INA_440_Lecture9_2015

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Espectrofotometría

Caracterización de Residuos Sólidos y Aguas Residuales

INA 440

Valeria Ochoa, Ph.D.

Primer Semestre 2015 - 2016

Noviembre 22, 2015

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Espectrofotometría

http://www.realmagick.com/ultraviolet-spectrophotometry/ Colorímetro Spectronic 20D+ - LIA-USFQ

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I) Definición

•  Se conoce como espectrofotometría a cualquier proceso que emplea luz para medir concentraciones químicas

•  Es el método de análisis óptico más empleado en las investigaciones químicas y bioquímicas

•  Se refiere a la medida de cantidades relativas de luz absorbida por una muestra, en función de la longitud de onda.

Espectrofotometría

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Espectrofotometría

http://www.adinstruments.com/solutions/education/lcexp/introduction-spectrophotometry

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Espectrofotometría

http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/18797/title/Across-the-Spectrum--Instrumentation-for-UV-Vis-Spectrophotometry/

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I) Definición

•  La luz se describe en función de ondas y partículas

Espectrofotometría

Propiedades de la luz

http://www.bcssa.org/newsroom/scholarships/great8sci/Earth/RocksMinerals/RocksMinerals/Minerals/Properties3.html

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I) Definición

•  ONDA: Se considera que la luz es una onda electromagnética que se autopropaga indefinidamente a través del espacio, con campos magnéticos y eléctricos generándose continuamente. Estas ondas electromagnéticas son sinusoidales, con los campos eléctrico y magnético perpendiculares entre sí y respecto a la dirección de propagación.

Espectrofotometría

Propiedades de la luz

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Frecuencia (ν): Número de oscilaciones del campo por unidad de tiempo. Es una cantidad inversa al periodo. (Hz = 1/s) Longitud de onda (λ): Es la distancia lineal entre dos puntos equivalentes de ondas sucesivas. Velocidad de propagación (V): Es la distancia que recorre la onda en una unidad de tiempo. En el caso de la velocidad de propagación de la luz en el vacío, se representa con la letra c.

I) Definición Propiedades de la luz

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Donde: c = velocidad de la luz (2.998 x 108 m/s en el vacío)


En otro medio que no sea el vacío, la velocidad de la luz es c/n, n es el índice de refracción de dicho medio. Para longuitudes de onda en el rango visible, n > 1, entonces la luz visible viaja más despacio a través de la materia que a través del vacío

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Espectrofotometría

I) Definición Propiedades de la luz •  PARTÍCULA: en términos de energía es más conveniente considerar a la luz como partículas llamadas fotones

Donde: h = constante de Planck (6.626 x 10-34 J.s)

Donde: v = número de onda

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Espectrofotometría


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Espectrofotometría


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II) Absorción de la Luz Cuando una molécula absorbe un fotón, la energía de la molécula

aumenta, la molécula alcanza un estado excitado. Si la molécula emite un fotón, la energía de la molécula disminuye El estado más bajo de energía se llama: ¨ground state¨

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II) Absorción de la Luz •  Radiación microonda: estimula el movimiento rotacional de las moléculas

•  Radiación infraroja: estimula las vibraciones de las moléculas

•  Luz visible y radiación UV: ocasiona que los electrones sean promovidos a orbitales más altos de energía

•  Rayos X y los ondas cortas UV rompen los enlaces químicos e ionizan las moléculas

•  Rayos X (medicina) dañan el cuerpo humano y su exposición debe ser minimizada

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Espectrofotometría

II) Absorción de la Luz •  Irradiancia (I) = Potencia incidente por unidad de superficie

•  Transmitancia (T) = Fracción de la luz que pasa a través de una muestra

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II) Absorción de la Luz •  Absorbancia (A) = Potencia incidente por unidad de superficie

•  Absorbancia (A) = Directamente proporcional a la concentración

Beer – Lambert Law

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II) Absorción de la Luz Beer – Lambert Law: absorbancia es directamente proporcional a

la concentración de las especies que absorben luz en la muestra

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Beer_lambert.png?uselang=es

Donde: A = Absorbancia Є = factor de absortividad molar* b = largo de la celda (pathlength) (cm) c = concentración del absorbente en el medio * Absortividad molar= característica de una sustancia e indica cuanta luz se absorbe a una longitud de onda dada.

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II) Absorción de la Luz

http://www.plantingscience.org/index.php?module=MediaAttach&func=display&fileid=287

Espectra de absorción

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II) Absorción de la Luz La parte de la molécula responsable de la absorción de la luz se llama

cromoforo

http://www.pburch.net/dyeing/dyeblog/C1845207367/E20071121154411/

Cualquier sustancia que absorbe luz visible toma un color cuando la luz se transmite o se refleje a través de ella. La sustancia absorbe cierto color y nuestros ojos detectan las longitudes de onda que nos son absorbidas. El color observado se llama complementario del color absorbido

Cromoforo

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Espectrofotometría

II) Absorción de la Luz

Longitud de onda (nm) de max.

absorción

Color absorbido Color observado

380-420 Violeta Verde-amarillo

420-440 Violeta-azul Amarillo

440-470 Azul Naranja

470-500 Azul-verde Rojo

500-520 Verde Morado

520-550 Amarillo-verde Violeta

550-580 Amarillo Violeta-azul

580-620 Naranja Azul

620-680 Rojo Azul-verde

680-780 Morado Verde

Tabla 18-1 Colores de la luz visible

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Espectrofotometría

II) Absorción de la Luz •  Análisis espectrofotométricos: compuesto debe absorber luz y esta

absorción se puede distinguir de aquella de otras sustancias •  Análisis colorimétricos: análisis espectrofotométricos en los que se emplea radiación visible

•  Muchos compuestos absorben luz en el rango UV, por lo que muchas veces los análisis se restringen al rango visible

•  Si no existen especies que interfieren se emplea el rango UV, por ejemplo para análisis de proteínas, ya que los grupos aromáticos presentes en ellas tienen una absorbancia máxima a 280 nm

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Espectrofotometría

II) Absorción de la Luz Ex. Análisis de benceno

a) Se prepara una solución disolviendo 25.8 mg benceno en hexano y diluyéndola a 250 ml. Esta solución registra un pico de absorción a 256 nm con una absorbancia de 0.266 en una celda de 1 cm. Determine ε para benceno a esta longitud de onda b) Determine la concentración de benceno si la muestra tiene una absorbancia de 0.070 a 256 nm en una cuveta de 5 cm de ancho.

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Espectrofotometría

III) Espectrofotómetros Single-beam spectrophotometer

http://www.uam.es/docencia/quimcursos/Scimedia/chem-ed/spec/uv-vis/uv-vis.htm

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III) Espectrofotómetros

•  La luz generada por una fuente es separada en longitudes de onda con bandas angostas por un monocromador, atraviesa la muestra y es medida en un detector. La irradiancia (P) que llegue al detector se mide en relación a un celda de referencia que contiene el blanco.

•  Problemas: no se puede emplear este instrumento para medir absorbancia en función de tiempo

Single-beam spectrophotometer

Colorímetro Spectronic 20D+ LIA-USFQ

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III) Espectrofotómetros Single-beam spectrophotometer

Colorímetro Spectronic 20D+ LIA-USFQ

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Double-beam spectrophotometer

http://www.chemguide.co.uk/analysis/uvvisible/spectrometer.html

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•  La luz pasa a través de la muestra y de la celda de referencia debido a rotaciones del espejo (chopper) ¨into and out of the light path¨

•  Cuando la luz pasa a través de la muestra, el detector mide P, cuando el chopper difiere la luz y pasa a través de la referencia, el detector mide Po. El circuito automáticamente compara P y Po para obtener la transmitancia y la abosorbancia.

•  Correción automática para cambios en la intensidad de la luz y respuesta del detector con el tiempo y la longitud de onda


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Espectrofotometría



http://www2.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/virttxtjml/spectrpy/uv-vis/uvspec.htm

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Espectrofotometría



The functioning of this instrument is relatively straightforward. A beam of light from a visible and/or UV light source (colored red) is separated into its component wavelengths by a prism or diffraction grating. Each monochromatic (single wavelength) beam in turn is split into two equal intensity beams by a half-mirrored device. One beam, the sample beam (colored magenta), passes through a small transparent container (cuvette) containing a solution of the compound being studied in a transparent solvent. The other beam, the reference (colored blue), passes through an identical cuvette containing only the solvent. The intensities of these light beams are then measured by electronic detectors and compared. The intensity of the reference beam, which should have suffered little or no light absorption, is defined as I0. The intensity of the sample beam is defined as I. Over a short period of time, the spectrometer automatically scans all the component wavelengths in the manner described. The ultraviolet (UV) region scanned is normally from 200 to 400 nm, and the visible portion is from 400 to 800 nm.

http://www2.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/virttxtjml/spectrpy/uv-vis/uvspec.htm

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III) Espectrofotómetros Double-beam spectrophotometer

http://www.made-in-china.com/showroom/pgeneral/product-detailsMhxXCjkAGYA/China-UV-Vis-Double-Beam-Spectrophotometer-T80-.html

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Componentes

•  Fuente ¨Source¨

•  Celda de la muestra ¨sample cell¨

•  Monocromador ¨monochromator¨

•  Detector ¨detector¨

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Componentes

Fuente ¨Source¨

•  Radiación UV: lámpara de deuterio

•  Radiación Visible: lámpara de tungsteno

•  Láser

http://spanish.alibaba.com/product-gs/2500w-g22-tungsten-halogen-lamp-204836455.html

http://spanish.alibaba.com/gs-suppliers_yuyu/column/208091027/deuterium_lamp.html

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Componentes

Celda de la muestra

•  Transparente a la radiación de interés

•  Celda de referencia compensa reflexión de la celda y el solvente

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Componentes

Monocromador

•  Dispersa la luz en las diferentes logitudes de onda que la componen, mejor dispersión = mayor resolución. Pero esto crea mayor ruido ya que menos luz llega al detector

http://hasylab.desy.de/science/studentsteaching/primers/storage_rings__beamlines/index_eng.html

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Monocromador: dispera la luz en las longitudes de onda que la componen y selecciona un longitud de onda que pasa a través de la muestra y del detector •  Grating: componente óptico que refleja y transmite la luz con una serie de líneas juntas. Cuando la luz se refleja o se transmite a través del grating, cada línea actúa como una fuente separada de radiación.

•  Difracción: bending of light by a grating

•  Refracción: bending of light by a lens or prism

•  Filtros: remueven bandas anchas de radiación de una señal.

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Componentes

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III) Espetrofotómetros

Monocromador: dispera la luz en las longitudes de onda que la componen y selecciona un longitud de onda que pasa a través de la muestra y del detector •  Filtros: remueven bandas anchas de radiación de una señal. El filtro más simple es un vidrio de color en el que las especies coloradas absorben un porción amplia del espectra y transmiten otras porciones.

Figura 20-10

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Componentes

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Espectrofotometría

Componentes

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Detectores: producen una señal eléctrica cuando son “struck” por fotones. La respuesta de un detector depende de la longitud de onda de la luz incidente (fotones)

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Componentes

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Detectores:

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Componentes

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Componentes

Detector •  Tubo fotomultiplicador (UV – VIS): fotones ocasionan que los electrones sean expulsados de un cátodo metálico

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•  Tubo fotomultiplicador (Photomultiplier tube, PMT): compuesto de un cátodo fotoemisivo formado de metales alcalinos, seguido de electrodos enfocadores, un multiplicador de electrones (dínodos) y un colector de electrones (ánodo) en un tubo al vacío. Cuando la luz entra al fotocátodo, este convierte la energía de la luz incidente en fotoelectrones, los cuales son enfocados hacia los dínodos. La energía de los electrones incidentes provoca la emisión de un número mayor de electrones secundarios que son dirigidos hacia un segundo dínodo que es más positivo que el primero. Alta sensibilidad y bajo ruido. Por cada fotón emitido, se colectan 106 electrones

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Componentes

Detector

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•  Tubo fotomultiplicador (Photomultiplier tube, PMT): compuesto de un cátodo fotoemisivo formado de metales alcalinos, seguido de electrodos enfocadores, un multiplicador de electrones (dínodos) y un colector de electrones (ánodo) en un tubo al vacío. Cuando la luz entra al fotocátodo, este convierte la energía de la luz incidente en fotoelectrones, los cuales son enfocados hacia los dínodos. La energía de los electrones incidentes provoca la emisión de un número mayor de electrones secundarios que son dirigidos hacia un segundo dínodo que es más positivo que el primero. Alta sensibilidad y bajo ruido. Por cada fotón emitido, se colectan 106 electrones

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Componentes

Detector

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Refracción de la luz

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Espectrofotometría

Refracción de la luz

Cuando la luz se refleja, el ángulo de reflexión es igual al ángulo de incidencia. Cuando la luz pasa de un medio a otro (con diferentes índices de refracción), la luz se desvía, y esto es lo que se llama refracción de la luz Snell´s Law

Mientras mayor es la diferencia entre los índices de refracción entre los dos medios, mayor luz se refleja en la interfase Ejemplo

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Ruido

Cuando la luz se refleja, el ángulo de reflexión es igual al ángulo de incidencia. Cuando la luz pasa de un medio a otro (con diferentes índices de refracción), la luz se desvía, y esto es lo que se llama refracción de la luz Snell´s Law

Ejemplo

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Ruido White noise (Gaussian noise): movimiento aleatorio de los electrones en el circuito

http://en.wikipedia.org/wiki/File:White-noise.png

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Espectrofotometría

Ruido 1/f noise (Drift noise): disminuye en proporción 1/ frecuencia (drifting de una fuente de luz). Ester ruido se debe a cambios pequeños en los componentes del instrumento con la temperatura,edad y variaciones de voltaje

http://planck.caltech.edu/lfi.html

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Espectrofotometría

Ruido Line noise (Interference or whistle noise, electrical noise): a frecuencias discretas como la de 60-Hz este ruido se produce cuando ¨elefantes caminan en el subsuelo del edificio¨

http://planck.caltech.edu/lfi.html

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