ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN I H M - Thai Nguyen University ...dhsptn.edu.vn/uploads/news/2017_12/nguyen-huy-hoang_toan-van-luan-an.pdf · trong các Tạp chí Khoa học; phần còn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN HUY HOÀNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN INTERLEUKIN 7

TÁI TỔ HỢP TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY THỰC VẬT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN HUY HOÀNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN INTERLEUKIN 7

TÁI TỔ HỢP TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY THỰC VẬT

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS. TS. Chu Hoàng Hà

2. PGS. TS. Lê Văn Sơn

THÁI NGUYÊN - 2017

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự

hướng dẫn của PGS. TS. Chu Hoàng Hà và PGS. TS. Lê Văn Sơn. Các số

liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần đã được công bố

trong các Tạp chí Khoa học; phần còn lại chưa từng được ai công bố trong bất

kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn, tham khảo đều ghi rõ nguồn gốc.

Thái Nguyên, ngày 25 tháng 11 năm 2017

TÁC GIẢ

Nguyễn Huy Hoàng

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu

sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà, PGS. TS. Lê Văn Sơn, là những người thầy

đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong

suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án này.

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới TS. Phạm Bích Ngọc, TS. La

Việt Hồng, ThS. Lê Thu Ngọc, ThS. Nguyễn Thu Giang cùng toàn thể các cô

chú, anh chị và các bạn Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng công nghệ

ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, là những người đã tận tình truyền đạt

nhiều kinh nghiệm quý báu và giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiệm tại

phòng.

Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS. Chu Hoàng Mậu, PGS. TS Nguyễn

Thị Tâm và các thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại

học Thái Nguyên đã giảng dạy, truyền đạt cho tôi những kiến thức mới và tạo

điều kiện để tôi có thể hoàn thành được khóa học này.

Tôi xin cảm ơn phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học

Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi về mặt quản lý trong suốt quá trình tôi

học tập tại Trường.

Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Y Dược, đồng nghiệp

của tôi tại Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học cơ bản và các phòng chức năng

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong công tác để tôi yên tâm học tập.

Cuối cùng tôi xin gửi tới gia đình, bạn bè, người thân lòng biết ơn sâu

sắc. Những người luôn luôn ở bên, ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi trong quá

trình học tập và nghiên cứu của mình

Thái Nguyên, ngày 25 tháng 11 năm 2017

TÁC GIẢ

Nguyễn Huy Hoàng

iii

MỤC LỤC

Lời cam đoan ...................................................................................................... i

Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii

Mục lục ............................................................................................................. iii

Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................... iv

Danh mục các bảng ........................................................................................... v

Danh mục các hình ........................................................................................... vi

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

1. Tính cấp thiết của luận án ............................................................................. 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2

3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2

4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của luận án ....................................................... 3

4.1. Ý nghĩa lý luận ........................................................................................... 3

4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 3

5. Đóng góp mới của luận án ............................................................................ 3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4

1.1. Vai trò của cytokine và interleukine 7 trong hệ miễn dịch ở người .......... 4

1.1.1. Cytokine .................................................................................................. 4

1.1.2. Interleukine 7 ........................................................................................ 11

1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các loại cytokine tái tổ hợp trong y học16

1.2.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới ................................... 16

1.2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước ..................................... 18

1.3. Một số hệ thống biểu hiện protein người tái tổ hợp ................................. 20

1.3.1. Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn ................................. 20

1.3.2. Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2) ........ 21

1.3.3. Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật ........................................................... 23

1.3.4. Cây chuyển gen biểu hiện cytokine tái tổ hợp ...................................... 25

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 30

2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 30

2.1.1. Vật liệu thực vật .................................................................................... 30

2.1.2. Các chủng vi khuẩn ............................................................................... 30

2.1.3. Các gen và vector .................................................................................. 31

2.1.4. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ................................................. 31

2.1.5. Hóa chất và thiết bị máy móc................................................................31

2.1.6 . Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................ 33

2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 33

2.2.1. Phương pháp thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện protein ở

thực vật ............................................................................................................ 35

2.2.2. Thiết kế mồi .......................................................................................... 36

2.2.3. Thiết kế vector chuyển gen mang gen hIL-7 tái tổ hợp ........................ 36

2.2.4. Phương pháp biểu hiện gen ở vi khuẩn, tạo dòng tế bào thuốc lá BY2,

rễ tơ thuốc lá .................................................................................................... 45

2.2.5. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen .............................. 49

2.2.6. Phân tích các dòng chuyển gen b ng k thuật sinh học phân tử .......... 50

2.2.7. Tinh sạch protein hIL-7 tái tổ hợp ........................................................ 52

2.2.8. Đánh giá hoạt tính protein hIL-7 tái tổ hợp .......................................... 52

2.2.9. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm ............................................... 54

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................ 55

3.1. Thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện ở thực vật .................. 55

3.2. Thiết kế vector chuyển gen hIL-7 tái tổ hợp vào vi khuẩn, dòng tế bào

BY2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá ................................................................. 59

3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen pET32c(+)/IL7.......................................... 59

3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7 ................................... 61

3.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7 ................................ 63

3.2.4. Thiết kế vector chuyển gen pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP .. 66

3.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp ............................................................ 71

3.3.1. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong vi khuẩn ................................ 71

3.3.2. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2 ................... 76

3.3.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng rễ tơ chuyển gen .......... 87

3.3.4. Biểu hiện protein hIL-7 trong cây thuốc lá b ng Agro-infiltration ...... 96

3.4. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp ...................... 105

Chƣơng 4. BÀN LUẬN ............................................................................... 107

4.1. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong E. coli rosetta-gami B............ 107

4.2. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY-2, rễ tơ ......... 109

4.3. Biểu hiện tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá .................... 112

4.4. Tăng cường biểu hiện protein ở thực vật với ELP và tinh sạch mITC .. 113

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................109

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN110

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 119

PHỤ LỤC ..................................................................................................... 145

iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Ký tự Tiếng Anh Tiếng Việt

AIDS Acquired immunodeficiency

syndrome

Hội chứng suy giảm miễn dịch

mắc phải ở người

A. tumefaciens Agrobacteria tumefaciens

A. rhizogenes Agrobacteria rhizogenes

AS Acetosyringone

bp Base pairs Cặp bazơ

BSA Bovine serum albumin Huyết thanh bò

BY2 Bright yellow 2

Cal Calreticulin

cDNA Complementary DNA ADN bổ sung

CTAB Cetyl trimethyl

ammonium bromide

Chất hoạt động bề mặt ammonium

bromide

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

dNTP Deoxyribo nucleotide triphosphate

DTT Dithiothreitol

E.Coli Escherichia coli

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit ethylenediaminetetraacetic

ELISA Enzyme-linked

immunosorbent assay

K thuật phát hiện kháng nguyên,

kháng thể trong mẫu xét nghiệm

ELP Elastin-like peptide

FDA Food & drug administration Cục quản lý thực phẩm và dược

phẩm Hoa Kỳ

FGF8b Fibroblast growthfactor 8

isoform b

Yếu tố tăng trưởng nguyên bào

sợi 8 isoform b

hIL-7 Human interleukin 7 Interleukin 7 của người

HEV Hepatitis E virus Virus viêm gan E ở người

HPV Human papilloma virus Virus gây u nhú ở người

HRP Horseradish peroxidase

IFN Interferon

IL Interleukin

IMAC Immobilized metal ion affinity

chromatography Sắc kí ion cố định kim loại

IPTG Isopropyl β-D-1-

thiogalactopyranoside

kb Kilo base

kDa Kilo danton đơn vị protein

LB Luria and Bertani Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy

vi khuẩn theo Luria và Bertani

MHC Major histocompatibility complex Phức hệ phù hợp tổ chức

mITC Membrane-based inverse transition

cycling Đảo ngược theo màng

mRNA ARN messenger ARN thông tin

MS Murashige and Skoog

Môi trường dinh dưỡng cơ bản

nuôi cấy mô thực vật theo

Murashige và Skoog

NK cell Natural killer cell tế bào miễn dịch tự nhiên

nptII Neomycin phosphotransferase

II gen

Gen kháng kháng sinh

kanamycine

OD Optical density Mật độ quang

PBS Phosphate buffer saline dung dịch muối đệm phosphate

PBST Phosphate buffer saline + tween 20

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase

PVDF Polyvinylidene difluoride Màng sử dụng trong western blot

Ri - plasmid Hairy root inducing plasmid Plasmid gây bệnh rễ tơ ở thực vật

RNAi RNA interference ARN can thiệp

RNase Ribonuclease phân giải ARN

Rpm Revolutions per minute Vòng/phút

scFv Single-chain variable fragment

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate

polyacrylamide gel electrophoresis

siRNA small interfering RNA

TAE Tris acetate EDTA

TCR T-cell receptor Thụ thể kháng nguyên tế bào T

T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA chuyển vào thực vật

TNF Tumor necrosis factor yếu tố hoại tử khối u

TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine

UV Ultraviolet Tia tử ngoại

vir Virulence region Vùng gây độc

v/v Volume/volume thể tích/thể tích

WPM Woody plant medium Môi trường nuôi cấy theo

Mccown

WT Wild type Chủng hoang dại

w/v weight/volume khối lượng/thể tích

YEB Yeast extract broth

YMB Yeast malnitol broth

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Phân nhóm IL ở người........................................................ 7

Bảng 1.2 Một số cytokine biểu hiện thành công ở tế bào BY2......... 21

Bảng 1.3 Một số cytokine tái tổ hợp biểu hiện ở thực vật ................ 25

Bảng 2.1 Thống kê các trình tự mồi sử dụng trong luận án............... 30

Bảng 2.2 Danh sách kháng sinh sử dụng trong luận án..................... 31

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng LR................................................... 40

Bảng 2.4 Thành phần gel SDS-PAGE............................................... 49

Bảng 3.1 Xử lý mẫu protein với DTT................................................ 71

Bảng 3.2 Kết quả tạo và chọn dòng tế bào BY2 mang gen hIL-7..... 74

Bảng 3.3 Nồng độ DNA tổng số của 20 dòng tế bào BY2................ 75

Bảng 3.4 Khối lượng tươi và khối lượng khô của một số dòng tế bào

BY2. 78

Bảng 3.5 Kết quả chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7 vào mô lá

thuốc lá trên môi trường chọn lọc...................................... 84

Bảng 3.6 Kết quả tạo dòng rễ tơ chuyển gen hIL-7.......................... 84

Bảng 3.7 Đánh giá khối lượng tươi và khối lượng khô các dòng rễ

tơ chuyển gen hIL-7............................................................ 87

Bảng 3.8 Đánh giá chiều dài một số dòng rễ tơ chuyển gen (cm)..... 89

Bảng 3.9 Hiệu suất thu hồi protein hIL-7 tái tổ hợp b ng phương

pháp mITC.......................................................................... 97

Bảng 3.10 Kết quả hoạt hoá dòng tế bào 2E8 b ng protein hIL-7....... 99

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc protein hIL-7....................................................................... 11

Hình 1.2 Thụ thể hIL-7.................................................................................... 12

Hình 1.3 Vai trò của hIL-7............................................................................... 15

Hình 1.4 Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana Bright Yellow 2).................... 22

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát............................................................... 33

Hình 2.2 Cấu trúc attL1_cal/SacI và HindIII/attL2 trong vector pENTR/cal... 38

Hình 3.1 Sự phân bố tỷ lệ % phù hợp của các nhóm mã bộ ba gen hIL-7 biểu

hiện trong hệ thống thực vật ............................................................ 54

Hình 3.2 Biểu đồ phân bố tần suất sử dụng codon theo chiều dài gen hIL-7

khi biểu hiện trong hệ thống thực vật............................................... 55

Hình 3.3 Trình tự gen hIL-7 trước và sau tối ưu mã di truyền.......................... 56

Hình 3.4 Cấu trúc vector pET32c(+)/IL7......................................................... 57

Hình 3.5 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen

pET32c(+)/IL7................................................................................... 58

Hình 3.6 Cấu trúc vector pENTR221/cal/IL7................................................... 59


pENTR221/cal/IL7............................................................................. 60

Hình 3.8 Kết quả colony PCR pK7WG2D.1/cal/IL7........................................ 62

Hình 3.9 Kết quả cắt pK7WG2D.1/cal/IL7 b ng enzyme SacI và HindIII...... 62

Hình 3.10 Cấu trúc vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.................. 63


pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP............................................ 65

Hình 3.12 Kết quả điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen

pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP........................................... 66

Hình 3.13 Kết quả kiểm tra vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

b ng enzyme NcoI.............................................................................. 67

Hình 3.14 Kết quả kiểm tra chủng biểu hiện pET32c(+)/IL7/Rosetta................ 69

Hình 3.15 Kết quả kiểm tra khả năng biểu hiện hIL-7 từ vi khuẩn E.coli

Rosetta gami B nuôi ở 37oC và 28

oC................................................. 70

Hình 3.16 Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7 pha tan b ng Western blot............ 72

Hình 3.17 Kết quả kiểm tra colony PCR pK7WG2D.1/IL7/Cv58..................... 73

Hình 3.18 Chọn lọc dòng tế bào BY2 sau chuyển gen....................................... 74

Hình 3.19 Kết quả PCR các dòng BY2 chuyển gen b ng IL7_F và IL7_R....... 76

Hình 3.20 Kết quả PCR các dòng BY2 chuyển gen b ng cặp mồi gen virC...... 77

Hình 3.21 Các dòng tế bào huyền phù BY2 sau 21 ngày nuôi cấy..................... 77

Hình 3.22 Đồ thị sinh trưởng của một số dòng tế bào huyền phù thuốc lá BY2

chuyển gen (theo khối lượng tươi)..................................................... 79

Hình 3.23 Đồ thị sinh trưởng của một số dòng tế bào huyền phù thuốc lá BY2

chuyển gen (theo khối lượng khô)..................................................... 80

Hình 3.24 Kiểm tra sự biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng tế

bào huyền phù BY2 b ng Western blot............................................. 82

Hình 3.25 Biểu đồ so sánh hàm lượng hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng BY2

chuyển gen......................................................................................... 83

Hình 3.26 Kết quả quá trình tạo và chọn dòng rễ tơ chuyển gen hIL-7……… 85

Hình 3.27 Kết quả PCR 5 dòng rễ tơ b ng cặp mồi IL7_F và IL7_R................ 85

Hình 3.28 Đồ thị sinh trưởng của các dòng rễ tơ (tính theo khối lượng tươi).... 88

Hình 3.29 Đồ thị sinh trưởng của các dòng rễ tơ (tính theo khối lượng khô)..... 88

Hình 3.30 Kết quả biểu hiện protein hIL-7 ở các dòng rễ tơ b ng Western blot 90

Hình 3.31 Biểu đồ so sánh hàm lượng protein hIL-7 trong 5 dòng rễ tơ chuyển

gen 90

Hình 3.32 Kết quả colony PCR b ng cặp mồi IL7_BamHI_F/IL7_BamHI_R...... 91

Hình 3.33 Kết quả cắt kiểm tra b ng enzyme giới hạn NcoI................................... 92

Hình 3.34 Trang thiết bị biến nạp pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào

cây thuốc lá................................................................................................ 93

Hình 3.35 Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7 trong lá thuốc lá b ng Western blot... 94

Hình 3.36 Kết quả tinh sạch và định lượng protein hIL-7 b ng phương pháp

IMAC 95

Hình 3.37 Kết quả tinh sạch protein hIL-7 b ng phương pháp mITC...................... 97

Hình 3.38 Kết quả định lượng protein hIL-7 tái tổ hợp b ng Western blot.............. 98

Hình 3.39 Khả năng hoạt hóa dòng tế bào 2E8 của protein hIL-7 tái tổ hợp............ 100

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của luận án

Interleukine là một nhóm các cytokine tiết và các phân tử tín hiệu được

tìm thấy đầu tiên trong các tế bào bạch cầu, đóng vai trò quan trọng trong hệ

thống miễn dịch. Chức năng của hệ thống miễn dịch ở người phụ thuộc chủ

yếu vào các Interleukine, thiếu hụt interleukin sẽ dẫn đến các bệnh tự miễn và

thiếu hụt miễn dịch.

Interleukine 7 (hIL-7) là một cytokine có vai trò chính trong sự tăng

trưởng của các dòng tế bào B và T [13]. Đây là những dòng tế bào có chức

năng quan trọng trong hệ miễn dịch của con người, cũng là đích tấn công của

các virus, mầm bệnh khi xâm nhập vào cơ thể con người.

Trong y học ngày nay, các protein có hoạt tính sinh học được sử dụng

rộng rãi để làm thuốc điều trị như các loại hormone, enzyme tái tổ hợp...

Trước đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là tách

chiết từ các bộ phận của động vật. Tuy nhiên, do nhu cầu ngày càng cao trong

khi nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt và dễ nhiễm các

mầm bệnh nguy hiểm cho con người, nên việc nghiên cứu tổng hợp protein tái

tổ hợp được đặt ra một cách cấp thiết.

Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong lĩnh vực

công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein không còn khó khăn như

trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học. Thực tế hiện nay phương pháp này

đã được áp dụng rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm

thuốc như insulin, hormone tăng trưởngv.v…. mà còn để tổng hợp rất nhiều

hợp chất khác trong khi nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp

hoá học gặp khó khăn.

Hiện nay, biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật đang được quan tâm

nghiên cứu vì những ưu điểm vượt trội so với các hệ thống biểu hiện khác

2

như chúng có thể sinh trưởng trên môi trường tương đối đơn giản, protein

được tiết ra môi trường nhiều hơn phần tích lu trong tế bào nên việc thu hồi

và tinh sạch dễ thực hiện, đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật an

toàn cho con người hơn so với các protein có nguồn gốc từ các hệ thống nuôi

cấy khác do các mầm bệnh và virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh

ở người.

Nh m mục đích nâng cao chất lượng điều trị bệnh theo hướng sử dụng

liệu pháp sinh học và góp phần hoàn thiện các phương pháp nghiên cứu sản

xuất các cytokine nói chung và hIL-7 nói riêng một cách tối ưu. Căn cứ vào

điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương pháp khả thi, chúng tôi

quyết định lựa chọn thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu biểu hiện protein

interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được hệ thống nuôi cấy thực vật biểu hiện tối ưu protein hIL-7

tái tổ hợp.

Thu nhận và tinh sạch được protein hIL-7 tái tổ hợp từ hệ thống nuôi

cấy thực vật.

3. Nội dung nghiên cứu

Đổi mã di truyền gen hIL-7 phù hợp biểu hiện ở hệ thống thực vật.

Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa hIL-7 tái tổ hợp phù

hợp với các hệ thống nuôi cấy thực vật.

Biểu hiện proteinhIL-7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật:

huyền phù, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen.

Phân tích, kiểm tra và đánh giá chất lượng hIL-7 tái tổ hợp thu được

qua hệ thống nuôi cấy thực vật.

3

4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của luận án

4.1. Ý nghĩa lý luận

Luận án cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu về biểu hiện, sản

xuất protein tái tổ hợp dùng trong y học ở thực vật thông qua biến đổi mã di

truyền và các hệ thống nuôi cấy thực vật.

Nội dung luận án có thể được sử dụng làm tài liệu giảng dạy, tham

khảo cho giảng viên và sinh viên các trường khối khoa học tự nhiên nói chung

và sinh học nói riêng.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Luận án cung cấp quy trình biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp ở các hệ

thống nuôi cấy dòng tế bào huyền phù BY2, rễ tơ, cây thuốc lá chuyển gen

trong quy mô phòng thí nghiệm, phục vụ cho mục đích nuôi cấy thu sinh khối

tế bào.

Bước đầu đánh giá được hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp

thu được sau khi tinh sạch ở các hệ thống nuôi cấy, là tiền đề cho các nghiên

cứu sâu hơn.

5. Đóng góp mới của luận án

Luận án đã thiết kế thành công 3 cấu trúc vector biểu hiện protein hIL-

7 ở tế bào thuốc lá BY2, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen.

Đã biểu hiện thành công protein hIL-7 tái tổ hợp trong: dòng tế bào

BY2, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen. Trong đó, protein biểu hiện cao nhất ở

cây thuốc lá chuyển gen 5 ngày tuổi với hàm lượng 36,7 ng/µg protein tan

tổng số, có hoạt tính sinh học cao.

Đây là công trình nghiên cứu mới ở Việt Nam và trên thế giới về biểu

hiện protein hIL-7 trong hệ thống nuôi cấy thực vật.

4

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. VAI TRÕ CỦA CYTOKINE VÀ INTERLEUKINE 7 TRONG HỆ

MIỄN DỊCH Ở NGƢỜI

1.1.1. Cytokine

1.1.1.1. Vai trò trong hệ miễn dịch người

Cytokine là các polypeptide được sản xuất khi có kích thích của vi sinh

vật hay các kháng nguyên khác nh m điều hòa các phản ứng miễn dịch và

viêm của cơ thể. Những phân tử này điều hòa các hoạt động chức năng của

từng tế bào riêng biệt và của cả tổ chức trong trường hợp sinh lý và bệnh lý.

Các protein này cũng làm trung gian điều hòa trực tiếp sự tương tác giữa các

tế bào và kiểm soát các quá trình xảy ra trong khoang ngoại bào. Cytokine

hoạt động như những yếu tố giúp tế bào sống sót b ng cách ngăn hiện tượng

apoptosis xảy ra.

Cytokine gồm một số nhóm có mối liên hệ mật thiết, tác động qua lại

với nhau trong hệ thống miễn dịch của người để thực hiện chức năng của

chúng.Thuộc các cytokine này có chemokine, họ yếu tố hoại tử khối u (TNF),

họ các interferon và họ interleukin. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, cytokine

tham gia vào nhiều quá trình sinh học trong cơ thể như tạo phôi, sinh sản, tạo

máu, đáp ứng miễn dịch, viêm; chúng có vai trò khá quan trọng trong các

bệnh lý như: bệnh tự miễn, nhiễm trùng huyết, ung thư,viêm gan siêu vi,

nhiễm HIV v.v… Ngoài ra, cytokine còn được dùng làm các tác nhân trị liệu

(yếu tố tạo khóm tế bào hạt sử dụng trong huyết học) hay các đích điều trị

(như các loại TNF trong bệnh Crohn, viêm đa khớp dạng thấp v.v…) [64],

[164].

1.1.1.2. Cơ chế hoạt động

a. Chemokine

5

Chemokine là những cytokine được sản xuất trong giai đoạn sớm nhất

của nhiễm trùng. Chúng phát huy tác dụng hóa ứng động đến các tế bào có

khả năng đáp ứng gần đó. Cơ chế hoạt động của chemokine thể hiện ở khả

năng tập trung các loại tế bào bạch cầu của cơ thể chủ đến vị trí nhiễm trùng.

Chemokine hiện diện trên tế bào nội mô tác động lên các bạch cầu đi qua làm

cho các integrin bạch cầu tăng ái lực kết gắn với ligand của chúng. Điều này

rất quan trọng để giữ bạch cầu lại nội mô của mao mạch vùng tổn thương.

Ngoài ra, chemokin còn kích thích sự di chuyển của bạch cầu đến nơi có tổn

thương trên cơ sở sự chênh lệch nồng độ của chemokin tại nơi tổn thương và

các nơi khác. Các chemokin khác nhau kích thích các tế bào khác nhau nhờ

thế mà kiểm soát được thành phần của các tế bào tại ổ viêm. Chemokin điều

hòa sự lưu thông của tế bào lympho và các bạch cầu khác trong các mô

lympho ngoại biên. Các chemokin có khả năng thúc đẩy các tế bào đã được

hoạt hóa và tế bào T di chuyển đến các mô không phải thuộc hệ lympho bao

gồm cả da và niêm mạc [64], [152].

b. Họ các yếu tố hoại tử khối u (TNF)

TNF có khả năng kích thích tập trung tế bào trung tính và tế bào mono

đến nơi nhiễm trùng và hoạt hoá những tế bào này để tiêu diệt vi khuẩn.

Ngoài ra, TNF còn có khả năng kích thích tế bào nội mô và đại thực bào tiết

ra chemokine nh m tăng cường ái lực của integrin bạch cầu đối với ligand của

chúng, tạo nên sự tập trung bạch cầu; đặc biệt chúng còn kích thích thực bào

đơn nhân tiết interleukine 1 - là chất có tác dụng rất giống với TNF [82].

TNF tác động lên tế bào gan làm tăng tổng hợp protein huyết thanh,

dưới tác động của TNF, interleukine 1 và interleukine 6 tạo nên đáp ứng pha

cấp của phản ứng viêm. Với nồng độ thấp, TNF tác động lên bạch cầu và nội

mô để khởi động phản ứng viêm.Ở nồng độ trung bình, TNF làm trung gian

cho các tác động toàn thân của phản ứng viêm.Đặc biệt, với nồng độ cao TNF

6

có thể gây ra các bất thường bệnh lý của sốc nhiễm trùng có thể gây tử vong

[154], [158].

c. Họ interferon (IFN)

IFN là những protein kháng virus được tế bào sản xuất khi bị nhiễm

virus gây bệnh nào đó. Chúng có khả năng bảo vệ cơ thể chống lại nhiễm

trùng virus và thúc đẩy đáp ứng miễn dịch tế bào chống lại các vi sinh vật nội

bào. IFN ức chế sự nhân lên của virus b ng cách kích thích tế bào sản xuất ra

nhiều loại enzyme như 2’,5’-oligoadenylate synthetase ngăn cản sự sao chép

của virus DNA hoặc RNA và sự nhân lên của chúng[106].

IFN có tác dụng làm bộc lộ phân tử MHC lớp I. Tế bào T CD8+ có khả

năng nhận diện kháng nguyên lạ liên kết với MHC lớp I, qua đó tế bào gây

độc nhận ra tế bào chứa virus và tiêu diệt chúng. Ngoài ra, IFN còn có khả

năng kích thích sự phát triển của tế bào Th1 trong hệ miễn dịch của người,

giúp gia tăng hoạt tính ly giải tế bào của tế bào NK [64], [142].

d. Họ Interleukine

Interleukine (IL) là một trong các nhóm chính của cytokine, đóng vai

trò quan trọng nhất trong hệ miễn dịch của con người. Chúng có chức năng

điều hoà miễn dịch, bao gồm cả phát triển tế bào, sự trưởng thành, di chuyển

và bám dính. Ngoài ra, chúng còn có khả năng kích hoạt các phản ứng miễn

dịch của cơ thể [25], [82].

Interleukine được chia thành nhiều loại khác nhau từ IL-1 đến IL-36

dựa vào đặc điểm cấu trúc của chúng. Ví dụ, IL-1 được phân biệt với các IL

khác bởi sự gấp nếp nhiều hơn ở chuỗi [158]. Ngoài ra, chúng còn được xếp

vào các nhóm khác nhau gọi là cytokine nhóm I và cytokine nhóm II. IL-10

và IL-28 được xếp vào cytokine nhóm II vì có cấu trúc phân tử gần giống

7

nhau, đều có sáu hoặc bảy xoắn xếp song song nhau [39], [76], [170]. IL-28

cũng có cấu trúc intron-exon tương tự IL-10 [135].

Bảng 1.1. Phân nhóm IL ở người[9], [19], [26], [34], [60], [63], [83], [84],

[156]

IL Nguồn gốc Thụ thể Vai trò

IL-1 Tế bào B,

monocytes

CD121a/IL1R1

CD121b/IL1R2

Kích thích tế bào T hỗ trợ; bảo

vệ và kích hoạt tế bào B, tế

bào NK.

IL-2 Tế bào Th1

CD25/IL2RA,

CD122/IL2RB,

CD132/IL2RG

Tham gia kích hoạt tế bào B,

T và NK.

IL-3

Tế bào T hỗ

trợ, tế bào

mast, NK

CD123/IL3RA,

CD131/IL3RB

Hỗ trợ tế bào mast tổng hợp

histamin

IL-4 Tế bào Th2,

đại thực bào

CD124/IL4R,

CD132/IL2RG

Tham gia kích hoạt tế bào B,

hỗ trợ tăng sinh tế bào T

IL-5 Tế bào Th2, tế

bào mast

CD125/IL5RA,

CD131/IL3RB

Tham gia sản xuất eosinophils

và IgA.

IL-6

Tế bào Th2, tế

bào B, tế bào

hình sao, nội

mạc

CD126/IL6RA,

CD130/IL6RB

Gây phản ứng cấp tính, viêm ở

tế bào T

IL-7 Các tế bào mô

đệm ở tuỷ

CD127/IL7RA,

CD132/IL2RG

Hỗ trợ và bảo vệ các tế bào B,

T và NK; cân b ng nội môi,

8

xương và tuyến

ức

cytokine tiền viêm.

IL-8

Tế bào lympho,

biểu mô, nội

mô, đại thực

bào

CXCR1/IL8R,

CXCR2/IL8RB

/CD128

Tác động hướng hoá lên bạch

cầu trung tính, tế bào lympho.

IL-9 Tế bào Th2 CD129/IL9R Kích thích tế bào mast.

IL-10

Tế bào Th2,

monocytes,

CD8+ T

CD210/IL10R

A, CDW210B/

IL10RB

Kích hoạt tế bào lympho B, ức

chế tế bào Th1 sản xuất các

yếu tố IFN-γ, TNF-β, IL-2

IL-11 Tuỷ xương IL11RA Sản xuất protein pha cấp, kích

thích tạo máu

IL-12

Tế bào đuôi

gai, tế bào

lympho B, T,

đại thực bào

CD212/IL12R

B1IL12RB2

Tham gia kích hoạt tế bào T,

kích thích tế bào NK sinh

IFN-γ, TNF-α

IL-13

Tế bào NK, tế

bào mast, tế

bào Th2 đang

hoạt động

IL13R

Kích thích sự tăng trưởng và

biệt hoá của tế bào B (IgE), ức

chế tế bào Th1 và sản xuất các

cytokine gây viêm đại thực

bào (IL-1, IL-6) và giảm IL-8,

IL-10, IL-12.

IL-14

Tế bào T và

một số tế bào B

ác tính

-

Kiểm soát sự tăng trưởng và

phát triển của các tế bào B, ức

chế tiết Ig

IL-15 Thực bào đơn

nhân, các đại IL15RA

Kích thích sản xuất các tế bào

miễn dịch tự nhiên (tế bào

9

thực bào sau

nhiễm trùng

bởi virus

NK), tế bào T CD8+.

IL-16

Tế bào lympho,

biểu mô, bạch

cầu ái toan, tế

bào CD8+ T

CD4 Thu hút CD4+

IL-17 Tế bào Th17 CDw217/IL7R

AIL7RB

Tăng nồng độ các cytokine

trong phản ứng viêm.

IL-18 Đại thực bào CDw218a/IL18

R1

Kích thích sản xuất yếu tố

IFN, tăng hoạt động của tế

bào NK.

IL-19 - IL20R -

IL-20 Bạch cầu đơn

nhân IL20R

Điều khiển sự tăng sinh và

biệt hoá của tế bào sừng.

IL-21

Tế bào NKT và

tế bào T hỗ trợ

đang hoạt động

IL21R

Tham gia hoạt hoá CD8+ T,

tăng cường NK độc tế bào,

thúc đẩy sự phân hoá của các

tế bào Th17.

IL-22 Tế bào hỗ trợ

Th17 IL22R

Sản xuất defensins từ các tế

bào biểu mô. Hoạt hoá STAT1

và STAT3, làm tăng protein

pha cấp như amyloid huyết

thanh A và haptoglobin trong

tế bào gan.

IL-23 Đại thực bào, IL23R Bảo vệ các tế bào sản xuất IL-

10

tế bào đuôi gai 17, làm giảm xâm nhập CD8

T.

IL-24 Tế bào T, bạch

cầu đơn nhân IL20R

Tham gia ức chế khối u, làm

lành vết thương và bệnh vẩy

nến, biểu hiện cytokine viêm.

IL-25

Tế bào T, bạch

cầu ái toan, đại

thực bào

LY6E Kích thích sản xuất IL-4, IL-5,

IL-13.

IL-26 Tế bào T, tế

bào mono IL20R1

Tăng tiết IL-10 và IL-8; biểu

hiện CD54 trên tế bào biểu

mô.

IL-27 Đại thực bào,

tế bào đuôi gai IL27RA

Điều hoà hoạt động của tế bào

lympho B và T.

IL-28 - IL28R Có vai trò trong miễn dịch

chống lại virus.

IL-29 - - Có vai trò trong miễn dịch

chống lại vi khuẩn.

IL-30 - - Là một chuỗi của IL-27

IL-31 Tế bào Th2 IL31RA Có thể đóng vai trò trong viêm

da.

IL-32 - -

Kích thích bạch cầu đơn nhân

và đại thực bào tiết TNF-,

IL-8 và CXCL2.

IL-33 - - Hỗ trợ các tế bào lympho T

sản xuất cytokine typ 2.

IL-35 Tế bào T - Ức chế hoạt hoá tế bào T hỗ

11

trợ.

IL-36 - - Điều chỉnh phản ứng tế bào

đuôi gai và tế bào lympho T.

1.1.2. Interleukine 7

1.1.2.1. Cấu trúc gen hIL-7

hIL-7gồm một chuỗi glycoprotein xoắn 4α, có khối lượng phân tử 17,4

kDa và được ổn định b ng gốc N - glycosyl hóa hoặc O - glycosyl hóa và cầu

nối disulfide nội phân tử[169]. Ở người, genhIL-7 có kích thước 33Kb, gồm

có 6 exon và 5 intron n m trên nhiễm sắc thể số 8, ở vị trí 8q21.13. Cấu trúc

phân tử của hIL-7 được giữ vững ngay cả khi nồng độ pH có sự biến động

mạnh (2,1 - 8,0) [33]. Tuy nhiên, hIL-7 sẽ mất hoạt tính sinh học khi bổ sung

2-mercaptoethanol, điều này cho thấy tầm quan trọng của các liên kết cầu nối

disulfide có trong cấu trúc phân tử hIL-7 [14].

Hình 1.1.Cấu trúc proteinhIL-7[65]

hIL-7 cấu tạo gồm một chuỗi glycoprotein xoắn 4α, liên kết với nhau

bằng gốc N-glycosyl hóa hoặc O-glycosyl hóa và các cầu nối disulfide

hIL-7 lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1988 bởi công ty Immunex

[102] và cDNA được nhân bản đầu tiên vào năm 1989[103].hIL-7 có vai trò

12

quan trọng trong hệ bạch huyết do có khả năng thúc đẩy sản sinh các tế bào

bạch cầu lympho ở chuột bị nhiễm bệnh [97], [98].

hIL-7 chủ yếu được sản xuất bởi tuyến ức [102], [163]. Ngoài ra, các tế

bào khác như các tế bào tủy [47], nội mạc ruột [162]và tế bào sừng trên da

[57] cũng có thể sản xuất hIL-7. Gần đây, các nghiên cứu đã chỉ ra r ng hIL-7

còn được sản xuất bởi các tế bào nguyên bào sợi lưới (FRC) trong vùng tế bào

T của hạch bạch huyết [84].

1.1.2.2. Thụ thể của hIL-7

hIL-7 có hai thụ thểlà IL-7Rα và thụ thể γc. Trong đó, thụ thể IL-7R

(CD127) cũng là thụ thể của các lymphoprotein mô đệm tuyến ức

(TSLP)[175] và chuỗi (CD132) là thụ thể của IL-2, IL-4, IL-9, IL-15 và IL-

21 [29], điều này cho thấy mối quan hệ chặt chẽ giữa các cytokine trong hệ

miễn dịch người [41]. Trong khi thụ thể c thường thấy ở các tế bào tạo máu

thì IL-7R lại thấy ở trên bề mặt các tế bào bạch huyết. Gen mã hóa cho

protein thụ thể hIL-7 n m ở vị trí 5p13 trên nhiễm sắc thể số 5, gần với vị trí

của thụ thể hormone tăng trưởng prolactin và một gen ức chế ung thư tế bào

bạch cầu có đặc điểm tín hiệu tương tự như thụ thểhIL-7[57].

Khối lượng phân tử của protein thụ thể hIL-7 là 80kDa. Chuỗi γc là

thành phần chức năng và có vai trò góp phần làm tăng liên kết giữa hIL-7 và

thụ thể hIL-7. Protein IL-7Rα tồn tại ở hai dạng: dạng liên kết với màng và

dạng hòa tan. Các đồng vị màng (p64) cũng được liên kết với IL-2Rγc [57].

13

Hình 1.2. Thụ thể hIL-7[151]

hIL-7 có chung chuỗiγc với IL-2, IL-4, IL-9, IL-15, IL-21

và chung chuỗi IL-7Rα với TSLP

1.1.2.3. Cơ chế tác động

Janus kinase-3 (Jak3) gắn chọn lọc với các chuỗi c [146] trong khi

Jak1 gắn với IL-7R[125]. Sự đột biến ở chuỗi c [24], [37], [111] hoặc Jak3

[16], [109], [117] gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải trầm trọng

AIDS ở người, đặc trưng bởi sự thiếu hụt lympho T và NK[110]. Khi hIL-7

gắn với IL-7R mang theo chuỗi c liên kết với Jak1 và Jak3, sẽ làm hoạt hoá

kinase và phosphoryl hoá các vị trí Y449 quan trọng trên IL-7R[62]. Sau đó,

các thụ thể trở thành điểm bám cho protein Stat5 qua sự tương tác SH2-

phosphothyrosine để thực hiện các chức năng.Các tiểu đơn vị p85 của

PI3Kinase liên kết trực tiếp với Y449 phosphoryl hoá thông qua vùng SH2.

Các PI3K được đưa qua màng tế bào và hoạt hoá các genPDK1 và Akt

[137].Akt sau đó sẽ phosphoryl hoá gen điều tiết chuyển hoá tế bào, sự tiến

triển của chu kì tế bào như GSK3, P27. hIL-7 điều khiển quá trình này b ng

việc phosphoryl hoá GSK3, làm ngăn cản quá trình phosphoryl hoá các phân

14

tử tín hiệu của tế bào -catein, cản trở sự suy thoái và kết hợp với các yếu tố

phiên mã khác như TCF/LEF-1, giúp một số gen được biểu hiện [101].

hIL-7 có tính đặc hiệu cao với thụ thể hIL-7. Sweeney và cộng sự đã

chứng minh yếu tố DAB389gây độc tế bào chỉ hoạt động với tế bào có mặt

thụ thể hIL-7, điều này rất có ý nghĩa trong vấn đề trị liệu nh m chống lại các

khối u ác tính mang thụ thể hIL-7. Sự biểu hiện của thụ thể hIL-7 cũng có thể

được coi là mục tiêu điều trịcác khối u ác tính[147].

Tuy nhiên, hIL-7 cũng được chứng minh có khả năng tạo ra các tín hiệu

khác khi truyền thông tin trong các tế bào không có sự xuất hiện của IL-7R

bởi khả năng đặc hiệu với các thụ thể bề mặt khác như Flt-3 và c-kit [47].

1.1.2.4. Hoạt tính sinh học của hIL-7

hIL-7 có chức năng chủ yếu là hỗ trợ cho sự tăng trưởng và chống lại

các yếu tố phá hủy các tế bào lympho B và lympho T[104] và kích thích tế bào

lympho B và lympho T phát triển[14], [33].hIL-7 giúp tăng cường sự phát

triển của tế bào thực bào tự nhiên và thúc đẩy sự sinh trưởng và biệt hoá của

các dòng tế bào lympho T [119], [124], [138], đồng thời tăng cường hệ

thống,kích thích sự hoạt động của bạch cầu đơn nhân máu ngoại vi [14]. hIL-7

có thể tăng tốc độ sản sinh bạch huyết trong trạng thái giảm bạch cầu lympho

như ở những bệnh nhân AIDS [47], [111] hoặc sau khi hóa trị liều cao hoặc xạ

trị [57], [101].

Apoptosis là một quá trình phức tạp của các hoạt động thông qua các

yếu tố trung gian hoặc mất yếu tố tăng trưởng cytokine cần thiết hoặc do sự

tham gia của một thụ thể chết với TNF làm tế bào tự chết theo một chu trình.

Theo nhiều nghiên cứu, hIL-7 có khả năng ngăn chặn hoặc làm chậm lại quá

trình apotosis. Morrissey (1991) đã chỉ ra r ng tế bào lympho T đáp ứng với

phorbal myristate acetate trong thụ thể của hIL-7 thay vì trải qua quá trình

apoptosis. Khi loại bỏ p53 ở gen ức chế khối u trong Rag-1-/- ở chuột, quá

15

trình apoptosis của tế bào bị chặn lại, tế bào lympho T sẽ sống sót lâu hơn

[97]. Do đó, nhiều khả năng đây là một chức năng quan trọng của hIL-7 để

ngăn chặn tế bào gốc từ tuyến ức trải qua quá trình apoptosis. Cytokine sử

dụng chuỗi γc trong các thụ thể của chúng, chẳng hạn như IL-2, IL-4, IL-9

và IL-15 để có thể tồn tại trong điều kiện nhất định. hIL-7 có thể duy trì khả

năng tồn tại của tế bào b ng cách ngăn cản yếu tố “gây chết” hoặc kích hoạt

yếu tố “thúc đẩy sự sống” [98].

Mặt khác, hIL-7 có thể hoạt hóa các tế bào T chống lại quá trình

apoptosis b ng cách nâng cao mức độ hoạt động của các protein chống

apoptosis như Bcl-2 và Bcl-XL [14], [41]. Ngoài ra, hIL-7 ngăn chặn tế

bào chết b ng cách ức chế một số protein pro-apoptosis như Bid, Bad

hoặc Bax [57], [68],[114] và có thể hoạt động như một đồng yếu tố với

gen V, D, J tái tổ hợp để thực hiện các phản ứng của các chuỗi TCR trong

sự hiện diện của hIL-7 tái tổ hợp [162].Đặc biệt, hIL-7 cũng đóng góp vào

quá trình cân b ng nội môi của tế bào T CD8+ ở các tế bào lymphopenic

và có thể thay thế cho sự thiếu hụt của IL-15 [133]; làm tăng khả năng

sinh kháng thể chống ung thư [120].

1.1.2.5. Vai trò của hIL-7

Hiện nay, hIL-7 được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong điều trị bệnh

như bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính [65], [130], bệnh cúm A [10], một

số bệnh tự miễn [27]; được sử dụng là yếu tố chỉ thị một số bệnh như viêm

đường mật cấp tính [145], ung thư đại trực tràng (CRC) [78], bệnh viêm gan

B[173] v.v… đã thu được nhiều kết quả khả quan.

16

Hình 1.3. Vai trò của hIL-7[151]

hIL-7 có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch type I, hoạt hóa tế bào

LAK, ngăn cản hiện tượng apoptosis, thúc đẩy sự tăng trưởng của tế bào

lympho T CD4+ và CD8

+, giảm sản xuất TGF β trong điều trị các khối u.

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨUVÀ ỨNG DỤNG CÁC LOẠI

CYTOKINE TÁI TỔ HỢP TRONG Y HỌC

1.2.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới

Cytokine đầu tiên được phát hiện là interferon vào năm 1957, là một

cytokine có hoạt tính chống virus. Trong những thập niên vừa qua, các nghiên

cứu và hiểu biết về vai trò sinh lý cũng như sinh lý bệnh của cytokine đã đạt

được những thành tựu đáng kể. Cytokine tham gia vào rất nhiều quá trình sinh

học trong cơ thể như tạo phôi, sinh sản, tạo máu, đáp ứng miễn dịch, viêm.

17

Ngoài ra, các phân tử này cũng đóng vai trò quan trọng trong các bệnh lý như:

bệnh tự miễn, nhiễm trùng huyết, ung thư, các bệnh lý viêm mạn tính (viêm

đại tràng mạn, bệnh Crohn, viêm đa khớp dạng thấp, bệnh vảy nến...), viêm

gan siêu vi, nhiễm HIV v.v...Các cytokine cũng được sử dụng là các tác nhân

trị liệu (yếu tố tạo khóm tế bào hạt được sử dụng trong huyết học) hay là các

đích điều trị (như TNF trong bệnh Crohn, viêm đa khớp dạng thấp v.v...).

Vì vậy hiện nay, việc nghiên cứu và sử dụng các loại cytokine tái tổ

hợp đang mở ra một hướng điều trị tích cực mới trong y học. Hàng loạt các

cytokine khác nhau đã được nghiên cứu, sản xuất và thử nghiệm trong điều trị

lâm sàng nhưhIL-2, hIL-7, IFN-, G-CSF, GM-CSF, hIL-11 và EPO [79],

[92]. Ngoài ra, còn có một số loại cytokine khác đã được sử dụng nhưng còn

hạn chế do chưa kiểm soát được khả năng thải loại cũng như các hiệu ứng phụ

khác như TNF-, hIL-12 v.v…

Các loại cytokine có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch đặc

hiệu và không đặc hiệu, do đó các hướng nghiên cứu hiện nay tập trung vào

tác dụng điều trị của cytokine như là một tác nhân dược lý hoặc đích tác động

theo bốn hướng chính.

Dùng các chất đối vận với các cytokine được xem là có vai trò gây

bệnh. Sử dụng các kháng thể kháng cytokine như kháng thể kháng TNF

trong điều trị nhiễm trùng huyết hoặc ức chế hIL-6 trong viêm đa khớp dạng

thấp v.v…

Dùng các cytokine để kích thích các hoạt động sinh lý của cơ thể:

erythropoietin trong điều trị thiếu máu, các yếu tố kích thích tạo khóm trong

điều trị giảm bạch cầu v.v…

Sử dụng cytokine trong liệu pháp điều hoà miễn dịch, tự miễn dịch.

hIL-6, hIL-7 được xác định như một yếu tố biệt hóa tế bào B, đóng một vai

trò quan trọng trong sự phát triển của các tế bào B huyết tương sản xuất kháng

18

thể. hIL-6 kích hoạt tế bào B qua hoạt tính của chúng trên các nguyên bào

huyết tương và gần đây đã cho thấy gián tiếp kích hoạt tế bào B sản xuất

kháng thể b ng cách hoạt hóa các tế bào T CD4 có đặc tính hỗ trợ tế bào B

thông qua sự sản xuất IL-21 v.v… Dùng cytokine trong điều trị nhiễm virus

viêm gan b ng interferon, hIL-12 [48], [70], điều trị ung thư b ng hIL-2 v.v…

Một số thành tựu trong nghiên cứu và ứng dụng cytokine trong điều trị

bệnh nhưhIL- 11 và hIL-3 được sử dụng để điều trị bệnh thrombocytopenia

do chúng có khả năng kích thích sự tạo thành tiểu cầu [132]. hIL-2 được sử

dụng để điều trị một số bệnh ung thư như ung thư biểu mô, ung thư mạch

bạch huyết, đặc biệt là ung thư thận và da; hIL-7 được ứng dụng giúp hồi

phục mạch bạch huyết sau khi phẫu thuật, sử dụng trong các bệnh suy giảm

hệ miễn dịch như HIV/AIDS do có khả năng bảo vệ và thúc đẩy sản sinh các

tế bào bạch cầu lympho T CD4+ và T CD8

+. hIL-12 được sử dụng để làm tá

chất cho sản xuất vaccine [12], [15].

Interferon là một nhóm trong số các nhóm chính của cytokine cũng có

nhiều nghiên cứu và ứng dụng trong y học. Từ năm 1991, FDA đã đồng ý cho

sử dụng một số loại IFN để chữa một số bệnh do virus như HBV, HCV.

Những sản phẩm này gồm có interferon 2b (Intron A), interferon 2b (Roferon,

infergen) và peginterferon (PEG-IFN). Đặc biệt, IFN có thể được đưa vào cơ

thể b ng đường miệng với một liều lượng thấp hơn nhưng cho hiệu quả cao

hơn đường tiêm [18].

1.2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước

Trong bối cảnh hiện nay, Bộ Y tế rất khuyến khích việc nghiên cứu tự

sản xuất thuốc trong nước với giá thành rẻ và chất lượng tốt để chữa bệnh.

Cùng với những ưu điểm của các loại cytokine nói chung cũng như IL nói

riêng, ở Việt Nam đã và đang có một số công trình nghiên cứu, chuyển giao

19

công nghệ về việc sản xuất và ứng dụng các loại cytokine trong điều trị bệnh

cho con người.

Trong đó, nổi bật nhất là công trình nghiên cứu và sản xuất interleukin-

2 ứng dụng trong điều trị bệnh ung thư năm 2010 do PGS. TS. Trương Nam

Hải, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam thực hiện đã thu được protein hIL-2 tái tổ hợp có độ tinh sạch 95% và có

hoạt tính tốt, đang được triển khai sản xuất ở quy mô công nghiệp [2]. Điều

này mở ra triển vọng rất lớn đối với bệnh nhân ung thư, khi theo đánh giá của

tổ chức y tế thế giới WHO thì Việt Nam hiện đứng trong 50 nước top 2 của

bản đồ ung thư thế giới khi mỗi ngày có khoảng 315 người chết vì ung thư

[166].

Ngoài ra, trung tâm Công nghệ sinh học TP. HCM đang tiến hành các

nghiên cứu về cytokine hIL-33, thuộc họ cytokine tiền viêm hIL-1 (IL-1β, IL-

1α, IL-1Ra, hIL-18, hIL-33) được phát hiện vào năm 2005. Cytokine hIL-33

giữ vai trò kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thích ứng của

cơ thể chống lại tác nhân xâm nhiễm. Ức chế hoạt động của hIL-33 có thể là

liệu pháp tiềm năng cho việc điều trị các bệnh tự miễn như thấp khớp, hen

suyễn, dị ứng quá mẫn v.v…, hIL-33 là một cytokine ít được nghiên cứu trên

thế giới nhưng Việt Nam đã thành công trong việc thử nghiệm ứng dụng điều

trị hen suyễn ở chuột. Hiện nhóm nghiên cứu của trung tâm Công nghệ sinh

học TP. HCM đang hướng đến mục tiêu tạo ra thuốc trị bệnh tự miễn như các

loại thuốc ngoại nhập đang có mặt trên thị trường, từng bước tiến đến tự sản

xuất thuốc phục vụ cho nhu cầu trong nước [3].

20

1.3. MỘT SỐ HỆ THỐNG BIỂU HIỆN PROTEIN NGƢỜI TÁI TỔ

HỢP

1.3.1. Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn

Những năm gần đây, cùng với sự bùng nổ của ngành công nghệ sinh

học với nhiều nghiên cứu, ứng dụng trong cuộc sống, ngành công nghệ sinh

phẩm với các chế phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật ứng dụng trong y học

ngày càng được quan tâm chú trọng. Số lượng protein tái tổ hợp, trong đó có

các loại cytokine được tạo ra cho mục đích chữa bệnh cho con người ngày

càng tăng.

Vi khuẩn E. colilà vi khuẩn gram âm, có kích thước khoảng 1,0 x 6,0

µm có nhiều ưu điểm như dễ nuôi cấy, môi trường nuôi cấy đơn giản, thời

gian sinh trưởng nhanh, khả năng thu nhận protein đích với hàm lượng cao

v.v… nên thường được lựa chọn là hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp. Tuy

nhiên, hệ thống biểu hiện E.coli cũng có những hạn chế như khi biểu hiện

protein của gen eukaryote cần phải thay đổi các codon hiếm ở gen ban đầu

b ng các codon phổ biến ở E. coli,protein ngoại lai thường tích lu ở dạng thể

vùi trong tế bào làm giảm hoặc mất hoạt tính sinh học, quá trình cắt

methionine đầu N của protein ngoại lai khó khăn; mức độ biểu hiện còn phụ

thuộc nhiều yếu tố như: đặc điểm của gen ngoại lai (bộ ba mã hiếm, hàm

lượng GC v.v…) [36], điều kiện biểu hiện (nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng

v.v…), tính chất của protein (số lượng cầu disunfide, trọng lượng phân

tửv.v…) [140]. Đặc biệt, khi sản xuất các loại protein sử dụng trong y học ở

E. colicòn có sự tích lu của các chất gây sốt có thành phần là

lipopolysaccharide, là một nội độc tố đối với con người, gây phản ứng phụ

cho người khi sử dụng qua đường tiêm nếu không được loại bỏ sau khi tinh

sạch protein [150].

21

Hiện nay, có rất nhiều chủng E. coli được nghiên cứu để biểu hiện

protein tái tổ hợp với các vector biểu hiện khác nhau như BL21, BL21 (DE3)

pLysS, M15, Tuner, Rosetta, Origami, Rosetta-gami, AD494 v.v... Trong đó,

chủng Rosetta-gami có nguồn gốc từ chủng Origami, mang plasmid pRARE

mã hoá cho các tRNAs hiếm trong chủng K-12 đột biến trxB/gor để tăng

cường sự hình thành các cầu nối disulfide trong tế bào chất và có thể sử dụng

cùng với các vector chuyển gen pET-44, pET-43.1, pET32 (a, b, c) để tăng

cường khả năng biểu hiện protein của gen có nguồn gốc từ eukaryote

Mặc dù còn hạn chế, nhưng hiện nay hệ thống biểu hiện protein ở vi

khuẩn vẫn được nghiên cứu sử dụng nh m mục đích thử nghiệm, so sánh mức

độ biểu hiện protein tái tổ hợp giữa các hệ thống nuôi cấy, đánh giá mức độ

biểu hiện của protein tái tổ hợp trước khi biểu hiện ở các hệ thống khác. Theo

Sanchez-Garcia (2016), hiện nay vẫn có tới 86% protein tái tổ hợp dùng trong

điều trị ung thư là biểu hiện và thu nhận qua hệ thống E. coli, nên đây vẫn là

một hệ thống đang được quan tâm hiện nay.

1.3.2. Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2)

Những thập niên gần đây, cùng với các hệ thống biểu hiện vi khuẩn, nấm

men, tế bào côn trùng, tế bào động vật v.v… thì hệ thống thực vật đang ngày

càng tỏ ra có nhiều ưu điểm hơn khi biểu hiện các loại protein tái tổ hợp [59],

[60], [128]. Trong đó, hệ thống dòng tế bào huyền phù BY2 mang nhiều ưu

điểm hơn so với các hệ thống khác như tránh được thời tiết bất thường của tự

nhiên, loại bỏ được nguy cơ việc du nhập gen ra ngoài môi trường và không

tiềm ẩn những bệnh lây nhiễm trên động vật[96]. BY2 có khả năng phát triển

đồng nhất và ổn định trên môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền với tốc độ nhân

dòng từ 80-100 lần trong vòng một tuần [74]. Một đặc điểm ưu việt khác nữa là

BY2 đáp ứng tốt với quy trình chuyển gen b ng vi khuẩn Agrobacterium[100],

và bản thân BY2 là tế bào nhân thực nên nó có thể thực hiện nhiều quá trình cải

22

biến sau dịch mã, điều này mở ra triển vọng biểu hiện các protein tái tổ hợp để

giữ được hoạt tính giống như protein ngoài tự nhiên [80]. Hiện nay, chưa có

một nghiên cứu lâm sàng nào chỉ ra được sự khác nhau về khả năng tạo đáp

ứng miễn dịch giữa một loại protein tái tổ hợp sản xuất từ thực vật với sản xuất

b ng tế bào động vật; điều này cho thấy khả năng thu nhận được protein tái tổ

hợp từ tế bào thực vật nói chung và tế bào huyền phù BY2 nói riêng có cấu trúc

và hoạt tính sinh học rất giống với protein tự nhiên[127], [149].

Bảng 1.2.Một số cytokine biểu hiện thành công ở tế bào BY2

Cytokine Đặc điểm của cassette biểu hiện Hàm lƣợng protein thu đƣợc

Erythropoietin Promoter và terminator 35S 25 pg/l[93].

G-CSF Promoter 35S cùng trình tự tăng

cường biểu hiện, nos terminator 105 µg/l[58].

GM-CSF Promoter 35S, his tag, terminator T7 150 µg/l (trong tế bào); 250

µg/l (tiết ra môi trường) [40].

IL-2 Promoter 35S, terminator T7 0,09 mg/l[89].

IL-4 Promoter 35S CaMV, terminator T7 0,45 mg/l[89].

IL-12 Promoter 35S cùng hai trình tự

tăng cường Ω 175 µg/l[80].

Ngoài ra, dòng tế bào BY2 có thể được sử dụng làm mô hình để nghiên

cứu sự biểu hiện, sự hoàn thiện và ổn định của các protein tái tổ hợp mong

muốn [120] như kháng thể biscFv [44], kháng thể đơn dòng của người kháng

kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B (mAb against HbsAg) [167],

albumin huyết thanh người tái tổ hợp (recombinant human serum albumin-

rHSA) [144]. Một số nghiên cứu đã chuyển sang giai đoạn sản xuất protein tái

tổ hợp ở quy mô công nghiệp b ng hệ thống BY2 như sản xuất protein tái tổ

hợp hydrophobin [123].

23

Với các ưu điểm của BY2 và những thành công trong nghiên cứu đã đạt

được, việc sản xuất protein tái tổ hợp trong các dòng tế bào thuốc lá BY2 là

một trong những hướng nghiên cứu có triển vọng, cũng như kiểm tra mức độ

biểu hiện của protein tái tổ hợp trong tế bào thực vật trước khi được chuyển

vào cây chủ.

1.3.3. Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật

Thực vật là nguồn cung cấp các loại dược chất quan trọng đối với con

người. Ngày nay, từ những thành tựu của khoa học hiện đại, bao gồm cả

công nghệ sinh học phân tử giúp cho thực vật trở thành nguồn sản xuất các

hợp chất có giá trị như: các cytokine, kháng nguyên vaccine và kháng thể

v.v… [21], [22], [23], [52], [85], trong đó, rễ tơ được sử dụng cho mục đích

sản xuất protein tái tổ hợp và các chất chuyển hóa thứ cấp do có nhiều ưu

điểm như chi phí sản xuất tương đối thấp, quá trình vận hành đơn giản, sản

xuất các hợp chất đặc trưng cho các tế bào nhân chuẩn có hoạt tính sinh học

do chúng có khả năng cải biến sau dịch mã, an toàn đối với con người do

cũng giống như hệ thống huyền phù BY2, chúng không có các loại virus và

mầm bệnh gây hại cho người [153].

A B

Hình 1.4. Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2)

A. Trên môi trường đặc B. Trên môi trường lỏng

24

Rễ tơ (hairy root), bản chất là một bệnh gặp ở thực vật gây ra bởi vi

khuẩn Agrobacterium rhizogenes, đây là một loại vi khuẩn đất thuộc nhóm

Gram âm. Khi xâm nhiễm vào thực vật, dưới sự kiểm soát của vùng gây độc,

hai vùng phân tán của Ri-plasmid gồm TL (T-left T-DNA) và TR (T-right T-

DNA). Trong đó, TR T-DNA chứa các gen sản xuất opine (mannopine hoặc

agropine) và các dòng được định rõ đặc điểm nhờ các gen opine đặc trưng của

chúng. Mặt khác TR T-DNA còn chứa hai gen mã hóa cho sự tổng hợp auxin,

các gen này có độ tương đồng rất cao với các gen auxin của A.tumefaciens.

Ngược lại, TL T-DNA không tương đồng với T-DNA của A.tumefaciens.

Toàn bộ TL T-DNA có tối thiểu 11 khung đọc mở, tương tự với các khung

đọc mở đã được tìm thấy ở genome của eukaryote, gồm có promoter và các

yếu tố polyadenine hóa cần thiết để thực hiện chức năng khi chuyển vào trong

genome thực vật. Sau khi xâm nhiễm vào, tại vị trí vi khuẩn xâm nhiễm sẽ

hình thành nên rễ tơ [28], [30].

Rễ tơ hiện nay có tiềm năng nghiên cứu, ứng dụng rất lớn do chúng có

thể sinh trưởng tốt trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng, dễ

dàng nuôi cấy, môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, dễ dàng sản xuất một

lượng sinh khối lớn trong khoảng thời gian ngắn, có thể tạo sinh khối liên tục

nên được xem là một trong những xu hướng mới được sử dụng để biểu hiện

các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Đặc biệt, rễ tơ chuyển gen có mức độ

phân hóa cao, có thể sử dụng là nguồn sản xuất ổn định các hợp chất thứ cấp.

Mặt khác, vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes có thể chuyển T-DNA và cho

phép các gen ngoại lai biểu hiện ở rễ tơ chuyển gen và từ rễ tơ chuyển gen

này có thể tái sinh thành cây chuyển gen [28].

Một ưu điểm của nuôi cấy rễ tơ thực vật so với các hệ thống nuôi cấy

thực vật chuyển gen khác là chúng không đòi hỏi diện tích canh tác, không

chịu ảnh hưởng của môi trường, mùa vụ, sản phẩm protein thu được không

25

mang các yếu tố độc hại từ thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu và rút ngắn được thời

gian sản xuất. Ngoài ra, sản phẩm sinh học tái tổ hợp thu được thường được

biểu hiện ra môi trường nuôi cấy, điều này giúp cho quá trình tinh sạch các

sản phẩm sinh học được thuận lợi và đạt độ tinh sạch cao [77].

Hiện nay, nuôi cấy rễ tơ thực vật đã được sử dụng rộng rãi cho nhiều

quá trình sản xuất protein tái tổ hợp [165] và các dược phẩm sinh học tái tổ

hợp như SEAP (human secreted alkaline phosphatase) [50], kháng nguyên bề

mặt HbsAg của virus viêm gan B, các tiểu đơn vị B của độc tố vi khuẩn

Vibrio cholerae, protein vỏ L1 của HPV, protein E2 của virus viêm gan E ở

người HEV, kháng nguyên HA của virus cúm, protein vỏ của virus Rota,

glycoprotein của virus dại [21]; protein huỳnh quang kết hợp với protein ricin

B (GFP-ricin B) [91]; các loại kháng thể và các chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của

kháng thể [38].

Giống như hệ thống biểu hiện huyền phù BY2, việc sử dụng hệ thống

nuôi cấy rễ tơ thực vật để biểu hiện protein tái tổ hợp là một hướng nghiên

cứu rất triển vọng, giúp sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp ở quy mô phòng thí

nghiệm và công nghiệp.

1.3.4. Cây chuyển gen biểu hiện cytokine tái tổ hợp

Sự phát triển của công nghệ DNA tái tổ hợp và thực vật chuyển gen đã

tạo nền tảng cho việc sản xuất protein từ thực vật hoặc tế bào thực vật. Những

kết quả đầu tiên đã được công bố từ thập niên 80 của thế kỷ 20 [11]. Việc sản

xuất thành công hormone tăng trưởng của người trong cây thuốc lá và hạt

hướng dương [17], albumin trong thuốc lá và khoai tây [139] đã cho thấy hệ

thống nuôi cấy thực vật có thể được sử dụng để sản xuất các protein của động

vật có vú, trong đó có con người.

Erythropoietin là một trong những cytokine đầu tiên được sản xuất

b ng tế bào thực vật. cDNA mã hóa erythropoietin của người được biểu hiện

26

qua promoter 35S của virus khảm súp lơ (CaMV) trong tế bào thuốc lá BY2,

tuy nhiên năng suất còn thấp, chỉ đạt 0,0026% tổng số protein tan[93].

Tiếp sau erythropoietin thì yếu tố GM-CSF của người cũng được tập

trung nghiên cứu, biểu hiện ở thực vật. Ban đầu, chúng được biểu hiện trong

thuốc lá [40],[82] và dịch treo tế bào lúa[71], [72], [136]. Để tăng năng suất,

các loại muối khoáng hoặc 5% (w/v) gelatin đã được bổ sung vào môi trường

nuôi cấy, giúp sản lượng của hệ thống đạt 129 mg/l. Ngoài biểu hiện trên cây

thuốc lá và tế bào lúa thì yếu tố GM-CSF còn được biểu hiện trên một số cây

trồng khác như trong lá mía chuyển gen là 0,02% [160], trong lá thuốc lá

khoảng 0,22% protein tan tổng số [53], trong hạt giống lúa chuyển gen GM-

CSF tái tổ hợp tích lũy lên tới 1,3% protein tan tổng số [129], đặc biệt hàm

lượng GM-CSF biểu hiện cao nhất là ở khoai tây lên tới 2% protein tổng số

với lớp vỏ protein biến đổi[174].Trong hầu hết các trường hợp, các hoạt tính

sinh học của GM-CSF tái tổ hợp đã được chứng minh ở mức độ phòng thí

nghiệm, và trên cơ thể sống trong mô hình chuột[107].

Bảng 1.3. Một số cytokine tái tổ hợp biểu hiện ở thực vật

Cytokine Cây

biểu hiện

Đặc điểm của

cassette biểu hiện

Hàm lƣợng

protein thu đƣợc

GM-CSF Mía Promoter Mubi-1 của ngô hoặc

Scubi-9 của mía

0,02% protein tan

tổng số [156].

GM-CSF Thuốc lá Promoter Gt1, Gt3 (glutelin) và

tín hiệu peptide, nos terminator

0,005 - 0,03% protein

tan tổng số [126].

GM-CSF Thuốc lá Promoter Gt1 và tín hiệu

peptide, nos terminator

1,3% protein tan tổng

số[127].

GM-CSF Lúa Promoter Gt3α, tín hiệu peptide

glutelin, nos terminator

0,5 - 14

µg/hạt[73],[105].

Murine Thuốc lá Promoter RbcS1, tín hiệu 19 µg/g lá tươi;

27

GM-CSF peptide, KDEL 0,22% [53].

IL-2 Khoai tây Promoter patatin, nos

terminator

115 U/mg protein

tổng số[116].

IL-4 Thuốc lá,

khoai tây Promoter 35S, KDEL

0,1% protein tổng số

ở thuốc lá; 0,08%

protein tổng số ở

khoai tây [88].

IL-10 Thuốc lá

Promoter 35S cùng trình tự tăng

cường, ELP, KDEL, nos

terminator

0,27% protein tan

tổng số[115].

IL-10 Thuốc lá

(A). Promoter 35S CaMV, có

hoặc không có his tag, peptide

lục lạp

(B). Promoter 35S CaMV, his

tag, peptide ty thể

(A). 7 ng/mg protein

tổng số (không có his

tag); 43 ng/mg (có

his tag).

(B). Không biểu hiện

[94].

IL-12 Thuốc lá Promoter 35S và terminator 40 ng/g [54].

IL-12 Cà chua Promoter 35s cùng trình tự

tăng cường, 35S terminator

7,3 µg/g ở lá; 4,3

ng/g ở quả [55],

[126].

IL-13 Thuốc lá Hai promoter 35S, KDEL, nos

terminator

0,15% protein tổng

số [155].

IL-18 Thuốc lá Promoter 35S, nos terminator

0,004 - 0,051%

protein tổng số, 351

ng/g [171].

IFN-α2b

IFN-α8 Khoai tây - 560 IU/g mô [112]

28

IFN-α2b Cà rốt

(A). Promoter 35S, nos

terminator, tín hiệu mục tiêu

calreticulin

(B). Promoter MLL, nos

terminator, tín hiệu mục tiêu

calreticulin

(A). 26,8 x 103 U/g

FW của lá tươi

(B). 8,56 x 103 U/g

FW của rễ [86].

IFN-β

Biểu hiện

tạm thời

lá rau diếp

Promoter 35S, nos terminator 3,1 x 104 IU/ml[63]

TNF-α Khoai tây Promoter 35S, trình tự

SEKDEL 15 µg/g mô [113]

FGF8b Thuốc lá

Promoter 35S cùng hai trình tự

tăng cường, 35S terminator,

c-myc, his, KDEL

4,1% protein tổng

số[121].

Ngoài ra, một số loại cytokine khác cũng được nghiên cứu biểu hiện

như: IL-12 [54], [55], [126], [136], IL-13[159], cardiotrophin 1 [42], IL-18

[171], yếu tố hoại tử khối u TNF-α được biểu hiện trong khoai tây với hàm

lượng tích lũy đạt khoảng 15 µg trong 1g mô thực vật [113].

Những kết quả này mở ra hướng nghiên cứu sử dụng thực vật như các

bioreactor để sản xuất các protein có hoạt tính sinh học ổn định [61], ứng

dụng trong y học.

Ở Việt Nam, năm 2012, Phan Tường Lộc và cộng sự đã chuyển thành

công gen HIV-1 p24 và gen aadA vào lục lạp cây thuốc lá Virginia (V2), là

giống thuốc lá được nhập nội và thuần hóa ở Việt Nam cho năng suất cao.

Gen HIV-1 p24 mã hóa cho protein p24 kháng nguyên vỏ của HIV. Protein

tái tổ hợp p24 được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu như điều chế vaccine

đa thành phần và kit chẩn đoán HIV. Gen aadA quy định tính kháng hai loại

29

kháng sinh spectinomycin và streptomycin, được dùng làm marker chọn lọc

cây chuyển gen [6].

Hiện nay, ngoài phương thức biến nạp tạo cây chuyển gen, còn có thể

sử dụng phương pháp biểu hiện tạm thời để biểu hiện protein ở thực vật.

Hệ thống biểu hiện tạm thời cho thấy là một phương pháp thuận lợi để

phân tích khả năng biểu hiện của protein đích trong thực vật do phương pháp

này không bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen đích trong hệ gen của thực vật, thời

gian thực hiện ngắn, cho kết quả nhanh và đặc biệt là có thể biểu hiện được

tốt ngay cả trên những mô đã biệt hóa hoàn toàn như lá [44]. Hiện nay có hai

phương pháp để biểu hiện tạm thời là sử dụng virus thực vật làm vector và

phương pháp Agro-infiltration. Tuy nhiên, phương pháp Agro-infiltration tỏ

ra chiếm ưu thế hơn do mức độ biểu hiện protein cao, quy trình thực hiện đơn

giản và có thể chuyển những đoạn gen có kích thước lớn hơn so với phương

pháp sử dụng virus thực vật làm vector chuyển gen.

Phương pháp Agro-infiltration đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu

biểu hiện và sản xuất kháng nguyên của virus cúm gia cầm H5N1 với hàm

lượng cao tới 200 mg HA/kg lá tươi [168], 675 mg HA/kg lá tươi[99], 400 mg

NA/kg lá tươi[96]… B ng cách sử dụng hệ thống biểu hiện tạm thời này,

Vaquero và đồng tác giả đã biểu hiện thành công scFv; chuỗi nặng, chuỗi nhẹ

của kháng thể [157]. Phân tử kháng thể đầy đủ có thể biểu hiện b ng cách

tiêm đồng thời hai chủng vi khuẩn Agrobacterium mang riêng biệt chuỗi nặng

và chuỗi nhẹ vào lá cây. Phương pháp biểu hiện tạm thời này phù hợp để

kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong tế bào thực vật, đồng thời

cũng để kiểm tra sự hoạt động của cấu trúc vector vừa thiết kế trước khi tiến

hành tạo cây chuyển gen [43].

Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy thực vật là hệ thống có nhiều

ưu điểm để biểu hiện protein trong đó có protein hIL-7 tái tổ hợp.

30

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Vật liệu thực vật

1. Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum L. Cv Bright Yellow

2) do phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp.

Sử dụng để biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp.

2. Giống thuốc lá N. tabacum K326 được cung cấp bởi Viện Kinh tế k

thuật thuốc lá, Tổng Công ty thuốc lá Thăng Long cung cấp. Sử dụng để biểu

hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong hệ thống rễ tơ bắt nguồn từ lá cây thuốc lá

K326.

3. Giống thuốc lá N. benthamiana được cung cấp bởi Phòng Công nghệ

tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa Học và

Công Nghệ Việt Nam. Sử dụng để biểu hiện tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp.

2.1.2. Các chủng vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn s d ng trong nghiên cứu được cung cấp t iện

Công nghệ sinh h c - Viện Hàn l m Khoa h c và Công nghệ Việt Nam gồm

Chủng vi khuẩn E. coli DH-5α, A. tumefaciens C58C1/pGV2260 mang

yếu tố phiên mã FUS3 sẽ đồng biểu hiện tạm thời với vector đích chứa trong

vi khuẩn Agrobacteriumkhi biểu hiện protein tái tổ hợp dưới sự kiểm soát của

promoter CaMV 35S.

Chủng vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834, A. tumefaciens Cv58,

E.coli Rosetta-gami Bdùng trong phân lập gen, thiết kế vector chuyển gen và

biểu hiện protein hIL-7.

Dòng tế bào 2E8 do Ngân hàng tế bào Hoa Kỳ ATCC cung cấp được

sử dụng để bước đầu đánh giá hoạt tính sinh học của hIL-7

31

2.1.3. Các gen và vector

Thông tin gen hIL-7 được khai thác trên ngân hàng Gen, mã số

J04156.1. Sử dụng để cải biến mã di truyền tối ưu biểu hiện ở thực vật.

Vector chuyển gen pK7WG2D.1 (phụ lục) có hai vị trí attR1 và attR2

được sử dụng làm vector đích trong k thuật Gateway.

Vector pET32c(+) chứa đoạn Trx.tag hỗ trợ tăng cường biểu hiện

protein dung hợp với thioredoxin.Vector chuyển gen pCB301 chứa gen kháng

kháng sinh kanamycin, được sử dụng làm vector chuyển gen để biểu hiện tạm

thời protein hIL-7 ở cây thuốc lá.

Vector pRTRA 35S-TBAG-100xELP [45] mang promoter 35S chứa

gen kháng kháng sinh ampicilin, trình tự 100xELP; vector hỗ trợ biểu hiện

protein đích pMON6530/Hc-Pro.

Vector pENTRTM

221/cal nhận từ Viện Sinh học phân tử và Dược học,

Trường Đại học Heidelberg, CHLB Đức. Vector này được thiết kế mang đoạn

tín hiệu peptide calreticulin n m giữa hai vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2 và hai

điểm cắt của enzyme giới hạn là SacI và HindIII n m ở đầu 3’ của đoạn tín hiệu

peptide.

2.1.4. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.1. Thống kê các trình tự mồi s d ng trong luận án

Ký hiệu Trình tự nucleotide (5’ - 3’) Mục đích

Sản

phẩm

(bp)

IL7_F TCGAGCTCGATTGTGATATT Kiểm tra gen hIL-7

trong các phản ứng

PCR, colony-PCR

536 IL7_R AGGAAACACAAGTCATTCAG

IL7_BamHI_R CCGGATCCTCCCTGAAAATACAGGTTTT Kiểm tra gen hIL-7

biểu hiện tạm thời 564

IL7_BamHI_F GAAAACCTGTATTTTCAGGGAGGATCC

35S-SQF CACTGACGTAAGGGATGACGC Kiểm tra chiều gắn

của gen hIL-7 vào

vector pRTRA

814 35Sterm CTGGGAACTACTCACACA

32

virC_F ATCATTTGTAGCGACT Kiểm tra mẫu có

sạch khuẩn không 899

virC_R AGCTCAAACCTGCTTC

Các trình tự mồi IL7_F/R và IL7_BamHI_F/R được đặt tổng hợp tại

công ty Epoch Life Science (Hoa Kỳ).Các trình tự mồi 35S-SQF/35Sterm và

virC_F/R được cung cấp bởi phòng Công nghệ Tế bào thực vật, viện Công

nghệ Sinh học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.1.5. Hóa chất và thiết bị máy móc

a. Hóa chất

Thang DNA 1kb (Fermentas), marker protein, Master Mix 2X

(Promega), Kit tinh sạch DNA AccuPrep Gel Purification, kit tách chiết

plasmid (Bioneer, Hàn Quốc). Các loại hoá chất: bacto pepton, yeast extract,

NaCl, agarose, trypton, KCl, tris-HCl, EDTA, SDS, sorbitol, IPTG, CTAB,

KNO3, CaCl2, NH4NO3, sucrose, ethidium bromide, zeatin riboside, glycerol,

ethanol, nước khử ion.

Bảng 2.2. Danh sách kháng sinh s d ng trong luận án

Kháng sinh Nồng độ sử dụng Nguồn gốc

Kanamycin 50 mg/l Duchefa, The Netherlands

Rifammycin 50 mg/l Duchefa, The Netherlands

Cefotaxime 400 mg/l; 500 mg/l Duchefa, The Netherlands

Chloramphenicol 34 mg/l Duchefa, The Netherlands

Carbenicillin 50 mg/l Duchefa, The Netherlands

Spectinomycin 100 mg/l Duchefa, The Netherlands

Các loại enzyme sử dụng của hãng Fermentas: SacI, BamHI, NcoI,

HindIII, SAP, T4 ligase…

b. Trang thiết bị

Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu: máy nghiền mẫu (Retsch), máy nuôi

lắc, máy ly tâm lạnh (Hettich), máy PCR (Thermo Scientific), máy Nanodrop

33

lite (Thermo scientific), bộ điện di DNA(Biorad), bộ điện di protein, máy

chụp ảnh gel (Cleaver Scientific), thiết bị hấp khử trùng (Hirayama), máy đo

quang phổ (Shimadzu), máy khuấy từ gia nhiệt (Velp), máy đo pH (Horiba),

cân k thuật, cân phân tích (Sartorius), buồng an toàn sinh học cấp II (Esco),

máy sấy Speed-Vac, ELISA reader v.v…

2.1.6 . ịa điểm và thời gian nghiên cứu

Các thí nghiệm trong nội dung nghiên cứu của luận án được thực hiện

tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng,

Phòng thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Thời gian thực hiện từ

năm 2012 đến năm 2016.

Luận án được hoàn thành tại Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục

sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nội dung nghiên cứu của luận án được khái quát theo sơ đồ hình 2.1

gồm các bước chính:

Thông tin gen hIL-7quy định protein IL-7 ở người có mã số J04156.1

trên ngân hàng Gen sẽ được thay đổi mã di truyền để phù hợp biểu hiện

protein tái tổ hợp ở thực vật và được đặt tổng hợp nhân tạo.

Gen hIL-7 tái tổ hợp được đưa vào các cấu trúc vector pET32c,

pK7WG2D.1, pTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP, pCB 301 35S/IL7-

cmyc-histag-100xELP để chuyển gen và biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi

khuẩn, tế bào huyền phù BY2, rễ tơ và cây thuốc lá.

Chọn lọc, đánh giá và phân tích các dòng chuyển gen.

Định tính, định lượng, tinh sạch và đánh giá hoạt tính của protein hIL-7

tái tổ hợp thu được.

34

Interleukin 7

Thay đổi mã di

truyền, tổng hợp

nhân tạo

Cấu trúc T7-Pro/IL7-histag-trx/T7-Ter

Cấu trúc 35S-Pro/IL7-cal/35S-Ter

Cấu trúc 35S-Pro/IL7-cmyc-histag-ELP/35S-Ter

Thiết kế vector chuyển gen mang genhIL-7

E.coli Rosetta gami B

Tế bào BY2

Rễ tơ

Cây thuốc lá

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát Chuyển gen, chọn dòng và phân

tích biểu hiện protein hIL-7

ProT7 hIL-7 His-tag Trx TerT7 amp R Cmyc

LB T35S hIL-7 cal P35S RB NPT II Cmyc His-tag

RB NPT II T35S 100xELP Cmyc hIL- 7 P35S LB His-tag

35

2.2.1. Phƣơng pháp thay đổi mã di truyền genhIL-7 tối ƣu biểu hiện

protein ở thực vật

Amino acid có thể được quy định bởi nhiều bộ ba mã di truyền khác

nhau. Do đó, để phù hợp và tăng khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp của

genhIL-7 trong hệ thống thực vật, chúng tôi tiến hành thay đổi những mã di

truyền hiếm của gen ngoại lai hIL-7thành mã di truyền phổ biến trong thực

vật mà không làm thay đổi trình tự acid amin của protein.

Quá trình thay đổi mã di truyền của genhIL-7 gồm các bước:

Bước 1: Khai thác thông tin trình tự nucleotide genhIL-7 trên Ngân

hàng Gen quốc tế, mã số 3574 [104]và trình tự mRNA, mã số J04156.1.

Bước 2: Thay thế các codon hiếm trong genhIL-7 b ng các codon phổ

biến ở thực vật b ng phần mềm Codon Optimization 2.0 dựa trên thông tin

tần suất các codon phổ biến ở thực vật trong cơ sở dữ liệu mã di truyền Codon

Usage Database [67]. Ngoài ra, trình tự ATTTA được loại bỏ và sử dụng phần

mềm Invitrogen để tối ưu nh m giảm thiểu sự hình thành mRNA thứ cấp.

Bước 3: Bổ sung các vị trí nhận biết của enzyme giới hạn SacI, NcoI,

HindIII, BamHI vào trình tự gen nh m phục vụ cho quá trình cắt và ghép nối

gen khi thiết kế vector chuyển gen.

Bước 4: Thêm đoạn trình tự mã hoá cho c-myc tag và His-tag vào đầu

3’ của genhIL-7 để kiểm tra sự biểu hiện của protein hIL-7 tái tổ hợp trong

thực vật thông qua các phương pháp lai miễn dịch Western blot và phân tích

ELISA.

Bước 5: Sử dụng phần mềm BioEdit, Graphical Codon Usage Analyzer

để kiểm tra và so sánh trình tự nucleotide và trình tự acid amin suy diễn của

genhIL-7 trước và sau khi đổi mã. GenhIL-7 tái tổ hợp được đặt tổng hợp nhân

tạo tại hãng Epoch Life Science (M ) và được nhân dòng trong vector pBSK-

IL7.

36

2.2.2. Thiết kế mồi

Sử dụng phần mềm BioEdit và trình tự genhIL-7 tái tổ hợp cùng trình

tự gen đã công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế để thiết kế các cặp mồi phục

vụ nghiên cứu trong luận án, thể hiện tại bảng 2.1

2.2.3. Thiết kế vector chuyển gen mang genhIL-7 tái tổ hợp

Quá trình thiết kế vector chuyển gen gồm các bước chính sau: Bước 1.

Chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng lai; Bước 2. Ghép nối các đoạn gen tạo

plasmid tái tổ hợp; Bước 3. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH-5 để

nhân dòng; Bước 4. Chọn dòng khuẩn lạc b ng phương pháp colony-PCR và

kiểm tra plasmid tái tổ hợp b ng enzyme cắt giới hạn.

Trong nội dung nghiên cứu của luận án, chúng tôi tiến hành thiết kế các

vector chuyển gen sau: (1). pET32c(+)/IL7; (2). pENTR221/IL7/cal (3).

pK7WG2D.1/cal/IL7; (4). pRTRA 35S-IL7-100xELP; (5). pCB301_IL7/ELP.

2.2.3.1. Thiết kế vector pET32c/IL7 tái tổ hợp

a. Nhân dòng genhIL-7

* Chuẩn bị tế bào khả biến

Tế bào khả biến E. coli DH-5αđược tạo theo phương pháp của

Sambrook và cộng sự (1998) có cải tiến ở bước rửa cặn khuẩn trong CaCl2

0,1M sau khi ly tâm. Bước này được lặp lại ba lần, để trong đá lần đầu và thứ

hai 30 phút, lần thứ ba 45 phút.

*Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E.coli DH-5α

Vector pBSK-IL7 và pET32c(+) được biến nạp song song vào tế bào

khả biến E.Coli DH-5α b ng phương pháp sốc nhiệt, gồm các bước

chính:Bước 1. Bổ sung 5 µl vector vào tế bào khả biến và đảo nhẹ; Bước 2.Ủ

trong đá 15 - 30 phút; Bước 3.Sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút 30 giây; Bước

4.Để trong đá 15 - 30 phút; Bước 5.Bổ sung 200 µl LB lỏng; Bước 6. Nuôi lắc

200 rpm ở 37oC trong 1giờ; Bước 7. Cấy trải 100 µl dịch biến nạp trên môi

37

trường chứa kháng sinh chọn lọc carbenicillin 50 mg/l và nuôi qua đêm ở

37oC

* Kiểm tra khuẩn lạc dương tính bằng kỹ thuật colony PCR

K thuật colony-PCR cũng giống như PCR, nhưng mẫu DNA được

thay b ng khuẩn lạc. Ở nhiệt độ 94-95oC, màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ,

giải phóng plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp này sẽ làm khuôn cho phản

ứng PCR nhân gen b ng cặp mồi đặc hiệu.

* Tách chiết plasmid từ tế bào vi khuẩn

Các tế bào E.coli mang plasmid tái tổ hợp sau khi nuôi cấy đến pha cân

b ng được cho vào ống Eppendorf 2ml ly tâm thu cặn. Bổ sung Sol I

(Glucose 50 mM, TrisHCl 25 mM; EDTA 10 mM pH 8,0), voltex để hòa tan

và ổn định tế bào. Tiếp tục bổ sung Sol II (NaOH 0,2N; SDS 1%), đảo nhẹ để

phá vỡ thành và màng tế bào b ng kiềm và chất tạo sức căng bề mặt. Tiếp tục

bổ sung Sol III (CH3COOK 3M, CH3COOH 5M), đảo nhẹ để biến tính và tủa

DNA hệ gen và protein, phần tủa bị loại bỏ khỏi dung dịch chứa DNA

plasmid b ng ly tâm, thu 800 µl dịch nổi. Bổ sung 800 µl chloroform :

isoamylalcohol (24 : 1 v/v), đảo nhẹ, ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút, thu

500 µl dịch nổi phía trên, chuyển sang ống Eppendorf 1,5 ml. Bổ sung 1 ml

isopropanol, ủ 30 phút trong -20oC, ly tâm thu cặn. Bổ sung 1ml ethanol 70%,

ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút, thu cặn. Làm khô cặn b ng máy Speed-vac

trong 2 phút. Hòa tan DNA b ng 30 µl nước khử ion khử trùng có bổ sung

RNase 10 µg/µl. Bảo quản ở -20oC.

b. Ghép nối genhIL-7 vào vector pET32c(+)

* Phản ứng cắt enzyme giới hạn

Vector pET32c(+) và genhIL-7 được cắt tạo đầu so le b ng cặp enzyme

giới hạn NcoI và HindIII với thành phần phản ứng gồm: nước khử ion 9,5l,

đệm 10X 10l, DNA (~1µg) 80l, enzyme 0,5l. Ủ ở 37oC trong 2 - 4 giờ.

38

* Tinh sạch genhIL-7

Sản phẩm DNA được phân tách trong gel agarose khi đặt trong điện

trường dòng điện một chiều thành các băng vạch. Soi gel dưới đèn UV và thu

nhận đoạn gel chứa DNA mong muốn.

Tiến hành loại bỏ gel agarose và tinh sạch genb ng bộ kit tinh sạch

DNA AccuPrep Gel Purification

* Phản ứng lai ghép đoạn genhIL-7 vào pET32c(+)

Sản phẩm tinh sạch - đoạn genhIL-7 được ghép nối vào vector

pET32c(+) tạo plasmid tái tổ hợp mang genhIL-7 (ký hiệu pET32c(+)/IL7).

Hỗn hợp phản ứng lai gồm: nước 0l, đệm 10X 1l, sản phẩm cắt (pET32c)

5l, sản phẩm cắt (hIL-7) 3l, enzyme T4 ligase 1l; ủ ở 22oC trong 1 giờ 30

phút.

Đặt phản ứng trong đá và chuẩn bị thực hiện quá trình biến nạp vào tế

bào khả biến E.coli DH-5α.

c. Biến nạp sản phẩm ghép nối gen vào tế bào khả biến E.coli DH-5α

bằng phương pháp sốc nhiệt

Quá trình biến nạp được thực hiện tương tự mục 2.2.3.1.a. Kết quả thu

được các dòng khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc.

d. Chọn dòng khuẩn lạc mang vector pET32c(+)/IL7

Các dòng khuẩn lạc thu được sau biến nạp được tiến hành kiểm tra

b ng phương pháp colony PCR và enzyme cắt giới hạn NcoI và HindIII. Các

khuẩn lạc dương tính sau kiểm tra được nuôi thành các dòng và tách plasmid

vector chuyển gen pET32c(+)/IL7.

2.2.3.2. Thiết kế vector pK7WG2D.1/cal/IL7 tái tổ hợp

Vector pK7WG2D.1/cal/IL7 được thiết kế b ng phương pháp Gateway.

a. Nhân đoạn genhIL-7 bằng kỹ thuật PCR

39

Cấu trúc genhIL-7 được nhân lên b ng k thuật PCR với cặp mồi đặc

hiệu IL7_F/IL7_R. Để đảm bảo độ chính xác cao cho thí nghiệm, chúng tôi sử

dụng Pfu DNA polymerase để thay thế Taq-polymerase trong phản ứng PCR.

Sản phẩm PCR được chạy điện di kiểm tra b ng gel agarose 0,8%, sử dụng

đệm TAE 1X trước khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

Phản ứng PCR khuyếch đại genhIL-7 từ vector pBSK-IL7 được tiến

hành với thành phần gồm: nước khử ion 61 l, đệm 10X 10l, dNTPs 8l,

MgCl2 10l, DNA (50ng) 2l, Pfu DNA polymerase 1 µl, mồi IL7_F 4l,

mồi IL7_R 4ltheo chu kỳ nhiệt: 95oC/3 phút;95

oC/30 giây, 55

oC/30 giây,

72oC/1 phút 30 giây, lặp lại 30 chu kỳ; 72

oC/10 phút; 15

oC/∞.

b. Ghép nối genhIL-7 vào pENTR221/cal

* Phản ứng cắt enzyme giới hạn

Vector pENTR/cal: là vector tiếp nhận, trên vector này có đoạn peptide

tín hiệu calreticulin n m giữa hai vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2 và hai điểm

cắt của enzyme giới hạn SacI và HindIII ở đầu 3’. Hai vị trí attL1 và attL2 sẽ

phục vụ cho bước thiết kế vector chuyển gen b ng k thuật Gateway (mục

2.2.3.2.e).

1 AATGCCAACT TTGTACAAAA AAGCAGGCTC ATTTAACTTT

AAGAAGGAGA TATATACCAT

61 GGCTACTCAA CGAAGGGCAA ACCCTAGCTC TCTCCATCTA

ATTACTGTAT TCTCTCTGCT

121 CGTCGCTGTC GTCTCCGCTG AGCTCTCTAG AAAGCTTGAC

CCAGCTTTCT TGTACAAAGTTGGCCCC

Hình 2.2. Cấu trúc attL1_Cal/SacI và HindIII/attL2 trong vector

pENTR/cal

SacI

attL1

attL2 HindIII

40

Sản phẩm PCR - gen hIL-7 (mục 2.2.3.2.a) được tinh sạch theo bộ kit

AccuPrep PCR Purification Kit (Bionner).

Phản ứng cắt được thực hiện tương tự mục 2.2.3.1.b với cặp enzyme

cắt giới hạn SacI và HindIII.

* Phản ứng lai ghép genhIL-7 vào vector pENTR221/cal

Quá trình thí nghiệm được thực hiện giống quy trình ghép nối đã trình

bày tại mục 2.2.3.1.b.

Sản phẩm sau lai ghép được đặt trong đá và chuẩn bị cho quá trình biến

nạp vào tế bào khả biến E.coli DH-5α.



Quá trình tạo tế bào khả biến và biến nạp được thực hiện với quy trình

giống mục 2.2.3.1.a. Kết quả sau biến nạp là các dòng khuẩn lạc mọc trên môi

trường chọn lọc.

d. Chọn dòng khuẩn lạc dương tính bằng kỹ thuật colony PCR và

enzyme cắt giới hạn

Tiến hành chọn dòng khuẩn lạc dương tính b ng phương pháp colony

PCR với cặp mồi đặc hiệu. Tuy nhiên, colony-PCR có thể cho kết quả dương

tính giả do nhiều nguyên nhân. Do đó, để khẳng định chắc chắn chúng tôi tiến

hành nuôi cấy các khuẩn lạc phát triển trên môi trường chọn lọc, sau đó tách

plasmid theo protocol của kit Plasmid Extraction Kit (bionner) và sử dụng cặp

enzyme cắt giới hạn SacI và HindIII để kiểm tra sản phẩm và chọn được dòng

khuẩn lạc dương tính.

e. Tạo vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway

K thuật Gateway gồm hai loại phản ứng LR và BP (Invitrogen). Trong

nghiên cứu này phản ứng LR được thực hiện giữa vector tiếp nhận và vector

41

đích pK7WG2D.1 dưới sự xúc tác của enzym LR ClonaseTM

II . Đoạn gen cần

quan tâm sau khi đưa vào vector tiếp nhận (ví dụ, pENTR/IL7), ở bên sườn có

hai điểm tái tổ hợp (attL1 và attL2) sẽ được chuyển vào vector đích (ví dụ,

pK7WG2D.1), vector này chứa tất cả trình tự cần biểu hiện và cũng chứa hai

điểm tái tổ hợp (attR1 và attR2) ở giữa hai điểm có đoạn gen chọn lọc âm tính

ccdB. Hai vị trí att1 và att2 là hai điểm định hướng và đặc hiệu để tái tổ hợp, mỗi

một điểm trên vector này chỉ tái tổ hợp với một điểm tương ứng trên vector kia

mà không kết hợp với vị trí khác, vì vậy, attL1 phản ứng với attR1, còn attL2

phản ứng với attR2. Hai sự tái tổ hợp này tạo ra dòng biểu hiện, một là giữa

attL1 và attR1 thứ hai là attL2 và attR2. Sản phẩm của hai sự tái tổ hợp sẽ tạo ra

một plasmid như mong muốn và các sản phẩm phụ. Plasmid mới có hai sự lựa

chọn, kháng kháng sinh và chọn lọc âm tính. Vì vậy, tế bào sau khi được biến

nạp sản phẩm LR đều là những dòng khuẩn lạc dương tính trên môi trường có

kháng sinh chọn lọc.

Tuy nhiên, để xác định chính xác các plasmid tái tổ hợp mới được tạo

thành đúng như mong đợi cần sử dụng các phản ứng cắt b ng enzym giới hạn

và PCR để kiểm tra.

Phương pháp

Phản ứng lai LR:

Sản phẩm plasmid tinh sạch và định lượng được sử dụng cho phản ứng

LR.

Thành phần phản ứng LR được bổ sung vào ống Eppendorf 1,5ml ở

nhiệt độ phòng và đảo nhẹ.

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng LR

STT Thành phần Thể tích (µl)

1 Plasmid pENTR/IL7 (50 - 100 ng) 0,5

2 Vector pK7WG2D 1

42

3 Nước khử ion 2,5

4 LR Clonase 1

Tổng 5

Ủ phản ứng ở 25oC trong 90 phút.Bổ sung 1 µl dung dịch proteinase K

để kết thúc phản ứng, đảo nhẹ. Ủ ở 37oC trong 10 phút.

Vector pK7WG2D.1 là vector đích n m trong hệ thống Gateway. Với 2

vị trí tái tổ hợp attR1, attR2 và gen ccdB - gen mã hóa plasmid F gây ức chế sự

sinh trưởng của tế bào E.ColiDH-5α. Khi thực hiện phản ứng LR, hai vị trí này

sẽ được trao đổi với hai điểm tái tổ hợp khác trên vector pENTR/IL7 là attL1

và attL2. Kết thúc phản ứng sẽ tạo được dòng biểu hiện mà gen cần chèn n m

giữa hai vị trí attB1 và attB2. Cấu trúc vector pK7WG2D.1 được trình bày tại

phụ lục.

Biến nạp

Chuyển 3 µl phản ứng LR vào 50 µl tế bào khả biến E.Coli DH-5α.Ủ

trong đá 15 - 30 phút. Tiến hành xung điện ở điều kiện 2,5kV, 200Ω, 25 µF.

Sau đó, bổ sung 300 µl YMB lỏng, nuôi lắc 200 rpm trong 1 giờ ở 28oC.

Cấy trải 50 - 100 µl khuẩn lên môi trường YMB đặc có bổ sung kháng

sinh chọn l c cefotaxime 500 mg/l. Ủ đĩa 2 ngày ở tủ 28oC.

* Ch n dòng bằng colony-PCR

Lựa chọn 5 dòng khuẩn lạc để thực hiện phản ứng colony-PCR với cặp

mồi đặc hiệu IL7_F và IL7_R. Phản ứng này được thực hiện tương tự như

phản ứng PCR thông thường, chỉ khác là DNA được thay b ng dịch khuẩn.

Sản phẩm colony-PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.

Chọn các khuẩn lạc dương tính với phản ứng colony-PCR, tiến hành nuôi

lỏng trong môi trường YMB qua đêm ở 28oC (50 ml YMB lỏng có bổ sung 100

µl cefotaxime 500 ml/L). Dịch khuẩn sử dụng cho việc tách chiết plasmid. Sau

đó, thực hiện phản ửng cắt plasmid tách được b ng hai enzyme SacI và HindIII,

43

gồm: nước khử ion 4,5l, đệm tango 2X 2l, enzyme HindIII 1l, enzyme SacI

1,5l; ủ trong 2 giờ ở 37oC. Chạy điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose

0,8%.

Vector chuyển gen mang gen mong muốn sẽ được sử dụng để chuyển

vào vi khuẩn A. rhizogenes b ng xung điện tạo vector tái tổ hợp.

f.Biến nạp vector chuyển gen vào vi khuẩn A. rhizogenes

ATCC15834

* Chuẩn bị tế bào khả biến A. rhizogenes ATCC15834

50 ml tế bào vi khuẩn A. rhizogenes nuôi cấy trên môi trường mới đến

đầu pha log được thu lại b ng ly tâm lạnh. Cặn của tế bào vi khuẩn được làm

sạch b ng cách rửa nhiều lần b ng nước khử ion và glyxerol 10% đã làm lạnh

trước. Các thao tác được thực hiện trong box vô trùng. Bước cuối cùng bổ

sung 0,5 ml glycerol 10% chia đều 50 µl vào 10 ống Eppendorf và giữ ở tủ -

85oC.

* Phương pháp biến nạp bằng xung điện

Vector pK7WG2D.1/cal/IL7 sẽ được biến nạp vào tế bào A. rhizogenes

ATCC15834 b ng phương pháp xung điện, gồm các bước: Tiến hành rửa

cuvette b ng cồn 70ovà nước deion vô trùng.Sau đó, đặt tế bào khả biến trong

đá 15 phút và bổ sung 1 µl plasmid vào 50 µl tế bào khả biến và trộn nhẹ.

Tiếp tục chuyển tất cả hỗn hợp dịch tế bào khả biến và plasmid vào cuvette và

xung điện ở điều kiện 2,5 kV, 25 µF, 200 Ω.Sau đó, bổ sung 500 µl YMB và

đảo nhẹ rồi chuyển sang ống eppendoft 2ml. Nuôi lắc ở 28oC trong 1 giờ và

cấy trải ra đĩa môi trường YMB bổ sung 100 mg/lkháng sinh spectinomycin.

Sự có mặt của vector chuyển gen được kiểm tra b ng colony-PCR (mục

2.2.3.3.d) với cặp mồi đặc hiệu hoặc b ng phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn

SacI và HindIII (mục 2.2.3.3.b).

44

2.2.3.3. Thiết kế vector pCB301_IL7/ELP

a. Nhân dòng genhIL-7

Đoạn genhIL-7 được nhân lên b ng phản ứng PCR sử dụng khuôn là

plasmid pBSK-IL7 với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R.

Phản ứng PCR được tiến hành trong điều kiện: 50 µl hỗn hợp phản ứng gồm

0,3 µM mồi, 0,2 µM dNTPs, 5 µl đệm 10X Pwo SuperYield PC, 2,5U Pwo

SuperYield DNA polymerase, 20 ng khuôn. Chu trình nhiệt: 94oC/5 phút, 30

chu kỳ lặp lại các bước 94oC/30 giây, 50

oC/30 giây, 72

oC/1 phút 30 giây. Sau

đó giữ 72oC/10 phút và sản phẩm được giữ bảo quản ở 15

oC. Kết quả PCR

được kiểm tra trên gel agarose 0,8%.

b. Ghép nối genhIL-7 vào vector pRTRA 35S-TBAG-100xELP

Sản phẩm PCR và plasmid pRTRA 35S-TBAG-100xELP tinh sạch

được cắt đồng thời b ng enzyme BamHI để tạo đầu dính và loại bỏ

genTBAGkhỏi vector. Riêng vector 35S-TBAG-100xELP sau khi loại bỏ

genTBAG được cắt thêm với enzyme SAP để loại bỏ gốc phosphate, tránh

hiện tượng vector tự đóng vòng. Sau đó, tiến hành ghép nối tạo vector tái tổ

hợp pRTRA 35S-IL7-100xELP. Quá trình lai ghép được thực hiện tương tự

mục 2.2.3.1.b



Quá trình tạo tế bào khả biến và biến nạp được thực hiện với quy trình

giống mục 2.2.3.1.a. Kết quả thu được các dòng khuẩn lạc chuyển gen mọc

trên môi trường chọn lọc.

d. Chọn dòng khuẩn lạc dương tính bằng phương pháp colony PCR

45

Các dòng khuẩn lạc thu được sau biến nạp được tiến hành kiểm tra

b ng phương pháp colony PCR. Các khuẩn lạc dương tính sau kiểm tra được

nuôi thành các dòng và tách pladmid pRTRA 35S-IL7-100xELP.

e. Thiết kế cấu trúc chuyển gen pCB301_IL7/ELP tối ưu biểu hiện

Thực hiện phản ứng cắt vector pRTRA 35S-IL7-100xELP và vector

pCB301 b ng enzyme HindIII và loại bỏ gốc phosphate b ng enzyme SAP.

Sản phẩm ghép nối DNA vào vector pCB301 được biến nạp vào vi khuẩn

E.coli DH-5α và chọn lọc trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh

kanamycin 50 mg/l. Plasmid tái tổ hợp pCB301_IL7/ELP sau khi được chọn

dòng b ng PCR và cắt kiểm tra b ng enzyme NcoI sẽ được biến nạp vào vi

khuẩn A.tumefaciensC58C1/pGV2260 b ng xung điện để phục vụ cho nghiên

cứu biểu hiện tạm thời.

2.2.4. Phƣơng pháp biểu hiện gen ở vi khuẩn, tạo dòng tế bào thuốc lá

BY2, rễ tơ thuốc lá

2.2.4.1. Biểu hiện gen trong tế bào vi khuẩn E.coli Rosetta gami B

Một khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp pET32c-IL7 được nuôi trong

10ml môi trường LB lỏng có kháng sinh thích hợp ở 37oC, lắc 200 rpm qua

đêm. Cấy chuyển 1ml dịch khuẩn đã nuôi qua đêm sang 50ml môi trường LB

mới và nuôi ở 37oC, lắc 200 rpm đến khi OD600 0,4 - 0,6 thì chia 2 phần: 10ml

và 40 ml. Phần 40ml bổ sung IPTG tới nồng độ 1mM, phần 10ml không bổ

sung IPTG và chuyển sang nuôi lắc 200 rpm ở 28oC trong 8 giờ để cảm ứng

biểu hiện protein ngoại lai. Tế bào được thu lại b ng cách ly tâm dịch nuôi

cấy ở 6000 rpm trong 15 phút và hòa trong dung dịch đệm PBS 1X. Bổ sung

lysozyme tới nồng độ 0,1 mg/ml, ủ trên đá 1 giờ và tiến hành siêu âm phá

màng tế bào, sau đó ly tâm 13.000 rpm trong 30 phút, thu cả dịch nổi và cặn

để kiểm tra b ng phương pháp điện di SDS-PAGE.

46

2.2.4.2. Tạo dòng tế bào thuốc lá BY-2 chuyển genhIL-7

Quá trình tạo dòng tế bào BY-2 mang gen chuyển interleukin-7 được

chúng tôi thực hiện theo phương pháp của Nocarova và Fischer (2009)

[108]gồm các bước chính: Bước 1.Tạo huyền phù vi khuẩn: Chủng vi khuẩn

A.tumefaciens mang cấu trúc pK7WG2D.1/cal/IL7 cấy vạch lên môi trường

LB đặc có bổ sung kháng sinh rifamycin 50 mg/l và kanamycin 50 mg/l. Nuôi

trong tủ lắc 28oC/48 giờ. Lấy một khuẩn lạc riêng biệt cấy vào 2 ml LB lỏng

chứa kháng sinh chọn lọc. Đặt nuôi trong tủ lắc ở 200 rpm ở 28oC/qua đêm.

Lấy 0,5 ml dịch khuẩn chuyển vào nuôi trong 50 ml LB lỏng không chứa

kháng sinh chọn lọc, nuôi phục hồi trong 4 giờ ở điều kiện 200 rpm ở 28oC.

Sử dụng dịch khuẩn khi OD600 đạt 1,0.Bước 2.Chuẩn bị tế bào B 2 Tế bào

BY2 chủng dại được nuôi mới trước khi đồng nuôi cấy 5 ngày trong môi

trường MS lỏng; Bước 3. ồng nuôi cấy Lấy 4 ml tế bào BY2 cho vào đĩa

petri. Bổ sung 5 μl AS 20 μg/ml vào đĩa, lắc nhẹ; Bổ sung 100 μl dịch khuẩn;

Dán parafin và đặt ở tủ tối 2 ngày ở 25oC; Bước 4. R a khuẩn và ch n l c tế

bào chuy n gen: Tế bào BY2 được hút từ đĩa petri vào ống fancol 15 ml.

Thêm 5-7 ml MS lỏng. Đảo nhẹ; Sau 15 phút để lắng, hút phần dịch phía trên

bỏ đi, tiếp tục thêm môi trường MS lỏng và lặp lại bước rửa 3 lần đến khi

quan sát thấy dịch trong; Lấy 1 ml dịch huyền phù tế bào đã rửa sạch trải lên

môi trường MS đặc có bổ sung cefotaxime 500 mg/l và kanamycin 50 mg/l;

Dàn đều tế bào trên mặt thạch. Dán parafin và đặt vào tủ tối ở 25oC. Các dòng

tế bào ổn định sau 3 tuần sẽ hình thành mô sẹo, những dòng được chuyển gen

sẽ có khả năng kháng kháng sinh và có màu trắng hoặc vàng, còn những tế

bào không chuyển gen sẽ bị chết, có mầu nâu sẫm hoặc đen.

Để chọn lọc những dòng tế bào huyền phù đã được chuyển gen, tiếp tục

lấy 2g tế bào mô sẹo đã chọn lọc trên môi trường đặc để nuôi lỏng trong 150

ml môi trường MS có bổ sung kháng sinh kanamycine 50 mg/l và cefotaxime

47

500 mg/l, nuôi lắc 120 rpm ở 28oC. Sau 3 - 4 tuần thu được dòng tế bào huyền

phù BY2 chuyển gen ổn định.

2.2.4.3. Tạo rễ tơ thuốc lá chuyển gen hIL-7

Vector chuyển gen pK7WG2D.1 mang cấu trúc hIL-7 được chuyển vào

tế bào vi khuẩn A. rhizogenes ATCC15834 b ng phương pháp xung điện.

Phương pháp tạo rễ tơ chuyển gen được thực hiện theo Gaume và cộng

sự (2003) [49] gồm các bước chính sau:

Bước 1. Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn Nuôi một khuẩn lạc A.

rhizogenes ATCC15834 mang cấu trúc pK7WG2D.1/cal/IL7 vào 5 ml MS

lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin 50 mg/l một ngày trước đồng nuôi cấy

ở 28oC và 200 rpm. Hút 1 ml dịch khuẩn nuôi lỏng ở trên cho vào 50 ml MS

lỏng, nuôi tiếp cho đến khi OD600 đạt 0.7.

Bước 2. Chuẩn bị mảnh cấy thực vật: Cắt các mảnh lá thuốc lá 1 tuần

tuổi có kích thước khoảng 1 cm2 và làm tổn thương xung quanh b ng lưỡi

dao, đặt lên môi trường WPM trong 2 ngày.

Bước 3. ồng nuôi cấy Cho các mảnh lá vào bình tam giác loại 250 ml,

bổ sung huyền phù vi khuẩn để lây nhiễm. Sau 30 phút, chuyển các mảnh lá lên

giấy thấm đã khử trùng, thấm khô và cấy chuyển các mảnh lá lên môi trường

WPM.

Bước 4. Ch n l c Sau 2 ngày đồng nuôi cấy, tiến hành chuyển các

mảnh lá sang môi trường WPM đặc bổ sung kháng sinh cefotaxime 500 mg/l

và kanamycin 100 mg/l để chọn lọc những mảnh lá chuyển gen thành công.

Sau 2 - 4 tuần, các mảnh cấy bắt đầu cảm ứng tạo rễ được cắt và chuyển sang

môi trường WPM có bổ sung cefotaxime 400 mg/l và kanamycin 100 mg/l.

2.2.4.4. Biểu hiện tạm thời hIL-7 ở cây thuốc lá

Quá trình bi u hiện tạm thời protein hIL-7 gồm các bước chính sau

48

Bước 1: Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn: Chủng A. tumefaciens mang

vector pCB301_IL7/ELP mã hóa cho protein hIL-7 và chủng A.tumefaciens

mang vector chứa gen mã hóa cho protein HcPro ức chế câm gen hoạt động

trong cây được nuôi cấy riêng trong 200ml môi trường YEB có bổ sung kháng

sinh kanamycin 50 mg/ml và rifamycin 50 mg/ml, nuôi lắc qua đêm ở 28oC,

140rpm. Sau 24 giờ, chuyển 50 ml dịch khuẩn sang bình lớn, bổ sung 500 ml

môi trường LB với kháng sinh thích hợp vào hai bình nuôi cấy, nuôi thêm 24

giờ, ở 28oC, 140 rpm. Ly tâm 4000 rpm, 10 phút, 4

oC để thu cặn khuẩn, hòa

trong đệm (10 mM 2 - N - morpholimo MES acid ethanesulphonic, 10 mM

MgSO4, pH 5,6). Trộn lẫn 2 dịch khuẩn, pha loãng trong đệm để nồng độ khuẩn

cuối cùng đạt OD6000,5 chuẩn bị cho quá trình biến nạp vào cây thuốc lá

N.benthamiana.

Bước 2. Chuẩn bị c y thuốc lá N. benthamiana

Cây con sau giai đoạn nuôi cấy invitro khoảng 4 tuần tuổi được tiến

hành ra cây bầu nhỏ. Sau 1 - 1,5 tuần chuyển cây từ bầu nhỏ sang bầu lớn,

mỗi ngày tưới 1 - 2 lần nước. Khi cây 4 - 6 tuần và có từ 8 đến 12 lá sẽ được

sử dụng để biến nạp tạm thời.

Bước 3. Biến nạp

Bọc nilon quanh bầu đất và úp ngược cây chìm trong bình chứa dịch

khuẩn; đặt vào bình hút chân không. Tiến hành hút chân không ở điều kiện áp

suất 635 mm thủy ngân trong 2 phút, sau đó xả từ từ. Các cây sau biến nạp

được đặt trong nhà kính ở 21oC- 26

oC. Sau 6 ngày, tiến hành thu lá và bảo quản

ở -80oC để chuẩn bị kiểm tra sự biểu hiện của protein hIL-7 b ng phương pháp

western blot.

49

2.2.5. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen

2.2.5.1. ánh giá các chỉ số sinh trưởng của dòng tế bào BY2 chuyển gen

Sinh trưởng của dòng tế bào BY2 chuyển gen được đánh giá thông qua

các chỉ số khối lượng tươi và khối lượng khô của các dòng BY2 chuyển gen.

Quá trình đánh giá thực hiện theo phương pháp của Phạm Bích Ngọc

(2009)[105].

Chúng tôi sử dụng 1,5 ml huyền phù BY2 một tuần tuổi cấy chuyển

vào 30 ml môi trường mới có chứa kháng sinh kanamycin 100 mg/l và

cefotaxime 400 mg/l, còn dòng đối chứng không chuyển gen thì không bổ

sung kháng sinh. Tiến hành đánh giá sự tích lũy sinh khối tươi và sinh khối

khô trong 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 và 16 ngày. Khối lượng tươi và khối lượng

khô được xác định b ng cách hút 1 ml dịch huyền phù BY2 cho vào ống

Eppendorf loại 1,5 ml đã khoan lỗ ở đáy ống b ng kim tiêm, đặt lồng vào ống

Eppendorf loại 2 ml, ly tâm loại nước. Sau đó đem cân b ng cân phân tích,

thu được khối lượng tươi. Sau đó, sấy ở 105oC trong 3 giờ, cân để xác định

khối lượng khô.

2.2.5.2. ánh giá sinh trưởng của rễ tơ chuyển gen

Đánh giá sinh trưởng của các dòng rễ tơ chuyển gen thông qua các chỉ

tiêu khối lượng tươi, khối lượng khô và chiều dài rễ theo phương pháp của

Phạm Bích Ngọc năm 2009 [105].

Ch tiêu khối lượng tươi và khối lượng khô

Chúng tôi cân 0,2 g mẫu một số dòng chuyển gen cho vào bình tam

giác 250 ml chứa 20 ml môi trường MS lỏng, bổ sung kháng sinh kanamycin

100 mg/l. Đánh giá sinh khối tươi - khô của các dòng rễ tơ được tiến hành

nhiều lần trong 42 ngày, mỗi lần cách nhau 7 ngày. Thu toàn bộ rễ tơ được

nuôi trong môi trường lỏng, thấm khô môi trường, cân xác định khối lượng

tươi. Sau đó, sấy ở 105oC trong 3 giờ, cân xác định khối lượng khô.

50

Ch tiêu chiều dài rễ tơ

Tách rễ đơn dài khoảng 1 - 1,5 cm của một số dòng rễ tơ chuyển gen

đặt lên môi trường MS đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc. Quan sát sinh

trưởng và đo chiều dài rễ trong 0, 7, 14, 21 ngày nuôi cấy b ng thước kẻ

thẳng có khoảng chia mm.

2.2.6. Phân tích các dòng chuyển gen b ng thuật sinh học phân tử

2.2.6.1. Kỹ thuật PCR

DNA tổng số từ các dòng chuyển gen được tách chiết và sử dụng làm khuôn

cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_F và IL7_R. Sản phẩm PCR

được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.

2.2.6.2. Lai Western blot

Tách chiết protein tan tổng số: Thu 1 gam sinh khối nghiền thành bột

mịn trong nitơ lỏng b ng cối chày sứ, bổ sung đệm PBS 1X. Thu dịch nghiền

vào ống Eppendorf 2ml, ly tâm 10.000 rpm ở 4oC, thu dịch protein ở phía

trên. Protein tổng số được định lượng b ng phương pháp so màu của Bradford

(1976) [20] dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thụ cực đại và sự đổi màu xảy

ra khi CBB (Coomasie Brilliant Blue) liên kết với protein trong dung dịch

acid.

iện di protein tổng số và chuy n màng: Protein được phân tách b ng

điện di SDS-PAGE 12% trong điều kiện không khử, sau đó chuyển lên màng

nitrocellulose b ng máy chuyển màng Fast blotter G2 (Thermo Scientific

Pierce) ở 25V, 1,3A trong 20 phút. Tháo màng, tráng b ng nước khử ion trong

5 phút.

Bảng 2.4. Thành phần gel SDS-PAGE

Thành phần Gel tách Gel cô

Bản kính 1ml Bản kính 1,5ml Bản kính 1ml Bản kính 1,5ml

Nước khử ion 0,55 ml 1,1 ml 0,45 ml 1,3 ml

51

Tris HCl 1,125 ml 1,25ml 0,2 ml 0,5 ml

Glycerol 50% 0,9 ml 1,8 ml - -

Acrylamid 30% 1,89 ml 3,78 ml 0,14 ml 0,35 ml

SDS 10% 45 µl 90 µl 4 µl 10 µl

APS 10% 30 µl 60 µl 8 µl 20 µl

TEMED 3 µl 6 µl 1 µl 2 µl

* Tris HCl 1,5M; pH 8,8 cho gel tách.Tris HCl 0,5M, pH 6,8 cho gel

cô.

Blocking protein: Protein trên màng lai được blocking b ng sữa tách

béo 5% (pha trong PBS 0,05% Tween); ủ với kháng thể 1 anti c-myc nồng độ

180 µg/ml pha loãng tỷ lệ 1:100 qua đêm ở 4oC, rửa màng b ng dung dịch

PBST 3 lần, mỗi lần 5 phút; ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG cộng hợp

HRP pha loãng tỷ lệ 1:10.000 trong 1 giờ. Rửa màng b ng PBST 3 lần, mỗi

lần 10 phút.

Hiện màu protein: Protein hIL-7 trong mẫu được phát hiện nhờ phản ứng

hiện màu b ng cơ chất DAB (Diaminobenzidine) trong 15 phút đến khi hiện

băng màu nâu.

2.2.6.3. Sử dụng kỹ thuật ELISA để phân tích sự tích l y hIL-7 tái tổ hợp

K thuật ELISA gián tiếp định lượng protein hIL-7 thông qua định

lượng protein c-myc được tiến hành theo phương pháp của Sun và cộng sự

với một số cải tiến (2006) [143], gồm các bước chính: Bước 1: Pha loãng dịch

chiết protein tổng số của các mẫu chứa hIL-7đạt nồng độ 200 μg/ml, sử dụng

100 μl mẫu tra vào các ô trên đĩa microplate, mỗi mẫu lặp lại 3 lần; Bước 2: Ủ

qua đêm ở 4oC; rửa đĩa 2 lần b ng PBS-T (Tween 0,05%); Bước 3: Blocking

b ng sữa tách béo 5% pha trong PBS trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng; rửa đĩa 2

lần; Bước 4: Ủ với kháng thể 1 anti c-myc (180μg/ml) pha loãng 1:100 trong

2 giờ; lặp lại 3 lần; Ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG cộng hợp HRP pha

52

loãng 1:10.000 trong 1 giờ và cơ chất hiện màu là TMB; Bước 5: Dùng HCl

1N để dừng phản ứng màu; Đo màu ở bước sóng 630nm.

2.2.7. Tinh sạch protein hIL-7 tái tổ hợp

2.2.7.1. Phương pháp tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực Probond™ Nickel-

Chelating Resin (Invitrogen)

* Chuẩn bị cột: Lắc đều lọ đựng Pro BondTM

resin. Hút 2ml dung dịch

cho vào cột tinh sạch, để lắng dần hoặc ly tâm 800 rpm trong 1 phút, hút bỏ

dịch.

Bổ sung 6 ml nước khử ion khử trùng, đảo đều. Để lắng hoặc ly tâm, bỏ

dịch. Bổ sung 6 ml đệm binding, đảo đều, ly tâm bỏ dịch, thực hiện 2 lần.

* Tinh sạch: Thêm dung dịch đã siêu âm và lọc vào cột, đảo đều trong

30 - 60 phút.Ly tâm, thu cặn; phần dịch để riêng. Tiếp tục bổ sung 8 ml đệm

rửa vào cột. Ly tâm thu cặn; phần dịch để riêng. Lặp lại 4 lần.Bổ sung 8 - 12

ml đệm elution, thu từng phân đoạn 1 ml để điện di kiểm tra.

2.2.7.2. Phương pháp tinh sạch mITC

Nghiền 100 g lá trong nitơ lỏng b ng cối chày sứ. Bổ sung 200 ml Tris-

HCl 50 mM (pH8) lạnh. Ly tâm 25.000 rpm trong 30 phút ở 4oC. Dung dịch

đưa qua màng polyethersulfone (PES) 0,22 µm ở 4oC để thu dịch chiết trước

xử lý. Dịch chiết được làm ấm đến nhiệt độ phòng và lọc qua màng cellulose

acetate 0,2 µm sử dụng máy bơm. Rửa màng 2 lần b ng NaCl 2M để loại

protein lẫn. Nước Milipore-Q lạnh được chuyển qua màng lọc để thu hồi

protein hIL-7 tái tổ hợp.

2.2.8. Đánh giá hoạt tính protein hIL-7 tái tổ hợp

Để bước đầu đánh giá hoạt tính của protein hIL-7 tái tổ hợp chúng tôi

sử dụng dòng tế bào 2E8. Đây là dòng tế bào hoàn toàn phụ thuộc vào hIL-

7để tồn tại, sinh trưởng và sinh sản [66], [87].Khi môi trường nuôi cấy

không cóhIL-7 thì tế bào 2E8 sẽ chết sau 48 giờ. Vì thế, dòng tế bào 2E8

53

được sử dụng là dòng chuẩn để xác định hoạt tính sinh học của protein hIL-7

tự nhiên cũng như protein tái tổ hợp. Khi bổ sung hIL-7 vào môi trường nuôi

cấy, tùy theo hoạt tính sinh học của protein hIL-7 mà tế bào 2E8 sẽ duy trì

sự sống và khả năng hoạt hóa quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh sản

của tế bào, hoạt tính của protein hIL-7 càng mạnh thì khả năng sống sót và

hoạt hóa của tế bào 2E8 càng cao.

a. Nuôi cấy, bảo quản dòng tế bào 2E8

Môi trường nuôi cấy tế bào: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s

medium) có bổ sung 4 mM L-glutamin, 1.5 g/l sodium bicarbonate, 0.05 mM

2-mercaptoethanol, 1 ng/ml hIL-7 và 20% fetal bovine serum.

Nuôi cấy, duy trì: Tế bào nuôi ở dạng hỗn dịch với chu kỳ cấy chuyển

là từ 3 - 5 ngày và nuôi trong tủ ấm ở điều kiện 37oC và 5% CO2.

b. Th nghiệm hoạt tính protein hIL-7 tái tổ hợp

Lựa chọn dòng hIL-7 tái tổ hợp tốt nhất để thử nghiệm hoạt tính sinh

học. Sử dụng màng lọc có kích cỡ 0,22 µm để lọc khuẩn, sau đó pha loãng

b ng PBS đã khử trùng để đạt nồng độ gốc là 0,1 mg/ml.

Hai ngày sau cấy chuyển, tế bào 2E8 được rửa sạch 3 lần b ng môi

trường IMDM cơ bản (không có huyết thanh và không có hIL-7). Sau đó, hòa

trong môi trường IMDM với nồng độ 1 x 105 tế bào/ml và chuyển vào 96

giếng, thực hiện phản ứng ELISA (190 µl/giếng). Bổ sung mẫu protein hIL-7

tái tổ hợp vào các giếng với các nồng độ khác nhau. Lặp lại thí nghiệm 3 lần.

Các giếng đối chứng âm chỉ có tế bào 2E8 và môi trường nuôi cấy IMDM cơ

bản có bổ sung huyết thanh, không bổ sung hIL-7.

Các giếng được ủ trong tủ ấm CO2 với điều kiện 37oC, 5% CO2. Sau 48

giờ bổ sung thêm 30 µl dung dịch thuốc nhuộm trong bộ kit Non-radioactive

proliferation để định tính và định lượng protein hIL-7. Tiếp tục ủ trong tối 4

giờ và đọc kết quả b ng máy ELISA reader ở bước sóng 525 nm.

54

2.2.9. Phân tích thống ê ết quả thực nghiệm

Kết quả nghiên cứu của luận án được phân tích thống kê b ng phần

mềm Microsoft Excel 2016, Table Curve theo các tham số thống kê: giá trị

trung bình, độ lệch chuẩn ( ), sự sai khác giữa các giá trị trung bình được

kiểm định b ng giới hạn sai khác nhỏ nhất LSD của Fisher với α=0,05, chỉ số

ED50 v.v... [7]. Các chỉ tiêu nghiên cứu, thống kê gồm khối lượng tươi, khối

lượng khô, chiều dài rễ, hàm lượng hIL-7 tái tổ hợp. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3

lần.

55

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Thay đổi mã di truyền genhIL-7 tối ƣu biểu hiện ở thực vật

Chúng tôi sử dụng trình tự genhIL-7ở người được công bố trên Ngân

hàng Gen có mã sốJ04156.1 và bảng tần suất các codon phổ biến ở thực vật

(Codon Usage Database)[67], cùng với phần mềm Codon Optimization 2.0 để

loại bỏ và thay thế khoảng 10% các codon hiếm trong gen hIL-7 b ng các

codon phổ biến trong thực vật mà không làm thay đổi thành phần và trật tự

các acid amin. Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành loại bỏ trình tự ATTTA

trên gen hIL-7 được cho là gây bất ổn trong quá trình phiên mã mRNA [56],

kết hợp sử dụng phần mềm của Invitrogen để giảm thiểu sự hình thành cấu

trúc mRNA thứ cấp.

Ngoài ra, để chuẩn bị cho cắt và ghép nối gen trong quá trình thiết kế

vector chuyển gen, các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn NcoI, SacI đã

được thêm vào đầu 5’ và trình tự nhận biết của enzyme giới hạn HindIII được

thêm vào đầu 3’ của gen hIL-7. Đồng thời, chúng tôi thêm các trình tự

nucleotide mã hóa cho protein c-myc và epitope his-tag vào đầu 3’ của gen

hIL-7.

Để phân tích và kiểm tra mức độ phù hợp của các codon trên gen hIL-7

trước và sau khi cải biến mã di truyền, chúng tôi sử dụng công cụ Graphical

Codon Usage Analyzer. Các bộ ba hiếm có chỉ số phù hợp dưới 30% có khả

năng ảnh hưởng tới sự biểu hiện của protein hIL-7 trong hệ thống thực vật đã

được thay b ng các bộ ba đồng nghĩa.

Kết quả phân tích sự phù hợp của gen hIL-7 trước khi cải biến mã di

truyền có số codon mà tần suất sử dụng dưới 30 chiếm 4% (hình 3.1.A) được

phân bố rải rác trên gen (hình 3.2.A). Ngoài ra, chỉ số phù hợp codon CAI

(codon adaptation index) của gen hIL-7 trước cải biến đối với hệ thống biểu

56

hiện thực vật là 0,72. Sau cải biến chỉ số CAI của gen hIL-7 tăng lên 0,82 và

không còn các bộ ba có tần suất sử dụng dưới 30% (hình 3.1.B và 3.2.B), thay

vào đó là các mã có tần suất sử dụng cao 90-100% (hình 3.2.B).

Kết quả thể hiện trên hình 3.3 cho thấy, chúng tôi đã thành công trong

việc thay đổi mã di truyền của gen hIL-7 để phù hợp và nâng cao hiệu quả biểu

hiện trong thực vật mà không làm thay đổi trình tự acid amin so với gen gốc,

với độ tương đồng nucleotide là 63,6 %, độ tương đồng acid amin là 100%.

Hình 3.1. Sự phân bố tỷ lệ % phù hợp của các nhóm mã bộ ba gen hIL-7

biểu hiện trong hệ thống thực vật

57

A. Gen hIL-7 trước cải biến mã di truyền, B. Gen hIL-7 đã cải biến mã di

truyền

Hình 3.2. Biểu đồ phân bố tần suất sử dụng codon theo chiều dài gen hIL-7

khi biểu hiện trong hệ thống thực vật

A. Gen hIL-7 trước cải biến mã di truyền, B. Gen hIL-7 đã cải biến mã di truyền

Trình tự nucleotide genhIL-7 sau khi được tối ưu có kích thước 536bp,

được đặt tổng hợp nhân tạo tại hãng Epoch Life Science (Hoa Kỳ) và được

nhân dòng trong vector pBSK/IL7.

58

59

Hình 3.3. Trình tự genhIL-7 trước và sau tối ưu mã di truyền

3.2. Thiết kế vector chuyển genhIL-7 tái tổ hợp vào vi huẩn, dòng tế bào

BY2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá

Trong nội dung nghiên cứu của luận án, chúng tôi đã tiến hành thiết kế

4 vector chuyển gen: (1). pET32c(+)/IL7; (2). pENTR221/IL7/cal (3).

pK7WG2D.1/cal/IL7; (4). pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP; (5).

pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP. Trong đó, vector (2) được thiết kế

làm vector trung gian để thiết kế vector (3); vector (4) được thiết kế làm

vector trung gian để thiết kế vector (5). Các vector (1), (3), (5) được sử dụng

để chuyển vào các hệ thống biểu hiện.

3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen pET32c(+)/IL7

Sơ đồ mô phỏng cấu trúc vector pET32c(+)/IL7 được thể hiện trên hình

3.4

Hình 3.4. Cấu trúc vector pET32c(+)/IL7

Chúng tôi tiến hành biến nạp song song vector pBSK/IL7 và

pET32c(+) vào tế bào khả biến E. coli DH5α để nhân dòng. Sau đó, tách

plamid để sử dụng cho phản ứng cắt ghép tiếp theo.

Sử dụng cặp enzyme giới hạn NcoI và HindIII để cắt đồng thời vector

tách dòng pBSK/IL7 và vector pET32c(+) để tạo đầu dính sole, sản phẩm cắt

được kiểm tra trên gel agarose 0,8% (Hình 3.5.A).

Theo tính toán lý thuyết, khi cắt mở vòng vector pET32c(+) b ng

enzyme NcoI và HindIII sẽ thu được hai phân đoạn có kích thước 19bp và

5882bp; vector pBSK/IL7 sẽ thu được hai phân đoạn gồm pBSK có kích

thước 2883 bp vàgenhIL-7 có kích thước 536bp. Kết quả ở hình 3.5.A cho

NcoI HindIII

60

thấy ở đường chạy 1 thu được băng có kích thước khoảng 5,9kb tương ứng

với kích thước lý thuyết của vector pET32c(+); tại đường chạy 2 xuất hiện 2

băng có kích thước khoảng 2,9kb và 0,53kb tương ứng với kích thước của

vector pBSK và genhIL-7. Từ kết quả này, các phân đoạn hIL-7 và vector

pET32c(+) được tinh sạch, chuẩn bị cho phản ứng ghép nối.

Ghép nối genhIL-7 vào vector pET32c(+) sẽ thu được vector tái tổ hợp

pET32c(+)/IL7 có kích thước khoảng 6,43kb và được nhân dòng trong E.coli

DH5α. Tiến hành kiểm tra sự có mặt của vector pET32c(+)/IL7 tái tổ hợp

b ng phương pháp colony PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_F và IL7_R và b ng

phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn NcoI và HindIII từ các khuẩn lạc dương

tính trong môi trường chọn lọc.

A B C

Hình 3.5. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép

tạo vector chuyển gen pET32c(+)/IL7

(A). Kết quả điện di sản phẩm cắt mở vòng pET32c(+)(đường chạy 1) và vector

pBSK/IL7 (đường chạy 2) bằng cặp enzyme NcoI và HindIII; (B). Kết quả điện di sản

phẩm colony PCR pET32c(+)/IL7 bằng cặp mồi đặc hiệu IL7_F và IL7_R, (-). ối

chứng m (pET32c(+)),(+). ối chứng dương (pBSK/IL7); (C). Kết quả diện di sản

61

phẩm cắt ki m tra vector pET32c(+)/IL7 tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn NcoI và

HindIII; M. Thang DNA chuẩn 1kb.

Kết quả thể hiện trên hình 3.5.B và 3.5.C; ở đường chạy 1 hình 3.5.B

xuất hiện một băng đặc hiệu có kích thước khoảng 0,53kb tương đương với

kích thước genhIL-7 theo tính toán lý thuyết được khuếch đại b ng phản ứng

PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_F và IL7_R, còn ở đường chạy 1 hình 3.5.C

xuất hiện hai băng có kích thước khoảng 0,53kb và 5,9kb tương ứng với kích

thước của genhIL-7 và vector pET32c(+) mở vòng. Các kết quả này chứng tỏ

vector chuyển gen pET32c(+)/IL7 đã được thiết kế thành công. Cấu trúc này

sẽ được biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium rosetta gami B để biểu hiện

protein hIL-7 tái tổ hợp.

3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7

Cấu trúc vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7 được mô phỏng trên hình

3.6

Hình 3.6. Cấu trúc vector pENTR221/cal/IL7

Vector pENTR221 mang đoạn peptide tín hiệu calreticulin có vai trò

tăng cường khả năng cuộn, gấp để hình thành cấu trúc bậc cao của protein tái

tổ hợp[90] n m giữa hai vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2 và hai điểm cắt của

enzyme giới hạn là SacI và HindIII n m ở đầu 3’ của đoạn signal peptide, sẽ

trao đổi đoạn với hai vị trí tái tổ hợp attR1 và attR2 trên vector pK7WG2D.1.

Do đó, chúng tôi thiết kế vector pENTR221/cal/IL7 làm vector trung gian

nh m thiết kế vector pK7WG2D.1 tái tổ hợp mang cả genhIL-7 và đoạn

peptide tín hiệu calreculin theo phương pháp Gateway.

SacI HindIII

62

GenhIL-7 trong vector pBSK/IL7 được khuếch đại b ng phản ứng PCR

với cặp mồi IL7_F và IL7_R. Sản phẩm được tinh sạch và điện di kiểm tra trên

gel agarose 0,8%. Kết quả trên hình 3.7.A cho thấy, tại đường chạy 1 xuất hiện

một băng có kích thước khoảng 0,53 kb tương ứng với kích thước của genhIL-

7được khuếch đại b ng cặp mồi IL7_F và IL7_R. Sản phẩm PCR được tinh

sạch để thực hiện phản ứng cắt b ng cặp enzyme giới hạn SacI và HindIII tạo

đầu sole.

Theo tính toán, khi cắt mở vòng vector pENTR221 b ng enzyme SacI

và HindIII sẽ thu được phân đoạn có kích thước khoảng 2,5 kb. Kết quả ở

hình 3.7.B cho thấy ở đường chạy 1 thu được băng có kích thước khoảng 2,5

kb tương ứng với kích thước lý thuyết của vector pENTR221; tại đường chạy

2 xuất hiện một băng có kích thước khoảng 0,53kb tương ứng với kích thước

của genhIL-7. Từ kết quả này, các phân đoạn hIL-7 và vector pENTR221

được tinh sạch, chuẩn bị cho phản ứng ghép nối

A B C


tạo vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7

(A). Kết quả ki m tra sản phẩm PCR sau tinh sạch genhIL-7; (B). Kết quả

điện di sản phẩm cắt vector pENTR221 và genhIL-7 bằng cặp enzyme cắt giới

63

hạn SacI và HindIII; (C). Kết quả điện di sản phẩm cắt ki m tra vector

pENTR221/cal/IL7 tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn SacI và HindIII; M.

Thang DNA chuẩn 1kb

Thực hiện phản ứng lai ghép genhIL-7và vector pENTR221 với sự xúc

tác của enzyme T4 ligase ở 220C trong 1 giờ 30 phút, sẽ thu được vector

pENTR221/cal/IL7 tái tổ hợp có kích thước khoảng 3kb và được biến nạp vào

vi khuẩn E.coli DH5α đểtách dòng. Tiến hành tách plasmid từ các khuẩn lạc

dương tính trong môi trường chọn lọc và kiểm tra sự có mặt của vector

pENTR221/cal/IL7 tái tổ hợp b ng phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn SacI và

HindIII. Kết quả thể hiện ở hình 3.7.C cho thấy ở đường chạy 1 xuất hiện hai

băng có kích thước khoảng 2,5 kb và 0,53 kb tương ứng với kích thước của

vector pENTR221 mở vòng và genhIL-7. Điều này chứng tỏ vector chuyển

gen pENTR221/cal/IL7 đã được thiết kế thành công. Cấu trúc này sẽ được sử

dụng làm nguyên liệu để thiết kế vector chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7

b ng k thuật Gateway .

3.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7

Dựa trên cấu trúc vector pK7WG2D.1 có hai vị trí attR1, attR2 và

vector pENTR221/cal/IL7 có hai vị trí attL1, attL2 n m ở hai đầu của đoạn

gen cần chuyển. Hai vị trí này sẽ trao đổi với nhau khi thực hiện phản ứng

LR, chúng tôi đã thiết kế được vector chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7.

Chúng tôi thực hiện phản ứng LR (mục 2.2.3.2.e) giữa plasmid tiếp

nhận pENTR221/cal/IL7 và vector đích pK7WG2D.1 để tạo vector

pK7WG2D.1/cal/IL7 tái tổ hợp.

Để thu nhận dòng plasmid pK7WG2D.1/cal/IL7, hỗn hợp phản ứng LR

được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Sản phẩm của quá trình biến

nạp được nuôi trên môi trường chọn lọc có chứa kháng sinh. Những khuẩn lạc

mọc trên đĩa thạch là những khuẩn lạc mang plasmid pK7WG2D.1 mà gen

64

ccdB của nó đã bị đột biến hoặc mang vector pK7WG2D.1/cal/IL7. Do đó, để

chọn ra những dòng khuẩn lạc mang vector chuyển gen, chúng tôi kiểm tra

b ng phản ứng PCR colony và phản ứng cắt b ng enzyme giới hạn SacI và

HindIII.

Chúng tôi chọn 5 khuẩn lạc để tiến hành phản ứng colony PCR với cặp

mồi IL7_F và IL7_R. Những khuẩn lạc được chọn là những khuẩn lạc tròn

đều, không quá to hoặc quá nhỏ. Kết quả colony PCR được thể hiện ở hình

3.8 cho thấy, 5 khuẩn lạc đều cho kết quả dương tính, xuất hiện một băng

vạch có kích thước 536bp tương ứng với kích thước genhIL-7.

Hình 3.8. Kết quả colony PCR pK7WG2D.1/cal/IL7

M. Thang DNA chuẩn 1kb; 1-5: 5 khuẩn lạc thí nghiệm;

(-). ối chứng m (pK7WG2D.1); (+). ối chứng dương (pBSK/IL7)

65

Hình 3.9. Kết quả cắt pK7WG2D.1/cal/IL7 bằng enzyme SacI và HindIII

M. Thang DNA chuẩn 1kb (Fermentas); 1-2. Các mẫu pK7WG2D.1/cal/IL7;

(-). Mẫu pK7WG2D.1

Để tránh hiện tượng dương tính giả của phản ứng PCR, chúng tôi tiếp

tục tách plasmid và tiến hành phản ứng cắt b ng cặp enzyme giới hạn SacI và

HindIII. Kết quả thể hiện ở hình 3.9.

Theo tính toán lý thuyết, vector pK7WG2D.1 có kích thước 12794 bp

với 4 điểm cắt nhận biết của hai enzyme giới hạn SacI và HindIII. Do đó, khi

cắt b ng hai enzyme này sẽ thu được 3 phân đoạn có kích thước 434bp, 1201

bp và 11.159 bp; còn vector pK7WG2D.1/cal/IL7 khi cắt sẽ thu được 4 phân

đoạn, gồm 3 phân đoạn của vector pK7WG2D.1 và 1 phân đoạn genhIL-7.

Kết quả trên hình 3.9 cho thấy ở các đường chạy 1-2 thu được 4 băng tương

ứng với 3 băng của vector pK7WG2D.1 và 1 băng có kích thước 536bp tương

ứng với kích thước của genhIL-7, còn đường chạy (-) (đối chứng âm) chỉ thấy

xuất hiện 3 băng tương ứng với các phân đoạn của vector pK7WG2D.1.

Vector chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7 được biến nạp vào vi khuẩn

A.rhizogenes ATCC15834 b ng phương pháp xung điện. Sự có mặt của gen

chuyển cũng được kiểm tra b ng phản ứng colony PCR với cặp mồi IL7_F và

66

IL7_R và b ng phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn SacI và HindIII. Qua đó có

thể khẳng định, chúng tôi đã thiết kế thành công vector chuyển gen

pK7WG2D.1/cal/IL7 và chuyển vào vi khuẩn A.rhizogenes ATCC15834 để

chuẩn bị cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2.4. Thiết kế vector chuyển gen pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

Cấu trúc vector chuyển gen pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

được thiết kế dựa trên cấu trúc vector pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-

100xELP b ng cách loại bỏ và thay thế genTBAG b ng genhIL-7 được mô

phỏng như hình 3.10

Hình 3.10. Cấu trúc vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

Chúng tôi tiến hành nhân genhIL-7 từ vector pBSK/IL7 b ng phản ứng

PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R. Sản phẩm PCR

được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả thể hiện trên hình 3.11.A

cho thấy, chúng tôi thu được một băng có kích thước khoảng 564bp tương

ứng với kích thước genhIL-7 theo tính toán lý thuyết.

Vector pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-100xELPđược xử lý với

enzyme cắt giới hạn BamHI và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết

quả thể hiện trên hình 3.11.B cho thấy, tại đường chạy 1 xuất hiện 2 băng có

kích thước khoảng 5051 bp và 1152 bp tương ứng với kích thước của vector

pRTRA 35S-cmyc-histag-100xELP mở vòng và genTBAG theo tính toán lý

thuyết. Chúng tôi tiến hành thôi gel và tinh sạch đoạn DNA có kích thước

5051 bp để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.

Tiến hành lai ghép genhIL-7 vào vector pRTRA 35S-cmyc-histag-

100xELP tạo vector tái tổ hợp pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP với

BamHI BamHI

67

sự xúc tác của enzyme T4 ligase ở 220C trong 1 giờ 30 phút. Plasmid tái tổ

hợp sẽ được biến nạp vào tế bào E.coli DH 5α để nhân dòng b ng phương

pháp sốc nhiệt.

Để chọn lọc các dòng khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc có mang

vector chứa gen mã hóa protein hIL-7, chúng tôi thực hiện phản ứng colony

PCR với cặp mồi 35S-SQF và IL7_BamHI_R để kiểm tra chiều gắn của gen

trong vector. Kết quả thể hiện trên hình 3.11.C cho thấy, trong 10 dòng khuẩn

lạc thí nghiệm, có dòng 2, 4, 5, 7, 8, 9 dương tính với băng có kích thước

khoảng 0,8kb gồm kích thước của gen mã hóa protein hIL-7 (564bp) cộng

kích thước của promoter (250bp). Để loại bỏ khả năng dương tính giả của

phản ứng colony PCR, chúng tôi tiến hành tách plasmid các khuẩn lạc dương

tính và thực hiện phản ứng cắt b ng enzyme cắt giới hạn BamHI.

A B C D


tạovector chuyển gen pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

(A). Kết quả PCR nh n genhIL-7 bằng IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R; (B). Kết

quả cắt vector pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-100xELP bằng enzyme BamHI;

(C): Kết quả colony PCR bằng cặp mồi 35S-SQF và IL7_BamHI_R, 1-10: mẫu

khuẩn,(-). ối chứng m (pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-100xELP), (+). ối

chứng dương (pBSK/IL7); (D). Kết quả cắt ki m tra vector pRTRA 35S/IL7-

68

histag-cmyc-100xELP bằng enzyme giới hạn BamHI; M. Thang DNA chuẩn 1kb

(Fermentas)

Theo tính toán lý thuyết, vector pRTRA tái tổ hợp khi cắt b ng enzyme

giới hạn BamHI sẽ cho 2 băng khi kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Tại đường

chạy 1 trên hình 3.11.D xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 5 kb và 0,56 kb

tương ứng với kích thước vector pRTRA mở vòng và genhIL-7. Điều này khẳng

định, vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP đã được thiết kế thành

công. Cấu trúc này sẽ được biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5αđể nhân dòng và

sử dụng làm nguyên liệu để thiết kế vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-

100xELP.

3.2.5. Thiết kế vector chuyển gen pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

Plasmid pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và pCB301 được xử

lý b ng enzyme cắt giới hạn HindIII. Với plasmid pCB301 để tránh hiện

tượng tự đóng vòng, sản phẩm cắt với enzyme HindIII sau khi tinh sạch được

xử lý tiếp b ng enzyme SAP. Các sản phẩm cắt được điện di kiểm tra trên gel

agarose 0,8%. Trên hình 3.12.A, đường chạy 1 (sản phẩm cắt pRTRA

35S/IL7-cmyc-histag-100xELP) xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 2,9kb

và 2,6 kb; ở đường chạy 2 (sản phẩm cắt pCB301 đã xử lý qua SAP) có 1

băng có kích thước khoảng 5,6 kb. Điều này chứng tỏ đã cắt thành công

plasmid pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và pCB301 b ng enzyme

HindIII. Tiến hành tinh sạch các phân đoạn DNA có kích thước 2,9 kb và 5,6

kb chuẩn bị cho thí nghiệm tiếp theo.

Tiến hành lai ghép 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào vector mở vòng

pCB301 tạo vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và được biến nạp

69

b ng phương pháp sốc nhiệt vào vi khuẩn E.coli DH5α để chọn lọc, nhân

dòng.

A B C

Hình 3.12. Kết quả điện di các sản phẩm cắt ghép

tạo vector chuyển gen pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

(A). Kết quả x lý vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và vector

pCB301 bằng enzyme giới hạn HindIII; (B). Kết quả ki m tra colony PCR

pCB301/IL7-cmyc-histag-100xELP bằng cặp mồi IL7_BamHI_F và

IL7_BamHI_R, (-). ối chứng m (pCB301), (+). ối chứng dương

(pBSK/IL7); (C). Kết quả cắt ki m tra vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-

100xELP bằng enzyme giới hạn HindIII; M. Marker 1kb (Fermentas)

Chọn 5 khuẩn lạc, colony PCR với cặp mồi IL7_BamHI_F và

IL7_BamHI_R, kết quả trên hình 3.12.B cho thấy, ở các đường chạy xuất

hiện một băng kích thước khoảng 564bp tương ứng với kích thước genhIL-7

theo tính toán lý thuyết. Để tránh khả năng dương tính giả của PCR, chúng tôi

tiến hành tách plasmid và cắt kiểm tra b ng enzyme giới hạn HindIII. Kết quả

trên hình 3.12.C, đường chạy 1 xuất hiện hai băng kích thước khoảng 2.9 kb

và 5.6 kb theo đúng kích thước tính toán lý thuyết. Điều này chứng tỏ chúng

tôi đã thiết kế thành công vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP tái

tổ hợp.

70

Do chỉ dùng một enzyme cắt giới hạn khi tạo đầu dính giữa vector

pCB301 và cassette 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP nên chúng tôi sử dụng

enzyme giới hạn NcoI để kiểm tra chiều cassette chuyển vào so với chiều của

vector pCB301. Vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP tái tổ hợp có

hai vị trí nhận biết của enzyme giới hạn NcoI, một vị trí n m trên vector và

một vị trí n m trên cassette, do đó khi xử lý b ng NcoI sẽ cho ra 2 băng có

kích thước khác nhau tùy theo cassette gắn xuôi chiều hay ngược chiều với

vector pCB301.

Hình 3.13. Kết quả kiểm tra

vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP bằng enzyme NcoI

M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1. Sản phẩm cắt ngược chiều; 2. Sản phẩm cắt

xuôi chiều

Kết quả thể hiện trên hình 3.13 cho thấy, ở đường chạy 1 xuất hiện 2

băng có kích thước khoảng 3.6 kb và 4.9kb tương ứng với kích thước tính

toán lý thuyết khi cassette gắn ngược chiều với chiều của vector pCB301, còn

ở đường chạy 2 xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 6.9kb và 1.6 kb tương

ứng với trường hợp cassette gắn xuôi chiều với vector pCB301. Chúng tôi lựa

chọn những vector tái tổ hợp có chứa cassette ngược chiều sau khi cắt kiểm

71

tra để biến nạp vào tế bào A.tumefaciens C58C1 b ng xung điện, chuẩn bị cho

thí nghiệm tiếp theo.

3.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp

3.3.1. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong vi khuẩn

Vector pET32c(+)/IL7 tái tổ hợp được biến nạp vào vi khuẩn E.coli

Rosetta-gami B b ng phương pháp sốc nhiệt và được chọn lọc trên môi

trường LB có bổ sung kháng sinh chloramphenicol34 mg/l, carbenicillin

50ml/l và kanamycin 50 mg/l.

Chọn 5 khuẩn lạc dương tính và thực hiện phản ứng colony PCR với

cặp mồi đặc hiệu IL7_F và IL7_R, kết quả thể hiện trên hình 3.14.A. Tiến

hành tách plasmid pET32c(+)/IL7 và thực hiện phản ứng cắt b ng cặp

enzyme giới hạn NcoI và HindIII. Kết quả thể hiện trên hình 3.14.B.

Trên hình 3.14.A cho thấy, các đường chạy 1 - 5 đều xuất hiện một băng

có kích thước khoảng 536 bp tương ứng với kích thước genhIL-7 được nhân

lên b ng cặp mồi đặc hiệu IL7_F và IL7_R theo tính toán lý thuyết. Hình

3.14.B cho thấy, khi xử lý b ng cặp enzyme NcoI và HindIII thu được 2 băng

có kích thước khoảng 5,9 kb và 0,53 kb tương ứng với kích thước vector

pET32c(+) mở vòng và genIL-7. Điều này chứng tỏ đã biến nạp thành công

vector pET32c(+)/IL7 vào tế bào E.coli Rosetta-gami B để chuẩn bị cho thí

nghiệm tiếp theo.

72

A B

Hình 3.14. Kết quả kiểm tra chủng biểu hiện pET32c(+)/IL7/Rosetta

(A). Kết quả colony PCR bằng cặp mồi IL7_F và IL7_R, (-). ối chứng m

(pET32c(+)), (+). ối chứng dương (pBSK/IL7); (B). Kết quả cắt enzyme

giới hạn NcoI và HindIII; M. Thang DNA chuẩn 1 kb (Fermentas)

Tiến hành nuôi cấy tế bào E. coli Rosetta-gami B chứa plasmid tái tổ

hợp trong hai môi trường LB chọn lọc có bổ sung IPTG với các nồng độ 0,2;

0,4; 0,6 mM ở hai mức nhiệt độ 28oC và 37

oC.

Kết quả phân tích protein ở các dòng tế bào thể hiện trên hình 3.15

cho thấy, tại các đường chạy protein của các dòng E. coli rosetta-gami B

mang plasmid pET32c(+)/IL7 có cảm ứng IPTG xuất hiện một băng đậm nét

có kích thước khoảng 37 kDa tương ứng với kích thước của protein IL-7 tái

tổ hợp dung hợp với Thiodedoxin (Trx.tag), trình tự mã hóa cmyc-tag và

his-tag. Trong khi đó, dòng đối chứng nuôi cấy ở 370C (đường chạy 1) và

nuôi cấy ở 280C (đường chạy 5) không biểu hiện protein này. Với kết quả

này, có thể bước đầu khẳng định genhIL-7 đã được biểu hiện thành công

trong tế bào E. coli rosetta-gami B.

73

Để kiểm tra nhiệt độ và điều kiện cảm ứng tối ưu, chúng tôi tiến hành

nuôi cấy tế bào Rosetta-gami B có chứa plasmid tái tổ hợp ở hai điều kiện

nhiệt độ 370C và 28

0C với các nồng độ IPTG khác nhau. Kết quả nhận thấy

hIL-7 tái tổ hợp biểu hiện ở 370C tốt hơn ở 28

0C, kết quả điện di cho thấy các

vạch protein ở điều kiện 370C hàm lượng nhiều và phân tách rõ ràng hơn so

với 280C. Hơn nữa, khi tiến hành nuôi cấy Rosetta-gami B có chứa plasmid

tái tổ hợp trong môi trường chọn lọc có bổ sung IPTG với nồng độ khác nhau

cho thấy hIL-7 biểu hiện mạnh nhất khi cảm ứng IPTG 0,4 mM trong 3 giờ ở

370C.

Hình 3.15. Kết quả kiểm tra khả năng biểu hiện hIL-7

từ vi khuẩn E. coli Rosetta gami Bnuôi ở 37oC và 28

oC

1 - 4 Nuôi cấy 370C; 1 không bổ sung IPTG, 2: 0,6 mM IPTG, 3: 0,4 mM

IPTG, 4: 0,2 mM IPTG; 5 - 8: Nuôi cấy 28oC; 5 không bổ sung IPTG,6: 0,6

mM IPTG, 7: 0,4 mM IPTG, 8: 0,2 mM IPTG; M: thang protein chuẩn

(Fermentas)

74

Trong quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp, một điểm thiết yếu cần xác

định là protein biểu hiện có phải chính xác là protein mong muốn hay không.

Để khẳng định điều đó, ngoài việc xác định qua băng điện di SDS-PAGE,

chúng tôi sử dụng k thuật lai miễn dịch Western blot. Trong thí nghiệm này,

dựa trên đặc tính của hệ biểu hiện pET32c(+) là sự dung hợp protein đích với

cmyc - một polypeptide gồm 10 amino acid ở vùng đầu C. Vì không có kháng

thể đặc hiệu nhận biết IL-7 nên việc thêm đuôi cmyc cho phép chúng tôi phát

hiện protein này b ng cách sử dụng kháng thể kháng lại kháng nguyên cMyc.

Ở bước tiếp theo, kháng thể thứ hai anti-mouse cộng hợp HRP được sử dụng

để gắn vào kháng thể anti-cmyc nh m nhận biết phản ứng đặc hiệu kháng

nguyên - kháng thể; myc-antimyc. Đuôi HRP phân giải cơ chất DAB là cơ sở

đánh giá mức độ phản ứng lai kháng nguyên - kháng thể cũng như sự có mặt

của hIL-7 trong mẫu protein được tách chiết. Độ nhạy của phản ứng lai

Western blot được đánh giá b ng đối chứng dương là protein tái tổ hợp scFv

có trình tự c-myc với nồng độ xác định là 50 ng/µl. Ngoài ra, chúng tôi có thể

định lượng được lượng protein IL-7 có trong mẫu khi so sánh mầu sắc các

vạch mẫu với vạch đối chứng dương. Đồng thời, để khẳng định băng kích

thước 80 kDa có phải trạng thái dimer không, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu

số 3 với DTT ở các nồng độ và thời gian khác nhau.

Bảng 3.1. Xử lý mẫu protein với DTT

STT Mẫu Nồng

độ DTT

Thời

gian

Nhiệt

độ

1 100 µl mẫu + 100 µ DTT 1M 500 mM

2 giờ 37oC

2 100 µl mẫu + 80 µl DTT 1M + 20 µl nước khử ion 400 mM



5 100 µl mẫu + 40 µl DTT 1M + 60 µl nước khử ion 200 mM 30 50oC

75

6 100 µl mẫu + 40 µl DTT 1M + 60 µl nước khử ion 200 mM phút

Kết quả trên hình 3.16 cho thấy, ở đường chạy protein số 2,3,4,5,6, 7xuất

hiện một băng màu đậm, rõ nét có kích thước khoảng 37kDa, là kích thước

protein hIL-7 dung hợp với thiodedoxin, trình tự mã hoá c-myc và histag đúng

như tính toán lý thuyết, trong khi ở dòng đối chứng âm không có protein này.

Hình 3.16. Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7 pha tan bằng Western blot

(-). ối chứng m: mẫu protein không cảm ứng IPTG; 1. Mẫu protein không

x lý DTT; 2, 3, 4, 5, 6, 7: mẫu protein x lý DTT ở các điều kiện khác nhau;

(+). ối chứng dương: 150 ng protein scFv; M. Thang chuẩn protein

(Fermentas).

Từ các kết quả thu được, cho thấy chúng tôi đã biểu hiện thành công

protein IL7 trong tế bào Rosetta-gami B và protein tái tổ hợp hIL-7 tồn tại ở

cả hai pha cặn và tan. Điều này chứng tỏ gen hIL-7 tái tổ hợp hoạt động ổn

định và sẽ tiếp tục được chuyển vào các hệ thống biểu hiện ở thực vật để thu

nhận được protein hIL-7 tái tổ hợp.

76

3.3.2. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2

3.3.2.1. Tạo dòng tế bào thuốc lá BY2 mang genhIL-7

Chúng tôi sử dụng 50 ng plasmid pK7WG2D.1/cal/IL7 để biến nạp vào

tế bào khả biến A. tumefaciens Cv58. Sản phẩm của quá trình biến nạp được

chọn lọc trên môi trường LB bổ sung kháng sinh kanamycin 50 mg/l ở 28oC.

Sau 2 ngày, những dòng khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc được kiểm

tra gen hIL-7b ng phản ứng colony PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu IL7_F và

IL7_R, điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 0,8%.

Hình 3.17. Kết quả kiểm tra colony PCR pK7WG2D.1/IL7/Cv58

M. Thang DNA chuẩn 1 kb; (+). ối chứng dương (pBSK/IL7); (-). ối

chứng m (pK7WG2D.1); 1 - 5: các dòng khuẩn lạc

Kết quả thể hiện trên hình 3.17 cho thấy, tại đường chạy số 1, 3, 4, 5

xuất hiện một băng có kích thước khoảng 536 bp, tương ứng với kích thước

gen hIL-7 khi khuếch đại b ng cặp mồi IL7_F và IL7_R theo tính toán lý

thuyết, đường chạy đối chứng dương là plasmid pBSK/IL7 cũng xuất hiện

một băng có kích thước khoảng 536 bp và đường chạy đối chứng âm không

xuất hiện băng nào cho thấy phản ứng PCR xảy ra bình thường, các mẫu

không bị nhiễm. Điều này cho thấy, chúng tôi đã biến nạp thành công vector

pK7WG2D.1/cal/IL7 vào vi khuẩn A. tumefaciens Cv58.

77

Để chuyển cấu trúc vector pK7WG2D.1/cal/IL7 vào dòng tế bào thuốc

lá BY2, chúng tôi tiến hành chuẩn bị dịch huyền phù tế bào BY2 và dịch

huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu trúc vector tái tổ hợp.

Với phương pháp trình bày ở mục 2.2.4.2, tế bào BY2 được đồng nuôi

cấy với tế bào vi khuẩn A.tumefacies Cv58 trong 2 ngày, sau đó chuyển sang

môi trường chọn lọc. Sau 3 tuần, thu được 80 dòng tế bào BY2 sinh trưởng tốt

trên môi trường chọn lọc có chứa kháng sinh cefotaxime 500 mg/l và

kanamycin 50 mg/l. Kết quả thể hiện trên hình 3.18.

Bảng 3.2. Kết quả tạo và chọn dòng tế bào BY2 mang genhIL-7

Hình 3.18.Chọn lọc dòng tế bào BY2 sau chuyển gen

(A). Tế bào B 2 dại trong môi trường không chứa kháng sinh ch n l c; (B). Tế

bào B 2 dại trong môi trường chứa kháng sinh ch n l c; (C). Tế bào B 2 chuy n

gen sau 1 lần ch n l c; (D). Dòng tế bào B 2 sau 5 lần ch n l c trên môi trường

đặc; (E). Dòng tế bào B 2 sau 5 lần ch n l c trên môi trường lỏng

78

Lần chọn lọc Số dòng BY2 thu được

Chọn lọc lần 1 80





Tiếp tục chọn lọc nh m mục đích thu nhận được những dòng BY2

chuyển gen ổn định và đồng nhất, sau 5 lần cấy chuyển với khoảng cách các

lần là 1 tuần, số dòng tế bào BY2 chuyển gen phát triển tốt và ổn định là 20

dòng.

Qua bảng thống kê cho thấy, ở 3 lần chọn lọc đầu tiên, các dòng tế bào

huyền phù BY2 mang genhIL-7 chưa phát triển ổn định, có thể do gen chuyển

gắn vào vị trí không ổn định trong hệ gen tế bào chủ, các dòng tế bào này sinh

trưởng chậm và chết dần trên môi trường chọn lọc. Từ lần chọn lọc thứ 3 trở

đi, các dòng tế bào đã phát triển sinh trưởng tốt và ổn định trên môi trường

chọn lọc, các mô sẹo phát triển to đều, có màu vàng nhạt. Những dòng tế bào

BY2 phát triển ổn định sau 5 lần chọn lọc sẽ được kiểm tra sự có mặt của gen

chuyển hIL-7 b ng phương pháp PCR.

3.3.2.2. ánh giá các dòng tế bào BY2 bằng kỹ thuật PCR

Để khẳng định các dòng tế bào huyền phù BY2 đã chọn lọc có mang

gen mã hóa hIL-7, chúng tôi tiến hành chọn lọc các dòng tế bào BY2 sinh

trưởng ổn định sau 5 lần chọn lọc để tách chiết và kiểm tra DNA tổng số.

Bảng 3.3. Nồng độ DNA tổng số của 20 dòng tế bào BY2

Dòng Độ tinh

sạch

Định lƣợng

ng/µl Dòng

Độ tinh

sạch

Định lƣợng

ng/µl

1 1,96 134,2 35 1,89 776,0

2 1,91 500,2 36 1,82 237,3

79

3 1,85 285,5 37 1,86 149,3

5 1,98 187,8 38 1,95 308,2

7 1,89 481,0 39 1,97 755,0

13 1,97 719,3 68 1,99 441,5

14 1,92 287,6 71 1,84 270,0

28 1,80 237,4 74 1,87 143,8

32 1,83 733,8 75 1,81 341,1

33 1,94 633,1 78 1,96 298,6

Bảng 3.3 cho thấy, các mẫu DNA tách chiết có độ tinh sạch cao từ 1,8 -

2 với nồng độ DNA tổng số khá cao; điều này chứng tỏ các mẫu tách chiết

đảm bảo độ tinh sạch cho các thí nghiệm tiếp theo.

Để kiểm tra sự có mặt của gen mã hóa hIL-7 trong hệ gen của các dòng

tế bào huyền phù BY2 chuyển gen, chúng tôi tiến hành PCR các mẫu DNA

tổng số b ng cặp mồi đặc hiệu IL7_F và IL7_R, sản phẩm PCR được điện di

kiểm tra trên gel agarose 0,8%.

Kết quả thể hiện trên hình 3.19 cho thấy, ở các đường chạy 1 - 5 chỉ

xuất hiện duy nhất 1 băng có kích thước khoảng 536 bp, tương ứng với kích

thước gen hIL-7 được nhân lên b ng cặp mồi IL7_F và IL7_R.

Hình 3.19. Kết quả PCR các dòng BY2 chuyển gen bằng IL7_F và IL7_R

M. Thang DNA chuẩn 1kb; 1-5 các dòng tế bào B 2 chuy n gen;

80

(+). ối chứng dương: pBSK/IL7; (-). ối chứng m dòng B 2 hoang dại

Mặt khác, để tránh hiện tượng dương tính giả do vi khuẩn

A.tumefaciens tồn tại trong mô tế bào chuyển gen, chúng tôi tiếp tục PCR các

dòng tế bào BY2 dương tính với cặp mồi đặc hiệu genvirC, đây là gen n m

trên vùng Ri - plasmid của vi khuẩn A. rhizogenes được sử dụng để kiểm tra

sự tồn tại của khuẩn trong mẫu nghiên cứu.

Tại các đường chạy 1 - 5 (hình 3.20) không xuất hiện băng nào, cho thấy

các dòng tế bào huyền phù BY2 chuyển gen đều sạch khuẩn và mang genhIL-

7.

Hình 3.20. Kết quả PCR các dòng BY2 chuyển gen bằng cặp mồi gen virC

(+). ối chứng dương với vi khuẩn A. tumefaciens; M. Thang DNA chuẩn

1kb (Fermentas);1 - 5 các dòng tế bào B 2 chuy n gen

Từ kết quả ở hình 3.19 và 3.20 cho thấy, chúng tôi đã biến nạp thành

công gen mã hóa protein hIL-7 vào các dòng tế bào thuốc lá BY2.

3.3.2.3. Đánh giá sinh trƣởng các dòng tế bào BY2 chuyển gen

Chọn 5 dòng huyền phù 2, 3, 13, 32, 39 chuyển gen và nuôi cấy sang

môi trường lỏng để đánh giá sự sinh trưởng của các dòng BY2 chuyển gen. Sau

3 lần cấy chuyển (21 ngày) trên môi trường có kháng sinh chọn lọc, thu được

các dòng tế bào huyền phù đồng nhất, các tế bào có màu vàng nhạt, sáng, so

81

với dòng tế bào BY2 không chuyển gen thì không thấy sự khác biệt nhiều về

hình thái.

Hình 3.21. Các dòng tế bào huyền phù BY2 sau 21 ngày nuôi cấy

A. Dòng B 2 không chuy n gen ( C), B. Dòng BY2 chuy n genhIL-7

82

Bảng 3.4. Khối lượng tươi và khối lượng khô của một số dòng tế bào BY2

2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày 10 ngày 12 ngày 14 ngày 16 ngày

Khối lƣợng tƣơi* (g/ml)

BY2 (WT) MT2 0,033b 0,011

e 0,052

e 0,051

f 0,051

f 0,034

e 0,032

e 0

e

BY2 (WT) MT0 0,041a 0,009

a 0,262

a 0,489

a 0,789

a 0,865

a 0,812

a 0,765

b

Dòng 2 0,036ab

0,065b 0,202

c 0,385

e 0,596

e 0,711

d 0,693

e 0,675

e

Dòng 3 0,039ab

0,052d 0,186

d 0,412

c 0,686

b 0,792

b 0,784

b 0,729

c

Dòng 13 0,032b 0,061

c 0,193

d 0,401

d 0,552

b 0,705

c 0,713

d 0,683

c

Dòng 32 0,037ab

0,056c 0,211

b 0,426

b 0,675

c 0,774

c 0,752

c 0,735

c

Dòng 39 0,038ab

0,062b 0,198

c 0,405

d 0,612

d 0,764

c 0,701

d 0,686

d

Khối lƣợng hô* (g/ml)

BY2 (WT) MT2 0,009c 0,012

c 0,009

c 0,025

d 0,025

f 0,016

e 0,016

e 0

b

BY2 (WT) MT0 0,012abc

0,036a 0,104

a 0,232

a 0,501

a 0,531

a 0,506

a 0,492

a

Dòng 2 0,016a 0,034

a 0,094

b 0,198

c 0,329

d 0,416

d 0,402

e 0,387

e

Dòng 3 0,011bc

0,028b 0,081

c 0,198

c 0,392

c 0,478

b 0,465

b 0,442

b

Dòng 13 0,012b 0,031

b 0,083

d 0,196

c 0,335

c 0,436

c 0,405

b 0,386

c

Dòng 32 0,015ab

0,032ab

0,098ab

0,215b 0,398

b 0,440

c 0,426

c 0,402

c

Dòng 39 0,010c 0,031

ab 0,086

c 0,201

c 0,341

d 0,437

c 0,406

d 0,392

d

Ghi chú * giá trị trung bình của 3 thí nghiệm độc lập. Trong cùng một cột, kí tự theo sau khác nhau thể hiện sự sai khác giữa các nghiệm thức theo

trắc nghiệm phân hạng t Test (LSD) với α = 0,05. Đối chứng BY2 (Wt)-MT2: dòng tế bào BY2 không chuyển gen nuôi cấy trong môi trường kháng

sinh chọn lọc.Đối chứng BY2 (Wt)-MT0: dòng tế bào không chuyển gen nuôi cấy trong môi trường không có kháng sinh chọn lọc.

Dòng

Ngày nuôi

cấy

83

Tiến hành đánh giá sinh trưởng của các dòng tế bào chuyển gen mang

gen hIL-7 với dòng tế bào BY2 không chuyển gen thông qua sự tích lũy khối

lượng tươi và khối lượng khô; kết quả thể hiện trong bảng 3.4

Khi phân tích ANOVA khối lượng tươi và khối lượng khô thì dòng đối

chứng BY2 (Wt)-MT0 cho kết quả tốt nhất. Dòng kém nhất là dòng đối chứng

BY2 (Wt)-MT2, kết quả phân tích đa số là e và f. Các dòng chuyển gen không

có sự khác biệt lớn với nhau, kết quả thường ở trung gian b và c.

So sánh khối lượng khô và khối lượng tươi của các dòng chuyển gen qua

các ngày nhận thấy: Ngày 2, 4 thu sinh khối ở dòng 2 là tốt nhất (khối lượng

tươi ở ab, khối lượng khô ở a).Ngày 6, 8, 10 thu sinh khối ở dòng 32 tốt nhất

(khối lượng tươi ở b, khối lượng khô ở b). Các dòng khác đa số ở mức c và

d.Ngày 12 khối lượng trung bình của tế bào BY2 chuyển gen ở các dòng cao

nhất (0,792 g/ml tươi và 0,479 g/ml khô ở dòng 3). Thời điểm này thu tế bào để

tách chiết các chất phục vụ nghiên cứu là tốt nhất. Trong các dòng tế bào thì

dòng 3 có kết quả phân tích là b, sẽ thu được sinh khối tốt nhất ở dòng này. Do

đó, khi làm các nghiên cứu sâu hơn về tế bào BY2 mang gen IL-7, chúng tôi sẽ

chọn 2 dòng này.

Hình 3.22. ồ thị sinh trưởng của một số dòng tế bào

huyền phù thuốc lá BY2 chuyển gen (theo khối lượng tươi)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

2 4 6 8 10 12 14 16

Khố

i lượng tươi (g/m

l)

Thời gian nuôi cấy (ngày)

BY-2 (wt)-MT2

BY-2 (wt)-MT0

Dòng 3

Dòng 39

Dòng 2

Dong 32

Dong 13

84

Hình 3.23. ồ thị sinh trưởng của một số dòng tế bào

huyền phù thuốc lá BY2chuyển gen (theo khối lượng khô)

Từ bảng thống kê 3.4, chúng tôi dựng biểu đồ sinh trưởng của các dòng

tế bào huyền phù BY2 chuyển gen để so sánh khả năng sinh trưởng của các

dòng tế bào này với dòng tế bào huyền phù BY2 đối chứng không chuyển

gen.

Qua biểu đồ hình 3.22 và 3.23 chúng tôi thấy r ng, ở các dòng tế bào

đối chứng không chuyển gen mã hoá hIL-7 khi nuôi trong môi trường chọn

lọc có kháng sinh chọn lọc (MT2) thì các tế bào gần như không phát triển, các

tế bào hoá màu nâu đen và chết sau 10 ngày chọn lọc. Quan sát các dòng tế

bào huyền phù 2, 3, 13, 32, 39 chuyển gen có khả năng sinh trưởng khá đồng

đều. Sau 6 ngày cấy chuyển đầu tiên, các tế bào bắt đầu phân chia song số

lượng tế bào thu được còn ít, giai đoạn này tương ứng với pha tiềm phát. Tại

pha này, các tế bào huyền phù gần như rất ít phát triển, các tế bào chủ yếu là

phản ứng thích nghi với môi trường nuôi cấy mới.

Khối lượng tế bào tăng nhanh từ ngày thứ 8 đến ngày thứ 12, giai đoạn

này ứng với pha phát triển. Ở pha này, các tế bào sau khi trải qua thời gian

thích nghi và bắt đầu phát triển với tốc độ lu thừa, các tế bào phát triển

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

2 4 6 8 10 12 14 16

Khố

i lượng khô (g/m

l)

Thời gian nuôi cấy (ngày)

Đối chứng BY-2 (Wt)-MT2

Đối chứng BY-2 (Wt)-MT0

Dòng 3

Dòng 39

Dòng 2

Dòng 32

Dòng 13

85

nhanh tạo ra một lượng lớn, màu sắc các tế bào huyền phù có màu vàng, sáng,

các tế bào rời không tạo cụm.

Từ ngày 12 đến ngày 14, chúng tôi nhận thấy khối lượng tế bào thu

được không tăng, giai đoạn này tương ứng với pha ổn định. Trong pha này,

các tế bào gần như không phát triển và không có sự phân chia.

Từ ngày 14 đến 16, chúng tôi thấy r ng khối lượng tế bào thu được

không tăng mà còn giảm, giai đoạn này tương ứng với pha suy tàn, các tế bào

già và chết, phân huỷ trong môi trường, màu sắc tế bào chuyển sang màu nâu,

đen.

3.3.2.4. Phân tích sự biểu hiện của hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng BY2

chuyển gen

Để đánh giá sự biểu hiện protein hIL-7 trong các dòng tế bào thuốc lá

BY-2 chuyển gen, chúng tôi sử dụng các dòng tế bào BY2 chuyển gen và một

dòng không chuyển gen (đối chứng âm) sau 12 ngày nuôi cấy để tách chiết

protein tan tổng số, điện di kiểm tra trên gel 12,6% SDS polyacrylamide, tiến

hành xử lý DTT protein của các dòng tế bào BY2 và thực hiện phản ứng lai

miễn dịch Western blot để đánh giá chất lượng protein thông qua protein c-

myc, phát hiện sự có mặt của protein hIL-7 b ng kháng thể kháng c-Myc. Độ

nhạy của phản ứng Western blot được đánh giá b ng đối chứng dương là

protein tái tổ hợp scFV có gắn đuôi c-Myc. Kết quả thể hiện trên hình 3.24.

Kết quả cho thấy, các dòng BY2 chuyển gen hIL-7 số 2, 3, 32 xuất

hiện một băng khoảng 23 kDa, tương ứng với kích thước protein hIL-7 có

gắn thêm protein cmyc và histag theo tính toán lý thuyết. Trong khi đó,

dòng số 13, 39 không xuất hiện băng protein IL-7 mặc dù kết quả kiểm tra

b ng PCR cho kết quả dương tính, điều này có thể do hiện tượng gen

chuyển không hoạt động [143].

86

Từ những kết quả trên cho thấy, chúng tôi đã thiết kế và biểu hiện

thành công protein hIL-7 tái tổ hợp trong tế bào huyền phù BY2.

Hình 3.24. Kiểm tra sự biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp

trong các dòng tế bào huyền phù BY2 bằng Western blot

M. Thang protein chuẩn; (+). ối chứng dương (protein scFv 150 ng); (-). ối

chứng m (dòng tế bào B 2 hoang dại); 1 - 5 các dòng tế bào B 2 chuy n

gen; Phản ứng lai s d ng kháng th anti c- myc

Chúng tôi sử dụng k thuật ELISA để đánh giá gián tiếp mức độ biểu

hiện của protein hIL-7 trong các dòng BY2 chuyển gen dương tính khi kiểm

tra b ng Western blot. Hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp gắn đuôi c-myc

được tính toán dựa trên phương trình đường chuẩn của protein scFv gắn đuôi

c-myc (phụ lục). Kết quả thể hiện trên hình 3.25.

Hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp tích lũy trong các tế bào huyền phù

chuyển gen BY2 dao động từ 2,25 ng/µg đến 3,25 ng/µg protein tan tổng số.

Trong đó, cao nhất là dòng tế bào BY2 số 32 đạt 3,25 ng/µg protein tan tổng số

và thấp nhất là dòng tế bào BY2 số 2 đạt 2,25 ng/µg protein tan tổng số. Tuy

nhiên, mức độ tích lũy protein hIL-7 tái tổ hợp còn thấp so với protein tổng số.

87

3.3.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng rễ tơ chuyển gen

3.3.3.1. Tạo dòng rễ tơ chuyển gen mang genhIL-7

Để chuẩn bị cho thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành cảm ứng mảnh lá

thuốc lá trong môi trường WPM trước 2 ngày. Đồng thời, tiến hành nuôi

khuẩn A.rhizogenes ATCC15834 mang vector pK7WG2D.1/cal/IL7 trong môi

trường YMB có bổ sung kháng sinh spectinomycin 100 mg/l.

Sau 2 ngày cảm ứng, các mảnh lá thuốc lá được đồng nuôi cấy với vi

khuẩn A. rhizogenes mang vector chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7 (mục

2.2.4.3). Các mảnh lá được nuôi cộng sinh 2-3 ngày và được cấy chuyển sang

môi trường WPM có kháng sinh cefotaxime 500 mg/l và kanamycin 100 mg/l

để chọn lọc. Số lượng mô lá sống sót trên môi trường chọn lọc giảm dần theo

thời gian, sau 3 tuần, những mô lá sống sót bắt đầu cảm ứng tạo rễ tơ, kết quả

thể hiện trên bảng 3.5.

2,25

3 3,25

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

Dòng 2 Dòng 3 Dòng 32

Hàm

lượng hIL

-7 (

ng

/μg protein tổng số)

Dòng BY2 chuyển gen Hình 3.25. Biểu đồ so sánh hàm lượng

hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng BY2 chuyển gen

88

Bảng 3.5. Kết quả chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7

vào mô lá thuốc lá trên môi trường chọn lọc

Lô thí

nghiệm

Tổng số

mô lá

Số mô lá sống

sót sau 1 tuần

Số mô lá sống

sót sau 2 tuần

Số mô lá sống

sót sau 3 tuần

1 70 49 33 25

2 70 52 36 28

3 70 50 37 26

Tổng số 210 151 106 79

Kết quả tạo dòng và hình ảnh các mảnh lá trên môi trường chọn lọc

được thể hiện qua bảng 3.6 và hình 3.26.

Bảng 3.6. Kết quả tạo dòng rễ tơ chuyển genhIL-7

Lô thí

nghiệm

Số

mẫu

Mẫu cảm

ứng tạo rễ Số rễ/mảnh lá Chọn lọc rễ

Số

lƣợng

Tỷ lệ

(%) 7 ngày 15 ngày

Số rễ

tách

riêng

Số

rễ

sống

sót

Tỷ

lệ

(%)

1 70 25 35,71 2,34±1,15 12,31±1,22 108 108 100

2 70 28 40 2,33±1,45 11,27±1,14 102 102 100

3 70 26 37,14 2,14±1,24 9,56±1,34 95 95 100

Tổng số 210 79 37,62 2,27±1,28 11,04±1,23 305 305 100

Các dòng rễ tơ chuyển gen sẽ được chuyển sang nuôi cấy lỏng thu sinh

khối để tách chiết protein hIL-7 tái tổ hợp. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã

sử dụng trình tự nucleotide tín hiệu calreticulin ở đầu 5’ của genhIL-7, đoạn

tín hiệu này có chức năng dẫn protein tái tổ hợp biểu hiện ra môi trường nuôi

cấy giúp việc tinh sạch các protein tái tổ hợp được dễ dàng hơn [134].

89

Hình 3.26. Kết quả quá trình tạo và chọn dòng rễ tơ chuyển genhIL-7

(A).Giai đoạn đồng nuôi cấy; (B). Mảnh lá trên môi trường ch n l c; (C).

Mảnh lá cảm ứng tạo rễ sau 3 tuần; (D). Rễ tơ sinh trưởng nhanh sau 15

ngày cấy chuy n; (E). Rễ tơ chuy n gen trong môi trường lỏng

3.3.3.2. Kiểm tra các dòng rễ tơ chuyển genhIL-7 bằng kỹ thuật PCR

Để kiểm tra sự có mặt của genhIL-7 trong các dòng rễ tơ chuyển gen,

chúng tôi chọn ngẫu nhiên 5 dòng rễ tơ từ các dòng sống sót sau chọn lọc,

sinh trưởng ổn định và tiến hành phản ứng PCR b ng cặp mồi đặc hiệu IL7_F

và IL7_R. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.

Hình 3.27. Kết quả PCR 5 dòng rễ tơ bằng cặp mồi IL7_F và IL7_R

M. Thang DNA chuẩn 1kb; 1 - 5. Các dòng rễ tơ chuy n gen;(-). ối chứng

m dòng rễ tơ không chuy n gen; (+). ối chứng dương: pBSK/IL7

90

Kết quả thể hiện trên hình 3.27 cho thấy, ở các giếng 1-5 đều xuất hiện

một băng đặc hiệu, kích thước khoảng 536 bp, tương ứng với kích thước gen

hIL-7 khi được nhân b ng cặp mồi IL7_F và IL7_R. Điều này chứng tỏ,

chúng tôi đã chuyển thành công gen hIL-7 vào rễ tơ thuốc lá, là tiền đề cho

các thí nghiệm biểu hiện protein tiếp theo.

3.3.3.3. ánh giá sinh trưởng một số dòng rễ tơ chuyển gen

a. ánh giá ch tiêu khối lượng khô và khối lượng tươi

Khối lượng khô và khối lượng tươi cho phép đánh giá khả năng tích lũy

sinh khối của hệ thống rễ tơ ở quy mô phòng thí nghiệm. Chúng tôi sử dụng 5

dòng rễ tơ đã đánh giá b ng k thuật PCR và một dòng rễ tơ không chuyển

gen (đối chứng âm) để đánh giá khả năng sinh trưởng của các dòng rễ tơ trong

42 ngày, mỗi lần cách nhau 7 ngày. Kết quả thể hiện ở bảng 3.7

Từ số liệu thống kê trong bảng 3.7 cho thấy, sự sinh trưởng của các

dòng rễ tơ trải qua 4 giai đoạn: giai đoạn tiềm phát ( 0 - 7 ngày), ở giai đoạn

này tế bào sinh trưởng ít, chủ yếu là làm quen thích nghi với môi trường nuôi

cấy; giai đoạn lũy thừa (7 - 21 ngày), ở giai đoạn này rễ tơ đã thích nghi với

môi trường và phát triển khá mạnh, sinh khối tích lũy tăng vọt; giai đoạn ổn

định (28 - 35 ngày), ở giai đoạn này, tốc độ tăng trưởng không nhiều, chủ yếu

là hình thành và tích lũy các sản phẩm thứ cấp; cuối cùng là giai đoạn suy

vong (42 ngày trở đi), các dòng rễ tơ sinh trưởng chậm lại, già hóa và chết.

Sau 35 ngày nuôi cấy, khối lượng tươi của các dòng rễ tơ có sự khác biệt, dao

động từ 0,79 gram đến 0,89 gram, cao nhất là dòng số 3 đạt 0,89 gram, thấp

nhất là dòng đối chứng không chuyển gen đạt 0,79 gram. Trong khi đó, khối

lượng khô của các dòng rễ tơ không có sự khác biệt, dao động từ 0,07 gram

đến 0,078 gram.

91

Thông qua bảng số liệu 3.7, chúng tôi dựng được đường cong sinh

trưởng của các dòng rễ tơ, qua đó thể hiện được khả năng tích lũy sinh khối

của chúng. Kết quả thể hiện trên hình 3.28 và 3.29.

92

7 ngày

14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày 42 ngày

Khối lƣợng tƣơi* (g)

Dòng đối chứng 0,331a 0,451

a 0,669

a 0,783

a 0,792

a 0,805

a

Dòng 1 0,315a 0,552

b 0,754

b 0,862

c 0,885

b 0,793

a

Dòng 2 0,356b 0,522

d 0,706

c 0,824

b 0,853

d 0,762

a

Dòng 3 0,283ab

0,483c 0,674

d 0,876

d 0,893

b 0,735

b

Dòng 4 0,302b 0,537

b 0,693

c 0,809

e 0,841

a 0,747

d

Dòng 5 0,376a 0,568

c 0,774

a 0,854

b 0,875

c 0,784

c

Khối lƣợng hô* (g)

Dòng đối chứng 0,015a 0,036

a 0,068

a 0,072

a 0,074

a 0,070

a

Dòng 1 0,011a 0,038

b 0,064

a 0,075

a 0,075

c 0,074

b

Dòng 2 0,018c 0,041

a 0,060

a 0,073

bc 0,074

b 0,071

b

Dòng 3 0,012b 0,040

b 0,065

b 0,068

a 0,070

bc 0,067

ab

Dòng 4 0,013a 0,042

a 0,063

c 0,076

c 0,077

d 0,074

c

Dòng 5 0,015ab

0,043a 0,067

a 0,077

c 0,078

b 0,076

c

Ghi chú * giá trị trung bình của 3 thí nghiệm độc lập

Trong cùng một cột, kí tự theo sau khác nhau thể hiện sự sai khác giữa các giá trị theo trắc nghiệm phân hạng t Tests (LSD) với α = 0,05

Ngày nuôi

cấy

Dòng

Bảng 3.7. ánh giá khối lượng tươi và khối lượng khô các dòng rễ tơ chuyển gen hIL-7

93

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

7 14 21 28 35 42

Khối lượng tươi

(g)

Thời gian sinh trưởng (ngày)

Đối chứng

Dòng 1

Dòng 2

Dòng 3

Dòng 4

Dòng 5

Hình 3.28. ồ thị sinh trưởng của các dòng rễ tơ (tính theo khối lượng tươi)

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

7 14 21 28 35 42

Khối lượng khô (

g)

Đối chứng

Dòng 1

Dòng 2

Dòng 3

Dòng 4

Dòng 5

Hình 3.29. ồ thị sinh trưởng của các dòng rễ tơ (tính theo khối lượng khô)

Thời gian sinh trưởng (ngày)

94

b. ánh giá ch tiêu chiều dài rễ

Khả năng sinh trưởng của các dòng rễ tơ chuyển gen được đánh giá

thông qua chiều dài rễ tơ. Chúng tôi tiến hành đo chiều dài 5 dòng rễ tơ

chuyển gen trong 21 ngày, mỗi lần cách nhau 7 ngày. Kết quả thể hiện trên

bảng 3.8

Bảng 3.8. ánh giá chiều dài một số dòng rễ tơ chuy n gen (cm)

7 ngày

( )

14 ngày

( )

21 ngày

( )

Dòng 1 2,5 ± 0,3a 5,4 ± 0,1

a 7,4 ± 0,2

a

Dòng 2 2,6 ± 0,1a 5,6 ± 0,2

a 7,2 ± 0,1

a

Dòng 3 1,9 ± 0,2b 4,9 ± 0,3

b 6,9 ± 0,1

b

Dòng 4 2,3 ± 0,2a

5,2 ± 0,4c

7,1 ± 0,2b

Dòng 5 2,2 ± 0.1ab

5,1 ± 0,2b

7,2 ± 0,2b

Ghi chú Các chữ a,b,c... trong cùng một cột thể hiện sự sai khác theo

trắc nghiệm phân hạng t Tests (LSD) với α = 0.05.

Từ bảng 3.8 cho thấy, các dòng rễ tơ chuyển gen phát triển nhanh, sau

21 ngày nuôi cấy, chiều dài của rễ đạt 6,9 - 7,43 cm, dài nhất là dòng số 1,

thấp nhất là dòng số 3. Về đặc điểm hình thái, các dòng rễ tơ đều phân nhánh

mạnh, phát triển nhanh, thể hiện rõ nhất sau 21 ngày nuôi cấy.

3.3.3.4. Phân tích biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng rễ tơ

chuyển gen

Chúng tôi sử dụng k thuật Western blot để phân tích sự biểu hiện của

protein hIL-7 ở 5 dòng rễ tơ đã được đánh giá b ng k thuật PCR. Kết quả

thể hiện trên hình 3.30 cho thấy, các dòng rễ tơ chuyển gen mã hóa protein

hIL-7 đều xuất hiện một băng kích thước khoảng 23 kDa, tương ứng với

kích thước protein hIL-7 theo tính toán lý thuyết. Trong khi ở đường chạy

đối chứng âm là dòng rễ tơ không chuyển gen không xuất hiện băng protein.

Ngày đánh

giá Dòng

95

Điều này cho thấy gen mã hóa protein hIL-7 đã được chuyển và biểu hiện

thành công trong rễ tơ thuốc lá.

Hình 3.30. Kết quả biểu hiện protein hIL-7 ở các dòng rễ tơ bằng Western

blot

M. Thang protein chuẩn; 1-5 dòng rễ tơ chuy n gen; (+). ối chứng dương

(protein scFv 150 ng), (-). ối chứng m dòng rễ tơ không chuy n gen.Phản

ứng lai s d ng kháng th kháng c-myc

Chúng tôi sử dụng phương pháp ELISA để xác định hàm lượng protein

hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng rễ tơ chuyển gen. Kết quả thể hiện ở hình

3.31.

96

Kết quả trên hình 3.31 cho thấy, hàm lượng protein hIL-7 thu nhận từ các

dòng rễ tơ chuyển gen dao động từ 17,84 ng/µg đến 23,3 ng/µg protein tan tổng

số. Trong đó, biểu hiện protein hIL-7 cao nhất là dòng 1, đạt 23,3 ng/µg protein

tan tổng số, thấp nhất là dòng 5, đạt 17,84 ng/µg protein tan tổng số. Đặc biệt,

hàm lượng protein hIL-7 biểu hiện ở dòng 2 và dòng 4 không có sự khác biệt

đáng kể.

3.3.4. Biểu hiện protein hIL-7 trong cây thuốc lá bằng Agro-infiltration

3.3.4.1. Tạo dòng tế bào A.tumefaciens C58C1/pGV2260 mang vector

pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

Từ kết quả ở mục 3.2.5, vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

tái tổ hợp đã được thiết kế thành công, sẽ được chuyển vào chủng vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens C58C1/pGV2260 b ng phương pháp xung điện

(mục 2.2.3.2.f). Sản phẩm của quá trình biến nạp được cấy trải trên môi

trường LB đặc có bổ sung kháng sinh rifamycin 50 mg/l, carbemycin 50 mg/l

và kanamycin 50 mg/l trong 2 ngày.

23,3

20

22

19,93

17,84

0

5

10

15

20

25

30

Dòng 1 Dòng 2 Dòng 3 Dòng 4 Dòng 5

Hàm

lượng hIL

-7 (

ng/μg protein tổng số)

Dòng rễ tơ chuyển gen

Hình 3.31. Biểu đồ so sánh hàm lượng

protein hIL-7 trong 5 dòng rễ tơ chuyển gen

97

Chúng tôi lựa chọn 5 khuẩn lạc mọc riêng rẽ, tròn đều phát triển trên

môi trường chọn lọc để kiểm tra b ng phản ứng colony PCR với cặp mồi đặc

hiệu IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R và phản ứng cắt b ng enzyme giới hạn

NcoI. Kết quả thể hiện trên hình 3.32 và 3.331.

Hình 3.32. Kết quả colony PCR bằng cặp mồi IL7_BamHI_F/IL7_BamHI_R

M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1 - 5. Các dòng khuẩn lạc;

(-). ối chứng m; (+). ối chứng dương

Trên hình 3.32 cho thấy, tại các đường chạy 1-5 xuất hiện một băng có

kích thước khoảng 564 bp, tương ứng với kích thước gen hIL-7 khi nhân b ng

cặp mồi IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R, đồng thời giếng đối chứng âm

không có băng nào, đối chứng dương là plasmid pBSK/IL7 cũng xuất hiện một

băng kích thước khoảng 564 bp. Điều này chứng tỏ phản ứng colony PCR đã

thành công và mẫu không bị nhiễm.

Để khẳng định chắc chắn cho kết luận, chúng tôi tiến hành tách plasmid

các dòng khuẩn dương tính với phản ứng colony PCR và cắt b ng enzyme giới

hạn NcoI. Kết quả trên hình 3.33cho thấy, tại đường chạy số 1 xuất hiện hai

băng có kích thước khoảng 3,6 kb và 4,9 kb đúng theo tính toán lý thuyết của

vector pCB301 và cassette 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.

98

Hình 3.33. Kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn NcoI

1. Sản phẩm cắt của vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

bằng enzyme giới hạn NcoI, M. Thang chuẩn DNA 1kb

Từ những kết quả trên cho thấy chúng tôi đã biến nạp thành công

vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào vi khuẩn A.tumefaciens

C58C1/pGV2260.

3.3.4.2. Biểu hiện tạm thời protein IL-7 bằng phương pháp Agro-

infiltration

Quá trình biến nạp vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào

cây thuốc lá được thực hiện theo quy trình đã trình bày tại mục 2.2.4.4.

Sau 6 ngày biến nạp, tiến hành thu lá, bảo quản ở -80oC để chuẩn bị

cho các thí nghiệm kiểm tra sự có mặt của vector pCB301 35S/IL7-cmyc-

histag-100xELP và biểu hiện tạm thời của protein IL-7 tái tổ hợp với sự hỗ

trợ của protein Hc-Pro ức chế cơ chế câm gen hoạt động trong cây b ng

phương pháp western blot.

99

Hình 3.34. Trang thiết bị biến nạp

pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào cây thuốc lá

A. Sơ đồ lắp đặt c y và chuẩn bị thiết bịbiến nạp

B. C y thuốc lá trước và sau khi biến nạp

3.3.4.3. ánh giá biểu hiện tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp

Để kiểm tra sự biểu hiện của protein hIL-7 tái tổ hợp, chúng tôi tiến

hành tách chiết protein tổng số và đo nồng độ theo phương pháp của Bradford

(1976), sau đó sử dụng k thuật lai miễn dịch Western blot trên các vị trí biểu

hiện tạm thời ở lá non, lá bánh tẻ và lá già. Qua thực nghiệm, chúng tôi nhận

thấy khả năng biểu hiện của protein hIL-7 tái tổ hợp khác nhau ở các lá có độ

tuổi khác nhau, trong đó biểu hiện mạnh nhất ở lá non; điều này có thể giải

thích do ở lá non có tốc độ sinh trưởng mạnh, sinh tổng hợp protein mạnh hơn

so với lá bánh tẻ và lá già.

Kết quả thể hiện trên hình 3.35cho thấy ở các đường chạy 1, 2, 3 xuất

hiện một băng có kích thước khoảng 64 kDa tương ứng với kích thước protein

hIL-7 tái tổ hợp có gắn thêm protein cmyc, histag và protein ELP theo tính

toán lý thuyết, trong khi ở đường chạy đối chứng âm, cây thuốc lá không

chuyển gen không xuất hiện băng này

100

Hình 3.35. Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7 trong lá thuốc lá bằng Western blot

M. Thang protein chuẩn (4 - 20% tris-glycine SDS-PAGE); 1. Lá non, 2. Lá bánh tẻ,

3. Lá già; (-). ối chứng m (lá thuốc lá không chuy n gen)

3.3.4.4. Phân tích định lượng và tinh sạch protein hIl-7 tái tổ hợp

Sau khi biểu hiện thành công protein hIL-7 tái tổ hợp trong thuốc lá,

chúng tôi tiến hành tinh sạch protein b ng phương pháp sắc ký ion cố định

kim loại (niken) để tinh sạch và định lượng protein hIL-7 tái tổ hợp. Đây là

phương pháp hiệu quả để tinh sạch protein tái tổ hợp liên kết với his-tag.

Phương pháp này dựa trên nguyên lý histidine tạo phức hợp với các kim loại

hoá trị II (niken) ở nồng độ pH trung tính. Sự tương tác của protein liên kết

his-tag với kim loại phụ thuộc vào nồng độ pH. Protein đích sau khi liên kết

với cột tinh sạch, sẽ được hoà tan thu lại b ng cách giảm pH dung dịch hoặc

tăng nồng độ của đệm ion hoặc nồng độ của đệm EDTA hoặc imidazole.

Sau khi tinh sạch, chúng tôi kiểm tra sự biểu hiện của protein hIL-7 tái

tổ hợp b ng điện di SDS-PAGE và phương pháp lai miễn dịch Western blot.

Kết quả thể hiện trên hình 3.36cho thấy, chúng tôi chỉ thu được một băng

protein có kích thước khoảng 64 kDa, đúng theo tính toán lý thuyết.

101

Hình 3.36. Kết quả tinh sạch và định lượng

protein hIL-7 bằng phương pháp IMAC

(A). iện di SDS-PAGE: 1A. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2A. Dịch

chiết thu nhận sau khi đi qua cột tinh sạch; 3A. Protein hIL-7 sau tinh sạch

(B). Kết quả Western blot: 1B. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2B. Dịch

chiết thu nhận sau khi đi qua cột tinh sạch; 3B. Protein hIL-7 sau tinh sạch

(C). ịnh lượng protein hIL-7 bằng western blot và s d ng phần mềm

ImageJ 1C, 2C, 3C, 4C đối chứng dương có nồng độ 50, 100, 150, 200

ng/giếng, 5C. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP trước x lý, 6C. protein

hIL-7 sau tinh sạch (30 µg protein tổng số/giếng.

Sau khi tinh sạch theo phương pháp IMAC, nồng độ protein tổng số

được định lượng theo phương pháp của Bradford và protein hIL-7 được định

lượng b ng phần mềm ImageJ trên màng lai. Kết quả thu được 27,86ng/µg

protein tan tổng số.So sánh với một số nghiên cứu biểu hiện protein tạm thời

khác thì sự biểu hiện của protein hIL-7 trong cây thuốc lá N. Benthamiana

của chúng tôi là tương đối cao.

Kết quả này cho thấy hiệu quả của phương pháp biểu hiện tạm thời và

tinh sạch protein hIL-7 từ cây thuốc lá N. benthamiana trong thời gian ngắn,

dễ thực hiện. Để có thể thu được protein hIL-7 tái tổ hợp với hàm lượng cao

64

102

hơn, chúng tôi tiếp tục định lượng và tinh sạch b ng phương pháp mITC dựa

trên đặc tính của sự gắn kết giữa ELP với protein đích hIL-7.

Chúng tôi sử dụng 100 gam lá thuốc lá đã được biến nạp b ng phương

pháp agroinfiltration để tinh sạch thu nhận protein hIL-7 tái tổ hợp theo

phương pháp mITC (mục 2.2.7.2).

Chúng tôi tiến hành thu lại dịch chiết protein sau mỗi bước tinh sạch

gồm dịch chiết thô trước tinh sạch, dịch ra khỏi màng sau khi đưa dịch chiết

thô qua màng và dịch tinh sạch protein hIL-7 tái tổ hợp tách khỏi màng khi

rửa màng b ng nước milipore Q lạnh. Dịch thu được sau từng bước được đo

nồng độ protein theo phương pháp Bradford (1976) và phân tích b ng phương

pháp lai miễn dịch western blot để kiểm tra protein tinh sạch và đánh giá hiệu

suất thu hồi protein. Kết quả thể hiện trên bảng 3.9 và hình 3.37.

Kết quả trên hình 3.37cho thấy, ở đường chạy 3 xuất hiện 2 băng có

kích thước khoảng 64 kDa và 130 kDa (trạng thái dimer) của protein có gắn

đuôi ELP; còn ở đường chạy 2 là dịch chiết protein ra khỏi màng lọc sau khi

đưa dịch protein thô ban đầu qua màng không xuất hiện băng protein nào,

điều này chứng tỏ protein IL7 có gắn đuôi ELP đã được giữ lại trên màng lai

không bị rửa trôi cùng các protein khác. Ở đường chạy số 1 là dịch chiết sau

khi rửa màng b ng nước milipore-Q lạnh ở nồng độ ion thấp chỉ có một băng

protein có kích thước khoảng 64 kDa tương ứng với kích thước protein hIL-7

tái tổ hợp theo tính toán.

103

Bảng 3.9. Hiệu suất thu hồi protein hIL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp mITC

Dịch chiết

protein

Protein

tổng số (mg)

Protein

tái tổ hợp

(mg)

Hiệu suất

thu hồi (%)

Độ tinh

sạch (%)

Dịch thô

trước tinh sạch 1634,7 38,3 100 X

Dịch hIL-7

đã tinh sạch 45,8 36,7 95,82 86,3

Hình 3.37. Kết quả tinh sạch protein hIL-7 bằng phương pháp mITC

M. Thang protein chuẩn; 1. Protein hIL-7 tinh sạch sau khi r a màng bằng

nước lạnh; 2. Dịch chiết ra khỏi màng sau khi đưa dịch thô qua màng; 3.

Dịch chiết protein chứa IL7/ELP trước tinh sạch

104

Hình 3.38Kết quả định lượngprotein hIL-7 tái tổ hợp bằng Western blot

1. Dịch chiết thô chứa protein IL7/ELP trước khi tinh sạch (30 µg/giếng);

2. Protein hIL-7 tách khỏi màng khi r a màng bằng nước milipore-Q lạnh;

3, 4, 5, 6. ối chứng dương với các nồng độ 200, 150, 100, 50 ng/giếng.

Từ kết quả xác định nồng độ protein cho thấy hiệu suất thu hồi protein

hIL-7 b ng phương pháp mITC đạt 95,82 %, độ tinh sạch đạt 86,3%. Hàm

lượng protein hIL-7 tái tổ hợp trên protein hòa tan tổng số là 2,34%, kết quả

này tương đương với những nghiên cứu trước đó về hàm lượng protein tái tổ

hợp trên protein hòa tan tổng số: 2% [81], [141]; 2,2% [1]; 3% [51].

Phương pháp gắn kết ELP vào protein đích tỏ ra có nhiều ưu điểm như

dễ dàng thu nhận và tinh sạch protein tái tổ hợp nhờ tính chất đặc biệt của

ELP, đồng thời hàm lượng protein tái tổ hợp thu được thường khá cao. Shoj và

cộng sự (2009) đã thu nhận được 200 mg HA/kg lá tươi, Mortimer và cộng sự

(2012) cũng thu nhận được 675 mg HA/kg lá tươi khi sản xuất kháng nguyên

của virus cúm gia cầm H5N1 b ng phương pháp này. Trong nghiên cứu biểu

hiện protein hIL-7 tái tổ hợp gắn kết ELP, chúng tôi cũng đã thu nhận được

36,7 ng/µg protein tan tổng số. Kết quả này cho thấy sự biểu hiện tạm thời của

protein hIL-7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá N. benthamiana khá cao, là cơ sở để

105

chúng tôi tiến hành sản xuất lượng lớn protein hIL-7 tái tổ hợp phục vụ cho

nghiên cứu và ứng dụng trong y học.

3.4. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp

Để đánh giá hoạt tính sinh học của protein hIL-7 chúng tôi tiến hành thí

nghiệm theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.2.8 với mẫu protein hIL7 biểu

hiện tạm thời ở cây thuốc lá b ng phương pháp agro-infiltration ở các nồng

độ hIL-7 là: 0,125 µg/ml; 0,25 µg/ml; 0,5 µg/ml; 1 µg/ml;1,5 µg/ml;2 µg/ml;

2,5 µg/ml. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.10 và hình 3.39.

Bảng 3.10. Kết quả hoạt hoá dòng tế bào 2E8 bằng protein hIL-7

Nồng độ protein hIL-7 Mức độ hoạt hóa tế bào 2E8 (%)

0,125 µg/ml 35,7

0,25 µg/ml 45,3

0,5 µg/ml 53,3

1 µg/ml 63,8

1,5 µg/ml 73,6

2 µg/ml 82,5

2,5 µg/ml 79,3

Giá trị ED50 (g/ml) 0,35

Qua bảng 3.10 và hình 3.39 cho thấy, protein hIL-7 tái tổ hợp được

biểu hiện tạm thời ở cây thuốc lá đã thể hiện hoạt tính sinh học trong việc hỗ

trợ sinh trưởng và hoạt hoá dòng tế bào 2E8, với khả năng hoạt hóa đạt 82,5%

so với đối chứng âm (dòng tế bào 2E8 không bổ sung hIL-7 vào môi trường

nuôi cấy). Ở các nồng độ chất thử hIL-7 tăng dần, % hoạt hóa tế bào của mẫu

cũng tăng theo, cho thấy hoạt tính sinh học của mẫu thử khá ổn định; trong

đó, khả năng hoạt hóa cao nhất tại nồng độ 2 µg/ml là 82,5%. Sau đó khả

năng hoạt hóa của các mẫu không tăng mà lại giảm đi, điều này có thể được

106

giải thích do proteinhIL-7 khi ở liều lượng cao có thể gây ức chế cho sự sinh

sản và hoạt hóa tế bào, thậm chí gây chết cho tế bào.

Qua kết quả trên, có thể bước đầu khẳng định protein hIL-7 tái tổ hợp

có khả năng thể hiện hoạt tính sinh học giống với tự nhiên, mở ra khả năng

sản xuất lượng lớn protein hIL-7 tái tổ hợp phục vụ trong y học nh m đáp ứng

nhu cầu chữa bệnh cho con người.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0.125 0 .25 0 .5 1 1 .5 2 2 .5

% hoạt hóa dòng tế bào 2

E8

Nồng độ mẫu thử (µg/ml)

Protein hIL-7 ở thực vật

Hình 3.39. Khả năng hoạt hóa dòng tế bào 2E8 của protein hIL-7 tái tổ hợp

107

Chƣơng 4. BÀN LUẬN

4.1. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong E.coli rosetta-gami B

Hệ thống biểu hiện protein ở vi khuẩn nói chung và ở vi khuẩn E.coli

Rosetta-gami B nói riêng hiện nay được nghiên cứu ứng dụng khá rộng rãi bởi

những ưu điểm nhưchi phí thấp, sinh khối lớn và tốc độ sản xuất nhanh.

Trong nội dung nghiên cứu của luận án, chúng tôi sử dụng vector

pET32c(+)/IL7 tái tổ hợp để biểu hiện protein hIL-7 trong vi khuẩn E.coli

Rosetta-gami B dưới sự điều khiển của promoter T7lac và nhờ hoạt tính của

T7 RNA polymerase của tế bào chủ được biến đổi bởi phage T7 [150]. Chủng

rosetta-gami B mang plasmid pRARE mã hoá cho các tRNAs hiếm trong

chủng K-12 đột biến trxB/gor có khả năng tăng cường sự hình thành các cầu

nối disulfide trong tế bào chất kết hợp với vector biểu hiện pET32c có chứa

đoạn DNA mã hoá cho oligo-histidine (His-tag) hỗ trợ việc phát hiện và tinh

chế protein hIL-7 nh m thu nhận protein hIL-7 tái tổ hợp có cấu trúc giống tự

nhiên để kiểm tra hoạt động của gen hIL-7 tái tổ hợp trước khi chuyển vào

các hệ thống nuôi cấy thực vật.

Khi được biểu hiện, protein hIL-7 sẽ dung hợp với protein Thiodedoxin

(Trx.Tag) trong pET32c(+) để tăng cường khả năng cuộn, gấp và biểu hiện

dạng tan giúp cho việc thu nhận và tinh sạch protein hIL-7 dễ dàng.

Mục tiêu đặt ra khi nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn

là có thể thu nhận được một lượng lớn trong một khoảng thời gian ngắn. Tuy

nhiên, khi có quá nhiều protein được tạo ra thì sẽ hình thành các thể vùi trong

vi khuẩn. Đây là những tinh thể đậm đặc của các protein cuộn gấp sai không

thể hoạt động chức năng. Vì lý do đó, nên chúng tôi sử dụng hệ thống biểu

hiện pET, đây là một trong hai hệ thống biểu hiện thường được sử dụng ở

E.coli để kiểm soát quá trình biểu hiện protein. Các dòng vector pET có

108

promoter T7/lac, vị trí đa nhân dòng (multi cloning site) và trình tự kết thúc

T7. Việc phiên mã từ promoter T7/lac đòi hỏi phải có T7 RNA polymerase.

Tế bào chủ E.coli có gen mã hóa cho T7 RNA polymerase, nhưng bị protein

lac operon, lacI ức chế kìm hãm biểu hiện gen này. Khi IPTG được bổ sung

trong quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp, sẽ cảm ứng giải phóng lacI ra

khỏi operator của lac operon và quá trình phiên mã được bắt đầu. T7 RNA

polymerase được tạo ra và bám vào promoter T7/lac và protein tái tổ hợp

được sản xuất. Trong nghiên cứu của luận án, chúng tôi đã xác định được

hàm lượng IPTG tối ưu là 0,4mM ở điều kiện nhiệt độ 37oC cho khả năng sản

xuất protein hIL-7 tái tổ hợp tốt nhất.

Ngoài ra, khi biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn còn gặp phải một

số vấn đề khác, đặc biệt là biểu hiện các protein của sinh vật nhân chuẩn ở vi

khuẩn như: các promoter của sinh vật nhân chuẩn không hoạt động ở tế bào vi

khuẩn, các vi khuẩn không thể cắt các đoạn intron ra khỏi mRNA, ở vi khuẩn

không có quá trình cuộn gấp tạo cấu trúc không gian của protein sau dịch mã,

protein tái tổ hợp sau khi được tạo ra n m trong tế bào chấtv.v… khiến cho

quá trình thu nhận protein tái tổ hợp còn gặp khó khăn. Trong nghiên cứu của

luận án, chúng tôi đã tiến hành thiết kế vector biểu hiện bao gồm cả trình tự

mã hóa protein hIL-7 và trình tự mã hóa cho thiodedoxin tạo ra protein dung

hợp có kích thước khoảng 37kDa và gần 80 kDa (trạng thái dimer), giúp tăng

cường khả năng cuộn gấp tạo cấu trúc không gian của protein hIL-7 và tăng

khả năng tiết ra môi trường ngoại bào, giúp cho việc thu nhận protein đơn

giản hơn.

Do đó, trong những nghiên cứu cơ bản biểu hiện protein tái tổ hợp thì

vi khuẩn vẫn là một hệ thống đáng quan tâm do những ưu điểm mà nó mang

lại. Tuy nhiên, khi biểu hiện những loại protein sinh vật nhân chuẩn, đặc biệt

là protein ở người sẽ có những hạn chế nhất định, đặc biệt là ởE. coli thường

109

lẫn với lipopolysaccharide, một loại nội độc tố ở người [36]. Vì vậy, nhiều hệ

thống khác đã được nghiên cứu để thay thế hệ thống biểu hiện ở vi khuẩn,

trong đó có các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật.

4.2. Biểu hiện protein h-IL7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY-2, rễ tơ

Sử dụng tế bào huyền phù thực vật như một mô hình sản xuất các

protein tái tổ hợp trong quy mô phòng thí nghiệm ngày càng trở nên phổ

biến[127]. Trong đó, dòng tế bào BY-2 và NT-1 của loài thuốc lá Nicotiana

tabacum cv.là một trong những dòng được sử dụng rộng rãi nhất cho mục

đích này [95]. Đặc biệt, protein tái tổ hợp sản xuất từ dòng tế bào BY-2 có

chứa N-liked glycan có cấu trúc tương tự như trong tế bào động vật, điều này

làm tiền đề cho việc thu nhận protein tái tổ hợp có cấu trúc và hoạt tính sinh

học giống tự nhiên [148], do đó, những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu

nh m thay đổi cơ chế glycosyl hoá ở thực vật để sản xuất các protein tái tổ

hợp có khả năng biến đổi giống như ở động vật có vú, trong đó có con người

[149].

Mô sẹo là các mô chưa phân hoá được thu nhận từ quá trình nuôi cấy

mẫu thực vật trên môi trường đặc có chứa chất điều hoà sinh trưởng. Tế bào

huyền phù được tạo ra từ quá trình nuôi lắc mô sẹo trong môi trường lỏng để

tạo thành các tế bào rời và các khối mô sẹo nhỏ. Từ cơ chế này, thực vật

chuyển gen biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp được sử dụng làm nguồn tạo

mô sẹo.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp

được biểu hiện trong dòng tế bào BY-2 chỉ đạt 2,25 - 3,25 ng/g protein tan

tổng số, tương đương 0,225 - 0,335% protein tan tổng số. Hàm lượng biểu

hiện này còn thấp so với một số nghiên cứu biểu hiện protein khác trong hệ

thống BY-2 như: theo tác giả Phạm Bích Ngọc (2009) khi biểu hiện protein

thaumatin I trong hệ thống tế bào BY2 cho thấy protein thaumatin I tái tổ hợp

110

tiết ra khoảng 1,024 g/ml môi trường nuôi cấy;theo La Việt Hồng (2015),

hàm lượng protein miraculin tái tổ hợp biểu hiện trong hệ thống huyền phù

BY-2 dao động từ 1,13 - 3,10 ng/g protein tan tổng số [4]; theo Đào Thị Sen

(2016), hàm lượng protein GP5 tái tổ hợp thu nhận được qua hệ thống BY2

đạt 3,4% protein tổng số[8].Theo nhiều nghiên cứu khác thì hàm lượng protein

tái tổ hợp, nhất là protein có nguồn gốc động vật khi biểu hiện trong hệ thống

thực vật thường không cao, nguyên nhân do quá trình glycosyl hóa ở động vật

và thực vật có sự khác biệt. Ngoài ra, quá trình thu nhận và tinh sạch protein

tái tổ hợp từ thực vật còn có một số khó khăn, điều này dẫn tới hàm lượng

protein tái tổ hợp thu nhận được không cao.

Hệ thống nuôi cấy rễ tơ chuyển gen cũng là một trong những hệ thống

biểu hiện protein tái tổ hợp ở quy mô phòng thí nghiệmdo ưu điểm dễ thực

hiện, dễ nuôi cấy và protein có khả năng biến đổi sau dịch mã.

Khi mô tế bào thực vật bị tổn thương tiếp xúc với vi khuẩn

A.rhizogenes mang Ri plasmid sẽ gây nên bệnh rễ lông ở thực vật, sau khi

tiếp xúc với vi khuẩn và được chọn lọc trên môi trường chọn lọc có chứa các

chất kháng sinh như kanamycin, carbecillin, cefotaxime, streptomycin v.vvới

nồng độ 100 - 500 g/ml,các mô tế bào thực vật sẽ bắt đầu cảm ứng tạo rễ sau

khoảng một vài tuần,rễ tơ có thể được hình thành ở hầu hết các vị trí mô thực

vật như lá, chồi đỉnh, lá mầm, rễ dự trữ (củ) v.v…. Tuy nhiên, tỷ lệ tạo rễ tơ ở

các vị trí lây nhiễm khác nhau của thực vật có sự khác nhau, trong đó sự cảm

ứng tạo rễ ở lá là cao nhất, điều này có thể giải thích do phản ứng của các mô

thực vật với sự xâm nhiễm của vi khuẩn A. rhizogenes là khác nhau và phụ

thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý của mô tế bào [118].

Ngoài ra, nồng độ vi khuẩn A.rhizogenes cũng có ảnh hưởng đến tỷ lệ

cảm ứng tạo rễ tơ ở thực vật. Trong nghiên cứu của chúng tôi, nồng độ vi

khuẩn A. rhizogenes mang genhIL-7 tương đương giá trị OD600 = 0,7 được lựa

111

chọn để lây nhiễm vào mảnh lá thuốc lá, cảm ứng tạo rễ tơ. Kết quả này khá

tương đồng với kết quả của Kiana và cộng sự (2012), khi khảo sát khả năng

cảm ứng tạo rễ tơ từ lá cây Portulaca oleracea tại bốn mật độ vi khuẩn A.

rhizogenesATCC15834 tương ứng với OD600 = 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 đã nhận thấy

ở nồng độ khuẩn tương đương giá trị OD600 = 0,6 cho tỷ lệ cảm ứng tạo rễ tơ

lớn nhất tới 70%, trong khi ở các nồng độ khác thì tỷ lệ cảm ứng tạo rễ tơ chỉ

còn 30 - 50%[69].Điều này có thể giải thích do với nồng độ khuẩn thấp hơn

mức tối ưu thì lượng khuẩn không đủ để chuyển T-DNA vào tế bào thực vật,

trong khi đó nếu nồng độ khuẩn cao hơn mức tối ưu có thể làm tổn thương

nặng hơn các mô tế bào thực vật bị tổn thương, thậm chí làm chết tế bào.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp

thu nhận được qua hệ thống nuôi cấy rễ tơ đạt 23,3 ng/µg protein tan tổng số.

So với hệ thống nuôi cấy tế bào BY-2 thì hệ thống nuôi cấy rễ tơ cho hàm

lượng protein tái tổ hợp cao hơn, điều này có thể do rễ tơ là dạng mô đã biệt

hóa nên kiểu gen ổn định hơn. Ngoài ra, các protein tái tổ hợp thường được

tiết ra môi trường ngoài, dẫn tới hiệu suất thu nhận và tinh sạch protein cao

hơn so với hệ thống nuôi cấy tế bào BY-2.

Đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện, ứng dụng trong y dược học và

đời sống như: tác giả La Việt Hồng và cộng sự (2015) đã biểu hiện thành

công protein tạo vị ngọt miraculin trong rễ tơ cây thuốc lá với hàm lượng cao

nhất đạt 19,97 ng/µg protein tan tổng số, góp phần nâng cao đời sống của

những người mắc bệnh béo phì, tiểu đường [4];năm 2016, Trịnh Thị Hương

và cộng sự đã hoàn thiện quy trình chuyển gen tạo rễ tơ sâm Ngọc Linh để

nuôi cấy thu sinh khối với tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ trung bình là 39,81% [5]. Những

nghiên cứu này cùng với sự phát triển của lĩnh vực nuôi cấy mô và công nghệ

sinh học đã tạo tiền đề cho hướng nghiên cứu sản xuất các chất, các protein có

hoạt tính sinh học ứng dụng trong y dược học hoặc trong đời sống con người

112

thông qua nuôi cấy rễ tơ là một phương pháp được đánh giá có nhiều triển

vọng.

4.3. Biểu hiện tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá

Thực vật hiện nay được sử dụng rất nhiều trong các nghiên cứu biểu

hiện protein tái tổ hợp. Protein tái tổ hợp có thể được biểu hiện trong thực vật

thông qua hai phương pháp: tạo cây chuyển gen và biểu hiện tạm thời. Trong

phương pháp tạo cây chuyển gen, gen tái tổ hợp được nhân bản trong vector

biểu hiện và chuyển vào hệ gen thực vật. Do đó, gen tái tổ hợp sẽ được di

truyền qua các thế hệ tiếp theo và có thể sản xuất quy mô lớn protein tái tổ

hợp [35], [122].Trong phương pháp biểu hiện tạm thời, thay vì tích hợp vào

hệ gen của thực vật thì gen chuyển sẽ nhanh chóng tạo ra protein tái tổ hợp.

Phương pháp này có lợi thế về mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp cao hơn rất

nhiều so với phương pháp khác, cũng như thời gian sản xuất protein nhanh

hơn, không bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen trong tế bào thực vật, đặc biệt

không gặp phải vấn đề an toàn sinh thái như phương pháp tạo cây chuyển

gen[75].

Tuy nhiên, phương pháp biểu hiện tạm thời do gen chuyển không được

gắn vào hệ gen của thực vật nên thường bị cơ chế câm gen(RNAi) dịch mã và

sau dịch mãtác động, dẫn đến hàm lượng protein tái tổ hợp thu nhận được

không cao. Đây là cơ chế phản ứng của thực vật trước sự xâm nhập của DNA

ngoại lai, dẫn đến sự phá hủy trình tự gen đặc hiệu và làm giảm sản phẩm

protein do genmã hóa[161].

Trong nghiên cứu của luận án, để tránh gặp phải hiện tượng RNAi có

thể làm giảm hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp, chúng tôi đã biểu hiện đồng

thời cả protein đích hIL-7 và protein hỗ trợ Hc-Pro của virus khoai tây Y

nh m chống lại hiện tượng câm gen ở thực vật b ng cách ngăn cản sự phân

giải mRNA và RNA sợi đôi, từ đó giảm lượng siRNA hoặc phá hỏng chức

113

năng cắt của enzyme cắt sợi đôi Dicer và RISC [172]. Kết quả, chúng tôi đã

thu được protein hIL-7 tái tổ hợp biểu hiện ở lá cây thuốc lá với hàm lượng

khá cao.

4.4. Tăng cƣờng biểu hiện protein ở thực vật với ELP và tinh sạch mITC

Mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp ở thực vật thường không cao là

một trong những giới hạn khi nghiên cứu biểu hiện protein ở thực vật. Đã có

nhiều nghiên cứu được thực hiện nh m vượt qua giới hạn đó để tăng cường

khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp khi biểu hiện ở thực vật b ng nhiều

phương pháp như: tối ưu hóa codon [31], kết hợp với một thành phần hỗ trợ

như enzyme lichenase [96], ELP [31], [46].

Trong nghiên cứu của luận án, chúng tôi đã sử dụng 100xELP cùng với

protein hIL-7 dưới sự kiểm soát của promoter CaMV35 nh m tăng cường khả

năng biểu hiện protein hIL-7 ở thực vật. Kết quả của chúng tôi phù hợp với

một số nghiên cứu khác như: Patel và cộng sự (2007) đã tăng cường sự biểu

hiện của interleukin 4 của người lên 19 lần và interleukin 10 lên 15 lần khi kết

hợp với 27xELP [115]; nghiên cứu của Floss (2009) cũng cho thấy, mức độ

biểu hiện của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của kháng thể kháng HIV (2F5 và

2G12) cao hơn khi không có sự kết hợp với ELP[46]. Từ những kết quả này

cho thấy sự tích lũy các protein tái tổ hợp là do hiệu ứng của ELP chứ không

phải do vị trí của gen chuyển.

Sự tăng cường biểu hiện của protein kết hợp với ELP có thể được giải

thích là do các protein kết hợp ELP khó bị protease của tế bào chủ phân cắt

hoặc thủy phân hơn. Điều này dẫn tới hàm lượng protein tái tổ hợp cao hơn so

với bình thường, góp phần nâng cao hiệu quả của các phương pháp tinh sạch

và thu nhận protein tiếp theo.

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp nh m tinh sạch và thu nhận các

loại protein tái tổ hợp đạt nồng độ cao và tinh khiết như: phương pháp sắc ký

114

lọc gel, phương pháp sắc ký ái lực (IMAC), sắc ký trao đổi ion, phương pháp

đảo chiều thuận nghịch mITC. Tùy thuộc vào nghiên cứu và loại

protein,người ta lựa chọn phương pháp tinh sạch tối ưu nhất để thu được hàm

lượng protein tái tổ hợp cao nhất.

Phương pháp tinh sạch protein đảo chiều thuận nghịch mITC dựa trên

tính chất đảo ngược chuyển từ trạng thái tan sang trạng thái không tan và

ngược lại khi nhiệt độ môi trường thay đổi của ELP tỏ ra có nhiều ưu điểm và

được ứng dụng ngày càng rộng rãi do hàm lượng protein tái tổ hợp thu nhận

được nhiều với độ tinh sạch cao, các bước tiến hành nhanh và đơn giản do sự

kết tinh của các protein gắn kết ELP được giữ lại trên bề mặt màng và dễ

dàng được khử khỏi màng.

Trong nghiên cứu của luận án, chúng tôi sử dụng hai phương pháp để

tinh sạch protein hIL-7 tái tổ hợp là phương pháp sắc ký ion cố định kim loại

(IMAC) và phương pháp đảo chiều thuận nghịch qua màng (mITC). Đối với

phương pháp sắc ký ion cố định kim loại, chúng tôi thu được hàm lượng

protein hIL-7 tái tổ hợp đạt 27,86ng/µg protein tan tổng số. Đối với phương

pháp tinh sạch protein tái tổ hợp b ng đảo chiều thuận nghịch qua màng

(mITC), chúng tôi thu được hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp đạt 36,7 ng/µg

protein tan tổng số với hiệu suất thu hồi đạt 95,82 % và độ tinh sạch đạt

86,3%. Qua số liệu thu được cho thấy, phương pháp đảo chiều thuận nghịch

qua màng (mITC) dựa trên đặc tính của ELP có hiệu suất thu hồi cao hơn hẳn

các phương pháp khác; kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương đồng với

những nghiên cứu trước đó về biểu hiện protein tái tổ hợp có gắn kết ELPnhư

Scheller và cộng sự (2006) đã tổng hợp được protein scFV tái tổ hợp với hàm

lượng tăng gấp 40 lần so với thông thường, không gắn với ELP [131], Theo

Floss (2009), việc gắn kết với ELP có thể làm tăng mức độ biểu hiện của các

kháng thể vô hiệu hóa HIV biểu hiện trong hạt [46]; ELP kết hợp với các

115

protein tái tổ hợp ở đầu C cũng làm tăng sự tích lũy của nhiều loại protein biểu

hiện trong lá [31], [32], [115].

Từ những kết quả trên cho thấy, việc biểu hiện protein tái tổ hợp gắn

kết với ELP và tinh sạch b ng phương pháp đảo chiều thuận nghịch qua màng

mITC cho hiệu suất thu hồi protein tái tổ hợp với độ tinh sạch cao hơn so với

các phương pháp khác. Mở ra một hướng nghiên cứu nhiều triển vọng cho

mục đích thu nhận protein tái tổ hợp của người sản xuất ở thực vật nh m phục

vụ trong y dược học, chữa bệnh cho con người.

116

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

1. Mã di truyền của gen hIL-7 được thay đổi phù hợp với hệ thống biểu

hiện ở thực vật với độ tương đồng nucleotide so với trình tự gen hIL-7 gốc là

63,6 % và độ tương đồng acid amin là 100%.

2. Đã thiết kế thành công các cấu trúc vector chuyển gen

pET32c(+)/IL7; pENTR221/cal/IL7; pK7WG2D.1/cal/IL7; pRTRA 35S/IL7-

histag-cmyc-100xELP; pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP phục vụ

chuyển gen vào tế bào vi khuẩn E.coli rosetta-gami B, dòng tế bào huyền phù

BY-2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá để biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp.

3. Hàm lượng proteinhIL-7 tái tổ hợp cao nhất đạt 36,7ng/µg protein

tan tổng số ở hệ thống biểu hiện tạm thời; thấp nhất đạt 2,25 ng/µg protein

tan tổng số trong hệ thống nuôi cấy tế bào BY2.

4. Hoạt tính sinh học của protein hIL-7 thu nhận qua hệ thống biểu hiện

tạm thời đạt 82,5% ở nồng độ 2 g/ml.

2. Đề nghị

Trên cơ sở những kết quả nghiên cứu đã đạt được, để tiếp tục phát triển

các kết quả nghiên cứu sâu hơn; chúng tôi đề xuất một số đề nghị sau:

1. Tiếp tục thử nghiệm protein hIL-7 tái tổ hợp đã tinh sạch ở mức độ

động vật thí nghiệm và trên lâm sàng nh m đánh giá sâu hơn hoạt tính sinh

học của protein hIL-7 trước khi sản xuất trên quy mô lớn.

2. Nghiên cứu tối ưu các hệ thống biểu hiện dòng tế bào BY2, rễ tơ

thuốc lá nh m tận dụng các ưu điểm của từng hệ thống để nâng cao hiệu suất

sản xuất protein hIL-7. Đồng thời nghiên cứu biểu hiện trên một số loài thực

vật khác để làm phong phú nguồn nguyên liệu tổng hợp protein hIL-7 tái tổ

hợp.

117

118

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Giang, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà,

Lê Văn Sơn (2014),“Nghiên cứu biểu hiện protein Interleukin 7 tái tổ hợp

trong vi khuẩn Escherichia coli Rosetta-gami”,Tạp chí Khoa h c- ại h c

Quốc gia Hà Nội, 30(6S-A), tr. 101-107.

2. Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Giang, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc,

Lê Văn Sơn (2014),“Interleukin 7 và vai trò trong hệ thống miễn dịch ở

người”,Tạp chí Khoa h c và Công nghệ - ại h c Thái Nguyên, 118(04),

tr. 153-156.

3. Nguyễn Huy Hoàng, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn

(2015),“Thiết kế vector mang cấu trúc gen Interleukin 7 phục vụ chuyển

gen trong hệ thống thực vật”,Tạp chí Khoa h c và Công nghệ- ại h c Thái

Nguyên, 134(04), tr. 25-28.

4. Nguyễn Huy Hoàng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn

(2017),“Biểu hiện protein Interleukin 7 tái tổ hợp trong dòng tế bào thuốc

lá BY-2”,Tạp chí Công nghệ Sinh h c,15(01), tr. 1-8.

5. Nguyễn Huy Hoàng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn

(2017),“Biểu hiện tạm thời protein Interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc

lá (Nicotiana benthamiana domin) b ng phương pháp Agro-

Infiltration”,Tạp chí Sinh h c,39(02), tr.232 - 238, doi: 10.15625/0866-

7160/v39n2.9000.

6. Hoang,N.H., Ha,C.H., Ngoc,P.B. and Son,L.V. (2017), IL7 human gene is

optimized genetic codes which will be expressed in plants, GenBank:

MF170526.1

119

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Chu Hoàng Hà (2015), Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên của virus g y

bệnh lợn tai xanh trong c y thuốc lá Nicotiana benthamiana bằng

phương pháp Agroinfiltration, Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Viện,

Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam.

2. Trương Nam Hải (2010), Nghiên cứu đánh giá hiệu lực của interleukin-2

tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam dùng trong hỗ trợ điều trị ung thư, Báo

cáo tổng kết đề tài khoa học cấp Nhà nước, Viện Công nghệ Sinh học,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

3. Mi Hoàng (2015), “Bước tiến trong điều trị bệnh tự miễn”, Tạp chí

Thông tin Khoa h c và Công nghệ, 9, tr. 28-30.

4. La Việt Hồng (2015), Nghiên cứu bi u hiện protein tái tổ hợp miraculin

trong dòng tế bào B 2, rễ tơ thuốc lá và c y cà chua chuy n gen, Luận

án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam.

5. Trịnh Thị Hương (2016), Nghiên cứu chuy n gen tạo rễ tơ s m Ng c

linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) làm nguyên liệu cho nuôi cấy

sinh khối, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

6. Phan Tường Lộc, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Thị Thanh (2012), “Biểu

hiện gen HIV-1 p24 ở cây thuốc lá chuyển gen lục lạp”, Tạp chí phát

tri n Khoa h c và Công nghệ, 15(1), tr. 52-61.

7. Chu Văn Mẫn (2010), Tin h c trong công nghệ sinh h c, Nhà xuất bản

Giáo dục Việt Nam.

120

8. Đào Thị Sen (2016), Nghiên cứu bi u hiện gen GP5 của virus g y hội

chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) trên tế bào thuốc lá và

hạt đậu tương, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Tiếng Anh

9. Abbas A. K., Lichtman A. H., Pillai S. (2012), Cellular and molecular

immunology (7th ed.), Philadelphia: Elsevier/Saunders. ISBN

1437715281.

10. Adam W. P., Daniel T. P., Jung H. S., Emma-Kate L., François J.,

Steven F. Z., Ninan A. (2012), “Interleukin-7, but not thymic stromal

lymphopoietin, plays a key role in the T cell response to influenza A

virus”, PLoS One, 7(11), PP. 1-8, doi: 10.1371/journal.pone.0050199.

11. Agnieszka S., Tomas V., Anna G., Patrycja R. (2011), “Recombinant

Cytokines from Plants”,Int. J. Mol. Sci., 12(6), pp: 3536-3552,

doi:10.3390/ijms12063536.

12. Alkayyal A. A., Tai L. H., Kennedy M. A., Tanese S. C., Zhang J.,

Lefebvre C., Sahi S., Ananth A. A., Mahmoud A. B., Makrigiannis A. P.,

Cron G. O., Macdonald B., Marginean E. C., Stojdl D. F., Bell J. C., Auer

R. C. (2017), “NK-cell recruitment necessary for eradication of peritoneal

carcinomatosis with an IL12-expressing maraba virus cellular vaccine”,

Cancer Immunol Res, 5(3), pp. 211-221, doi: 10.1158/2326-6066.CIR-16-

0162.

13. Alvarez M., Pinyerd H., Crisantes J., Rigano M., Pinkhasov J.,

Walmsley A., Mason H., Cardineau G. (2006), “Plant-made subunit

vaccine against pneumonic and bubonic plague is orally immunogenic in

mice”, Vaccine, 24(14), pp.2477-2490.

121

14. Appasamy P. M. (1999), “Biological and clinical implications of

interleukin-7 and lymphopoiesis”, Cytokines Cell. Mol. Ther., 5(1), pp. 25-

39.

15. Azizi H., Kazemi B., Bandehpour M., Mohebali M., Khamesipour A.,

Aryaeipour M., Yaghoobi H., Rokni M. B. (2016), “Modulation of the

immune response to DNA vaccine encoding gene of 8-kDa subunit of

echinococcus granulosus antigen B using murine interleukin-12 plasmid

in BALB/c Mice”, Iran J Parasitol, 11(4), pp.480-489.

16. Baird A. M., Lucas J. A., Berg L. J. (2000), “A profound deficiency in

thymic progenitor cells in mice lacking Jak3”, J Immunol, 165(7),

pp.3680–3688, PubMed: 11034372.

17. Barta A., Sommergruber K., Thompson D., Hartmuth K., Matzke M. A.,

Matzke A. J. M. (1986), “The expression of a nopaline synthase-human

growth hormone chimaeric gene in transformed tobacco and sunflower

callus tissue”, Plant Mol. Biology, 6(5), pp. 347–357.

18. Beilharz M. W., Cummins M. J.(2010), “Oromucosal administration of

interferon to humans”, Pharmaceuticals, 3(2), pp.323-344.

19. Bou-Dargham M. J., Khamis Z. I., Cognetta A. B., Sang Q. A. (2017),

“The role of interleukin-1 in inflammatory and malignant human skin

diseases and the rationale for targeting interleukin-1 alpha”, Med Res

Rev, 37(1), pp.180-216, doi: 10.1002/med.21406, PubmedID: 27604144.

20. Bradford M. M. (1976), “A rapid and sensitive method for the

quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of

protein-dye binding”, Anal Biochem, 72, pp. 248-254, PubmedID:

942051.

21. Budzianowski J. (2009), “New role for tobacco production of

biopharmaceuticals”, Przegl. Lek., 66(10), pp. 894-897.

122

22. Budzianowski J. (2012), “Tobacco a producer of recombinant

interleukins”, Przegl. Lek., 69(10), pp. 1060-1062.

23. Budzianowski J. (2010), “Tobacco a highly efficient producer of

vaccines”, Przegl. Lek., 67(10), pp. 1071-1076.

24. Cao X., Shores E. W., Huli J., Anver M. R., Kelsall B. L., Russell S. M.,

Drago J., Noguchi M., Grinberg A., Bloom E. T., Paul W. E., Kayz S. I.,

Love P. E., Leonard W. J. (1995), “Defective lymphoid development in

mice lacking expression of the common cytokine receptor-γ chain”,

Immunity, 2(3), pp. 223-238, PubMedID: 7697543.

25. Chad B., David T., Akiko M., Daniel W. N., Vasilis V. (2010),

“Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL)

gene family”, Human Genomics, 5(1), pp. 30-55, doi: 10.1186/1479-

7364-5-1-30.

26. Chen K., Kolls J. K. (2017), “Interluekin-17A (IL17A)”, Gene, 614, pp.

8-14, doi: 10.1016/j.gene.2017.01.016, PubMedID: 28122268.

27. Chen Y., Chauhan S. K., Tan X., Dana R. (2017), “Interleukin-7 and -15

maintain pathogenic memory Th17 cells in autoimmunity”, J

Autoimmun, 77, pp. 96-103, doi: 10.1016/j.jaut.2016.11.003, PubMedID:

27899224.

28. Chilton M., Tepfer D., Petit A., David C., Casse-Delbart F., Tempe J.

(1982), “Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genomes of

the host plant root cells”, Nature, 295, pp. 432-434, doi:

10.1038/295432a0.

29. Chong D. K. X., Langridge W. H. R. (2000), “Expression of full-length

bioactive antimicrobial human lactoferrin in potato plants”, Transgenic

Res, 9(1), pp. 71-78.

123

30. Christey M., Sinclair B. (1992), “Regeneration of transgenic kale

(Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B.

campestris var.rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated

transformation”, Plant Science, 87(2), pp. 161-169.

31. Conley A. J., Joensuu J. J., Jevnikar A. M., Menassa R., and Brandle J.

E. (2009), “Optimization of elastin-like polypeptide fusions for

expression and purification of recombinant proteins in plants”,

Biotechnology Bioeng, 103(3),pp. 562-573, doi: 10.1002/bit.22278.

32. Conrad U., Plagmann I., Malchow S., Sack M., Floss D. M., Kruglov A.

A., Nedospasov S. A., Rose-John S., Scheller J. (2011), “ELPylated anti-

human TNF therapeutic single-domain antibodies for prevention of

lethal septic shock”, Plant Biotechnol. J., 9(1), 22-31, doi:

10.1111/j.1467-7652.2010.00523.x.

33. Costello R., Imbert J., Olive D. (1993), “Interleukin-7, a major

Tlymphocyte cytokine”, Eur. Cytokine Netw., 4(4), pp. 253-262.

34. Dallenbach K., Maurer P., Rohn T., Zabel F., Kopf M., Bachmann M. F.

(2015), “Protective effect of a germline, IL-17-neutralizing antibody in

murine models of autoimmune inflammatory disease”. Eur J Immunol,

45(4): 1238-1247, doi: 10.1002/eji.201445017.

35. Davies H. M. (2010),“Review article: commercialization of whole-plant

systems for biomanufacturing of protein products: evolution and

prospects”,Plant Biotechnol J., 8(8), pp. 845-861, doi: 10.1111/j.1467-

7652.2010.00550.x.

36. Devi N., Adivitiya, Khasa Y. P. (2016), “A combinatorial approach of

N-terminus blocking and codon optimization strategies to enhance the

soluble expression of recombinant hIL-7 in E. coli fed-batch culture”.

124

Appl Microbiol Biotechnol, 100(23), pp: 9979-9994, PubMedID:

27342246, doi: 10.1007/s00253-016-7683-5.

37. Disanto J. P., Muller W., Guygrand D., Fischer A., Rajewsky K. (1995),

“Lymphoid development in mice with a targeted deletion of the

interleukin-2 receptor-γ chain”, Proc Natl Acad Sci USA, 92(2), pp. 377-

381, PubMed: 7831294.

38. Drake P., Chargelegue D., Vine N., van Dolleweerd C., Obregon P., Ma

J. (2003), “Rhizosecretion of a monoclonal antibody protein complex

from transgenic tobacco roots”, Plant Molecular Biology, 52(1), pp. 233-

241.

39. Ealick S. E., Cook W. J., Vijay-Kumar S., Carson M. (1991), “Three-

dimensional structure of recombinant human interferongamma”, Science,

252(5006), pp. 698-702, doi: 10.1126/science.1902591.

40. Eddie A. J., Changlin W., Zeping W., Raymond R., Joong H. S., Nancy

S. M., James M. L. (2000), “Production and characterization of

biologically active human GM-CSF secreted by genetically modified

plant cells”, Protein Expression and Purification, 19(1), pp: 131–138,

doi: https://doi.org/10.1006/prep.2000.1232.

41. Faller E. M., Ghazawi F.M., Cavar M., MacPherson P. A. (2010), “IL-7

induces clathrin-mediated endocytosis of CD127 and subsequent

degradation by the proteasome in primary human CD8 T cells”,

Immunology and Cell Biology, 165(2), pp. 11-23.

42. Farran I., Rio-Manterola F., Iniguez M., Garate S., Prieto J., Mingo-

Castel A. M. (2008), “High-density seedling expression system for the

production of bioactive human cardiotrophin-1, a potential therapeutic

cytokine, in transgenic tobacco chloroplasts”, Plant Biotechnol. J., 6(5),

125

516-527, doi: 10.1111/j.1467-7652.2008.00334.x, PubMedID:

18384506.

43. Fischer R., Emans N. (2000), “Molecular farming of pharmaceutical

proteins”, Transgenic Research, 9(4-5), pp. 279-299.

44. Fischer R., Schumann D., Zimmermann S., Drossard J., Sack M.,

Schillberg S. (1999), “Expression and characterization of bispecific

single-chain Fv fragments produced in transgenic plants”, Eur. J.

Biochem, 262(3), pp.810-816.

45. Floss D. M., Mockey M., Zanello G., Brosson D., Diogon M., Frutos R.,

Bruel T., Rodrigues V., Garzon E., Chevaleyre C., Berri M., Salmon H.,

Conrad U., Dedieu L. (2010), “Expression and immunogenicity of the

mycobacterial Ag85B/ESAT - 6 antigens produced in transgenic plants

by elastin-like peptide fusion strategy”, J. Biomed. Biotechnol, pp. 1-15,

Pubmed ID: 274346, doi: http://dx.doi.org/10.1155/2010/274346.

46. Floss D. M., Sack M., Arcalis E., Stadlmann J., Quendler H.,

Rademacher T., Stoger E., Scheller J. R., Fischer R., Conrad U. (2009),

“Influence of elastin-like peptide fusions on the quantity and quality of a

tobacco-derived human immunodeficiency virus-neutralizing antibody”,

Plant Biotechnology J., 7(9),pp. 899-913, doi: 10.1111/j.1467-

7652.2009.00452.x.

47. Funk P. E., Stephan R. P., Witte P. L. (1995), “Vascular cell adhesion

molecule 1-positive reticular cells express interleukin-7 and stem cell

factor in the bone marrow”, Blood, 86, pp. 2661-2671.

48. Gao P., Zhang C., Bian X., Guo Y., Wei Y., Zhang L., Liu Z., Wang X.,

Huang S. (2016), “The increasingly anti-tumor effect of a colonic

carcinoma DNA vaccine carrying HER2 by the adjuvanticity of IL-12”,

126

Immunopharmacol Immunotoxicol, 38(6), pp. 441-446, doi:

http://dx.doi.org/10.1080/08923973.2016.1233426.

49. Gaume A., Komarnytsky S., Borisjuk N., Raskin I. (2003),

“Rhizosecretion of recombinant proteins from plant hairy roots”, Plant

Cell Rep., 21(12), pp. 1188-1193, doi: 10.1007/s00299-003-0660-3.

50. Giddings G., Allison G., Brooks D., Carter A. (2000), “Transgenic plants

as factories for biopharmaceuticals”, Nat Biotechnol, 18(11), pp. 1151-

1155.

51. Gil F., Brun A., Wigdorovitz A., Catala R., Martincz-Torrecuadrada I.

L., Casal I., Salinas I., Borca M. V., Escribano J. M. (2001), “High-yield

expression of a viral peptide vaccine in transgenic plants”, FEBS Letter,

488(1-2), pp. 13-17, doi: http://doi.org/10.1016/S0014-5793(00)02405-4.

52. Gils M., Kandzia R., Marillonnet S., Klimyuk V., Gleba Y. (2005),

“High-yield production of authentic human growth hormone using a

plant virus-based expression system”, Plant Biotechnol. J., 3(6), pp. 613-

620, doi: 10.1111/j.1467-7652.2005.00154.x.

53. Gora-Sochacka A., Redkiewicz P., Napiorkowska B., Gaganidze D.,

Brodzik R., Sirko A. (2010), “Recombinant mouse granulocyte-

macrophage colony-stimulating factor is glycosylated in transgenic

tobacco and maintains its biological activity”, J. Interferon Cytokine

Res., 30(3), pp. 135-142, doi: 10.1089/jir.2009.0053.

54. Gutierrez-Ortega A., Avila-Moreno F., Saucedo-Arias L. J., Sanchez-

Torres C.,Gomez-Lim M. A. (2004), “Expression of a single-chain

human interleukin-12 gene in transgenic tobacco plants and functional

studies”, Biotechnology Bioeng., 85(7), pp. 734-740.

55. Gutierrez-Ortega A., Sandoval-Montes C., de Olivera-Flores T. J.,

Santos-Argumedo L., Gomez-Lim M. A. (2005), “Expression of

127

functional interleukin-12 from mouse in transgenic tomato plants”,

Transgenic Res., 14(6), pp. 877–885, doi: 10.1007/s11248-005-1464-8.

56. Gutierrez R., Macintosh G., Green P. (1999), “Current perspectives on

mRNA stability in plants: multiple levels and mechanisms of control”,

Trends Plant Sci., 4(11), pp. 429-438, doi.

57. Heufler C., Topar G., Grasseger A., Stanzl U., Koch F., Romani N.,

Namen A. E., Schuler G. (1993), “Interleukin 7 is produced by murine

and human keratinocytes”, J. Exp. Med., 178(3), pp. 1109-1114.

58. Hong S. Y., Kwon T. H., Lee J. H., Jang Y. S., Yang M. S. (2002),

“Production of biologically active hG-CSF by transgenic plant cell

suspension culture”, Enzyme Microb. Technol., 30(6), pp. 762–767, doi:

http://doi.org/10.1016/S0141-0229(02)00055-8.

59. Hood E., Woodard S. (2002), “Industrial proteins produced from

transgenic plants”, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, pp 119-

135, doi: 10.1007/978-94-017-2693-1_6.

60. Howard J., Hood E. (2005), “Bioindustrial and biopharmaceutical

products produced in plants”, Advances in Agronomy, 85, pp. 91-124,

doi:10.1016/S0065-2113(04)85002-8.

61. Jha S., Sanyal I., Amla D. (2015), “High-level expression and

purification of a therapeutic recombinant serine protease inhibitor from

transgenic tomato plants”, International Journal of Advance Research In

Science And Engineering 4(1), pp. 1158-1176.

62. Jiang Q., Li W. Q., Aiello F. B., Mazzucchelli R., Asefa B., Khaled A.

R., Durum S. K. (2005), “Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin”,

Cytokine Growth Factor Rev, 16(4-5), pp. 513–533, doi:

10.1016/j.cytogfr.2005.05.004.

128

63. Jing L., Min C., Xian-Wei L., Hou-Cheng Z., Fa F. S., George P. W.

(2007), “Transient expression of an active human interferon-beta in

lettuce”, Scientia Horticulturae, 112(3), pp. 258-265,

http://doi.org/10.1016/j.scienta.2006.12.047.

64. Jun-Ming Z., Jianxiong A., (2007), “Cytokines, Inflammation and Pain”,

Int Anesthesiol Clin, 45(2), pp. 27–37.

doi:10.1097/AIA.0b013e318034194e.

65. Kariminia A., Ivison S. M., Leung V.M., Sung S., Couto N., Rozmus J.,

Rolf N., Narendran A., Dunn S. E., Reid G. S., Schultz K. R. (2017), “Y-

box-binding protein 1 contributes to IL-7-mediated survival signaling in

B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia”, Oncology Letters,

13(1), pp. 497-505. doi: 10.3892/ol.2016.5437. PubmedID: 28123588.

66. Katsuhiko I., Kay M., Shin-jchi H., Carolynn P., Anthony E. N.,

Kensuke M., Paul W. K. (1991), “Stromal-cell and cytokine-dependent

lymphocyte clones which span the pre-B to B-cell transition”,

Developmental Immunology, 1(3), pp. 149-161.

67. Kazusa DNA Res. Inst. (2017), Codon usage database,

http://www.kazusa.or.jp/codon, ngày 7/01/2017.

68. Khaled A. R., Li W. Q., Huang J., Fry T. J., Khaled A. S., Mackall C. L.,

Muegge K., Young H. A., Durum S. K. (2002), “Bax deficiency partially

corrects interleukin-7 receptor-alpha deficiency”, Immunity, 17(5), pp.

561-573.

69. Kiana P., Khosro P., Taiebeh G. (2012),“Hairy root induction from

Portulaca oleracea using Agrobacterium rhizogenes to Noradrenaline’s

production”,International Research Journal of Applied and Basic

Sciences, 3(3): 642-649.

129

70. Kim H. J., Park S. M., Lee H., Kim Y. S. (2016), “Membrane-bound p35

Subunit of IL-12 on Tumor Cells is Functionally Equivalent to

Membrane-bound Heterodimeric Single Chain IL-12 for Induction of

Anti-tumor Immunity”, Immune Netw, 16(5), pp. 305-310, doi:

10.4110/in.2016.16.5.305.

71. Kim N. S., Kim T. G., Jang Y. S., Shin Y. J., Kwon T. H., Yang M. S.

(2008), “Amylase gene silencing by RNA interference improves

recombinant hGM-CSF production in rice suspension culture”, Plant

Mol. Biol., 68(4-5), pp. 369–377, doi: 10.1007/s11103-008-9376-7.

72. Kim N. S., Kim T. G., Kim O. H., Ko E. M., Jang Y. S., Jung E. S.,

Kwon T. H., Yang M. S. (2008), “Improvement of recombinant hGM-

CSF production by suppression of cysteine proteinase gene expression

using RNA interference in a transgenic rice culture”, Plant Mol. Biol.,

68(3), pp. 263–275, doi: 10.1007/s11103-008-9367-8.

73. Kim T. G., Lee H. J., Jang Y. S., Shin Y. J., Kwon T. H., Yang M. S.

(2008), “Co-expression of proteinase inhibitor enhances recombinant

human granulocyte-macrophage colony stimulating factor production in

transgenic rice cell suspension culture”, Protein Expr. Purif., 61(2),

pp.117–121, doi: 10.1016/j.pep.2008.06.005.

74. Kirchhoff J., Raven N., Boes A., Roberts J. L., Russell S., Treffenfeldt

W., Fischer R., Schinkel H., Schiermeyer A., Schillberg S. (2012),

"Monoclonal tobacco cell lines with enhanced recombinant protein

yields can be generated from heterogeneous cell suspension cultures by

flow sorting", Plant biotechnology journal, 10(8), pp. 936-944. doi:

10.1111/j.1467-7652.2012.00722.

75. Komarova T. V., Baschieri S., Donini M., Marusic C., Benvenuto E.,

Dorokhov Y. L. (2010),“Transient expression systems for plant-derived

130

biopharmaceuticals”,Expert Rev Vaccines, 9(8), pp. 859-876, doi:

10.1586/erv.10.85.

76. Kotenko S. V. (2002), “The family of IL-10-related cytokines and their

receptors: Related, but to what extent?”, Cytokine & Growth Factor Rev,

13(3), pp. 223-240, doi: 10.1016/S1359-6101(02)00012-6.

77. Kowalczyk T. , Lucka M., Szemraj J., Sakowicz T. (2016), “Hairy roots

culture as a source of valuable biopharmaceuticals”, Postepy Hig Med

Dosw (Online), 70, pp. 1-9, doi: 10.5604/17322693.1192186.

78. Krzystek-Korpacka M., Zawadzki M., Neubauer K., Bednarz-Misa I.,

Górska S., Wiśniewski J., Witkiewicz W., Gamian A. (2017), “Elevated

systemic interleukin-7 in patients with colorectal cancer and individuals

at high risk of cancer: association with lymph node involvement and

tumor location in the right colon”, Cancer Immunol Immunother, 66(2),

pp. 171-179. doi: 10.1007/s00262-016-1933-3, PubmedID: 27866242.

79. Kwon T., Kim Y., Lee J., Yang M.(2003), “Production and secretion of

biologically active human granulocyte-macrophage colony stimulating

factor in transgenic tomato suspension cultures”, Biotechnology Letters

25(18), pp. 1571-1574, doi: 10.1023/A:1025409927790.

80. Kwon T.H., Seo J.E., Kim J., Lee J.H., Jang Y.S., Yang M.S. (2003),

“Expression and secretion of the heterodimeric protein interleukin-12 in

plant cell suspension culture”, Biotechnology Bioeng., 81(7), pp. 870–

875, doi:10.1002/bit.10528.

81. Lamphear B. J., Jilka J. M., Kest L., Welter M., Howard J. A., Streatfield

S. (2004), “A corn-based delivery system or animal vaccines: an oral

transmissible gastroenteritis virus vaccine boosts lactogenic immunity in

swine”, Vaccine, 22(19), pp. 2420-2424, doi:

10.1016/j.vaccine.2003.11.066.

131

82. Lee J. H., Kim N. S., Kwon T. H., Jang Y. S., Yang M. S. (2002),

“Increased production of human granulocyte-macrophage colony

stimulating factor (hGM-CSF) by the addition of stabilizing polymer in

plant suspension cultures”, J. Biotechnol., 96(3), pp: 205–211.

83. Lefebvre A. L., McAuliffe L. (2016), “Targeted Immunomodulatory

Therapy: An Overview”, Rhode Island Medical Journal, 99(12), pp. 19-

22.

84. Link A., Vogt T. K., Favre S., Britschgi M. R., Acha-Orbea H., Hinz B.,

Cyster J. G., Luther S. A. (2007), “Fibroblastic reticular cells in lymph

nodes regulate the homeostasis of naive T cells”, Nat Immunol,

8(11):1255–1265, doi:10.1038/ni1513.

85. Liu C., Towler M. J., Medrano G., Cramer C. L., Weathers P. J. (2009),

“Production of mouse interleukin-12 is greater in tobacco hairy roots

grown in a mist reactor than in an airlift reactor”, Biotechnology Bioeng.,

102(4), pp. 1074-1086, doi: 10.1002/bit.22154.

86. Luchakivskaya Y., Kishchenko O., Gerasymenko I., Olevinskaya Z.,

Simonenko Y., Spivak M., Kuchuk M. (2011), “High-level expression of

human interferon alpha-2b in transgenic carrot (Daucus carota L.)

plants”, Plant Cell Rep., 30(3), pp. 407-415, doi: 10.1007/s00299-010-

0942-5.

87. Lutsenko T. N., Kovalenko M. V., Galkin O. Y. (2017), “Validation of

biological activity testing procedure of recombinant human interleukin-

7”, Ukr. Biochem. Journal, 89(1), pp. 82 - 89, doi:

https://doi.org/10.15407/ubj89.01.082.

88. Ma S., Huang Y., Davis A., Yin Z., Mi Q., Menassa R., Brandle J. E.,

Jevnikar A. M. (2005), “Production of biologically active human

132

interleukin-4 in transgenic tobacco and potato”, Plant Biotechnol. J.,

2005, 3(3), pp. 309-318, doi:10.1111/j.1467-7652.2005.00125.x.

89. Magnuson N. S., Linzmaier P. M., Reeves R., An G., Hay G. K., Lee J.

M. (1998), “Secretion of biologically active human interleukin-2 and

interleukin-4 from genetically modified tobacco cells in suspension

culture”, Protein Expr. Purif., 13(1), pp. 45-52, doi:

10.1006/prep.1998.0872.

90. Marek M., Jody G., Eva S., Leslie I. G., Michal O. (2009), “Calreticulin,

a multi-process calcium-buffering chaperone of the endoplasmic

reticulum”, Biochemical Journal, 417(3), pp. 651-666; doi:

10.1042/BJ20081847.

91. Mason H., Warzecha H., Mor T., Arntzen C. (2002), “Edible plant

vaccines pplication for prophylactic and molecular medicine”, Trends

Mol Med, 8(7), pp. 324-329.

92. Mauro F. R., Gentile M., Foa R. (2002), “Erythropoietin and chronic

lymphocytic leukemia”, Rev Clin Exp Hematol, 1, pp. 21-31.

93.Matsumoto S., Ikura K., Ueda M., Sasaki R. (1995), “Characterization of a

human glycoprotein (erythropoietin) produced in cultured tobacco cells”,

Plant Mol. Biol., 27(6), pp: 1163–1172.

94. Menassa R., Kennette W., Nguyen V., Rymerson R., Jevnikar A.,

Brandle J. (2004), “Subcellular targeting of human interleukin-10 in

plants”, J. Biotechnol., 108(2), pp. 179-183.

95. Mercx S., Tollet J., Magy B., Navarre C., Boutry M. (2016),“Gene

inactivation by CRISPR-Cas9 in N. tabacum BY-2 suspension

cells”,Front. Plant Sci., 7:40, doi:10.3389/fpls.2016.00040.

96. Mett V., Musiychuk K., Bi H., Farrance C. E., Horsey A., Ugulava N.,

Shoji Y., de la Rosa P., Palmer G. A., Rabindran S., Streatfield S. J.,

133

Boyers A., Russell M., Mann A., Lambkin R., Oxford J. S., Schild G. C.,

Yusibov V. (2008), “A plant-produced influenza subunit vaccine

protects ferrets against virus challenge”, Influenza Other Respi. Viruses,

2(1), pp. 33-40, doi: 10.1111/j.1750-2659.2008.00037.x.

97.Morrissey P. J., Conlon P., Braddy S., Williams D. E., Namen A. E.,

Mochizuki D. Y. (1991a), “Administration of IL-7 to mice with

cyclophosphamide-induced lymphopenia accelerates lymphocyte

repopulation”, J. Immunol, 146(5), pp. 1547-1552.

98. Morrissey P. J., Conlon P., Charrier K., Braddy S., Alpert A., Williams

D., Namen A. E., Mochizuki D. (1991b), “Administration of IL-7 to

normal mice stimulates B-lymphopoiesis and peripheral

lymphadenopathy”, J. Immunol, 147(2), pp. 561-568.

99. Mortimer E., James M. M., Sandiswa M., Amelia B., Anna-Lise W., Inga

I. H., Edward P. R. (2012), “Setting up a platform for plant-based

influenza virus vaccine production in South Africa”, BMC Biotechnol,

12:14. doi: 10.1186/1472-6750-12-14.

100. Nagata T., Hasegawa S., Int D. (2004), “Tobacco BY-2 Cells”,

Biotechnology in agriculture and forestry, 53, Springer-Verlag Berlin

Heidelberg.

101. Nahed E., Ronald E. G. (2010), “An Overview of IL-7 Biology and Its

Use in Immunotherapy”, J Immunotoxicol, 7(1), pp. 1-7,

doi:10.3109/15476910903453296.

102.Namen A. E., Lupton S., Hjerrild K., Wignall J., Mochizuki D. Y.,

Schmierer A., Mosley B., March C. J., Urdal D., Gillis S. (1988a),

“Stimulation of B-Cell progenitors by cloned murine interleukin- 7”,

Nature, 333(6173), pp. 571-573, doi: 10.1038/333571a0.

134

103. Namen A. E., Schmierer A. E., March C. J., Overell R. W., Park L. S.,

Urdal D. L., Mochizuki D. Y. (1988b), “B cell precursor growth-

promoting activity. Purification and characterization of a growth factor

active on lymphocyte precursors”, J. Exp. Med., 167(3), pp. 988-1002.

104. National Center for Biotechnology Information (2017), IL7 interleukin 7

[Homo sapiens (human)], https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3574,

ngày 5/01/2017.

105.Ngoc P. B. (2009), Production and Secretion of Recombinant Sweet-

Tasting Thaumatin from Suspension Cells and Hairy Roots of Nicotiana

tabacum, University of Heidelberg, Germany.

106. Nina W., Stefan Z., Martin-Walter W. (2016), “Concise review:

Interferon-free treatment of hepatitis C virus-associated cirrhosis and

liver graft infection”, World J Gastroenterol, 22(41), pp. 9044-9056,

doi:10.3748/wjg.v22.i41.9044.

107. Ning T., Xie T., Qiu Q., Yang W., Zhou S., Zhou L., Zheng C., Zhu Y.,

Yang D. (2008), “Oral administration of recombinant human

granulocyte-macrophage colony stimulating factor expressed in rice

endosperm can increase leukocytes in mice”, Biotechnology Letter,

30(9), pp. 1679-1686, doi: 10.1007/s10529-008-9717-2.

108. Nocarova E., Fischer L. (2009), “Cloning of transgenic tobacco BY-2

cells; an efficient method to analyse and reduce high natural

heterogeneity of transgene expression”, BMC Plant Biol., 9:44, doi:

10.1186/1471-2229-9-44.

109. Nosaka T., Vandeursen J. M. A., Tripp R. A., Thierfelder W. E.,

Witthuhn B. A., McMickle A. P., Doherty P. C., Grosveld G. C., Ihle J.

N. (1995), “Defective lymphoid development in mice lacking Jak3”,

Science, 270(5237), pp. 800-802.

135

110.O'Connor A. M., Crawley A. M., Angel J. B. (2010), “Interleukin-7

enhances memory CD8+ T-cell recall responses in health but its activity

is impaired in human immunodeficiency virus infection”, Immunology,

131(4), pp. 525-536, doi: 10.1111/j.1365-2567.2010.03325.x.

111. Ohbo K., Suda T., Hashiyama M., Mantani A., Ikebe M., Miyakawa K.,

Moriyama M., Nakamura M., Katsuki M., Takahashi K., Yamamura K.,

Sugamura K. (1996), “Modulation of hematopoiesis in mice with a

truncated mutant of the IL-2 receptor-γ chain”, Blood, 87(3), pp. 956-

967.

112. Ohya K., Matsumura T., Ohashi K., Onuma M., Sugimoto C. (2001),

“Expression of two subtypes of human IFN-alpha in transgenic potato

plants”, J. Interferon Cytokine Res., 21(8), pp. 595-602, doi:

10.1089/10799900152547858.

113. Ohya K., Itchoda N., Ohashi K., Onuma M., Sugimoto C., Matsumura

T.(2002), “Expression of biologically active human tumor necrosis

factor-alpha in transgenic potato plant”, J. Interferon Cytokine Res.,

22(3), 371-378, doi: 10.1089/107999002753675802.

114. Oliver P. M., Wang M., Zhu Y., White J., Kappler J., Marrack P. (2004),

“Loss of Bim allows precursor B cell survival but not precursor B cell

differentiation in the absence of interleukin 7”, J. Exp. Med., 200(9), pp.

1179-1187, doi: 10.1084/jem.20041129, PubMed ID: 15520248.

115. Patel J., Zhu H., Menassa R., Gyenis L., Richman A., Brandle J. (2007),

“Elastin-like polypeptide fusions enhance the accumulation of

recombinant proteins in tobacco leaves”, Transgenic Res., 16(2), pp.

239-249, doi: 10.1007/s11248-006-9026-2.

136

116. Park Y., Cheong H. (2002), “Expression and production of recombinant

human interleukin-2 in potato plants”, Protein Expr. Purif., 25(1), pp.

160-165, doi: 10.1006/prep.2002.1622.

117. Park S. Y., Saijo K., Takahashi T., Osawa M., Arase H., Hirayama N.,

Miyake K., Nakauchi H., Shirasawa T., Saito T. (1995), “Developmental

defects of lymphoid cells in Jak3 kinase-deficient mice”, Immunity, 3(6),

pp. 771-782. PubmedID: 8777722.

118. Pavar P. K., Maheshvari V. (2004), “Agrobacterium rhizogenes

mediated hairy root induction in two medicinally important members of

family solanaceae”, Indian Journal of Biotechnology, 3(3), pp. 414-417.

119.Pellegrini M., Calzascia T., Elford A. R., Shahinian A., Lin A. E.,

Dissanayake D., Dhanji S., Nguyen L. T., Gronski M. A., Morre M.,

Assouline B., Lahl K., Sparwasser T., Ohashi P. S., Mak T. W. (2009),

“Adjuvant IL-7 antagonizes multiple cellular and molecular inhibitory

networks to enhance immunotherapies”, Nature Medicine, 15, pp. 528-

536, doi:10.1038/nm.1953.

120. Plasson C., Michel R., Lienard D., Saint-Jore-Dupas C., Sourrouille C.,

de March G., Gomord V. (2009), “Production of recombinant proteins in

suspensioncultured plant cells”, Methods Mol Biol., 483, pp. 145-161,

doi:10.1007/978-1-59745-407-0_9.

121. Potula H. H., Kathuria S. R., Ghosh A. K., Maiti T. K., Dey S. (2008),

“Transient expression, purification and characterization of bioactive

human fibroblast growth factor 8b in tobacco plants”, Transgenic

Res.,17(1), pp. 19-32, doi: 10.1007/s11248-007-9072-4.

122. Qiang C. (2011),“Expression and manufacture of pharmaceutical

proteins in genetically engineered horticultural plants”,Transgenic

137

Horticultural Crops: Challenges, and Opportunities-Essays by Experts.

Boca Raton: Taylor & Francis, pp. 83-124, doi: 10.1201/b10952-5.

123. Reuter L., Bailey M., Joensuu J., Ritala A. (2014), “Scale-up of

hydrophobinassisted recombinant protein production in tobacco BY-2

suspension cells”, Plant Biotechnology Journal, 12(4), pp. 402-410, doi:

10.1111/pbi.12147.

124. Rich B. E., Campos-Torres J., Tepper R. I., Moreadith R. W., Leder P.

(1993), “Cutaneous lymphoproliferation and lymphomas in interleukin 7

transgenic mice”, J. Exp. Med., 177(2), pp. 305-316.

125. Rodig S. J., Meraz M. A., White J. M., Lampe P. A., Riley J. K., Arthur

C. D., King K. L., Sheehan K. C. F., Yin L., Pennica D., Johnson E. M.

J., Schreiber R. D. (1998), “Disruption of the Jak1 gene demonstrates

obligatory and non-redundant roles of the Jaks in cytokine-induced

biologic responses”, Cell, 93(3), pp. 373-383, PubMed: 9590172.

126.Sanchez-Hernandez C., Gutierrez-Ortega A., Aguilar-Leon D.,

Hernandez-Pando R., Gomez-Lim M., Gomez-Garcia B. (2010), “In

vivo activity of plant-based interleukin-12 in the lung of Balb/c mouse”,

BMC Res. Notes, 3:151, doi: 10.1186/1756-0500-3-151.

127. Santos R. B., Abranches R., Fischer R., Sack M., Holland T. (2016),

“Putting the Spotlight Back on Plant Suspension Cultures”, Front Plant

Sci., 7:297, doi: 10.3389/fpls.2016.00297.

128. Sardana R. K., Alli Z., Dudani A., Tackaberry E., Panahi M., Narayanan

M., Ganz P., Altosaar I. (2002), “Biological activity of human

granulocyte-macrophage colony stimulating factor is maintained in a

fusion with seed glutelin peptide”, Transgenic Research, 11(5), 521-531,

doi: 10.1023/A:1020343501475.

138

129. Sardana R., Dudani A. K., Tackaberry E., Alli Z., Porter S., Rowlandson

K., Ganz P., Altosaar I. (2007), “Biologically active human GM-CSF

produced in the seeds of transgenic rice plants”, Transgenic Res., 16(6),

pp. 713-721, doi:10.1007/s11248-006-9062-y.

130. Savino A. M., Izraeli S. (2017), “Interleukin-7 signaling as a therapeutic

target in acute lymphoblastic leukemia”, Expert Rev Hematol., 10(3), pp.

183-185, doi: 10.1080/17474086.2017.1292121.

131. Scheller J., Leps M., Conrad U. (2006), “Forcing single-chain variable

fragment production in tobacco seeds by fusion to elastin-like

polypeptides”, Plant Biotechnol. J., 4(2), pp. 243-249, doi:

10.1111/j.1467-7652.2005.00176.x.

132.Schwertschlag U. S., Trepicchio W. L., Dykstra K. H. (1999),

“Hematopoietic, immunomodulatory and epithelial effects of

interleukin-11”, Leukemia, 13(9), pp. 1307-1315.

133. Seddon B., Tomlinson P., Zamoyska R. (2003), “Interleukin 7 and T cell

receptor signals regulate homeostasis of CD4 memory cells”, Nature

Immunol, 4(7), pp. 680-686, doi: 10.1038/ni946.

134. Sevon N., Oksman-Caldentey K. M. (2002), “Agrobacterium

rhizogenes-mediated transformation: root cultures as a source of

alkaloids”, Planta Med, 68(10): p. 859-868, doi: 10.1055/s-2002-34924.

135.Sheppard P., Kindsvogel W., Xu W., Henderson K., Schlutsmeyer S.,

Whitmore T. E., Kuestner R., Garrigues U., Birks C., Roraback J.,

Ostrander C., Dong D., Shin J., Presnell S., Fox B., Haldeman B., Cooper

E., Taft D., Gilbert T., Grant F. J., Tackett M., Krivan W., McKnight G.,

Clegg C., Foster D., Klucher K. M. (2003), “IL-28, IL-29 and their class II

cytokine receptor IL-28R”, Nat Immunol, 4(1), pp. 63-68, doi:

10.1038/ni873.

139

136. Shin Y. J., Hong S. Y., Kwon T. H., Jang Y. S., Yang M. S. (2003),

“High level of expression of recombinant human granulocyte-

macrophage colony stimulating factor in transgenic rice cell suspension

culture”, Biotechnol. Bioeng, 82(7), pp.778-783, doi:10.1002/bit.10635.

137. Shiroki F., Satoshi M., Tomomitsu D., Mari F., Yoshito M., Takashi K.,

Harumi S., Shigeo K. (2007), “The p85α regulatory subunit of class IA

phosphoinositide 3-kinase regulates beta-selection in thymocyte

development”, Journal of Immunology, 178(3), pp. 1349–1356, doi:

10.4049/jimmunol.178.3.1349.

138. Silva M. R., Hoffman R., Srour E. F., Ascensao J. L. (1994),

“Generation of human natural killer cells from immature progenitors

does not require marrow stromal cells”, Blood, 84, pp. 841-846.

139. Sijmons P. C., Dekker B. M., Schrammeijer B., Verwoerd T. C., van den

Elzen P. J., Hoekema A. (1990), “Production of correctly processed

human serum albumin in transgenic plants”, Nature Biotechnology, 8,

pp. 217-222, doi:10.1038/nbt0390-217.

140. Song H., Nakayama E. E., Likanonsakul S., Wasi C., Iwamoto A.,

Shioda T., (2007), “A three-base-deletion polymorphism in the upstream

non-coding region of human interleukin 7 (IL-7) gene could enhance

levels of IL-7 expression”, Int J Immunogenet, 34(2), pp. 107-113.

141. Streatfield S. I., Mayor M., Barker D. K., Brooks C., Lamphcar B.,

Woodard S. L., Beifuss K. K., Vicuna D. V., Massey L. A., Horn M. E.,

Delaney D. E., Nikolov Z. L., Hood E. E., Jilka J. M., Howard J. A.

(2002), “Development of edible subunit vaccine in corn against

enterotoxigenic strains of Escherichia coli”, In Vitro Cellular &

Developmental Biology - Plant, 38(1), pp. 11-17,

doi:10.1079/IVP2001247.

140

142. Stephanie D. F., Thomas W. (2016), “Effects of interferons and viruses

on Metabolism”, Frontiers in Immunology, 7:630, doi:

10.3389/fimmu.2016.00630.

143. Sun H. J., Cui M., Ma B., Ezura H. (2006), “Functional expression of the

tastemodifying protein, miraculin, in transgenic lettuce”, FEBS Lett,

580(2), pp. 620-626, doi: 10.1016/j.febslet.2005.12.080, pubmed ID:

16406368.

144. Sun Q., Ding L., Lomonossoff G., Sun Y., Luo M., Li C., Jiang L., Xu Z.

(2011), “Improved expression and purification of recombinant human

serum albumin from transgenic tobacco suspension culture”, J

Biotechnol, 155(2), pp.164-172, doi: 10.1016/j.jbiotec.2011.06.033.

145. Matsuyama R., Goto K., Kadokura T., Sato M., Mori R., Kumamoto T.,

Taguri M., Miyasho T., Endo I. (2017), “IL-7 and procalcitonin are

useful biomarkers in the comprehensive evaluation of the severity of

acute cholangitis”, J Hepatobiliary Pancreat Sci, 24(2), pp. 81-88,

doi:10.1002/jhbp.420. PMID: 28002647

146. Suzuki K., Nakajima H., Watanabe N., Kagami S., Suto A., Saito Y.,

Saito T., Iwamoto I. (2000), “Role of common cytokine receptor-γ

chain- and Jak3-dependent signaling in the proliferation and survival of

murine mast cells”, Blood, 96(6), pp. 2172–2180.

147. Sweeney E. B., Foss F. M., Murphy J. R., Spek J. C. (1998), “Interleukin

7 (IL-7) receptor-specific cell killing by DAB389 IL-7: a novel agent for

the elimination of IL-7 receptor positive cells”, Bioconjug chem.,9(2),

pp. 201 - 207, doi: 10.1021/bc9701757.

148. Tekoah Y., Shulman A., Kizhner T., Ruderfer I., Fux L., Nataf Y.,

Bartfeld D., Ariel T., Gingis-Velitski S., Hanania U., Shaaltiel

Y.(2015),“Large-scale production of pharmaceutical proteins in plant

141

cell culture-the protalix experience”,Plant BiotechnologyJ., 13(8), 1199-

1208, doi: 10.1111/pbi.12428.

149. Tekoah Y., Shaaltiel Y. (2016),“Plant specific N-glycan do not have

proven adverse effects in humans”,Nature Biotechnology, 34, pp. 706-

708, doi:10.1038/nbt.3556.

150.Terpe K. (2006), “Overview of bacterial expression systems for

heterologous protein production: from molecular and biochemical

fundamentals to commercial systems”, Appl Microbiol Biotechnology,

72(2), pp. 211-22.

151. Tery J. F., Crystal L. M. (2002), “Interleukin-7: from bench to clinic”,

Blood, 99(11), pp. 3892-3904.

152. Ting‑ Ting C., Jaw‑ Wen C. (2016), “Emerging role of chemokine CC

motif ligand 4 related mechanisms in diabetes mellitus

and cardiovascular disease: friends or foes?”, Cardiovasc Diabetol,

15(1), pp.117, doi: 10.1186/s12933-016-0439-9.

153. Tomasz K., Marta L., Janusz S., Tomasz S. (2016), “Hairy roots culture

as a source of valuable biopharmaceuticals”, Postepy Hig Med Dosw

(online), 70, pp.1-9, doi: 10.5604/17322693.1192186.

154. Toussirot E., Aubin F. (2016), “Paradoxical reactions under TNF-α

blocking agents and other biological agents given for chronic immune-

mediated diseases: an analytical and comprehensive overview”, RMD

Open, 2(2), doi:10.1136/rmdopen-2015-000239.

155. Vandana K., Laura A. P., Yevgeniy Y., Florian M. B., Surojit S. (2015),

“Quiescence of Memory CD8(+) T Cells Is Mediated by Regulatory T

Cells through Inhibitory Receptor CTLA-4”, Immunity, 42(6), pp. 1116-

1129.

142

156. Van den Bergh J. M., Lion E., Van Tendeloo V. F., Smits E. L. (2017),

“IL-15 receptor alpha as the magic wand to boost the success of IL-15

antitumor therapies: The upswing of IL-15 transpresentation”,

Pharmacology & Therapeutics, 170, pp. 73-79, doi:

10.1016/j.pharmthera.2016.10.012.

157. Vaquero C., Sack M., Chandler J., Drossard J., Schuster F., Monecke M.,

Schillberg S., Fischer R. (1999), “Transient expression of a tumor-

specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco

leaves”, Proc Natl Acad Sci U S A, 96(20), pp. 11128-11133.

158. Veerapandian B., Gilliland G. L., Raag R., Svensson A. L., Masui Y.,

Hirai Y., Poulos T. L. (1992), “Functional implications of interleukin-1

beta based on the three-dimensional structure”, Proteins, 12(1), pp. 10-

23, doi: 10.1002/prot.340120103.

159. Wang D. J., Brandsma M., Yin Z., Wang A., Jevnikar A. M., Ma S.

(2008), “A novel platform for biologically active recombinant human

interleukin-13 production”, Plant Biotechnology J., 6(5), pp. 504–515,

doi: 10.1111/j.1467-7652.2008.00337.

160. Wang M. L., Goldstein C., Su W., Moore P. H., Albert H. H. (2005),

“Production of biologically active GM-CSF in sugarcane: A secure

biofactory”, Transgenic Res., 14(2), pp. 167-178.

161. Wang X. B., Wu Q., Ito T., Cillo F., Li W. X., Chen X., Yu J. L., Ding

S. W. (2010), “RNAi-mediated viral immunity requires amplification of

virus-derived siRNAs in Arabidopsis thaliana”, Proc Natl Acad Sci U S

A, 107(1), pp. 484-9, doi: 10.1073/pnas.0904086107.

162. Watanabe M., Ueno Y., Yajima T., Iwao Y., Tsuchiya M., Ishikawa H.,

Aiso S., Hibi T., Ishii H. (1995), “Interleukin 7 is produced by human

intestinal epithelial-cells and regulates the proliferation of intestinal

http://www.sciencedirect.com/science/journal/01637258

143

mucosal lymphocytes”, J. Clin. Investigation, 95(6), pp. 2945-2953, doi:

10.1172/JCI118002.

163. Wiles M. V., Ruiz P., Imhof B. A. (1992), “Interleukin-7 expression

during mouse thymus development”, Eur. J. Immunology, 22(4), pp.

1037-1042, doi: 10.1002/eji.1830220424.

164. Williams P., Galipeau J. (2011), “GMCSF-Interleukin fusion cytokines

induce novel immune effectors that can serve as biopharmaceuticals for

treatment of autoimmunity and cancer”, J. Intern. Medicine, 269(1), pp.

74–84, doi: 10.1111/j.1365-2796.2010.02314.x.

165. Wongsamuth R., Doran P. M. (1997), “Hairy roots as an expression

system for production of antibodies”, In: Doran PM, ed: Hairy Roots:

Culture and Applications, Amsterdam: Harwood Academic, pp. 89-97.

166. World Health Organization (2016), Vietnam has among world’s highest

cancer fatality rates,

https://www.vietnambreakingnews.com/2016/10/vietnam-has-among-

worlds-highest-cancer-fatality-rates/, ngày 01/01/2017.

167. Yano A., Maeda F., Takekoshi M. (2004), “Transgenic tobacco cells

producing the human monoclonal antibody to hepatitis B virus surface

antigen”, J. Med. Virol, 73(2), pp.208-215, doi: 10.1002/jmv.20077.

168. Yoko S., Hong B., Konstantin M., Amy R., April H., Gourgopal R.,

Brian G., Moneim S., Christine E. F., Barbara T., Nutan M., Natalia U.

(2009), “Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge

infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza”, Vaccine,

27(7), pp. 1087-1092, doi:10.1016/j.vaccine.2008.11.108.

169. Yoseph S., Yoram T. (2016), “Plant specific N-glycan do not have

proven adverse effects in humans”, Nature Biotechnology, 34, pp. 706-

708, doi:10.1038/nbt.3556.

144

170. Zdanov A., Schalk-Hihi C., Gustchina A., Tsang M., Weatherbee J.,

Wlodawer A. (1995), “Crystal structure of interleukin-10 reveals the

functional dimer with an unexpected topological similarity to interferon

gamma”, Structure, 3(6), pp. 591-601, doi: 10.1016/S0969-

2126(01)00193-9.

171. Zhang B., Yang Y. H., Lin Y. M., Rao Q., Zheng G. G., Wu K. F.

(2003), “Expression and production of bioactive human interleukin-18 in

transgenic tobacco plants”, Biotechnology Letter, 25(19), pp. 1629-1635.

172. Zhang X., Du P., Lu L., Xiao Q., Wang Q., CaoX., Ren B., Wei C., Li

Y.(2008), Contrasting effects of HC-Pro and 2b viral suppressors from

Sugarcane mosaic virus and Tomato aspermy cucumovir us on the

accumulation of siRNAs,Virology, 374(2), pp. 351-360, doi:

10.1016/j.virol.2007.12.045.

173. Zhong H., Gu X., Dai Y., Wang Z., Fu D., Guo X., Wu H., Wang D., Lu

Z. (2016), “Interleukin-7 in Patients With Chronic Hepatitis B May Have

Effect on T Follicular Helper Cells and Specific Cellular Immunity”,

Hepat Mon, 16(9): e36068, doi:10.5812/hepatmon.36068.

174. Zhou F., Wang M. L., Albert H. H., Moore P. H., Zhu Y. J. (2006),

“Efficient transient expression of human GM-CSF protein in Nicotiana

benthamiana using potato virus X vector”, Appl. Microbiology

Biotechnology, 72(4), pp. 756-762, doi: 10.1007/s00253-005-0305-2.

175. Ziegler S. F., Liu Y. J. (2006), “Thymic stromal lymphopoietin in

normal and pathogenic T-cell development and function”, Nature

Immunology, 7(7), pp. 709-714, doi: 10.1038/ni1360.

145

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Thành phần các loại môi trƣờng

Môi trƣờng Thành phần

YMB đặc

0.4 g/l Yeast extract + 0.5 g/l K2HPO4.3H2O + 10 g/l mannitol

+

2 g/l MgSO4.7H2O + 0.1 g/l NaCl + 15 g/l bacto agar, pH = 7

YMB lỏng

0.4 g/l Yeast extract + 0.5 g/l K2HPO4.3H2O + 10 g/l mannitol

+

2 g/l MgSO4.7H2O + 0.1 g/l NaCl, pH = 7

LB đặc 5 g/l Yeast extract + 10 g/l Bacto tryptone + 10 g/l NaCl + 15

g/l bacto agar, pH = 7

LB lỏng 5 g/l Yeast extract + 10 g/l Bacto tryptone + 10 g/l NaCl, pH =

7

WPM đặc

WPM I (20ml/L) + WPM II (10ml/L) + WPM III (10ml/L) +

WPM IV (10ml/L) + WPM V (10ml/L) + 30 g đường + 8 g

thạch, pH = 5.8

WPM lỏng

WPM I (20ml/L) + WPM II (10ml/L) + WPM III (10ml/L)

+ WPM IV (10ml/L) + WPM V (10ml/L) + 30 g đường, pH =

5.8

MS đặc 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS

IV + 10 ml/L MS V + 30 g đường + 8 g thạch, pH = 5.8

MS lỏng 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS

IV + 10 ml/L MS V + 30 g đường, pH = 5.8

½ MS 10 ml/L MS I + 5 ml/L MS II + 5 ml/L MS III + 5 ml/L MS IV

+ 5 ml/L MS V, pH = 5.8

146

YP 50 mM Tris-HCl 1M + 300 mM NaCl 5M + 20 mM EDTA

0.5M + 4% CTAB, pH = 8.0

147

Phụ lục 2. Thành phần một số dung dịch đệm

Dung dịch đệm Thành phần

Đệm xử lý mẫu

(Treatment buffer 6X)

Tris HCl 1M

Glycerol 100%

SDS

2-mercaptoethanol

Bromophenol blue

pH

3,75 ml

6 ml

1,2 g

0,9 ml

1,2 mg

6,8

Đệm chạy điện di protein

(running buffer protein)

Tris HCl

Glycine

SDS

25 mM

250mM

0,1%

1 lít running buffer 1X: 3g Tris, 18,8 g glycine, 1g

SDS

Đệm Staining buffer

CBBR - 250

Methanol

Acid axetic

0,25%

30%

10%

Đệm Destaining buffer Methanol

Acid axetic

30%

10%

Đệm chiết DNA tổng số

Tris-HCl 1M

NaCl 5M

EDTA 0.5M

CTAB

pH

50 mM

300 mM

20 mM

4%

8.0

148

Phụ lục 3. Các vector sử dụng trong luận án

P3.1. Sơ đồ cấu trúc vector pENTRTM

221

149

P3.2. Sơ đồ cấu trúc vector pK7WG2D.1

P3.3. Sơ đồ cấu trúc vector pET32c(+)

150

P3.4. Sơ đồ cấu trúc vector pBSK/IL7

151

P3.5. Sơ đồ cấu trúc vector pCB301 35S/IL7-histag-cMyc-100xELP

Phụ lục 4. Phương trình đường chuẩn protein

y = 0,0072x + 0,0432

R² = 0,9835

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 20 40 60 80 100 120

OD

59

5 n

m

C (g/ml)

P4.1. Phương trình đường chuẩn theo Bradford (chất chuẩn BSA)

Nồng độ chất chuẩn BSA: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 µg/ml

y = 0,0399x + 0,0769

R² = 0,9798

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 5 10 15 20 25

OD

63

0 n

m

C (ng/l)

P4.2. Phương trình đường chuẩn protein scFv gắn đuôi c-Myc

Nồng độ chất chuẩn 0; 1.25; 2; 2.5; 5; 10; 15; 20 ng/l

152

Phụ lục 5: Bảng phiên mã amino acid

Bazo thứ 1 Bazo thứ 2

Bazo thứ 3 T C A G

T

Phe Ser Tyr Cys T

Phe Ser Tyr Cys C

Phe Ser Tyr Cys A

Phe Ser Tyr Cys G

C

Leu Pro His Arg T

Leu Pro His Arg C

Leu Pro His Arg A

Leu Pro His Arg G

A

Ile Thr Asn Ser T

Ile Thr Asn Ser C

Ile Thr Lys Arg A

Met Thr Lys Arg G

G

Val Ala Asp Gly T

Val Ala Asp Gly C

Val Ala Glu Gly A

Val Ala Glu Gly G

Documents

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN I H M - Thai Nguyen University ...dhsptn.edu.vn/uploads/news/2017_12/nguyen-huy-hoang_toan-van-luan-an.pdf · trong các Tạp chí Khoa học; phần còn