dãy, sự khác
nhau đó cũng có thể do dung môi gây ra. Ở đây, hợp chất 127c và 127e được hòa tan
bằng CD3OD, các chất khác được hòa tan bằng clorofom CDCl3.
Như vậy, luận án đã nghiên cứu tổng hợp thành công 22 hợp chất lai mới từ
hai thành phần có hoạt tính là betulin và các thuốc chống HIV (AZT, d4T, 3TC). Cấu
trúc của các hợp chất mới đã được chứng minh bằng các phương pháp vật lí hiện đại
như phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (HRMS), phổ cộng hưởng từ proton (1H-
NMR), phổ cộng hưởng từ cacbon (13C-NMR), phổ cộng hưởng từ tương tác cacbon-
proton (HMBC và HSQC), phổ cộng hưởng từ tương tác proton-proton (NOESY).
Các hợp chất lai mới được nghiên cứu thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên hai
dòng tế bào ung thư là KB và Hep-G2.
Bảng 3. 16. Phân tích phổ HMBC và HSQC hợp phần 3TC và cầu nối hợp chất 127a [
Cacbon Tương tác chính C-H trên phổ HMBC HSQC
C δ (ppm) H_δ (ppm) δ (ppm)
C-1’ 172,8 Ha-28 (4,26, d, 11Hz); Hb-28 (3,88; d, 11Hz), H-2’
C-2’ 32,1 H-3’ (2,69-2,72, m) 2,81-2,84
C-3’ 28,7 H-2’(2,81-2,84, m) 2,69-2,72
C-4’ 172,1 H-3’ (2,69-2,72, m)
C-1” 88,1 Hb (8,35, s) 6,89-6,90; m
C-2” 38,9 3,61; dd, 5,0; 7,0 Hz
C-4” 88,0 H-5”b (4,12; dd; 3,5; 12,5Hz) 5,33-5,34; m
C-5” 62,9 3,95; 4,12
C=O pirimidin
162,6 Hb (8,35, d; 7,5 Hz)
C=N 155,0 Hb (8,35, d; 7,5 Hz)
=Ca 96,4 Hb (8,35, d; 7,5 Hz) 7,38, d; 7,5 Hz
=Cb 145,2 Ha (7,38, d; 7,5 Hz) 8,35, d; 7,5 Hz
3.5. Hoạt tính chống ung thư của các hợp chất lai Xuất phát từ mục đích tổng hợp các hợp chất lai từ hai thành phần có hoạt
tính sinh học nhằm tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính chống ung thư nên các
hợp chấtt lai mới tổng hợp được tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro đối
với hai dòng tế bào ung thư ở người là KB-CCL-17 (ung thư biểu mô) và HepG2-
HB-8065 (ung thư gan), cùng với phép thử hoạt tính của chất chuẩn Ellipticine và
các chất so sánh AZT, 3TC, d4T và các dẫn xuất axit 121a-f. Kết quả thử hoạt
tính của các hợp chất được trình bày trong bảng 3.17. Các dẫn xuất axit 121a-f có
hoạt tính gây độc tế bào rất thấp hoặc không thể hiện hoạt tính. Trong sáu dẫn
xuất, chỉ có hai hợp chất thể hiện hoạt tính với IC50 từ 61-138 M. Điều trùng lặp
là hai hợp chất này 121e và 121f đều có liên kết ở cầu nối. Hợp chất 121d thể
hiện hoạt tính gây độc đối với tế bào KB với IC50 = 64,6 M.
Kết quả thử hoạt tính của các sản phẩm lai đã chỉ ra phần lớn các hợp chất
lai thể hiện hoạt tính gây độc đối với hai dòng tế bào này ở những nồng độ khác
nhau. Trong đó một số hợp chất lai betulin-este-triazol-AZT 123a-f thể hiện hoạt
tính tốt với IC50 < 9 μM (với tế bào KB) và <15 μM (với tế bào HepG2) . Trong
22
khi các dẫn xuất axit ban đầu 121a-f thể hiện hoạt tính gây độc tế bào rất thấp,
giá trị IC50 trong khoảng từ 60 μM tới > 150 μM, điều này rất quan trọng khi so
sánh với hoạt tính gây độc mạnh của các hợp chất lai nhóm betulin-este-triazol-
AZT 123c-f. Đặc biệt hợp chất 123f có hoạt tính tốt nhất với IC50 < 1,5 μM đối
với cả hai dòng tế bào kể trên, giá trị này thấp hơn IC50 của chất chuẩn
Ellipticine trong phép thử đồng thời. Kết quả thử hoạt tính đã chứng minh sự kết
hợp hai thành phần AZT và betulin thành một hợp chất lai duy nhất qua cầu nối
este-triazol đã làm tăng mạnh hoạt tính chống ưng thư. Đây chính là mục tiêu
nghiên cứu của đề tài luận án. Tuy nhiên các hợp chất lai qua cầu nối amit-triazol
thể hiện hoạt tính thấp hơn rất nhiều so với các hợp chất lai có cầu nối este-
triazol. Đây là một kết quả khá thú vị và cần được lưu ý ở các nghiên cứu tiếp
theo.
Bảng 3. 17. Kết quả hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất lai
STT Hợp chất
Độc tính tế bào
(IC50, M) STT Hợp chất
Độc tính tế bào
(IC50, M)
KB HepG2 KB HepG2
Hoạt tính của các hợp chất lai
1 123a 8,97 34,65 12 126a 8,9 88,3
2 123b 4,32 15,40 13 126b 18,0 49,1
3 123c 1,38 8,16 14 126c 12,0 59,5
4 123d 2,45 7,45 15 126d 105 122
5 123e 3,44 6,94 16 126e 11,0 84,5
6 123f 0,38 1,32 17 126f 0,87 2,8
7 125a >150 >150 18 127a 12,4 23,2
8 125b >150 >150 19 127b 10,4 21,0
9 125c 83,59 >150 20 127c 14,6 21,1
10 125d 56,62 >150 21 127d 5,47 5,63
11 125e >150 >100 22 127e 9,8 90,0
Hoạt tính của các dẫn xuất axit 121a-f
1 121a >150 >150 4 121d 64.6 >150
2 121b >150 >150 5 121e 61 99
3 121c >150 >150 6 121f 135 138
Hoạt tính của các chất đối chứng
1 AZT 469 >400 3 d4T >500 >500
2 3TC >500 >500 4 Betulin >500 >500
5 Ellipticin 1,3 1,5
Các hợp chất lai với nhóm thuốc Stavudin và Lamivudin cầu nối là các liên
kết este thể hiện hoạt tính sinh học khá gần nhau và tương đối tốt. Độc tính của
23
các hợp chất đối với tế bào ung thư biểu mô KB thể hiện với IC50 < 18 μM và đối
với tế bào ung thư gan HepG2 là từ 2,8 μM đến 100 μM. Đặc biệt hợp chất có
hoạt tính tốt nhất là 126f (IC50: 0,87 μM (KB) và 2,8 μM (HepG2)). Đây là điều
trùng lặp đặc biệt vì trong cả bốn nhóm hợp chất lai mà luận án tổng hợp được,
các hợp chất thể hiện hoạt tính tốt nhất có đặc điểm chung là đi từ cùng một
nguyên liệu là hợp chất 121f.
Hình 3. 8. Hai hợp chất lai có hoạt tính tốt nhất
Trong phân tử các hợp chất này, nhóm cầu nối có một liên kết π C=C cấu hình
trans. Trong khi đó các hợp chất có nhóm cầu nối có liên kết π C=C cấu hình cis như
123e, 125e, 126e, 127e chỉ thể hiện hoạt tính sinh học gần như các hợp chất khác
trong dãy. Đây là một kết quả đáng được quan tâm trong những nghiên cứu tiếp theo
về các hợp chất lai tương tự.
24
KẾT LUẬN
1. Đi từ betulin, luận án đã tổng hợp thành công 39 hợp chất, trong đó có 22 hợp
chất lai mới chưa thấy trong các tài liệu tham khảo, bao gồm:
* 6 hợp chất lai của betulin và Zidovudin (AZT) qua cầu nối este-triazol 123a-f.
* 5 hợp chất lai của betulin và Zidovudin (AZT) qua cầu nối amit-triazol 125a-e.
* 6 hợp chất lai của betulin và Stavudin (d4T) qua cầu nối este 126a-f.
* 5 hợp chất lai của betulin và Lamivudin (3TC) qua cầu nối este 127a-e.
Để tổng hợp được 22 hợp chất lai, luận án đã tiến hành tổng hợp được 6 dẫn xuất
este giữa betulin và các anhydrit axit dicacboxylic khác nhau 121a-f. Từ các dẫn
xuất 121a-f chúng tôi đã tổng hợp được 11 hợp chất trung gian chứa nhóm chức
ankin 122a-f và 124a-e. Đây là các hợp chất mới chưa thấy mô tả trong các tài
liệu tham khảo.
2. Đã chứng minh được cấu trúc của 39 hợp chất tổng hợp được bằng các phương
pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-
NMR, 13C-NMR, HMBC, HSQC, NOESY) và phổ khối lượng phân giải cao
(HRMS).
3. Đã thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất lai mới 123a-f, 125a-e, 126a-f,
127a-e trên hai dòng tế bào ung thư ở người là tế bào KB (ung thư biểu mô) và tế
bào HepG2 (ung thư gan). Kết quả cho thấy nhiều hợp chất lai có hoạt tính rất tốt,
tốt hơn nhiều so với hoạt tính của các chất đầu như betulin, AZT, 3TC, d4T cũng
như các dẫn xuất đầu 121a-f; đặc biệt là hợp chất 123f (IC50 0,38 μM (KB), 1,32
μM (HepG2)) và 126f (IC50 0,87 μM (KB), 2,8 μM (HepG2)) với giá trị IC50 thấp
hơn chất chuẩn Ellipticine trong phép thử đồng thời.
25
CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN TỚI LUẬN ÁN
1. Synthesis and cytotoxic evaluation of novel ester derivatives of betulin with AZT,
d4T, and 3TC, Natural Product Communications, 2017, 12 (6), 885-888.
2. Synthesis and cytotoxic evaluation of betulin-triazole-AZT hybrids, Natural
Product Communications, 2017, 12 (10), 1567-1570.
3. Synthesis of ester of betulinic acid with conjugated fat acid, Proceedings of
scientific workshop on "Progress and trends in science and technology
commemorating 10 years of partnership beetween the Vietnam academy of science
and the Russian foundation for basic research, 2016, p 196-199.
4. Synthesis of betulin derivatives, Proceedings of scientific workshop on "Progress
and trends in science and technology commemorating 10 years of partnership
beetween the Vietnam academy of science and the Russian foundation for basic
research, 2016, p192-195.
