Introducción - Universidad Nacional De Colombia · La hipertensión arterial pulmonar (HAP) asociada a la hipoxia crónica de la gran altura, fue clasificada en el tercer grupo de

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Introducción

La hipertensión arterial pulmonar (HAP) asociada a la hipoxia crónica de la gran altura, fue clasificada en el tercer grupo de HAP, según la clasificación clínica para la HAP, establecida en el 4º simposio mundial sobre HAP en el año 2008 (Naval, 2011) y se calcula que más de 140 millones de personas viven en alturas mayores de los 2.500 metros sobre el nivel del mar (msnm) (Peñaloza & Arias, 2007); así mismo, el número de visitantes temporales a las grandes alturas se calcula en cerca de 40 millones (Moore et al., 1998; Ward et al., 2000). Debido a la gran cantidad de población expuesta a la hipoxia hipobárica, la HAP se considera un problema de salud pública en las regiones montañosas en todo el mundo y una complicación en individuos que sufren enfermedades pulmonares crónicas. Adicionalmente, la HAP de origen hipóxico, está fuertemente asociada con un incremento de la morbilidad y una reducida supervivencia (Incalzi et al., 1999; Barbera et al., 2003). Estos hechos imponen la necesidad de realizar continuamente investigaciones tratando de identificar los mecanismos celulares y moleculares que contribuyen a esta condición. Los estudios, in vivo e in vitro, en modelos animales de HAP son cada día más relevantes, en busca de la comprensión completa de la fisiopatología de la enfermedad.

Los principales biomodelos utilizados para el estudio de la HAP, a saber:

Cepas de ratas con susceptibilidad genética a desarrollar HAP como la cepa FHR (FHR: por sus siglas en inglés Fawn-Hooded Rats); junto con ésta también ha sido diseñado su control normotenso (SDR por sus siglas en inglés: Sprague-Dawley Rats); otras cepas genéticamente manipuladas, son la Dahl sensible a la sal (DS) y la cepa LH, entre otras (Folkow, 1993; Hernández, 1993; Jones & Jacobson, 2000; Stenmark et al., 2009).

La rata transgénica para el gen Ren-2, con bajo nivel de renina en el plasma. (Hernández, 1993).

Las ratas tratadas con monocrotalina, que ocasiona daño endotelial, extensión de músculo liso a los vasos sanguíneos no musculares, y proliferación del mismo en las arteriolas musculares, desencadenando el aumento de la RVP y la hipertrofia del ventrículo derecho (Lipke et al., 1993; Takahashi et al., 1998).

Los corderos, a los cuales mediante técnicas quirúrgicas realizadas aún dentro del útero, se les induce la HAP. Las de mayor uso son las anastomosis entre las arterias aorta y pulmonar y el procedimiento a través del cual se liga el ducto arterioso, ocasionando un shunt de derecha a izquierda (Reddy et al., 1995; Ivy et al., 1998).

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Corderos sanos a los cuales se les induce la HAP mediante sustancias químicas como el U-46619, el cual posee una función vasoconstrictora como el tromboxano A2 (TXA2) (Reddy et al., 1995), el alcohol y la angiotensina II (Ang II) (Baños, 2002).

Los cerdos recién nacidos mediante el sometimiento a hipoxia crónica introduciéndolos dentro de cámaras en condiciones normobáricas e hipóxicas (10% Oxígeno (O2)), durante 10 a 12 días (Fike et al., 1998).

Terneras recién nacidas en cámaras hipobáricas para inducir la HAP simulando una altitud de 4300 msnm; los animales desarrollan los cambios estructurales y hemodinámicos característicos de la enfermedad (Wohrley et al., 1995).

Aunque la rata ha sido el biomodelo animal más utilizado en la HAP, debido al costo de éstos animales genéticamente manipulados, al de las cámaras simuladoras hipobáricas, hipóxicas y al costo y complejidad de las técnicas quirúrgicas, se sugiere la posibilidad de utilizar un biomodelo más económico, que no requiera de manipulación genética ni quirúrgica, para inducirle la enfermedad. Como la HAP se presenta en forma natural en el pollo de engorde al exponerlo a un medio ambiente de hipoxia crónica, se podría sugerir su empleo para la realización de estudios tendientes a clarificar los mecanismos involucrados en la patogénesis de la HAP.

La HAP en pollos de engorde es una enfermedad de distribución mundial que puede ocurrir a cualquier edad, siendo más susceptibles las explotaciones comerciales ubicadas por encima de los 1300 msnm (Rodríguez, 1994). En México, en el año 1984 se estimaron pérdidas que ascendieron a 40 millones de dólares a causa de mortalidad ocasionada por HAP (López-Coello et al., 1985). En Estados Unidos, la presentación de la HAP aporta más del 25% de las pérdidas anuales en la industria del pollo de engorde, con una incidencia de la enfermedad entre 4 al 5%, lo cual ocasiona pérdidas económicas cuantiosas, cercanas al billón de dólares al año (Odom, 1993; Maxwell & Robertson, 1997). En Colombia la HAP se considera una grave entidad, y para el año de 1996, con una población de 380 millones de pollos de engorde se calcularon pérdidas económicas cercanas a 40 mil millones de pesos, con una incidencia del 6.5% (Moreno de Sandino y Hernández, 1996).

Es claro que dicha enfermedad posee una enorme importancia en la salud pública en el hombre por su elevada incidencia y desfavorable pronóstico. Por tal motivo muchas investigaciones se dirigen a identificar y desarrollar nuevas intervenciones terapéuticas que intenten interrumpir los procesos de vasoconstricción y de remodelación vascular propios de esta patología. Dentro de los fármacos más utilizados en el tratamiento de la HAP en mamíferos se encuentran los bloqueadores de los canales de calcio, como las Dihidropiridinas (DHP). La nifedipina es una DHP que posee elevada afinidad por la vasculatura pulmonar (Hernández, 1993; Poelaert & Roosens, 2000). Esta sustancia ha sido investigada en modelos de experimentación de la HAP. Sin embargo, aún se desconoce el efecto de este fármaco sobre la vasculatura pulmonar y en la presentación de la HAP en pollos de engorde.

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En el siguiente trabajo mediante la experimentación in vivo se intentó analizar el efecto de la nifedipina sobre: 1) la incidencia de la HAP, la hipertrofia e hiperplasia del ventrículo derecho del corazón y la remodelación de las arteriolas pulmonares. E in vitro 2) el efecto del vasoconstrictor de la ET-1 y del vasodilatador nifedipina sobre la vasculatura pulmonar de pollos de engorde sanos e hipertensos.

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Referencias

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Objetivos

Objetivo general

Evaluar in vitro e in vivo, el efecto de un bloqueador de los canales de calcio (Nifedipina) en la vasculatura pulmonar y en la presentación de la hipertensión arterial pulmonar de origen hipóxico en pollos de engorde.

Objetivos específicos

Determinar el efecto de la administración de nifedipina sobre la presentación de la HAP en pollos de engorde.

Determinar si la administración de Nifedipina modifica los procesos de remodelación de la vasculatura pulmonar en pollos de engorde.

Comparar la respuesta a ET-1, en anillos de arteria pulmonar, provenientes de pollos sanos y pollos con HAP.

Comparar la respuesta de anillos de arteria pulmonar de pollos sanos y con HAP, a Nifedipina.

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1. Revisión de Literatura. El endotelio y los canales iónicos en la fisiopatología de la hipertensión arterial pulmonar hipóxica

Resumen

La hipertensión arterial pulmonar (HAP) de origen hipóxico es una enfermedad progresiva y fatal, que ocurre en pollos de engorde y en mamíferos. La patogénesis de la HAP en todas las especies involucra un proceso complejo y multifactorial en el que la disfunción endotelial, a través del desbalance en la síntesis de sustancias vasoactivas (aumento de vasoconstrictores como la Endotelina-1 y disminución de vasodilatadores como el Óxido Nítrico) participa conjuntamente con las modificaciones de los canales iónicos de Calcio (Ca2+) y de Potasio (K+) en las células musculares lisas vasculares (CMLV). Los canales de Ca2+ de mayor relevancia en las CMLV son los operados por voltaje (VOCC) tipo L. La exposición de los individuos con vasculatura hiperreactiva a la hipoxia crónica ocasiona una sobre-regulación y sobre-activación de éstos canales que conllevan al aumento en la concentración de calcio libre citosólico [(Ca2+)i], lo cual favorece tanto la vasoconstricción sostenida como los cambios estructurales en la vasculatura pulmonar. La relevancia de los VOCC tipo-L en la vasoconstricción pulmonar hipóxica argumenta el empleo de los bloqueadores de canales de Ca2+. De éstos las Dihidropiridinas (DHP) se han destacado por su afinidad con la vasculatura muscular lisa. Un prototipo de las DHP es la nifedipina, que se ha utilizado ampliamente en el control de la HAP hipóxica y de otros orígenes, tanto en el hombre como en algunos modelos animales. Lo cual ha demostrado resultados benéficos en la reducción de la Presión Arterial Pulmonar (PAP) y en la Resistencia Vascular Pulmonar (RVP), también se ha reportado su efecto en el control de la remodelación vascular, eventos claves en la patogénesis de la HAP.

Palabras clave: Calcio, canales iónicos, hipertensión pulmonar, pollos de engorde,

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Introducción

La hipertensión arterial pulmonar (HAP) es definida clínicamente como una condición de presión arterial pulmonar (PAP) y resistencia vascular pulmonar (RVP) elevadas. La exposición crónica de la mayoría de los animales y del hombre a un ambiente de reducida presión parcial de oxígeno (PPO2), como lo que ocurre en las grandes alturas, ocasiona hipoxia alveolar en los mamíferos y en los capilares aéreos en el caso de las aves (D'Alonzo et al., 1991; Abenhaim et al., 1996). Esto conlleva al desarrollo de HAP, en la cual ocurre un incremento de la fuerza del ventrículo derecho para contrarrestar el aumento de la RVP, que lleva al desarrollo de hipertrofia, dilatación y falla ventricular (Weir et al., 1995).

La RVP elevada en la HAP es el resultado de un incremento en el tono vascular y de las alteraciones morfológicas de los vasos pulmonares precapilares (Rabinovitch et al., 1979; Stenmark, 1987; Durmowicz & Stenmark, 1999; Stenmark et al., 2006b). Dichas alteraciones, se refieren a la muscularización de las arteriolas pulmonares con proliferación tanto de las células musculares lisas vasculares (CMLV) de la capa media como de los fibroblastos de la adventicia (Rabinovitch et al., 1979; Stenmark, 1987; Durmowicz et al., 1993). Estos cambios estructurales que sufre la vasculatura como consecuencia de la hipoxia alveolar son conocidos como remodelación vascular. Las modificaciones en las CMLV conducen a la reducción del lumen de las arteriolas pulmonares, lo cual es más evidente en las de diámetros inferiores a 300 micrometros (μm). Así, la pared vascular se torna menos elástica y todo ello contribuye al aumento de la RVP (Durmowicz & Stenmark, 1999; Reid, 1994). Como en el caso de los bovinos entre los mamíferos, los pollos se estudian como modelo experimental en la interpretación de la fisiología aviar en las grandes alturas. En algunos individuos de esta especie, su vasculatura pulmonar se comporta de manera hiperreactiva a la hipoxia y cuando son sometidos a ésta de forma crónica, desarrollan fácilmente HAP (Burton & Smith, 1967; Burton et al., 1967; Sillau &, Montalvo, 1982; Cueva et al., 1974). En pollos de engorde mantenidos a 3.300 metros sobre el nivel del mar (msnm), hay un marcado incremento de la PAP y del número de eritrocitos en comparación con pollos mantenidos a nivel del mar. Estudios de pollos con síndrome ascítico muestran incrementos similares en estas variables (Maxwell et al., 1986).

La hipoxia se utiliza con frecuencia para inducir HAP en una amplia variedad de especies animales. Este modelo es útil porque es predecible y reproducible; sin embargo, existe variabilidad en la respuesta a la hipoxia crónica entre especies (Stenmark et al., 2006a). Los animales de rápido crecimiento son particularmente susceptibles a la hipoxia, como se observa en las diferentes estirpes de pollo de engorde, siendo este probablemente uno de los vertebrados de más rápido crecimiento (Peacock et al., 1989) y además puede desarrollar HAP en cualquier circunstancia que determine hipoxia de los capilares aéreos. A diferencia de los pollos de engorde, las estirpes de aves livianas productoras de huevo no padecen esta enfermedad, debido a que los pollos de engorde tienen una vasculatura pulmonar más reactiva, desarrollan una mayor respuesta vasoconstrictora y menor vasodilatadora en comparación con las aves livianas productoras de huevos (Martinez-Lemus et al., 2003).

Algunos autores relacionaron la excesiva vasoconstricción, por un lado, con la función anormal o con el cierre de los canales de potasio (K+) y sobre-regulación de los canales

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de calcio (Ca2+) ubicados en la membrana de las CMLV y por otra parte, con la disfunción endotelial. Ésta lleva a la disminución en la producción de vasodilatadores tipo Óxido Nítrico (NO) y Prostaciclina (PGI2) junto con el aumento en la síntesis de vasoconstrictores como la endotelina-1 (ET-1). Muchas de estas anormalidades no solamente elevan el tono vascular y promueven la remodelación vascular, sino que también, representan blancos farmacológicos potenciales (Inagami et al., 1995; Voelkel & Tuder, 2000).

1.1 La disfunción endotelial en la hipertensión arterial pulmonar hipóxica

La circulación pulmonar se caracteriza por su bajo tono vascular en reposo y por su sensibilidad a la hipoxia. El bajo tono vascular normal del pulmón es controlado por la actividad de las células endoteliales, las cuales elaboran y liberan una serie de sustancias vasodilatadoras como el NO, la PGI2, la adrenomedulina (AM), el factor de hiperpolarización derivado del endotelio (EDHF), el péptido atrial natriurético y vasocontractoras como la ET-1, el tromboxano A2 (TXA2), la angiotensina II (Ang II), la serotonina (5-HT), los leucotrienos y el factor activador de plaquetas (PAF). En condiciones fisiológicas existe un equilibrio entre las sustancias vasocontractoras y las vasodilatadoras, lo cual garantiza el mantenimiento del tono local normal. La hipoxia rompe ese equilibrio, causando lo que se conoce como “disfunción endotelial”. Cuando se produce la disfunción endotelial, se aumenta la síntesis de las sustancias vasocontractoras y se disminuye las vasodilatadoras; entre las sustancias vasodilatadoras producidas por el endotelio, la más importante es el NO y entre las vasocontractoras, la más importante es la ET-1 (Dinh-Xuan, 1993; Inagami et al., 1995; Stenmark y Mecham, 1997; Jeffery y Morrell, 2002; Budhiraja et al., 2004).

La hipoxia afecta la función de las células endoteliales y regula la producción y la liberación de sustancias vasoactivas implicadas en el control de la contracción y la remodelación estructural de la pared de las CMLV, que a su vez depende tanto del grado como de la duración de la hipoxia (Rubanyi & Vanhoutte, 1985; Vender et al., 1987; Faller, 1999). En la hipoxia aguda ocurren modificaciones rápidas en la reactividad vascular pulmonar, que son más evidentes en relación con la persistencia del estímulo hipóxico. Mientras que en la hipoxia crónica suceden alteraciones de la actividad de algunos factores de transcripción, los cuales a su vez estimulan la expresión de genes que inducen la proliferación celular (Durmowicz y Stenmark, 1999). Así, la hipoxia crónica constituye un grave estrés para las células y un estímulo importante que afecta las respuestas genéticas de las células endoteliales. Estas alteraciones son manifestaciones de una adaptación inadecuada (Faller, 1999).

La exposición crónica a la hipoxia reduce la producción de PGI2 y de NO, lo cual favorece la vasoconstricción pulmonar hipóxica y elimina su actividad como agentes antimitógenos, lo cual contribuye a la hiperplasia de las CMLV y de los fibroblastos (Durmowicz & Stenmark 1999; Budhiraja et al., 2004; Humbert et al., 2004).

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1.2 Remodelación vascular en la HAP hipóxica

En la HAP con manifestaciones clínicas el mayor componente del incremento de la RVP es la remodelación más que la vasoconstricción (McLauglhin & McGoon, 2006). Los cambios en la vasculatura pulmonar inducidos por la hipoxia son la acelerada formación de músculo liso en vasos sanguíneos normalmente no musculares de la pared alveolar (Stenmark et al., 2006a). Ello ocurre en las arterias precapilares, que puede ser debido a la proliferación de las CMLV de la capa media de las arteriolas pulmonares. También, se ha reportado que la hipoxia induce una respuesta inflamatoria temprana y persistente, que juega un papel crítico en la remodelación, lo cual corresponde principalmente a células mononucleares. En los cambios inducidos por la hipoxia también juegan un papel la hemodinamia y el reclutamiento de células progenitoras (Frid et al., 2006). Otros cambios son la diferenciación de pericitos y/o la migración de CMLV de la arteria pulmonar, incluyendo el reclutamiento y la diferenciación de fibroblastos locales, con engrosamiento de la adventicia. Cabe destacar que en modelos animales la lesión predominante es la hipertrofia de la capa media más que el engrosamiento de la íntima y la adventicia, que sí se observa en la HAP en el hombre (McLauglhin & McGoon, 2006).

1.2.1 Regulación transcripcional

La regulación de la transcripción génica durante la respuesta a la hipoxia es crucial para la remodelación vascular e involucra varias clases de señales y numerosos genes

blanco, como los de los siguientes factores de crecimiento: transformante beta (TGF-), vascular (VGF), endotelial vascular (VEGF), derivado de las plaquetas (PDGF). También están involucrados el PAF y la molécula de adhesión celular inducida-1 (ICAM-1). El VGF, VEGF y la eritopoyetina, son inducidos directamente por la transcripción del

factor inducible por la hipoxia1 (HIF-1) (Forsythe et al, 1996; Isner, 2000; Semenza, 2000).

1.1.1 Óxido nítrico (NO)

El NO es considerado un gas de fácil difusión, producido en forma endógena por múltiples tipos de células. Tiene una vida media de segundos y participa en una variedad de funciones biológicas importantes. En el lado luminal de la vasculatura, inhibe la agregación plaquetaria y la síntesis de las moléculas de adhesión para los leucocitos impidiendo su migración; mientras que sobre el músculo liso, el NO induce su relajación e inhibe su mitosis (Moncada et al., 1991; Inagami et al., 1995; Murad, 1999, 2004). El efecto inhibitorio sobre la proliferación de las CMLV, ocurre por el bloqueo en la síntesis de mitógenos para las CMLV como el PDGF y el VEGF (Adnot &, Raffestein, 1996).

La vasodilatación dependiente del NO se produce por dos vías: indirectamente a través de la acción del GMP cíclico (GMPc) como mediador intermediario y en una forma directa, abriendo los canales de K+ en la superficie de las CMLV (Yuan et al., 1996). La hipoxia puede modular el efecto inhibitorio de las células endoteliales sobre la proliferación de las CMLV por otros mecanismos. El NO puede inducir la activación

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reversible de la vía de la Proteína Quinasa-C (PKC), una señal intracelular asociada con la proliferación celular (Kirck et al., 2002). La hipoxia inhibe la liberación del heparán sulfato producido en las células endoteliales, el cual inhibe directamente la proliferación de las CMLV (Durmowicz & Stenmark 1999).

El NO es sintetizado a partir de la L-arginina a través de la enzima sintasa de óxido nítrico (NOS). Existen tres isoformas de la NOS: la NOS cerebral (bNOS), la NOS endotelial (eNOS) y NOS inducible (iNOS); de estas, la eNOS es indispensable para la vasorrelajación dependiente del endotelio y el mantenimiento del tono vascular local normal (Inagami et al., 1995); sin embargo, la exposición de las células endoteliales a la hipoxia, reduce los niveles de eNOS (Giaid & Saleh, 1995; Harrison, 1997). La disfunción endotelial y la alteración en la producción del NO en individuos con HAP hipóxica crónica hoy son incuestionables tanto en animales (Rees et al., 1989; Adnot et al. 1991; Karamsetty et al., 1996) como en humanos (Dinh-Xuan et al., 1989, 1992; Dinh –Xuan, 1993).

Un mecanismo probable del defecto de la liberación del NO en la HAP por hipoxia crónica es una disminución de la expresión genética de la enzima eNOS, secundariamente a factores físicos tales como la hipoxia o la tensión de roce sostenida. Los resultados de varios estudios permiten sugerir que la hipoxia crónica reduce la relajación dependiente del NO en las arterias pulmonares (Kouyoumdjian et al., 1994; Adnot & Raffestin, 1996; Roberts et al., 2000). Una disminución en la cantidad de la eNOS podría causar la reducción de la producción del NO (Giaid & Saleh, 1995). Moreno de Sandino y Hernández (2003), relacionaron la disminución de la expresión de la eNOS, y la consecuente disminución en la producción de NO, en las arteriolas pulmonares en pollos criados en la altura (2.638 msnm) con la patogénesis de la HAP hipóxica. Esto concuerda con los resultados reportados por Gómez (2008), quien demostró que hay una reducción en la expresión del mRNA del gen de la eNOS en pollos con HAP, en comparación con pollos sanos, criados en la misma altura. A partir de observaciones experimentales, se sugiere que en la vasculatura pulmonar la disminución de la expresión de la eNOS que ocurre por la exposición a la hipoxia crónica, está relacionada con los procesos de remodelación vascular (Giaid &, Saleh, 1995; Adnot & Raffestin, 1996; Moreno de Sandino & Hernández, 2006).

1.1.2 Endotelina-1 (ET-1)

Las endotelinas son una familia de péptidos de 21 aminoácidos, producidos por la mayoría de tipos celulares (Levin, 1996). La familia de las endotelinas comprende tres péptidos vasopresores (ET-1, ET-2 y ET-3) (Masaki, 1993), de éstos, la célula endotelial solamente produce ET-1 (Inoue et al., 1989; Masaki, 1993; Inagami et al., 1995). La ET-1 también es producida por otro tipo de células como las del músculo liso, las neuronas, las células mesengiales, los melanocitos, las células de la paratiroides y del amnios (Giaid et al., 1989; Boulanger et al., 2007).

Las células endoteliales tienen la capacidad única de sensar los cambios de velocidad del flujo, de la presión sanguínea y de la tensión de oxígeno, por mecanismos sujetos a la regulación de una variedad de hormonas (Inagami et al., 1995). La activación del gen que codifica para la ET-1 involucra un mecanismo Ca2+ dependiente de la PKC (Emori et

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al., 1991). Su expresión se disminuye por factores como el NO, los péptidos natriuréticos y concentraciones elevadas en el citoplasma de GMPc y también suprimiendo la PKC (Emori et al., 1993). La ET-1 no es almacenada en gránulos (Nakamura et al., 1990), sino que se forma después de la transcripción de genes que codifican a su precursor inactivado, después de la estimulación por la hipoxia, el estrés por roce y la isquemia. La ET-1 liberada por las células endoteliales, se adhiere a abundante proteína G, que está unida a receptores de la ET-1 expresados en las CMLV, lo cual ocasiona un incremento de la concentración de Ca2+ libre citosólico ([(Ca2+)i]) que a su vez, aumenta el tono de las CMLV (Simonson & Dunn , 1990).

Las acciones primarias de la concentración nanomolar de ET-1 son: La activación de la fosfolipasa C, que induce la formación de inositol trifosfato (IP3) y un incremento transitorio de la [(Ca2+)i]. Subsecuentemente ocurre una contracción vascular larga y sostenida y una elevación de la [(Ca2+)i] (Yamagisawa et al., 1988). Estas observaciones indican que la apertura de los canales de Ca2+ dependiente de la proteína G es importante para la contracción mediada por la ET-1.

Receptores de la ET-1

Existen dos isoformas de receptores de la ET-1, ETA (localizados en las CMLV) y ETB (localizados en las células endoteliales) responsables de la vasoconstricción y la vasodilatación respectivamente (Yamasigawa et al., 1988; Pollock, 1998). Éstos receptores pertenecen a la familia de receptores acoplados a proteínas G (Arai et al., 1990; Sakurai et al., 1990). La importancia de los receptores de la ET-1 se corroboró con el uso de los antagonistas no selectivos ò duales (ETA y ETB) y selectivos, los cuales han demostrado eficacia en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares como la HAP entre otras (Prie et al., 1998; Michel et al., 2003; Galley & Webster, 2004).

Los receptores ETA se encuentran en las CMLV y poseen las funciones de regular de manera paracrina el efecto vasoconstrictor de la ET-1 y estimular la proliferación de estas células. Existe una subtipificación de los receptores ETB, ETB1 y ETB2. Los receptores ETB1 están presentes en el endotelio y regulan la función autocrina de la ET-1 que ocasiona la liberación de NO y de la PGI2 ocasionando la vasodilatación (Inagami et al., 1995; Davie et al., 2002). Mientras que los receptores ETB2 se localizan en las CMLV y tienen efectos vasoconstrictores al igual que los receptores ETA. Las diferencias ETB1 y ETB2 son pocas ó incluso pueden ser de naturaleza post-transcripcional (Pollock, 1998; Ohlstein et al., 1996). Los receptores ETA se clasifican en ETA1 y ETA2, de acuerdo con su sensibilidad al antagonista BQ-123 (Sudjarwo et al., 1994; Ohlstein et al., 1996).

Los niveles plasmáticos de la ET-1 se encuentran elevados en pacientes con HAP y están correlacionados con el incremento de la RVP (Michel et al., 2003). Adicionalmente, la expresión del mRNA para la ET-1 está incrementada en las células endoteliales de arterias pulmonares de individuos con HAP primaria. Li et al (1994) reportaron que hay aumento en la síntesis de ET-1 y de su receptor ETA en la hipoxia crónica. Gómez et al. (2007) encontraron que la ET-1, el Factor de crecimiento tisular y la AM están sobre-regulados en los pulmones pollos con HAP hipóxica. Estos resultados sugieren que dichos péptidos pueden jugar un importante papel en la patofisiología de la HAP.

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1.3 Los canales iónicos en la HAP hipóxica

La vasoconstricción pulmonar debida a la hipoxia es una respuesta fisiológica durante la cual las pequeñas arterias pulmonares desvían la sangre venosa de los alvéolos hipóxicos y capilares aéreos en las aves, optimizando así el acoplamiento entre la perfusión y la ventilación, lo cual tiene como propósito prevenir la hipoxemia arterial. Cuando solamente una pequeña región del pulmón es hipóxica, la vasoconstricción puede ocurrir sin efecto significativo en la PAP (Nakanishi et al., 1996). Sin embargo, cuando la hipoxia es generalizada, como se observa en la exposición a las grandes alturas o en las enfermedades pulmonares, la subsecuente vasoconstricción arterial contribuye a la HAP, a la falla cardíaca y a la muerte (Sommer et al., 2008).

Es ampliamente aceptado que los canales iónicos de K+ y de Ca2+, expresados en las CMLV arteriales son sensibles a la presión de oxígeno en sangre, determinan el tono vascular y sufren modificaciones en respuesta a la hipoxia (Hong et al., 2004; Weir & Olschewski, 2006). La hipoxia a su vez ocasiona el aumento de las corrientes de Ca2+ a través de los canales de Ca2+ tipo L, lo que conlleva al aumento en la [(Ca2+)i]. Este incremento de la [(Ca2+)i causa vasoconstricción pulmonar y también es un importante estímulo para la proliferación de las CMLV de la arteria pulmonar (Platoshyn et al., 2001; Sommer et al., 2008). La hipoxia crónica reduce la actividad de los canales de K+ y puede inducir cambios en el control de la transcripción y la traducción de los genes de los canales de K+ en las CMLV de la arteria pulmonar (Mauban et al., 2005; Remillard & Yuan, 2005). En las alteraciones que ocurren en la vasculatura pulmonar como consecuencia de la exposición a la hipoxia crónica, existe una respuesta sinérgica entre esta y la ET-1 (aumentada como consecuencia de la disfunción endotelial). La consecuencia de esto afecta directamente los canales iónicos de Ca2+ y K+ localizados en la membrana de las CMLV, lo que ocasiona un efecto directo sobre el aumento de la [(Ca2+)i].

La vasoconstricción pulmonar inducida por la ET-1 ocurre en dos fases: la primera es una constricción transitoria que sucede por el cierre de los canales K+ y la consecuente despolarización de la membrana plasmática de las CMLV, de tal manera que los canales iónicos de K+ en las CMLV son los responsables de esta fase; la segunda fase es una constricción tónica y lenta, mediada por la ET-1 (Evans & Dipp, 2002).

1.3.1 Canales de potasio (K+)

Los canales de K+ son estructuras proteicas insertadas en la membrana plasmática celular que permiten el paso solamente de K+ a través de los mismos. Estos canales han sido descritos en todos los tejidos humanos. Así mismo, existen varias clases de canales K+ en una misma célula (Moudgil et al., 2006). En las CMLV, los canales de K+ regulan el potencial de membrana, el acoplamiento entre la excitación y la contracción, en el control del tono vascular arterial y actúan como sensores de oxígeno (Nelson & Quayle, 1995; Lesage & Lazdunski, 2000). Como algunos canales de K+ están abiertos en estado basal, si éstos se cierran, se despolariza la membrana celular y se abren los Canales de Ca2+ operados por voltaje (VOCC: por sus siglas en inglés Voltage Operated Calcium Channels). Esto permite la entrada de Ca2+ a las CMLV y favorece la interacción entre la miosina y la actina generando la fuerza contráctil (Nelson & Quayle, 1995). Al contrario, si

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los canales K+ se abren, se hiperpolariza la membrana plasmática y se desencadena la vasodilatación (Mandegar & Yuan, 2002). Además de la función sobre la contracción también se conoce que la activación de los canales de K+ también está involucrada en la modulación de la proliferación y la apoptosis en las CMLV arteriales pulmonares (Platoshyn et al., 2000; Brevnova et al., 2004).

Los canales de K+ descritos en todos los tipos celulares se pueden dividir al menos en cinco grandes familias: regulados por voltaje (Kv) (Yuan, 1995; Evans et al., 1996), activados por Ca2+ (KCA), regulados por ATP (KATP) (Nelson & Quayle, 1995), rectificadores internos (KIR) (Nelson et al., 1990; Nelson & Quayle, 1995; Coppock et al., 2001) y de dominios de poros repetidos (KT) (Gurney et al., 2003; Olschewski et al., 2006). Estas familias también se han descrito en las CMLV.

La estructura de los canales de K+, se compone de cuatro subunidades alfa () y cuatro

beta (β) (Jan & Jan, 1997). Existen nueve familias de -subunidades (Kv 1-9) (Hille, 2001), cada una de ellas con subtipos, los cuales muestran diferencias en la sensibilidad

al voltaje lo mismo que en su activación e inactivación (Salkoff et al., 1992). Las -subunidades idénticas o distintas, pueden combinarse para formar el canal funcional

heteromérico con propiedades únicas (Salinas et al., 1997). Subunidades accesorias

pueden combinarse con las subunidades para adicionar aún más diversidad a la

función de los canales. Las subunidades poseen un papel potencial en la modulación

funcional de las -subunidades, y en la respuesta de las CMLV de la arteria pulmonar a la hipoxia (Weir & Olschewski, 2006; Moudgil et al., 2006).

Bajo condiciones de hipoxia, existe disminución de la expresión del mRNA de las

subunidades de los canales Kv Kv1.1, Kv1.2, Kv1.5, Kv2.1, Kv4.3 y Kv9.3 en cultivos de CMLV (Sweeney & Yuan, 2000; Platoshyn et al., 2001). Esto ha sido demostrado en varios modelos, como el ratón crónicamente hipóxico y el ratón sin Kv1.5. En estos

individuos además de los cambios en la expresión de la proteína de las -subunidades que hacen parte de los poros de los canales de Kv, también ocurre una disminución de la sensibilidad al oxígeno en las CMLV arteriales pulmonares de animales crónicamente hipóxicos (Reeve et al., 2001). La mayoría de la evidencia de la actividad sensora del O2 de los canales Kv gira alrededor de los Kv1.5 y de los Kv2.1 (Archer et al., 1998, 2004). Los ratones sin Kv1.5 mostraron vasoconstricción pulmonar alterada y reducida sensibilidad al O2 en las CMLV (Archer et al., 2001). La reducción de la actividad de estos canales y la consecuente despolarización de la membrana podrían mediar la vasoconstricción y la remodelación vascular a través del incremento de la [(Ca2+)i] en las CMLV durante la HAP hipóxica crónica (Weir & Olschewski, 2006). Adicionalmente a los efectos en la proliferación de las CMLV, la disminución de la expresión de los canales de Kv inhibe la apoptosis (Remillard & Yuan, 2005). La hipoxia también altera la expresión de los canales de Kv a través de muchos factores de crecimiento y sustancias vasoactivas liberados por las células endoteliales (incluyendo la ET-1) (Wang et al., 1997; Platoshyn et al., 2001). Existen alteraciones ocasionadas por la hipoxia crónica en las CMLV de la arteria pulmonar, las cuales parecen no ocurrir en las CMLV de la arteria mesentérica (Sweeney & Yuan, 2000; Wang et al., 2005). Esto sugiere que la respuesta de las CMLV de la arteria pulmonar quizás sea selectiva de la circulación pulmonar.

Estos resultados dan una fuerte evidencia del papel de los canales Kv en la respuesta de la vasculatura pulmonar a la hipoxia crónica, puesto que la vasoconstricción sucede

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cuando la hipoxia inhibe uno o más Kv en las CMLV de la arteria pulmonar o de las arterias de resistencia. Según esto, la sobre-regulación y la sobre-activación de ellos

podría ser un blanco clave en el tratamiento de las enfermedades vasculares pulmonares cuando se ha perdido el balance entre la proliferación celular y la apoptosis como ocurre en la HAP crónica (Pozeg et al., 2003; Álvarez-Medina et al., 2012).

1.3.2 Canales de calcio Ca2+

El Ca2+ es el mayor disparador de la vasoconstricción pulmonar y un estímulo de la proliferación de las CMLV pulmonares. En el incremento de la [(Ca2+)i] en éstas células, actúan los siguientes canales (Nelson & Quayle 1995; Landsberg & Yuan, 2004):

Canales de Ca2+ operados por voltaje (VOCC: por sus siglas en inglés Voltage Operated Calcium Channels): son regulados por cambios en el potencial de membrana, su apertura sucede por la despolarización y su cierre por la hiperpolarización de membrana.

Canales de Ca2+ operados por receptor (ROCC: por sus siglas en inglés Receptor Operated Calcium Channels): son independientes del voltaje y se activan por la interacción del agonista con su respectivo receptor y proteínas de señalización como el Diacilglicerol, Rianodina, IP3 y la PKC.

Canales de Ca2+ operados por almacenamiento (SOCC: por sus siglas en inglés Store Operated Calcium Channels): su apertura sucede por la depleción de Ca2+ del retículo sarcoplásmico (RS) (Nelson et al., 1990; Moreno, 1999; Putney et al., 2001).

Canales de Ca2+ operados por voltaje (VOCC)

Hasta la fecha se considera que los VOCC son los más importantes en la vasoconstricción pulmonar hipóxica (Nelson & Quayle, 1995). También se demostró la sobre-regulación de los genes que codifican estos canales y su implicación en el desarrollo de la HAP (Landsberg &Yuan, 2004). La clasificación de los VOCC depende de sus propiedades electrofisiológicas (como el rango de voltaje requerido para su activación), farmacológicas y moleculares. Según el voltaje se clasifican en:

1) Activados por alto voltaje (HVA: por sus siglas en inglés High-Voltage-Activated) en esta categoría se encuentran los canales tipo L, N, P, Q, R.

2) Activados por bajo voltaje (LVA: por sus siglas en inglés Low-Voltage-Activated); a este grupo pertenece el canal tipo T.

3) El canal tipo R es clasificado ocasionalmente como activado por voltaje intermedio (IVA: por sus siglas en inglés Intermediate-Voltage-Activated) (Hagiwara et al., 1975; Llinas & Yarom, 1986; Reuter, 1996; Yamakage & Namiki, 2002).

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La clasificación según criterios farmacológicos se atribuye a su sensibilidad a las Dihidropiridinas (DHP) (Aosaki & Kasai., 1989) y por el bloqueo con conotoxinas (toxinas obtenidas a partir del caracol marino del género Conus (Gray et al., 1988). Existe otra forma de clasificación que se basa en la clonación de tipos de canales individuales que codifican cDNAs, esta metodología reveló la composición de los canales en subunidades y aclaró la función de cada una de ellas; la clasificación consiste en una nomenclatura sistemática, para la cual se tiene en cuenta la descripción del canal en donde se encuentre cada subunidad.

Canales de Ca2+ tipo L y su estructura molecular

Los canales de Ca2+ tipo L, son el tipo de canal VOCC predominante en las CMLV; aunque también se encuentran en las células de los músculos estriados. Constituyen la vía más importante de entrada de Ca2+ en los miocitos y se expresan además en células nerviosas, endocrinas, renales y en los fibroblastos (Izaguirre & Zavaleta, 1998; Moreno, 1999). Los canales tipo L son de activación lenta, prolongada (500-1000 milisegundos) y con un potencial de -10 milivoltios.

Los VOCC son proteínas oligoméricas, constituidas por una subunidad principal α1 que funciona como poro y sensor del cambio de potencial, y otras subunidades como las β, α2, γ, δ (Catterall, 1991). La estructura está compuesta por cinco subunidades con diferente peso molecular.

La subunidad α1 (175kD) es considerada el componente principal del canal de Ca2+ y contiene los sitios de unión de los antagonistas de Ca2+. La subunidad α1 posee cuatro dominios homólogos, cada dominio tiene seis segmentos transmembranales (S1, S2, S3, S4, S5, S6) (Catterall, 1988), el segmento S4 funciona como el sensor de voltaje en los canales dependiente de voltaje (Figura 1-1) (Stühmer et al., 1989; Jan & Jan, 1989).

La subunidad α2 (143kD) se asocia con la subunidad α1 y no posee ningún sitio de unión (Catterall, 1988; Ellis et al., 1988).

La subunidad β (54kD) posee la función de incrementar la actividad de la subunidad α1, alterar su sensibilidad al voltaje y a la cinética (Pragnell et al., 1994).

La subunidad γ (30kD) y la subunidad δ (27kD) (Ruth et al., 1989; Jay et al., 1990).

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Figura 1-1. Modelo estructural del VOCC tipo L (Catterall & Striessnig, 1992)

1.4 La Vasoconstricción Pulmonar Hipóxica

La constricción vascular hipóxica implica necesariamente un incremento de la [(Ca2+)i] en las CMLV arteriales pulmonares de resistencia, lo cual sucede por una mayor entrada a través de canales permeables al Ca2+ y/o por la movilización desde los sitios de almacenamiento intracelular como desde el RS. Sin embargo, cabe destacar que el principal mecanismo para aumentar la [(Ca2+)i] durante la hipoxia es la entrada de Ca2+ a través de los VOCC (Olschewski et al., 2002).

La homeostasis citoplasmática del Ca2+ es mantenida por mecanismos de balance que la incrementan y la disminuyen, dichos mecanismos son necesarios para mantener el balance que intenta ser alterado por las diferencias evidentes entre las concentraciones de Ca2+ extracelular y citosólico, lo que crea un enorme gradiente de concentración que permite el ingreso de Ca2+ a la célula.. Dentro de los factores que disminuyen la [(Ca2+)i] se encuentran el intercambiador Na+/Ca2+, el secuestro del Ca2+ dentro del RS, mediante la activación de la ATPasa Ca2+-Mg2+ conocida como SERCA (Landsberg & Yuan, 2004), y mecanismos que involucran las proteínas tamponadoras de Ca2+ como la calbindina

En lo que respecta a los factores que aumentan la [(Ca2+)i] se debe mencionar la movilización del Ca2+ por la activación de los receptores del IP3 en la membrana del RS, lo que lleva a liberación y depleción de Ca2+ desde esta reserva intracelular. Esta reducción del Ca2+ almacenado dispara el ingreso sostenido de Ca2+ al citoplasma, dicho mecanismo es conocido como entrada de calcio capacitado (CCE) (Landsberg &Yuan, 2004). La CCE asociada a la elevación de la [(Ca2+)

i], es mediada por la activación de los SOCC. En la actualidad este tipo de canales se consideran dentro de un grupo de canales conocidos como TPR (por sus siglas en inglés Transient Receptor Potential), en los que se considera a los canales catiónicos que son abiertos tanto por la unión del receptor a su agonista (ROCC), como por la depleción del Ca2+ del RS (SOCC) (Inoue et

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al., 2006; Abramowitz & Birnbaumer, 2009). La importancia de este grupo de canales TRP y la CCE, está dada por su papel regulador del tono vascular pulmonar y el crecimiento de las CMLV pulmonares bajo condiciones fisiológicas y patológicas (Golovina et al., 2001; Sweeney et al., 2002; Yu et al., 2003; Landsberg & Yuan, 2004). Lin et al. (2004) reportaron sobre-regulación de algunos canales TPRC (TPR1 y TPR6) en condiciones de hipoxia crónica.

Además de la obvia participación del la elevación de la [(Ca2+)i] en el proceso de vasoconstricción, es necesario mencionar que este mismo estímulo puede llevar a las CMLV a la proliferación bajo condiciones fisiológicas y patológicas. El complejo Calcio- Calmodulina (CaM) activado, es capaz de activar varias Quinasas de CaM involucradas en la fosforilación de proteínas de señales de transducción y factores de transcripción responsables de promover la transcripción genética y la estimulación de las CMLV a través del ciclo celular.

Sin embargo, es necesario mencionar que además de la activación de los ROCC y SOCC, los VOCC tipo-L representan una importante vía de ingreso de Ca2+ en condiciones de hipoxia ambiental crónica (Olschewski et al., 2002). Por ello, las sustancias farmacológicas como los bloqueadores de canales de Ca2+ (BCC), son considerados ampliamente para el tratamiento de la HAP.

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1.4.1 Los bloqueadores de canales de Ca2+ (BCC)

El empleo de los BCC inició a partir de los años sesenta, en el tratamiento de enfermedades neurológicas, gastrointestinales, cardiovasculares como la HAP (Fisher & Grotta., 1993). Según su estructura química los BCC se clasifican en 3 grupos: Dihidropiridinas (DHP), Benzotiacepinas y Fenilalquilaminas (Huber et al., 2000).

Las DHP bloquean los VOCC tipo-L en las células donde existe este tipo de canal como las CMLV arteriales entre otras (Chen et al., 1988; Nelson et al., 1990; Nilius et al., 1997). Estos reducen la [(Ca2+)i] y como resultado, disminuyen la presión arterial in vivo, causando vasodilatación en estados normales e hipertensivos (Nelson et al., 1990). Han sido descritos sus efectos antiproliferativos sobre la deposición de colágeno, sobre la expresión de procolágenos I, III y IV y sobre algunos factores de transcripción de los fibroblastos y de las CMLV; también pueden inducir el aumento de la actividad proteolítica de la colagenasa tipo IV (Roth et al., 1996). Entre los diferentes tipos de BCC se destaca la selectividad de las DHP sobre el músculo liso vascular, lo cual se atribuye a una mayor proporción de canales de tipo-L en las CMLV. Dentro de las DHP, existen diferencias por la afinidad del tipo de vasculatura, por ejemplo la nisoldipina por la vasculatura coronaria, la nimodipina y la nicardipina por la vasculatura cerebral (Hernández, 1993; Poelaert & Roosens, 2000). Otra de las explicaciones para esta selectividad de las DHP sobre los vasos sanguíneos se debe a una mayor afinidad de la subunidad α1 de la estructura del canal tipo-L, para las DHP en el músculo liso vascular respecto al músculo cardíaco. Entre las diferentes DHP, la nifedipina tiene una mayor selectividad sobre el músculo liso vascular respecto a las otras, las cuales además poseen inhibición sobre otros tipos de VOCC (Yamakage & Namiki, 2002).

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1.4.2 La nifedipina

La nifedipina [1,4-dihidro-2,6-dimetil-4-(2-nitrofenil) piridina-3-5-dicarboxilato dimetilo] es un prototipo de las DHP de 1ª generación, fue sintetizada inicialmente por los laboratorios Bayer con el nombre inicial de Bay A 1040 (Hernández, 1993; Poelaert & Roosens, 2000). Las funciones de la Nifedipina son: reducir la PAP a través de la reducción del tono vascular y de la inhibición de la vasoconstricción pulmonar de origen hipóxico, previniendo así la HAP en animales crónicamente hipóxicos (Stanbrook et al., 1984; Nelson et al., 1990). La nifedipina posee efectos antiproliferativos sobre las CMLV, los cuales son mayores respecto a otras DHP como la Nimodipina y la Nitrendipina (Hérembert et al., 1995). Tales efectos se desarrollan mediante varios procesos como la inhibición de la producción de sustancias vasoconstrictoras y mitógenas como el TXA2 y ET-1 (Ramadan et al., 1990) y la reducción de la síntesis de DNA de las CMLV arteriales y de los fibroblastos. Esta disminución se atribuye a que la Nifedipina afecta la transición desde la fase G0/G1 a la fase S del ciclo celular, lo cual se evidenció en fibroblastos de la adventicia y las CMLV de ratas hipertensas y normales (Hérembert et al., 1995); la nifedipina además, modula el metabolismo del colágeno dentro de la matriz extracelular (Roth et al., 1996) e inhibe la transcripción de genes responsables de la regulación del Ca2+ (Roche & Prentki, 1994).

Aspectos farmacológicos de la nifedipina

Los estudios para conocer aspectos sobre la farmacocinética y farmacodinámica de la nifedipina se han realizado en mamíferos como el hombre y la rata y aún no existen estudios en aves. La Nifedipina tiene una vida media de 2 horas y el tiempo en el cual se alcanza el nivel pico en sangre varía según la forma en que se administre, puesto que si se hace a través de cápsulas de liberación inmediata será a los 30 minutos, pero sí es a través de cápsulas de liberación sostenida será a las 6 horas. Su metabolismo ocurre inicialmente en el hígado a metabolitos menos activos, por la vía oxidativa, predominantemente la del citocromo P450 (CYP3A) (Guengerich et al., 1991; Abernethy & Schwartz, 1999). Cuando se administra por vía oral su absorción es del 95%, pero su biodisponibilidad es del 65 a 85%, debido a su metabolismo presistémico a metabolitos inactivos y a la actividad enzimática en la pared intestinal. El volumen de distribución promedio en estado estacionario es de 1.32 L/Kg y se une a las proteínas plasmáticas en un alto porcentaje (92 a 98%) principalmente a la albúmina; entre el 70 a 80% se elimina a través de los riñones en forma de metabolitos altamente solubles, el resto es excretado en las heces (Poelaert & Roosens, 2000; Palma-Aguirre, 2002; Gómez, 2006).

Uso de la nifedipina en el control de la HAP

En humanos con HAP tanto de origen primario como secundaria por enfermedad pulmonar obstructiva, la nifedipina se comporta eficientemente al reducir la PAP (Simoneau et al., 1981; Rich & Brundage, 1987; Brownlee et al., 1988), también en individuos normales sometidos a condiciones de hipoxia normobárica (en la que no hay cambio de la PPO2) y en hipoxia hipobárica (Naeije et al., 1982; Bärtsch, et al., 1991; Antezana et al., 1998). El empleo de la nifedipina en modelos animales con HAP, ha mostrado resultados satisfactorios en la reversión de la remodelación vascular del lecho

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pulmonar. En ratas con HAP hipóxica, se obtuvo además de la disminución del engrosamiento de la capa media de las arteriolas pulmonares, una reducción del grado de la hipertrofia ventricular derecha (Stanbrook et al., 1984). En lechones de 1 a 3 días, el tratamiento con Nifedipina redujo la presentación de la HAP (Fike & Kaplowitz, 1999); sin embargo, los estudios son escasos para evaluar el efecto de este fármaco en la prevención de la presentación de la HAP de origen hipóxico en el pollo de engorde y tampoco se conoce el comportamiento de su vasculatura pulmonar frente al mismo.

En conclusión, la hipoxia alveolar sostenida que se presenta en los residentes en las grandes alturas, tiene un severo impacto fisiológico en la vasculatura pulmonar. El aumento de la PAP es debido al aumento de la vasoconstricción y a la remodelación vascular pulmonar; ambos fenómenos causan la reducción del lumen vascular y el incremento de la RVP. Aparentemente el flujo iónico a través de la membrana de las CMLV juega un importante papel en el control de los procesos celulares que inducen tanto la vasoconstricción como la hipertrofia y la hiperplasia que se producen durante la exposición a la hipoxia crónica.

Es claro que el flujo de K+ y de Ca2+ a través de sus respectivos canales iónicos modula estos procesos, mediante el control del volumen celular, el potencial de membrana, la [(Ca2+)i], la transcripción genética, la apoptosis y la progresión del ciclo celular (Carmelle et al., 2005). Entre los diferentes canales de Ca2+, sobresale el papel que juegan los VOCC tipo-L en el aumento de la [(Ca2+)i], que permite el desencadenamiento de la contracción vascular pulmonar de origen hipóxico y en la proliferación de las CMLV arteriales pulmonares, eventos clave en la fisiopatología de la HAP hipóxica.

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2. Experimento In vivo. Efecto de la nifedipina en la incidencia de la hipertensión arterial pulmonar hipóxica y la remodelación vascular en pollos de engorde.

Resumen

En la Hipertensión Arterial Pulmonar (HAP) hipóxica, enfermedad que afecta tanto a mamíferos como a los pollos de engorde, ocurre una elevación exagerada de la concentración de calcio libre citosólico ([(Ca2+)i]), que promueve el sostenimiento de la vasoconstricción y la remodelación vascular. El bloqueador de canales de calcio nifedipina, se ha empleado en el tratamiento de la HAP en el hombre. Se evaluó el efecto del suministro de nifedipina en pollos de engorde en dosis de 6 y 2 mg/Kg de peso vivo entre los días 4 a 21 y desde el día 22 hasta el 42, de 30 y 10 mg/Kg, respecto a un grupo control, sobre la incidencia de la HAP, el índice cardiaco (IC) y el grosor de la capa media muscular de las arteriolas pulmonares (%T) con diámetros de 50 a 100 micrómetros (μM). Hubo una reducción de la mortalidad relacionada con la dosis del fármaco, de una forma dependiente de la dosis. Los valores del IC de las aves que murieron espontáneamente no presentaron diferencias estadísticas, tampoco entre las sacrificadas el día 42; sin embargo, sí las hubo entre los valores de IC de los pollos tratados no hipertensos e hipertensos con respecto a los controles correspondientes. Los resultados de %T de los grupos tratados con 30 y 10 mg/Kg de nifedipina fueron significativamente menores (P<0,05) comparados con el grupo control. La nifedipina puede constituir un tratamiento paliativo para disminuir la incidencia de la HAP.

Palabras clave: Hipertensión arterial pulmonar, hipoxia, nifedipina, pollos, remodelación vascular.

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Abstract

In hypoxic pulmonary arterial hypertension (PAH), a disease affecting mammals and commercial chickens, there is an exaggerated intracellular calcium concentration, [(Ca2+)i], which maintains sustained vasoconstriction and vascular remodeling. The effect of 2 doses of nifedipine, 6 and 2 mg/Kg of body weight from 4 to 21 days and 30 and 10 mg/Kg, from days 22 to 42, a Calcium channel´s blocker, employed in humans developing PAH, was evaluated as to control PAH incidence in chickens, cardiac index (CI) and middle muscle layer of arterioles (%T) of diameter 50 to 100 micrometers (μM), were evaluated, as compared to a non-treated control group. Nifedipine treatment diminished PAH incidence in a dose dependent manner. The CI values in animals did not show statistical differences in chickens dying spontaneously. Likewise, in those animals slaughtered at the 42nd day. In contrast, differences were detected when comparing CI values of all treated birds (healthy or pulmonary hypertensive) with those of the correspondent controls. %T values in all animals treated with nifedipine were lower than those in the control group (P<0,05). Present results offer possibilities of employing nifedipine as a paliative in the treatment of hypoxic PAH.

Key words: Chickens, hypoxia, nifedipine, pulmonary arterial hypertension, vascular remodeling.

2.1 Introducción

La hipoxia hipobárica ambiental es una causa de hipertensión arterial pulmonar (HAP) en pollos de engorde susceptibles. La hipoxia hipobárica en los capilares aéreos, ocasiona vasoconstricción en el sistema arterial pulmonar, un aumento en la resistencia al flujo de

sangre en las arteriolas de diámetros menores de 300 micrómetros (m) y engrosamiento de la media muscular y de la adventicia en las arteriolas (Sillau & Montalvo, 1982; Wideman, 2000). El incremento de la resistencia vascular pulmonar (RVP), ocasiona el aumento del gasto cardiaco del ventrículo derecho, éstasis venosa, congestión pasiva generalizada y falla cardiaca. En la HAP hay disfunción endotelial, puesto que el endotelio controla la vasoconstricción y los cambios estructurales en la vasculatura pulmonar (Budhiraja et al. 2004) y los niveles plasmáticos de las sustancias vasodilatadoras e inhibidoras de la mitosis, como el Óxido Nítrico (NO) y el factor de hiperpolarización derivado del endotelio (EDHF) están disminuidos tanto en mamíferos (Scotland et al. 2001), como en aves (Moreno de Sandino & Hernández, 2003; Álvarez-Medina et al. 2012). En algunas especies animales hay aumento de la cantidad de vasoconstrictores y mitógenos de las células musculares lisas vasculares como la Endotelina-1 (ET-1), el Tromboxano A2 (TXA2) y la serotonina (5-HT) (Gómez et al. 2007).

La hipoxia hipobárica crónica desencadena alteración en la función de los canales iónicos de Ca2+. El Ca2+ es el mayor disparador de la vasoconstricción pulmonar, que estimula la proliferación de las células musculares lisas vasculares (CMLV) pulmonares (Sommer et al. 2008). La vasoconstricción sucede por el incremento en la concentración del Ca2+ libre citosólico [(Ca2+)i], que ocurre por una mayor entrada de este ión a través de canales permeables al Ca2+ y/o por la movilización desde los sitios de almacenamiento intracelular como el retículo sarcoplásmico (RS). El principal

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mecanismo para aumentar la [(Ca2+)i] durante la hipoxia es la entrada a través de canales iónicos localizados en la membrana de las CMLV de la arteria pulmonar (Olschewski et al. 2002). La mayor vía de esta entrada es a través de los canales de Ca2+ operados por voltaje (VOCC) tipo L, regulados por el potencial de membrana en reposo (Mauban et al. 2005; Remillard & Yuan, 2005). El papel fundamental del incremento de la [(Ca2+)i] en la fisiopatología de la HAP, justifica el empleo de sustancias farmacológicas que antagonicen su efecto. Los bloqueadores de canales de Ca2+ (BCC) representan una útil alternativa en la terapéutica de dicha enfermedad (Huber et al. 2000). De éstos, las dihidropiridinas (DHP) poseen mayor selectividad por las CMLV que por las células del músculo cardíaco (Poelaert & Roosens, 2000), y entre las diferentes DHP, la nifedipina posee mejores efectos sobre las CMLV (Yamakage & Namiki, 2002) y sobre la disminución de la proliferación celular (Hérembert et al. 1995). Estas características favorables justifican el amplio uso de este fármaco en el hombre con resultados eficientes en el control de la HAP hipóxica y de otros orígenes (Antezana et al. 1998).

En la industria del pollo de engorde, la HAP hipóxica representa cuantiosas pérdidas económicas (Odom, 1993; Maxwell & Robertson, 1997). La fisiopatología de la HAP en el pollo doméstico y en el hombre son similares por lo cual, aquél constituye un modelo ideal para el estudio de la HAP, que desarrolla la enfermedad de forma natural, inducida por exposición prolongada a bajas temperaturas (Pan et al. 2005; Yang et al. 2010) o a hipoxia hipobárica (Hernández, 1984). Por todo lo anterior, se justifica plantear intervenciones terapéuticas para interrumpir o moderar los procesos de vasoconstricción, de proliferación y de remodelación vascular propios de la HAP. En este trabajo de investigación se empleó el BCC Nifedipina, con el propósito de evaluar su posible efecto sobre la incidencia de HAP de origen hipóxico en pollos de engorde y sobre la remodelación vascular en el pulmón.

2.2 Materiales y métodos

2.2.1 Animales experimentales

Se alojaron 300 pollos machos de la estirpe Cobb de un día de edad, en las instalaciones del Edificio de Investigaciones Avícolas ubicado en la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá, a una altura de 2.638 msnm.

La temperatura dentro del galpón fue controlada durante todo el experimento de forma automática, con un sensor conectado a la unidad central de las criadoras eléctricas, así: días 1 a 6 con 32-33°C, días 7 a 13 con 29 a 30°C, días 14 a 20 con 27 a 28°C, días 21 a 27 con 24 a 26°C, días 28 a 34 con 21 a 23°C, días 35 a 41 con 19 a 21°C (Guía de manejo Cobb 500, 2008).

El agua de bebida se suministró ad libitum. Todos los animales recibieron el alimento concentrado comercial tipo Iniciación desde el día 1 hasta el 21 y de finalización a partir del día 22 hasta el 42.

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Las aves se pesaron semanalmente, a partir del día 1 de edad; se conformaron 12 subgrupos experimentales homogéneos según el peso, cada uno compuesto de 25 aves. Cada subgrupo fue alojado en cubículos experimentales independientes.

Se establecieron 3 grupos de aves de 100 pollos cada uno, con 4 subgrupos de 25 pollos cada uno. A los pollos de los tratamientos 1 y 2, se les administró nifedipina disuelta en agua destilada en dosis de 6 y 2 mg/Kg de peso entre los días 4 a 21 de edad.

A partir del día 22 hasta el 42, 30 y 10 mg/Kg de peso, respectivamente (Cuadro 2-1).

Cuadro 2-1. Tratamientos y dosificaciones empleadas en el estudio.

Días experimentación

Tratamiento

1 2 3

4 a 21 Nifedipina 6 mg/Kg Nifedipina 2 mg/Kg control

22 a 42 Nifedipina 30 mg/Kg Nifedipina 10 mg/Kg control

A los pollos del tratamiento 3 (control) se suministró agua destilada solamente. Las dosis menores entre los días 4 a 21 de edad de los pollos se hizo con base en las consideraciones usadas en la dosificación de nifedipina en los humanos, dado que en esta especie, se recomiendan dosis más bajas del medicamento, en los individuos de menor edad (Palma-Aguirre et al. 1999). Las dosis se ajustaron diariamente según la tabla de peso de la estirpe (Guía de manejo Cobb 500, 2008). La nifedipina (tratamientos 1 y 2) y el agua destilada (tratamiento 3) se suministraron dos veces al día por via oral e individualmente a las 7:00 am y 7:00 pm; para ello se usó un inyector Socorex® que proporcionó un volumen idéntico para cada ave y una sonda intramamaria. Debido a la naturaleza fotosensible de la nifedipina, se utilizaron reflectores de luz de sodio durante el pesaje, preparación y suministro del medicamento.

Se realizó la necropsia de todos los pollos que murieron espontáneamente durante el experimento y se determinó el % de mortalidad de cada grupo, para la evaluación del efecto de la medicación con nifedipina. Sin embargo, además en la evaluación de este parámetro se tuvo en cuenta un grupo de aves (grupo 4, n=75), que se alojó en las mismas instalaciones de los pollos experimentales, pero que no tuvo ningún manejo individual a excepción del pesaje el día 1 y semanal hasta el día 42. El propósito de este grupo fue establecer el % de mortalidad, para poder así compararlo con los de otros experimentos en la misma estirpe, ya que los grupos 1, 2 y 3 tuvieron un manejo especial.

2.2.2 Determinación del Índice cardíaco (IC)

Tanto a las aves que murieron espontáneamente durante el experimento y las que sobrevivieron hasta el día 42 de edad, se les determinó el IC. Estás últimas fueron sacrificadas según las normas aprobadas por el comité de ética institucional. Se calculó el IC con la técnica de Alexander & Jensen (1959), así: IC= Peso del ventrículo derecho dividido entre el peso ventricular total multiplicado por 100. Los pollos se clasificaron

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como no hipertensos (PNHP): si tenían un valor de IC≤25 e hipertensos (PHP) con un IC≥ 26 (Areiza et al. 2011; Vásquez & Hernández, 2011).

2.2.3 Determinación del %T

Para la determinación de los valores promedio del grosor de la capa media vascular de las arteriolas pulmonares como % del diámetro externo del vaso sanguíneo (%T), se seleccionaron 16 pollos por grupo, 8 PNHP y 8 PHP. A estás aves se les tomó el pulmón izquierdo, el cual se fijó en una solución de formalina al 10% con un pH de 7,4. Se realizaron cortes sagitales y fueron teñidos con la coloración tricrómica de Masson (Luna, 1968). Para obtener el %T de cada uno de los pollos estudiados se evaluaron 10 arteriolas interparabronquiales con diámetros externos entre 50 y 100 μm.

El %T se expresó como la relación promedio del grosor de la media muscular/promedio del diámetro externo. El grosor de la capa media muscular (T) de cada vaso se calculó como un promedio de cuatro mediciones realizadas en los bordes superior, inferior y laterales de la capa media muscular de la correspondiente arteriola (T1+T2+T3+T4)/4 y el diámetro externo (D), como el promedio de dos mediciones en ángulo recto del vaso sanguíneo, excluyendo la capa adventicia (D1+D2)/2 (Figura 2-1). El %T se calculó mediante la fórmula %T=T/D x 100 (Tucker et al. 1975). Todas las mediciones se realizaron con un analizador de imágenes microcomputarizado (Image-Pro plus 7, Bethesda. MD. EEUU. 2010).

Figura 2-1. Esquema de una arteriola con las mediciones para la determinación del %T

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2.2.4 Análisis Estadístico

Las comparaciones entre tratamientos de los datos obtenidos para el %T y el IC de los animales que murieron durante el estudio y IC de las aves que se sacrificaron al día 42, fueron sometidos a análisis de varianza y a la prueba LSD. Para el resto de análisis se empleó la prueba t-student. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas con el nivel de P<0,05 y altamente significativas con P<0,01. Los valores se tomaron como promedio ± Desviación estándar (D.E). Para el análisis estadístico se empleó el software SAS 9.2, 2008.

2.3 Resultados

La mortalidad de los animales durante el curso del experimento se debió solamente a HAP, lo cual fue corroborado por el IC y las lesiones macroscópicas ya conocidas (Machorro Velasco & Paasch-Martínez, 1985). Se encontraron los siguientes % de mortalidad: a) tratamiento 1: 39,22, b) tratamiento 2: 44,76 y c) tratamiento 3: 51,92 (Tabla 2-1). Se halló un efecto positivo sobre la prevención de la mortalidad debida a HAP relacionada con el suministro de la nifedipina y de la dosis de la misma. El % de mortalidad del grupo 4 fue de 43,05, el cual sólo se tuvo en cuenta para la determinar la mortalidad de la estirpe en esta investigación.

Debido a la ausencia de normalidad del error fue necesario realizar la prueba equivalente

no paramétrica Kruskal- Wallis (Mood et al., 1974; Steel & Torrie, 1985), la cual arrojo

una probabilidad de significancia de 0.8234, con la cual se determino que no hubo

diferencias estadísticamente significativas en el promedio de los valores de los valores IC

de los pollos que murieron espontáneamente durante el experimento entre los tres

tratamientos. Así mismo al comparar los valores de IC de los pollos que se sacrificaron

el día 42 (Prueba Kruskal-Wallis Pr > Chi-cuadrado 0.5308). Por lo anterior, en estas

aves que se sacrificaron el día 42, los IC entre los PHP y entre los PNHP se analizaron

separadamente. En el análisis del promedio de los tres valores más altos de los IC de los

PHP solamente se encontró diferencia altamente significativa (P<0,01) entre los

tratamientos 1 y 3 (42,86 versus 50,92); el valor del tratamiento 2 fue 43,9 (Tabla 2-1). El

valor más alto del IC de los PHP entre los tres tratamientos fue respectivamente 51,94

para el tratamiento 3, seguido por el tratamiento 2: 47,66 y para el tratamiento 1 fue

43,63. Cuando se compararon los valores promedio del IC de los PNHP se encontraron

diferencias altamente significativas (P<0,01) entre el tratamiento 3: 21,66 (n=9) versus y

el tratamiento 1: 19,52 (n=15). Hubo diferencias significativas (P<0,05) entre el

tratamiento 1: 19,52 (n=15) versus el tratamiento 2: 20,97 (n=14); y no se encontró

diferencia significativa entre los tratamientos 2 y 3 (Tabla 2-1). El valor más bajo del IC

de los pollos PNHP fue: para el tratamiento 1: 17,76 para el tratamiento 2: 16,95 y para el

tratamiento 3 fue 20,05.

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Tabla 2-1. Efecto del tratamiento con dos dosis de nifedipina, sobre la incidencia de la hipertensión arterial pulmonar (HAP) y sobre los valores del Índice cardíaco en pollos de engorde con y sin HAP

Clasificación según IC

Parámetro a evaluar

Tratamiento

Significancia estadística

1 Nifedipina 30 mg/Kg

2 Nifedipina 10 mg/Kg

3 control

PHP y PNHP % Mortalidad 39,22 44,76 51,92

PHP y PNHP

IC Promedio de pollos muertos

espontáneamente durante el experimento

41,96 ± 4,89

41,42 ±5,40

41,26 ± 4,97 NS

PHP y PNHP

IC Promedio de pollos

sacrificados día 42

29,66 ± 8,06

29,18 ± 6,99

31,43 ± 8,89 NS

PHP

IC Promedio 3 valores más

altos de pollos sacrificados día

42

42, 86 43,9 50,92

A AB B P< 0,01

PNHP

IC Promedio de pollos

sacrificados día 42

19,52 20,97 21,66

A AB B P< 0,01

A B B P< 0,05

± D.E Desviación Estándar Pollos hipertensos: PHP. Pollos no hipertensos: PNHP Significancia estadística: Letras diferentes implican diferencias estadísticas significativas (p<0,05) o altamente significativas (p<0,01), NS: No diferencias significativas

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En el análisis de los resultados del %T se cumplieron los supuestos del modelo como la homogeneidad de varianzas (Prueba de Levene) con probabilidad de significancia de 0.3571 y normalidad del error, utilizando la prueba de Shapiro-wilk cuya probabilidad de significancia es 0.9992. Se encontró que, hubo diferencias significativas (P<0,05) entre el tratamiento 3 respecto al tratamiento 1 y entre el Tratamiento 2 y el tratamiento 3 de los valores de %T de los PHP. Sin embargo, no hubo diferencias cuando se compararon los datos obtenidos para los grupos 1 y 2 (P<0,05).

En cuanto a la comparación del %T de los pollos PNHP, no se encontraron diferencias significativas entre los tres tratamientos (Tabla 2-2).

El coeficiente de determinación (R2 es de 0.644181, lo cual explica el 64,42% de la

variabilidad total por medio del modelo lineal propuesto (Mood et al., 1974; Steel & Torrie,

1985).

Tabla 2-2. Efecto del tratamiento con dos dosis de nifedipina sobre el engrosamiento de la capa muscular de arteriolas pulmonares (%T) con diámetros entre 50 a 100 μm en pollos de engorde con y sin HAP

Tratamiento Subgrupo %IC %T Promedio

± D.E Significancia Estadística

1. Nifedipina 30 mg/Kg (n=8) PHP 30-35 19,6959 ± 1,18 B 2. Nifedipina 10 mg/Kg (n=8) PHP 30-35 19,8619 ± 1,52 B

3. Control (n=8) PHP 30-35 21,6422 ± 1,16 A

1. Nifedipina 30 mg/Kg (n=8) PNHP ≤ 23 17,2292 ± 1,73 C 2. Nifedipina 10 mg/Kg (n=8) PNHP ≤ 23 17,1941 ± 0,90 C

3. Control (n=8) PNHP ≤ 23 17,8834 ± 1,05 C

± D.E Desviación Estándar Pollos hipertensos PHP, Pollos no hipertensos PNHP Letras diferentes implican diferencias estadísticas significativas (p<0,05).

2.4 Discusión

El tratamiento con nifedipina, resultó en menor mortalidad en las aves medicadas, en relación directa con la dosis, respecto a las aves control. Aunque en los resultados de IC tanto de los pollos muertos espontáneamente durante el experimento, como en los sacrificados al día 42, no se reflejaron diferencias estadísticas (más sí numéricas) en el efecto de la dosis de la nifedipina, sí hubo diferencias cuando se analizaron por separado los IC de los PNHP y los PHP sacrificados al día 42. Sin embargo, no hay estudios que relacionen directamente el IC con el grado de HAP y que el IC en pollos con duración

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breve de la enfermedad (15 a 17 días) puede ser tan alto, como el de aquellos animales su evolución dura entre 36 y 41 días (Hernández & de Sandino, 2011). Los resultados favorables relacionados con la medicación de la nifedipina son similares a los de Sun et al. (2007) quienes indujeron HAP mediante la exposición de pollos, a bajas temperaturas y así redujeron la incidencia de la enfermedad. En el reporte de Paasch (1991), la medicación con nifedipina se hizo durante 20 días a pollos de 6 semanas de edad considerados con HAP, y no se encontró diferencia estadística significativa en la medición de la PAP, ni del IC entre los pollos tratados y los controles. Al comparar los resultados contrastantes de los trabajos de Sun et al. (2007), de Paasch (1991) y los del presente trabajo, podría plantearse que la nifedipina tiene un mejor desempeño cuando se suministra con propósitos preventivos para el control de la enfermedad. Según lo anterior, es posible que los efectos del tratamiento con nifedipina se manifiesten antes de la presentación de la enfermedad en individuos predispuestos. El valor más bajo del %T del grupo de PHP tratados con la dosis más elevada de la nifedipina en el presente estudio puede ser atribuido a la reducción de la PAP. Debido a la vasodilatación e inhibición de la vasoconstricción pulmonar de origen hipóxico, según lo postulado por Nelson et al. (1990). Otro mecanismo por el cual la Nifedipina ejerce su función vasodilatadora es a través de la reducción de la producción de agentes vasoconstrictores y mitógenos como el TXA2 y la ET-1 (Ramadan et al. 1990). La nifedipina también reduce la síntesis de DNA y la proliferación de las células musculares lisas vasculares (CMLV) y modula el metabolismo del colágeno dentro de la matriz extracelular (Roth et al. 1996). Esta propiedad de la nifedipina resulta fundamental puesto que en los individuos con HAP la síntesis de colágeno se encuentra aumentada y también la actividad proliferativa de las CMLV y de los fibroblastos (Hérembert et al. 1995). El mecanismo antiproliferativo de la nifedipina y otros BCC podría obedecer además a su actividad inhibitoria sobre varios factores de crecimiento como el Factor de Crecimiento Derivado de las Plaquetas (PDGF), la Angiotensina II (Ang II), el Factor de crecimiento básico de los fibroblastos (bFGF) y el Factor de crecimiento epidermal (EGF) (Block et al. 1989; Ko et al. 1993; Kataoka et al. 1997; Stepien et al. 1998). Otro aspecto fundamental es la dependencia de algunos factores de crecimiento sobre la entrada del Ca2+ extracelular y esto a su vez está relacionado con el antagonismo de estos bloqueadores a la apertura de los VOCC, inhibición de la liberación del Ca2+ intracelular por acción directa sobre la producción continua de fosfatidilinositol (Block et al. 1989), sobre algunas proteínas quinasas (PKC) (Kataoka et al. 1997) y del mRNA del factor de crecimiento transformante β (TGF-β) (Kim et al. 1995; Jeffrery & Wanstall, 2001). En los pollos afectados con HAP al igual que en los mamíferos, ocurre una sobre-expresión de algunas PKC. La activación de la PKCα favorece la remodelación vascular pulmonar. Este mecanismo implica el incremento de la [(Ca2+)i], que promueve la proliferación de las CMLV de la arteria pulmonar y los fibroblastos de la adventicia (Barman, 2001; Tan et al. 2005). Yang et al. (2010) indujeron la HAP en pollos de engorde con bajas temperaturas y analizaron, además de la PAP, el IC y el %T. La dosis empleada de nifedipina fue de 5mg/Kg cada 12 horas por vía oral a partir del día 16 hasta el 43, la nifedipina previno el aumento de la PAP durante la fase inicial del estudio, sin embargo, no suprimió el desarrollo de HAP en la fase final y tampoco mantuvo el valor de la PAP, del IC ni del %T en valores normales. Es claro que se necesitan más estudios para ajustar la dosis de la nifedipina, la edad a la cual se debe iniciar el tratamiento, así como su duración, si se quieren establecer programas de control de la ocurrencia de HAP en

42

pollos de engorde. Así mismo, es deseable que se lleven a cabo pruebas de toxicidad y la estimación de las relaciones de costo y beneficio del empleo de la nifedipina.

El engrosamiento de la capa muscular de arteriolas pulmonares es mayor en los PHP respecto a los PNHP (Figura 2-2) (Enkvetchakul et al. 1995; Tan et al. 2005; Moreno de Sandino & Hernández, 2006), lo cual coincide con lo hallado en el presente trabajo.

Figura 2-2. Izquierda, corte de pulmón de pollo con HAP (PHP), se observa el gran engrosamiento de la capa media muscular. Derecha, corte de pulmón de pollo sin HAP (PNHP), se observa la delgada capa de musculatura lisa. Aumento original 40x. Coloración Tricrómica de Masson.

El aumento de la RVP sucede como un fenómeno desencadenado por la vasoconstricción vascular pulmonar y por la remodelación vascular, la cual comprende cambios estructurales que incluyen la extensión distal del músculo liso en vasos previamente no muscularizados, característico en la HAP hipóxica, además del engrosamiento medial y de la adventicia de los vasos musculares y elásticos. Dicho engrosamiento medial se atribuye a la hipertrofia e hiperplasia de las CMLV así como al incremento de la deposición de proteínas de la matriz extracelular (Stenmark et al. 2006).

En el análisis de los resultados de mortalidad por HAP en pollos de engorde se debe tener en cuenta que no existe un patrón cronológico para el desarrollo de la HAP (Hernández & de Sandino, 2011) y su incidencia varía aún dentro de la misma estirpe. En el estudio de Vásquez & Hernández (2011), se reportó una mortalidad en pollos de la estirpe Cobb de 17,39% de hembras y 39,13% de machos. Areiza et al. (2011), encontraron para la misma estirpe, en el día 24 de edad, una mortalidad total acumulada por HAP de 9,18%. En el presente estudio el % de mortalidad por HAP fue de 43,05%. Esta variabilidad puede deberse a las condiciones particulares de cada investigación, así como al grado de susceptibilidad individual y de cada estirpe (Hernández, 1982; Hurchzermeyer, 1988).

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Actualmente, para el hombre, hay un amplio número de tratamientos farmacológicos en casos de HAP, la elección del indicado se realiza según las características de cada patología y del paciente mismo (Sáenz de la Calzada et al. 2001; Baloira, 2007). Sin embargo, a diferencia de los humanos, en la HAP hipóxica en el pollo de engorde, los tratamientos empleados han sido más escasos. Dentro de ellos están: la L-arginina (Wideman et al. 1995), L-arginina y vitaminas antioxidantes E y C (Bautista-Ortega & Ruiz-Feria, 2010), Prostaciclina (Wideman et al. 2005), Prostaglandina E2 (Stebel & Wideman, 2008), el digitálico digoxina (Otálora et al. 1988), inhalación de oxígeno al 100% (Wideman et al. 2000), antagonistas de los receptores de la ET-1 (BQ123) (Yang et al. 2005); sin embargo, aún falta conocer más acerca de ellos y adelantar análisis de su beneficio económico.

Sustancias farmacológicas como los BCC, tipo nifedipina han sido ampliamente estudiados en la HAP y se obtuvieron resultados satisfactorios en cuanto a la reducción de la PAP y de la RVP. La presente investigación refuerza hallazgos previos en cuanto a los beneficios de la nifedipina en el control de la incidencia de HAP y especialmente en lo concerniente a la importancia de controlar la remodelación vascular como clave en el tratamiento de la HAP en los pollos de engorde. El suministro de nifedipina en dosificaciones de 10 y 30 mg/Kg redujo la mortalidad ocasionada por HAP en pollos de engorde estirpe Cobb, criados a una altura de 2.638 msnm. Sin embargo, cabe la necesidad de la realización de mayor número de estudios con este tipo de sustancia vasodilatadora para evaluar la eficacia de la misma tanto en la reducción de la PAP y en la prevención de dicha patología, así mismo, futuros desarrollos para evaluar el efecto de la posible toxicidad en esta especie.

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3. Experimento In vitro. Efecto in vitro de la Endotelina-1 y la nifedipina sobre la contracción de la vasculatura pulmonar en pollos de engorde sanos y con hipertensión arterial pulmonar

Resumen

La Endotelina-1 (ET-1) es importante en la patogénesis de la Hipertensión Arterial Pulmonar (HAP) en varias especies incluyendo el pollo de engorde. En la vasoconstricción inducida por la ET-1, los canales de calcio operados por voltaje (VOCC) tipo L, tienen un rol central. En el presente trabajo, se evaluó el efecto de la ET-1 y del bloqueador de canales de calcio Nifedipina sobre la contracción inducida por ET-1, en anillos de arteria pulmonar de pollos de engorde no hipertensos (PNHP) y con HAP (PHP). Se observó una respuesta significativamente incrementada a la ET-1 en los anillos vasculares provenientes de los PHP respecto a los PNHP (P< 0,05). La incubación con 1 Micromolar (μM) de nifedipina no anuló completamente la contracción inducida por 1x10-7 Molar (M) de ET-1 en los anillos provenientes de los PNHP ni en los PHP, lo que podría sugerir la participación de fuentes de calcio adicionales a las que se logran mediante el ingreso a través de los canales VOCC tipo L. La nifedipina redujo, en mayor proporción, la contracción inducida por ET-1 en PNHP (50%), cuando se comparó con lo observado en anillos provenientes de PHP (30,7%). Lo anterior evidencia que los procesos por los que la ET-1 provoca vasoconstricción son más eficaces en los PHP, y que el calcio que ingresa a la célula por los VOCC tipo-L, probablemente representa sólo una parte del necesario para inducir vasoconstricción por la ET-1. Se sugiere que el bloqueo de la entrada de calcio por otras vías (ROCC Canales de calcio operados por receptor y SOCC canales de calcio operados por almacenamiento) puede producir un efecto vasodilatador de considerable significancia terapéutica en los pollos que padecen HAP.

Palabras Clave: Endotelina-1, Hipertensión arterial pulmonar, órgano vascular aislado, pollos de engorde

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3.1 Introducción

La hipoxia crónica ocasiona alteración de los mecanismos reguladores de la homeostasis del calcio, esto es clave para el entendimiento de la patogénesis de la Hipertensión Arterial Pulmonar (HAP), en este proceso, la participación de los canales iónicos y la disfunción endotelial desempeñan un rol determinante. En aquella alteración del funcionamiento endotelial, parece crucial el aumento de la síntesis de la Endotelina-1 (ET-1), la cual es considerada como uno de los vasoconstrictores más relevantes en el proceso fisiopatológico de la HAP (Shimoda et al., 2000b; Weigand et al., 2006). Este péptido, también participa en otras patologías vasculares como hemorragia subaracnoidea, vasoespasmo cerebral, (Kawanabe et al., 2002) aterosclerosis, preeclampsia (Okatani et al., 1995), cirrosis hepática (Pinzani et al., 1996) y falla cardiaca (Kawanabe & Nauli, 2005) entre otras. En el pulmón de mamíferos y pollos con HAP, hay mayor expresión de ET-1 que en los individuos sin la enfermedad (Giaid et al., 1993; Michel et al., 2003; Gómez et al., 2007).

La ET-1 induce vasoconstricción, a través de vías que permiten la elevación de la concentración de Ca2+libre citosólico ([(Ca2+)i]), y dentro de ellas vale la pena resaltar los canales permeables a este catión. Hasta la fecha se han identificado dos tipos de receptores para la ET-1 con potencial terapéutico: ETA y ETB. El receptor ETA está localizado en las células musculares lisas vasculares (CMLV), en las que induce vasoconstricción y mitosis. El receptor ETB, está localizado tanto en las células endoteliales como en las CMLV, donde activa la vasodilatación y vasoconstricción respectivamente (Yamasigawa et al., 1988; Pollock, 1998). Hay dos subtipos del receptor ETB, denominados ETB1 y ETB2. El receptor ETB1 está presente en el endotelio y es el responsable de la liberación de sustancias vasodilatadoras como el óxido nítrico (NO) y la prostaciclina (PGI2); mientras que el receptor ETB2, está ubicado en las CMLV y posee actividad vasoconstrictora (Warner et al., 1993; Gray et al., 1994; Sudjarwo et al., 1994). En la vasculatura pulmonar normal, los receptores ETA y ETB están diferencialmente distribuidos, los receptores ETA predominan en las arterias proximales, mientras que la proporción de receptores ETB se incrementa en pequeñas arteriolas pulmonares periféricas (Michel et al., 2003). En ciertas enfermedades cardiovasculares hay sobreexpresión de los receptores ETB2, mientras que el número de receptores ETB1 se encuentra reducido, lo que se relaciona directamente con el aumento de la contracción y consecuente disminución de la vasodilatación (Dupuis et al., 2000; Channick et al., 2004; Opitz & Ewert, 2006).

El mecanismo contráctil inducido por la ET-1, comienza con la activación del receptor ETA, localizado en las CMLV, lo que induce activación de la fosfolipasa C, a través de una proteína G para la formación de el 1,4,5 inositol trifosfato (IP3), lo que produce elevación de la [(Ca2+)i], mediante la liberación de Ca2+ desde depósitos intracelulares como el retículo sarcoplásmico (RS), a través de la apertura de canales de calcio operados por almacenamiento (SOCC) (por sus siglas en inglés: Store-Operated Ca2+ Channels) (Takuwa et al., 1990; Ohlstein et al., 1996). Posteriormente, ocurre la despolarización de la membrana de las CMLV, por un proceso que se inicia mediante la inactivación de los canales de potasio dependientes de voltaje (Kv), activados por Ca2+

(KCa2+) o ATP (KATP) (Nelson & Quayle, 1995, Shimoda et al., 1998; Goto et al., 1989; Al-

Jifrry et al., 2001). Estos cambios iónicos inducen modificaciones del potencial de

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membrana que permiten la activación de canales de calcio operados por voltaje (VOCC) (por sus siglas en inglés Voltage-Operated Calcium Channels), los cuales son los responsables de la elevación sostenida de [(Ca2+)i].

Lo anterior probablemente pueda explicar por qué la vasoconstricción inducida por ET-1, es considerada bifásica y dependiente de la concentración utilizada. Así, las concentraciones mayores a 10-9 Molar (M) permiten la elevación de la [(Ca2+)i], por una parte, mediante la liberación de Ca2+ desde los depósitos intracelulares, lo que induce una fase corta y transitoria de contracción, y por otro lado, por la activación de los VOCC, lo que induce un incremento mayor y sostenido de la [(Ca2+)i]. Así se genera una fase de contracción de mayor duración y magnitud (Takuwa et al., 1990, Komuro et al., 1997; Zhang et al., 1998; Minowa et al., 1997). En contraste, concentraciones menores de ET-1, sólo inducen la fase sostenida, es decir, en este caso la contracción es principalmente dependiente de la participación del Ca2+ extracelular (Komuro et al., 1997; Kawanabe et al., 2002). Lo anterior implica la participación de los canales de Ca2+ tipo L, que constituyen la mayor vía de entrada de Ca2+ requerido para el desencadenamiento de la contracción muscular. Estos canales se caracterizan por su elevado umbral, su inactivación lenta y elevada sensibilidad a los bloqueadores de canales de Ca2+ (BCC), tipo dihidropiridinas (DHP) (Katz, 1997; Lipscombe et al., 2004).

Aunque la principal vía de entrada del Ca2+ para el desencadenamiento de la contracción inducida por la ET-1, es la que ingresa a través de los VOCC tipo L, se demostró la participación de canales de Ca2+ que se activan por estímulos independientes a la despolarización celular. Éstos son los canales de Ca2+operados por almacenamiento (SOCC), también conocidos como canales de entrada de Ca2+ capacitado. Su apertura sucede por la reducción de la concentración de Ca2+ del lumen del RS tras la activación de receptores IP3 y receptores de rianodina. Otro tipo de canales de Ca2+ que activan la ET-1, son los canales de Ca2+ operados por receptor (ROCC) (Por sus siglas en inglés: Receptor-Operated Ca2+ Channels) (Takuwa et al., 1990; Ohlstein et al., 1996), los cuales están ubicados en la membrana plasmática y su apertura ocurre por la unión del su agonista (Diacilglicerol vía Proteina Quinasa-C (PKC)) a su receptor (Miwa et al., 2005).

Así, es incuestionable el papel determinante de la ET-1 en la fisiopatología de la HAP y la capacidad que tiene esta sustancia para generar un estímulo contráctil potente y sostenido, mediante la activación de los VOCC tipo L. Por tal motivo, teniendo en cuenta los resultados de trabajos previos, que demuestran una mayor expresión de la ET-1 en pollos de engorde que padecen HAP (Gómez et al., 2007), surge la intención de determinar la respuesta fisiológica de la vasculatura pulmonar a dicha sustancia. Con el presente trabajo se pretendió conocer el efecto in vitro de la ET-1 sobre la contractilidad de los anillos de arteria pulmonar de pollos sanos y pollos con HAP. También se buscó determinar la respuesta al BCC, tipo DHP “Nifedipina”, en la contracción de anillos de arteria pulmonar inducida por ET-1, con el propósito de indagar las posibles alteraciones en el comportamiento de la vasculatura pulmonar afectada por la HAP.

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3.2 Materiales y métodos

3.2.1 Medicamentos y soluciones

La Nifedipina y la ET-1 fueron obtenidas del laboratorio Sygma (St. Louis. MO. USA). La ET-1 (10-7 Molar (M)) se disolvió según la recomendación del productor, en agua destilada y almacenada a -20°C. La nifedipina se disolvió en Dimetilsulfóxido (DMSO) para obtener una solución que al adicionarse al baño de órganos su concentración final fuera de 1 Micromolar (ųM); hasta su empleo se mantuvo en refrigeración a 4°C. La cantidad adicionada de DMSO a los baños de órganos no modificó la respuesta contráctil de los anillos vasculares. Las soluciones que contenían nifedipina fueron protegidas con luz de sodio previniendo la fotodegradación. La composición de la solución de Krebs– Henseleit milimolar (mM) fue de: 119 NaCl; 4,7 KCl; 2,5 CaCl2; 1,2 KH2PO4; 1,2 MgSO4; 25 NaHCO3 y 5,6 glucosa.

3.2.2 Procedimiento experimental

Se alojaron 300 pollos de engorde machos, de un día de edad, de la línea genética Cobb 500, en el Edificio de Investigaciones Avícolas ubicado en la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá, a una altura de 2.638 metros sobre el nivel del mar (msnm). Se empleó un galpón experimental en el cual se controló la temperatura de forma automática, así: días 1 a 6: 32-33 °C, días 7 a 13: 29 a 30 °C, días 14 a 20: 27 a 28 °C, días 21 a 27: 24 a 26 °C, días 28 a 34: 21 a 23 °C, días 35 a 41:19 a 21 °C (Guía de manejo Cobb 500, 2008). Estos pollos no recibieron ningún tipo de tratamiento y se manejaron en condiciones estándar para explotaciones de pollo de engorde. A partir de la cuarta semana de edad, se realizaron los experimentos.

Obtención de los anillos de la arteria pulmonar

Todos los procedimientos a los que fueron sometidos los animales fueron aprobados por el comité de bioética de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia. Posterior al sacrificio de los pollos, se tomó de cada ave 1 o 2 anillos de arteria pulmonar. A todos los animales empleados, se les calculó el índice cardíaco (IC), que es la relación del peso de ventrículo derecho dividido por la masa ventricular total, multiplicado por 100 (Alexander & Jensen, 1959). Se consideraron pollos no hipertensos (PNHP) aquellos con IC ≤ 25% y los que tenían IC ≥ 26, pollos con HAP (PHP), según lo establecido para la estirpe Cobb 500 en trabajos anteriores, realizados en el altiplano de Bogotá, Colombia (Areiza et al., 2011; Vásquez & Hernández, 2011)

Una vez sacrificada el ave, se procedió a disectar la arteria pulmonar y se colocó en un recipiente con solución de Krebs-Henseleit, la cual se mantuvo con temperatura de 42

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ºC, y fue burbujeada continuamente con gas carbógeno (5% CO2 y 95% O2). Posteriormente se cortó en anillos de aproximadamente 3 a 5 mm de longitud cada uno, cada anillo de arterial pulmonar se fijó en sus extremos opuestos con dos alambres de acero inoxidable, dentro de un baño de órganos con solución de Krebs-Henseleit (20 ml), a una temperatura de 42 ºC y continuo burbujeo con gas carbógeno. Uno de los alambres se fijó al baño de órganos y el otro a un transductor isométrico (MLT0202 Panlab, España. 2008) conectado a un equipo de adquisición de datos (PowerLab). Para la obtención de datos, se empleó el Software Labchart 6. ADInstruments. Australia. 2008.

Los anillos arteriales se estabilizaron aproximadamente durante 30 minutos, haciendo cambios de medio cada 5 minutos, con una tensión basal de 1g (Ramírez et al., 2007; Álvarez-Medina et al., 2012. Esta tensión se logró luego de que los anillos vasculares se sometieron a cambio de la solución de Krebs-Henseleit cada 5 minutos y no mostraron cambios en su tensión basal (Figura 3-1).

Figura 3-1. Equipos que conforman el sistema para la realización de la técnica de órgano vascular aislado 1. Bomba termorreguladora Panlab, 2. Baño de órganos, 3. Bala de carbógeno, 4. Equipo de adquisición de datos (Powerlab), 5. Computador con el software Labchart 6.

Medición de la tensión isométrica

Se realizó el montaje de los anillos y se confirmó su funcionalidad. Todos los anillos de arteria pulmonar, inicialmente fueron sometidos a una concentración de 40 miliMolar (mM) de KCl para obtener la máxima contracción posible, la cual tuvo una duración que osciló entre 80 a 100 minutos y finalizó una vez se logró la estabilización de la respuesta contráctil del vaso; esta tensión se expresó como el 100%, y se tuvo en cuenta como valor de referencia para la evaluación de las siguientes respuestas, en términos comparativos. Posteriormente se efectuó el lavado de los anillos con solución de Krebs-Henseleit cada 5 minutos, para obtener la relajación del vaso hasta la tensión basal.

Para las sustancias vasoconstrictoras empleadas en todos los experimentos (KCl y ET-1), se identifico la máxima vasoconstricción, tras un periodo de mínimo 10 minutos sin cambios en la tensión del anillo arterial.

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Los protocolos utilizados se describen a continuación:

1. Efecto de la contracción inducida por ET-1 en anillos de arteria pulmonar provenientes de PNHP y PHP

Los anillos vasculares obtenidos de los PNHP y PHP, inicialmente fueron incubados con 40 mM de KCl, y posteriormente a su lavado y nueva estabilización de la tensión basal, se incubaron con el vasoconstrictor ET-1(1 x 10-7 M), tras un periodo de reposo de 30 minutos (Goto et al., 1989; Linder & Bendhack, 2002). Anillos de PNHP n=15. Anillos de PHP n=9.

2. Efecto del bloqueo de los VOCC tipo-L sobre la respuesta contráctil inducida por ET-1, en anillos de arteria pulmonar provenientes de PNHP

Para establecer el efecto del bloqueo de los VOCC tipo-L sobre la vasoconstricción inducida por ET-1, se empleó la DHP antagonista Nifedipina, a la concentración de 1 µM. La elección de 1 µM, fue según lo establecido por varios autores (Godfraind, 1983; Bialecki et al., 1998; Weigand et al., 2006). Tras la inducción de la máxima respuesta contráctil con 40 mM de KCl y su posterior estabilización en la tensión basal, se establecieron dos protocolos. En el protocolo 1 (n=15), los vasos se mantuvieron durante 30 minutos sin ningún tratamiento; mientras que en el protocolo 2 (n=9), se incubaron con Nifedipina (1 µM). Finalmente, en ambos protocolos, los anillos fueron expuestos a 10-7M de ET-1 (Goto et al., 1989; Linder & Bendhack, 2002).

3. Efecto del bloqueo de los VOCC tipo-L sobre la respuesta contráctil inducida por ET-1, en anillos de arteria pulmonar provenientes de PHP

Se realizó el mismo procedimiento anterior, en anillos de PHP. Protocolo 1 (n=9). Protocolo 2 (n=10).

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3.2.3 Análisis Estadístico

Las comparaciones entre tratamientos de los datos obtenidos para el % de contracción con ET-1 y con previa incubación con nifedipina entre PNHP y PHP se hicieron a través de estadística paramétrica empleando la prueba de comparación t-Student, la cual valida la diferencia entre medias de dos poblaciones normalmente distribuidas cuando el tamaño de la muestra es pequeña (menor 30) (Mood et al., 1974; Steel & Torrie, 1985). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas con un nivel de P<0,05: (*), los valores se tomaron como promedio ± desviación estándar (D.E). Para el análisis estadístico se empleó el software SAS 9.2, 2008

3.2.4 Estandarización de la técnica

Teniendo en cuenta que este es uno de los primeros trabajos experimentales realizados en la anillos de arteria pulmonar de pollos de engorde, fue necesario estandarizar la técnica de órgano vascular aislado a partir del procedimiento empleado inicialmente por Martínez-Lemus et al. (2003) y Álvarez-Medina et al. (2012). La tensión basal se modificó de 2 g a 1 g., las vasijas del equipo de baño de órganos se redujeron de tamaño con el objeto de disminuir el volumen de la solución de Krebs y por ende la cantidad de los reactivos necesarios. Por otro lado, se modificó el diseño de los serpentines que son estructuras tubulares del equipo, que permiten el atemperamiento de la solución a 42 °C, ya que su forma era muy frágil y fácilmente se rompían al manipularlos, lo cual dificultaba su limpieza; ahora la forma es en “U”, lo que permite realizar una adecuada y completa limpieza al equipo (Figura 3-2).

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Figura 3-2. Baño de órganos en el cual están ubicados los anillos de arteria pulmonar. Ver círculos rojos encerrando los anillos arteriales. Se puede observar la modificación realizada a las vasijas a las cuales se les disminuyó el volumen y a los serpentines originales, que se fabricaron en forma de “U”, la cual facilita la manipulación y limpieza del equipo.

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3.3 Resultados

Con el objeto de establecer la concentración de ET-1, con la que se induciría la contracción de los vasos en los subsecuentes experimentos, se hizo una curva dosis-respuesta a esta sustancia. Las concentraciones empleadas fueron desde 1x10-11 hasta 1x10-7 M, se eligió esta última como la concentración empleada por producir una contracción constante, reproducible y significativa. (Figura 3-3). La diferencia entre la concentración de 10-7 y la de 10-8 M fue altamente significativa (P< 0,01).

Figura. 3-3. Curva dosis-respuesta a ET-1. Se indujo contracción de los anillos de arteria pulmonar de pollos de engorde sanos, empleando concentraciones desde 10-11 hasta 10-7 M. Los resultados son expresados como % de la máxima respuesta contráctil inducida por 40 mM de KCl. **: Diferencia estadística altamente significativa (P< 0,01)

**

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Se empleó la prueba estadística t-student, puesto que la muestra de la población es pequeña (menor a 30). Dicha muestra cumple con los supuestos de normalidad del error (Prueba de Shapiro – Wilk) con una probabilidad de significancia de 0.1536 y la homogeneidad de varianzas (Prueba de Levene) con una probabilidad de significancia de

0.1204 (Mood et al., 1974; Steel & Torrie, 1985)

1. Comparación del efecto de la contracción inducida por ET-1 en anillos de arteria pulmonar provenientes de PNHP y PHP

Con el propósito de comparar las respuestas de los anillos provenientes de PNHP y PHP a la contracción con ET-1, se utilizó la concentración de 10-7 M, por provocar una contracción altamente reproducible. En los anillos provenientes de PNHP se obtuvo una contracción promedio de 23,72% ± 6,75. Esta respuesta es estadísticamente significativa (P< 0,05), respecto a la respuesta observada en los anillos de PHP, promedio: 32,87%± 10,07, error: 3,36. (Figura 3-3-1).

Figura. 3-3-1. Efecto de la contracción inducida por ET-1 en anillos de arteria pulmonar provenientes de PNHP y PHP. Los resultados son expresados como % de la máxima respuesta contráctil inducida por 40 mM de KCl. * : diferencia estadística significativa (P< 0,05).

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2. Efecto de la incubación con Nifedipina sobre la respuesta contráctil inducida por ET-1, en anillos de arteria pulmonar provenientes de PNHP

Para conocer el efecto del bloqueo de los canales tipo L sobre la contracción inducida por ET-1, se incubaron los anillos provenientes de PNHP con el antagonista de los VOCC tipo L, nifedipina, durante 30 minutos antes de inducir la contracción con ET-1, y esta respuesta se comparó con la contracción inducida por ET-1 en ausencia de nifedipina. La ET-1 indujo una contracción promedio de 23,72 %± 6,75, error: 1,74, que cuando se comparó con la contracción promedio obtenida en presencia de la DHP (11,85%± 5,57, error: 1,86 resultó significativa (P<0.05) (Figura 3-3-2).

Figura. 3-3-2. Efecto de la incubación con Nifedipina sobre la respuesta contráctil inducida por ET-1, en anillos de arteria pulmonar provenientes de PNHP. Los anillos vasculares de los PNHP fueron contraídos con 1x10-7 M de ET-1, y se comparó la respuesta con y sin previa incubación de 1 µM de Nifedipina. Los resultados son expresados como % de la máxima respuesta contráctil inducida por 40 mM de KCl. *: diferencia estadística significativa (P< 0,05).

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3. Efecto de la incubación con Nifedipina sobre la respuesta contráctil inducida por ET-1, en anillos de arteria pulmonar provenientes de PHP

Siguiendo la misma metodología del protocolo anterior, en anillos de PHP, se obtuvieron los siguientes resultados. En ausencia de la nifedipina, la ET-1 indujo una contracción promedio de 32,87 ± 10,07, error: 3,36. Esta respuesta al igual que ocurrió en los pollos sanos se vio significativamente reducida cuando se incubó con la nifedipina (promedio: 22,78 ± 11,28, error: 3,57), (P<0,05) (Figura 3-3-3).

Figura. 3-3-3. Efecto de la incubación con Nifedipina sobre la respuesta contráctil inducida por ET-1, en anillos de arteria pulmonar provenientes de PHP

Los anillos vasculares de los PHP fueron contraídos con una concentración de 10-7 M de ET-1, y se comparó la respuesta con y sin previa incubación con 1 µM de Nifedipina. Los resultados son expresados como % de la máxima respuesta contráctil inducida por 40 mM de KCl. *: Diferencia estadística significativa, (P< 0,05).

*

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4. Efecto de la incubación con Nifedipina, sobre la contracción inducida por ET-1 en anillos de arteria pulmonar provenientes de PNHP y PHP

Con el fin de establecer alguna posible diferencia en la respuesta inducida por Nifedipina sobre la contracción provocada por 10-7M de ET-1, se compararon las respuestas contráctiles de anillos provenientes de PNHP y PHP. En los anillos de PNHP la presencia del antagonista permitió una contracción promedio de 11,85 ± 5,57, error: 1,86. En lo que respecta a la respuesta de los anillos de PHP (promedio de contracción: 22,78%± 11,28, error: 3,57), es clara la diferencia, con significancia estadística significativa (P<0,05), cuando se compara su promedio con el obtenido en los anillos provenientes de animales no hipertensos (Figura 3-3-4).

Figura. 3-3-4. Efecto de la incubación con Nifedipina, sobre la contracción inducida por ET-1 en anillos de arteria pulmonar provenientes de PNHP y PHP. Los anillos de arteria pulmonar de PNHP y de PHP fueron incubados previamente con 1 µM de nifedipina y contraídos con 1x10-7 M de ET-1. Los resultados son expresados como % de la máxima respuesta contráctil inducida por 40 mM de KCl. *: Diferencia estadística significativa, (P< 0,05).

*

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3.4 Discusión

Probablemente, este es uno de los primeros trabajos donde se comparan las respuestas de los anillos de arteria pulmonar provenientes de pollos PHP y PNHP a ET-1. Así mismo, se describe, por primera vez, el efecto vasodilatador de la nifedipina en anillos arteriales de pollos de engorde y aporta conocimiento acerca del importante papel de la ET-1 y la función de los VOCC tipo L en la fisiopatología de la HAP.

Los resultados del presente estudio, mostraron diferencias estadísticamente significativas en la comparación de la respuesta entre los anillos vasculares de los PNHP y PHP a la contracción inducida por ET-1, la cual fue superior en los PHP. Estos hallazgos son similares a los reportados por Barman (2007), quien empleó arterias pulmonares aisladas de ratas a las cuales se les indujo HAP manteniéndolas en cámaras hipóxicas durante doce semanas.

La mayor reactividad observada en los anillos de los individuos hipertensos podría ser atribuida a un incremento en la sensibilidad de su vasculatura a la ET-1, lo que podría estar relacionado con las alteraciones en el número y distribución de los receptores ETA y ETB, en estados patológicos cardiovasculares como la HAP. Entre dichas alteraciones se encuentran la sobre-regulación de los receptores ETA en las CMLV (McCulloch et al., 1998; Weigand et al., 2006), de los receptores ETB2 en pequeñas arteriolas pulmonares periféricas (Channick et al., 2004; Opitz & Ewert, 2006) y la disminución de la expresión de los receptores ETB1, esto se encuentra directamente asociado con la disminución de la capacidad vasorelajante dependiente del endotelio, gracias a la reducción de la síntesis de sustancias vasodilatadoras como el NO y la PGI2 (Adnot et al., 1991; Inagami et al., 1995; Mam et al., 2010) .

Además de la ET-1, la serotonina (5-HT), la angiotensina II (Ang II), la noradrenalina y la histamina, se consideran sustancias que provocan reactividad incrementada en la vasculatura pulmonar sometida a hipoxia crónica (Shimoda et al., 2000a).Este aumento en la vasoreactividad en la HAP hipóxica, puede también ser atribuida a las anormalidades en las CMLV pulmonares, como el aumento en la [(Ca2+)i] en reposo (Shimoda et al., 2000b), la inhibición de los canales de K+ (Kv) gracias a la reducida expresión de sus subunidades alfa (Wang et al., 1997), y la actividad disminuida de los canales de K+ (KCa) (Peng et al., 1997). Esta alteración de la función de los canales de K+ por la hipoxia, puede explicar, el hecho de que agonistas como la ET-1 sean más efectivos en las arterias pulmonares de animales sometidos a hipoxia crónica que en individuos expuestos a normoxia (Shimoda et al., 2000a).

En contraste con los resultados obtenidos en este trabajo, Bialecki et al. (1998) e Itoh et al. (1999) reportaron una respuesta menor en los anillos de arteria pulmonar de ratas expuestas a hipoxia crónica. El comportamiento de la vasculatura pulmonar de estos individuos, podría ser atribuido a factores como la alteración en el número y afinidad de receptores o al metabolismo del agonista ET-1. Dichos autores se refieren a una posible alteración de la activación de los receptores ETA y/o un aumento en la respuesta mediada por el receptor ETB1 (Mam et al., 2010). Tampoco pueden descartarse diferencias de especie en este contexto. En numerosos estudios en modelos de hipertensión sistémica, con anillos arteriales precontraídos con ET-1, provenientes de animales sanos e hipertensos, también se encontraron resultados contradictorios (Lin et

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al., 1990; De Carvalho et al., 1990; Laurant & Berthelot, 1996; Linder & Bendhack, 2002). Estas diferencias en los resultados entre los diversos modelos analizados, podrían ser atribuidas al tipo de inducción de la HAP, curso de la misma, especie estudiada, además del lecho vascular estudiado, puesto que aún en un mismo modelo, existen diferencias.

El mecanismo contráctil inducido por la ET-1, implica la participación de algunos canales catiónicos permeables al Ca2+, que cuando son activados, permiten el aumento de la [(Ca2+)i], por una parte, a través del ingreso de Ca2+ desde el exterior de la célula y, por otro lado, por liberación desde depósitos intracelulares como el RS. Los canales de Ca2+ activados indirectamente por la ET-1 son los VOCC, pero también intervienen otros canales de Ca2+ cuya apertura es independiente del cambio de voltaje y son resistentes a las DHP, éstos son los SOCC y los ROCC, algunos de los cuales pueden ser activados por la ET-1 (Kawanabe et al., 2002; Miwa et al., 2005). Teniendo en cuenta el desarrollo de la respuesta vasocontráctil de la ET-1, se estudió el efecto de los BCC tipo DHP como la nifedipina sobre la vasculatura pulmonar en algunas especies como la rata (Weigand et al., 2006), el cerdo (Janssen et al., 2004) y el humano (Hall et al., 2009). En el presente trabajo se empleó 1 μM de nifedipina, en la incubación de anillos de arteria pulmonar de PNHP y PHP. La inactivación de los VOCC por la nifedipina no anuló completamente la respuesta a la ET-1, tanto en los PNHP como en los PHP. Esto podría explicarse por los mecanismos de inducción de la contracción de la ET-1, donde el incremento de la [(Ca2+)i] proviene no solamente del ingreso del Ca2+ extracelular a través de los VOCC tipo L, sino por otras fuentes de Ca2+ independientes del cambio de potencial de membrana y, que además, son resistentes a la nifedipina como la liberación de Ca2+ desde el RS, a través de la activación de los SOCC y por el ingreso de Ca2+ desde el exterior de la célula que se activa por la unión de un agonista (ET-1) a su receptor, mediante los ROCC (Miwa et al., 2005).

En la comparación del efecto de la nifedipina sobre la contracción inducida con ET-1 en los anillos arteriales provenientes de PNHP y de PHP, se encontró que la mayor reducción en la respuesta de los anillos vasculares fue en los PNHP (50%) comparados con los PHP (30,7%). Este resultado claramente podría sugerir la participación de fuentes de Ca2+, distintas a las que se activan por la despolarización de membrana, no obstante, la diferencia en la respuesta entre los anillos de los individuos sanos respecto a los hipertensos, demostraría un tipo de sobre-regulación de los canales independientes de voltaje como los ya mencionados (SOCC y ROCC) (Miwa et al., 2005). Lin et al. 2004 demostró que la exposición a la hipoxia crónica sobre-regula la expresión de algunos miembros de la familia de proteínas de canales catiónicos, como los Canales acoplados a Receptores de Potencial Transitorio (TPRC). Los miembros de esta familia, son esenciales constituyentes de los canales ROCC y SOCC (Gosling et al., 2005; Patel et al., 2010). Los tipos de TPRC que se han reportado sobre-expresados en la HAP son los TPRC-1, que se consideran del tipo de SOCC y los TPRC-6, como ROCC. De esta manera, al considerar que la hipoxia incrementa la expresión de los TPRC de algunos subtipos específicos (TPRC1 y TPRC6) (Lin et al., 2004; Wang et al., 2006; Abramowitz & Birnbaumer 2009) y que estos canales son activados por la misma ET-1, resulta evidente que el aumento de este tipo de canales y la sobre-expresión de ET-1, juegan un papel crítico en el incremento del tono vascular y en la proliferación de las CMLV, procesos fundamentales en el desarrollo de la HAP.

Aunque la entrada de Ca2+ extracelular a través de los VOCC cumple un papel relevante en el desarrollo de la contracción inducida por la ET-1, los resultados del presente trabajo

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22de%20Carvalho%20MH%22%5BAuthor%5D

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muestran evidencias de la importancia del estudio de otras fuentes de Ca2+ en la fisiopatología de la HAP hipóxica en el pollo de engorde. Este hecho podría reforzar la razón de la reciente necesidad de incorporar nuevas alternativas farmacológicas en el tratamiento de la HAP, las cuales tienen como diana terapéutica otros mecanismos fundamentales en el desarrollo de esta enfermedad, por ejemplo, los antagonistas de los receptores de ET-1 (Itoh et al., 1999; Opitz & Ewert, 2006). No obstante, es posible que el empleo de sustancias que impidan la elevación de la [(Ca2+)i] mediante la inactivación de los ROCC y los SOCC, pueda tener algún valor terapéutico. Sin embargo, es necesario llevar a cabo estudios adicionales con las moléculas que poseen dicha actividad, de esta manera sería posible determinar de forma específica precisar la participación del Ca2+, proveniente de fuentes distintas a los canales tipo L, en la vasoconstricción hipóxica.

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71

4. Discusión final

Este trabajo de investigación tuvo la ventaja de contar con dos componentes fundamentales, los ensayos de experimentación in vivo e in vitro. Este último ofrece beneficios en comparación con las técnicas in vivo, ya que permite evaluar la respuesta a diferentes sustancias en poco tiempo, con un reducido número de individuos experimentales y es de muy bajo costo. Además, permite la cuantificación precisa de la respuesta, ya que se suprime la interacción con otros órganos y sistemas, elimina la participación de fenómenos reflejos y excluye la influencia de la farmacocinética de la molécula analizada (Ramírez et al., 2007). En contraste, la experimentación in vivo, permite conocer los resultados de la integración de todos los sistemas orgánicos, de esta manera, la información emanada de este tipo de estudios podría arrojar respuestas fisiológicas más precisas y complejas.

En el experimento in vivo, se observó una reducción significativa en el % de mortalidad inducida por HAP, en el %T en los PHP y del IC en los pollos que fueron sacrificados al día 42, relacionadas de manera directamente proporcional con la dosificación de la DHP. La reducción del % de mortalidad, podría explicarse por las características de los BCC como la vasodilatación que se asocia a la reducción de la PAP, por los efectos antimitógenos que se reflejaron en la reducción del %T en el presente estudio y a los efectos sobre el corazón. Dentro de éstos se encuentran sus características anti-arrítmicas grupo IV como la disminución de la frecuencia cardíaca, de la conducción auriculo-ventricular y de la post-carga. También posee efecto inotrópico negativo y reduce la resistencia vascular periférica (Bendersky, 2005). Estas cualidades de la nifedipina sobre los miocitos cardiacos podrían explicar además la disminución del IC.

En el estudio in vitro, fue evidente que la nifedipina ocasionó reducción de la contracción inducida por ET-1 tanto en anillos provenientes de PHP y PNHP, que resultó mayor en estos últimos. Por ello, es de esperar que el hecho de evitar la

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entrada de Ca2+ extracelular (propiedad fundamental de los BCC tipo DHP como la nifedipina) en las CMLV, pueda prevenir la contracción vascular pulmonar sostenida y el aumento de la RVP, procesos patológicos que llevan al desarrollo de HAP. Sin embargo, es importante realizar investigaciones futuras que puedan dilucidar completamente todas las fuentes de Ca2+ que ingresen de forma diferente a las que emplean los VOCC tipo L.

Aunque el principal mecanismo implicado en el efecto terapéutico obtenido con los BCC sea la reducción de la PAP, es posible que otros procesos de importancia en la fisiopatología de la HAP puedan ser disminuidos también por la reducción de la entrada de Ca2+ a través de los VOCC tipo L. Así, es probable que los resultados obtenidos en este estudio puedan ser explicados, en parte, por la disminución de la activación de la PKC, la cual ha sido implicada en procesos de proliferación vascular (Kirck et al., 2002).

Otro de los aspectos importantes para resaltar en este trabajo es la evaluación de la viabilidad del empleo del pollo de engorde como modelo experimental, en el estudio de la HAP. Esta especie comparte con el humano ciertas características en el desarrollo de la enfermedad. Lo anterior sumado a la favorabilidad que posee su empleo en el estudio de esta patología, sugieren la importancia de trabajar con dicho modelo en la fisiopatología de la HAP.

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5. Recomendaciones

El presente trabajo permitió determinar la participación de la entrada de Ca2+ a través de los VOCC tipo-L en la contracción inducida por ET-1; sin embargo, al observar que el BCC nifedipina no anuló completamente esta respuesta contráctil, surge la necesidad de realizar estudios adicionales que intenten determinar la participación de otras fuentes de calcio, diferentes a las activadas tras la despolarización de membrana, por ejemplo las relacionadas con la activación de SOCC y ROCC. Para llevar a cabo dichos estudios, se podrían emplear sustancias bloqueadoras de los canales cationicos no selectivos permeables al Ca2+ (NSCC) por sus siglas en inglés: Non-Selective Calcium Channels), como el LOE908 y SK&F96365, los cuales poseen selectividad diferente en cuanto a las fuentes de Ca2+ (Iwamuro et al., 1999).

Es clara la importancia del Ca2+ intracelular en el desarrollo de la contracción inducida por ET-1 (Wang et al., 2006), por ello, es fundamental profundizar en el papel que juega la liberación de este catión desde las reservas intracelulares como el RS. Para esto, podría utilizarse un inhibidor de la liberación de Ca2+ sensible a la cafeína como la rianodina (Ito et al., 1986) y un inhibidor de la enzima Ca2+-ATP-asa como la tapsigargina (Marsden et al., 1989; Tribe et al., 1994).

Es probable que mediante el empleo de técnicas que permitan anular la participación del Ca2+ extracelular en la contracción vascular inducida por ET-1, sea posible determinar con seguridad la participación exacta del Ca2+ que penetra a las CMLV a través de los VOCC tipo-L. Por ello, la realización de experimentos con condiciones de cero Ca2+ podría evidenciar estas respuestas.

La hipoxia hipobárica es un factor determinante para la presentación de la HAP; no obstante, los experimentos in vitro llevados a cabo en este trabajo, fueron hechos en anillos de arteria pulmonar mantenidos en normoxia, este hecho

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justifica el desarrollo de investigaciones bajo condiciones de hipoxia y de esta manera determinar si dicha condición modificaría los resultados obtenidos respecto a los de nuestro trabajo.

Cabe la necesidad de analizar la respuesta de la arteria pulmonar de pollos de engorde a otras sustancias vasoconstrictoras importantes en la fisiopatología de la HAP como la 5-HT, el TXA2 (Inagami et al., 1995; Mandegar et al., 2004), Ang II, Bradiquinina, Histamina, además de establecer si sus efectos vasoconstrictores pueden crear interacciones o sinergismos, y de esta manera determinar su posible correlación en el proceso fisiopatológico de la HAP.

El grupo de investigación en Hipertensión Arterial Pulmonar ha venido estandarizando la técnica de órgano vascular aislado en arteria pulmonar de pollos de engorde, con la que se ha logrado la determinación de la respuesta vascular a múltiples sustancias como la ET-1; sin embargo, es probable que para dar una mayor validez a los resultados obtenidos en nuestro modelo, se realicen simultáneamente la exposición de los anillos vasculares de pollo con uno de los mamíferos más estudiados, el modelo de ratas genéticamente susceptibles a desarrollar HAP (FHR Fawn-Hooded Rats) y su control normotenso, SDR (Sprague-Dawley rats) (Marsboom & Janssens, 2004; Stenmark et al., 2009)

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Brock%20TA%22%5BAuthor%5D

76

77

A. Anexo: Signos clínicos de los pollos enfermos con HAP

Signos clínicos de los animales enfermos de HAP. Los signos clínicos se caracterizan por: depresión, dilatación abdominal por contenido de líquido (ascitis), plumas erizadas, retraso en el crecimiento

Figura 1. Pollo con sintomatología clásica de HAP: (depresión, abdomen dilatado, plumas erizadas, retraso en crecimiento).

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Figura 2. Pollo mostrando depresión, ojos apagados, plumas erizadas, cianosis

Figura 3. Pollo con distensión abdominal por acumulación de líquido

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Anexo B: Lesiones macroscópicas encontradas en los pollos con HAP

Las lesiones macroscópicas en la HAP se caracterizan por presencia de líquido de tonalidad amarillenta y depósitos de fibrina en la cavidad celómica (Figuras 1 y 2), presencia de fibrina sobre las vísceras y en los sacos aéreos (Figura 3), hidropericardio (Figura 4), hígado con bordes redondeados, cápsula engrosada (Figuras 3,6), congestión hepática (Figura 4), corazón con dilatación del ventrículo derecho (Figura 5).

Figura 1. Presencia de líquido abundante en la cavidad celómica (Ascitis)

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Figura 2. Presencia de fibrina en la cavidad celómica

Figura 3. Presencia de fibrina en los sacos aéreos torácicos y el hígado con los lóbulos redondeados, cápsula engrosada y presencia de fibrina entre la cápsula y el parénquima hepático

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Figura 4. Presencia de hidropericardio y congestión crónica hepática (aspecto de nuez moscada), bordes hepáticos redondeados

Figura 5. Dilatación del ventrículo derecho en pollos con HAP. De izquierda a derecha 1. Corazón normal. 2. Dilatación ventricular derecha leve. 3. Dilatación ventricular derecha moderada. 4. Dilatación ventricular derecha severa.

Figura 6. Hígado de la izquierda normal. Hígado de la derecha con grandes depósitos de fibrina entre la cápsula y el parénquima. Cápsula engrosada, bordes hepáticos redondeados. Órgano disminuido de tamaño.

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ANEXO C.

EXPERIMENTO IN VIVO

1. ANÁLISIS DE LOS VALORES DE IC DE LAS AVES MUERTAS DURANTE EL EXPERIMENTO

Grupo Control

Grupo Nifedipina 10 mg/Kg


Procedimiento GLM

Información de nivel de clase

Clase Niveles Valores

grupo 3 Control 10 30

Número de observaciones leídas 141

Número de observaciones usadas 141

83

Variable dependiente: icm icm

Suma de Cuadrado de

Fuente DF cuadrados la media F-Valor Pr > F

Modelo 2 11.927544 5.963772 0.23 0.7951

Error 138 3582.690703 25.961527

Total corregido 140 3594.618246

R-cuadrado Coef Var Raíz MSE icm Media

0.003318 12.27379 5.095246 41.51321

Cuadrado de

Fuente DF Tipo I SS la media F-Valor Pr > F

grupo 2 11.92754373 5.96377186 0.23 0.7951

Cuadrado de

Fuente DF Tipo III SS la media F-Valor Pr > F

grupo 2 11.92754373 5.96377186 0.23 0.7951

84

Procedimiento GLM

Observación Observado Predicción Residual

1 32.69141838 41.26252119 -8.57110281

2 41.66999715 41.26252119 0.40747595

3 41.53370031 41.26252119 0.27117912

4 37.94028120 41.26252119 -3.32223999

5 35.56183491 41.26252119 -5.70068628

6 44.83665361 41.26252119 3.57413242

7 35.14485190 41.26252119 -6.11766929

8 48.52348187 41.26252119 7.26096068

9 46.71979478 41.26252119 5.45727359

10 43.14617653 41.26252119 1.88365534

11 45.17967322 41.26252119 3.91715203

12 45.03664827 41.26252119 3.77412708

13 42.38992890 41.26252119 1.12740771

14 25.91566027 41.26252119 -15.34686093

15 44.41985457 41.26252119 3.15733338

16 43.22366435 41.26252119 1.96114316

17 39.45880660 41.26252119 -1.80371459

18 45.31153936 41.26252119 4.04901817

19 45.79412330 41.26252119 4.53160211

20 37.16562729 41.26252119 -4.09689390

21 44.52732309 41.26252119 3.26480189

22 39.83548297 41.26252119 -1.42703822

23 41.61723295 41.26252119 0.35471176

24 45.59385137 41.26252119 4.33133018

25 48.43591400 41.26252119 7.17339281

26 37.13579025 41.26252119 -4.12673094

27 40.97286482 41.26252119 -0.28965637

28 31.65838747 41.26252119 -9.60413372

29 46.16454632 41.26252119 4.90202513

30 40.33268588 41.26252119 -0.92983531

85

31 36.75649947 41.26252119 -4.50602172

32 40.27955737 41.26252119 -0.98296382

33 41.27221392 41.26252119 0.00969273

34 39.63136007 41.26252119 -1.63116112

35 46.73952584 41.26252119 5.47700465

36 43.24073315 41.26252119 1.97821196

37 47.11289893 41.26252119 5.85037774

38 43.18395120 41.26252119 1.92143001

39 33.73197843 41.26252119 -7.53054276

40 31.59726462 41.26252119 -9.66525657

41 33.74779789 41.26252119 -7.51472330

42 39.20344579 41.26252119 -2.05907540

43 42.04822368 41.26252119 0.78570249

44 43.43906689 41.26252119 2.17654570

45 33.52971965 41.26252119 -7.73280154

46 43.04454902 41.26252119 1.78202783

47 43.38432502 41.26252119 2.12180383

48 39.35298538 41.26252119 -1.90953581

49 46.12994265 41.26252119 4.86742146

50 47.64933963 41.26252119 6.38681844

51 47.36723194 41.26252119 6.10471075

52 40.12038573 41.26252119 -1.14213546

53 45.13947263 41.26252119 3.87695144

54 42.53587952 41.26252119 1.27335833

55 42.34252466 41.41805030 0.92447437

56 49.91206767 41.41805030 8.49401737

57 43.18892810 41.41805030 1.77087780

58 41.89317940 41.41805030 0.47512910

59 41.54977402 41.41805030 0.13172372

60 40.77415215 41.41805030 -0.64389815

61 47.17237771 41.41805030 5.75432742

62 43.32759818 41.41805030 1.90954788

63 42.23638389 41.41805030 0.81833359

86

64 47.44883289 41.41805030 6.03078260

65 40.71666916 41.41805030 -0.70138114

66 33.52776220 41.41805030 -7.89028810

67 39.43006082 41.41805030 -1.98798948

68 39.21801489 41.41805030 -2.20003541

69 35.40231852 41.41805030 -6.01573178

70 40.41627570 41.41805030 -1.00177460

71 39.58509821 41.41805030 -1.83295209

72 58.45850375 41.41805030 17.04045345

73 42.63172338 41.41805030 1.21367308

74 45.35143522 41.41805030 3.93338492

75 47.09896352 41.41805030 5.68091322

76 47.06137739 41.41805030 5.64332710

77 46.74879031 41.41805030 5.33074002

78 43.96013997 41.41805030 2.54208967

79 40.39823837 41.41805030 -1.01981192

80 38.68310715 41.41805030 -2.73494314

81 38.60515688 41.41805030 -2.81289342

82 40.34734678 41.41805030 -1.07070352

83 39.24846048 41.41805030 -2.16958982

84 41.30797599 41.41805030 -0.11007431

85 44.19845618 41.41805030 2.78040588

86 42.28138041 41.41805030 0.86333012

87 39.71231892 41.41805030 -1.70573138

88 40.78524415 41.41805030 -0.63280615

89 48.16608997 41.41805030 6.74803967

90 20.55418897 41.41805030 -20.86386132

91 39.20038338 41.41805030 -2.21766692

92 34.31428211 41.41805030 -7.10376819

93 43.62692593 41.41805030 2.20887563

94 37.47294236 41.41805030 -3.94510794

95 37.75097469 41.41805030 -3.66707560

96 39.39140479 41.41805030 -2.02664551

87

97 45.76636229 41.41805030 4.34831200

98 41.94512891 41.41805030 0.52707862

99 38.60099365 41.41805030 -2.81705665

100 38.83024092 41.41805030 -2.58780938

101 36.00780896 41.41805030 -5.41024134

102 38.66182931 41.96344099 -3.30161168

103 39.06967577 41.96344099 -2.89376523

104 38.14033388 41.96344099 -3.82310712

105 40.06167197 41.96344099 -1.90176902

106 42.85255432 41.96344099 0.88911333

107 47.76076279 41.96344099 5.79732179

108 42.02255609 41.96344099 0.05911510

109 42.04021094 41.96344099 0.07676995

110 46.93628075 41.96344099 4.97283976

111 39.51643935 41.96344099 -2.44700164

112 40.86390127 41.96344099 -1.09953972

113 37.54369348 41.96344099 -4.41974751

114 45.88452508 41.96344099 3.92108409

115 45.28113728 41.96344099 3.31769629

116 53.60425450 41.96344099 11.64081350

117 49.54198473 41.96344099 7.57854374

118 41.83372326 41.96344099 -0.12971773

119 37.56352810 41.96344099 -4.39991289

120 29.83582203 41.96344099 -12.12761896

121 41.34334585 41.96344099 -0.62009514

122 42.35378380 41.96344099 0.39034281

123 46.32170150 41.96344099 4.35826051

124 49.31378546 41.96344099 7.35034446

125 45.36373124 41.96344099 3.40029025

126 46.11666534 41.96344099 4.15322434

127 38.77399739 41.96344099 -3.18944361

128 44.82021558 41.96344099 2.85677459

129 41.16985208 41.96344099 -0.79358891

88

130 30.58591984 41.96344099 -11.37752116

131 46.08248207 41.96344099 4.11904107

132 36.19870410 41.96344099 -5.76473689

133 40.63787421 41.96344099 -1.32556678

134 45.16651052 41.96344099 3.20306953

135 45.34859180 41.96344099 3.38515080

136 43.55795826 41.96344099 1.59451727

137 37.46961887 41.96344099 -4.49382213

138 39.21642122 41.96344099 -2.74701977

139 33.92299786 41.96344099 -8.04044313

140 42.05917874 41.96344099 0.09573775

141 43.69941910 41.96344099 1.73597810

Suma de residuales -0.000000

Suma de los residuales cuadrados 3582.690703

Suma de residuales cuadrados - SS de error 0.000000

Autocorrelación de primer orden 0.125903

D de Durbin-Watson 1.726848

89

Test de Levene para homogeneidad de la varianza icm

ANOVA de las desviaciones cuadradas de las medias de grupo

Suma de Cuadrado de la

Fuente DF cuadrados media F-Valor Pr > F

grupo 2 704.1 352.0 0.13 0.8815

Error 138 384754 2788.1

Nivel de -------------icm-------------

grupo N Media Dev tip

Control 54 41.2625212 4.97299411

10 47 41.4180503 5.39806298

30 40 41.9634410 4.88736547

Procedimiento UNIVARIATE

Variable: icm (icm)

Momentos

N 141 Sumar pesos 141

Media 41.5132067 Observ suma 5853.36215

Desviación std 5.06713377 Varianza 25.6758446

Asimetría -0.5780515 Curtosis 2.39500253

SC no corregida 246586.451 SC corregida 3594.61825

Coef. variación 12.2060765 Media error std 0.42672964

90

Medidas estadísticas básicas

Ubicación Variabilidad

Media 41.51321 Desviación std 5.06713

Mediana 41.83372 Varianza 25.67584

Moda . Rango 37.90431

Rango intercuantil 5.96613

Tests para posición: Mu0=0

Test -Estadístico- -----P-valor------

T de Student t 97.28222 Pr > |t| <.0001

Signo M 70.5 Pr >= |M| <.0001

Puntuación con signo S 5005.5 Pr >= |S| <.0001

Tests para normalidad

Test -Estadístico-- -----P-valor------

Shapiro-Wilk W 0.964226 Pr < W 0.0010

Kolmogorov-Smirnov D 0.084157 Pr > D 0.0157

Cramer-von Mises W-Sq 0.141382 Pr > W-Sq 0.0320

Anderson-Darling A-Sq 1.01505 Pr > A-Sq 0.0113

91

Procedimiento NPAR1WAY

Análisis de la varianza para la variable icm

Clasificado por la variable grupo

grupo N Media

ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

Control 54 41.262521

10 47 41.418050

30 40 41.963441

Suma de Cuadrado de


ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

Among 2 11.927544 5.963772 0.2297 0.7951

Within 138 3582.690703 25.961527

Test de Kruskal-Wallis

Chi-cuadrado 0.3887

DF 2

Pr > Chi-cuadrado 0.8234

92

2. ANÁLISIS DE LOS VALORES DE IC DE LAS AVES SACRIFICADAS EL DÍA 42

Grupo Control



Procedimiento GLM



Grupo 3 Control 10 30



93

Variable dependiente: IC IC

Suma de Cuadrado de


Modelo 2 149.34384 74.67192 1.17 0.3119

Error 167 10627.50129 63.63773


R-cuadrado Coef Var Raíz MSE IC Media

0.013858 26.57134 7.977326 30.02230

Cuadrado de


Grupo 2 149.3438379 74.6719189 1.17 0.3119

Cuadrado de


Grupo 2 149.3438379 74.6719189 1.17 0.3119

94


1 17.75943680 29.66678338 -11.90734657

2 28.08453447 29.66678338 -1.58224890

3 26.65370534 29.66678338 -3.01307804

4 25.63738998 29.66678338 -4.02939340

5 41.49511384 29.66678338 11.82833047

6 35.08000193 29.66678338 5.41321856

7 27.55483461 29.66678338 -2.11194876

8 35.50683004 29.66678338 5.84004667

9 22.91277375 29.66678338 -6.75400963

10 30.77726418 29.66678338 1.11048081

11 41.28250746 29.66678338 11.61572408

12 24.47790767 29.66678338 -5.18887571

13 30.20255165 29.66678338 0.53576827

14 41.64834825 29.66678338 11.98156487

15 39.34821418 29.66678338 9.68143081

16 28.41420499 29.66678338 -1.25257839

17 40.35284886 29.66678338 10.68606549

18 43.62503184 29.66678338 13.95824846

19 26.08976131 29.66678338 -3.57702206

20 20.14063543 29.66678338 -9.52614795

21 20.92027145 29.66678338 -8.74651192

22 23.85545176 29.66678338 -5.81133162

23 17.49580718 29.66678338 -12.17097620

24 26.23052335 29.66678338 -3.43626002

25 27.60479645 29.66678338 -2.06198692

26 21.08816636 29.66678338 -8.57861702

27 19.42047169 29.66678338 -10.24631168

28 34.68524681 29.66678338 5.01846344

29 18.97321933 29.66678338 -10.69356405

30 33.94910895 29.66678338 4.28232557

31 36.72482126 29.66678338 7.05803789

95

32 37.14650939 29.66678338 7.47972601

33 30.61852498 29.66678338 0.95174160

34 18.11883471 29.66678338 -11.54794867

35 26.11301143 29.66678338 -3.55377195

36 17.15967745 29.66678338 -12.50710592

37 24.27559505 29.66678338 -5.39118833

38 19.97584489 29.66678338 -9.69093848

39 17.75943680 29.66678338 -11.90734657

40 23.94108466 29.66678338 -5.72569872

41 32.30973351 29.66678338 2.64295013

42 34.87122565 29.66678338 5.20444227

43 40.01390707 29.66678338 10.34712369

44 23.70046246 29.66678338 -5.96632091

45 39.06702605 29.66678338 9.40024267

46 40.95421575 29.66678338 11.28743238

47 29.76488476 29.66678338 0.09810138

48 41.46813868 29.66678338 11.80135530

49 20.44146271 29.66678338 -9.22532067

50 18.63470163 29.66678338 -11.03208175

51 33.65479833 29.66678338 3.98801496

52 25.61322052 29.66678338 -4.05356286

53 39.56730396 29.66678338 9.90052058

54 34.15417663 29.66678338 4.48739326

55 36.42685088 29.66678338 6.76006751

56 22.05706475 29.66678338 -7.60971862

57 25.24573003 29.66678338 -4.42105334

58 35.95423817 29.66678338 6.28745479

59 24.96744517 29.66678338 -4.69933820

60 41.57841633 29.66678338 11.91163296

61 32.50037698 29.66678338 2.83359361

62 43.29488871 29.66678338 13.62810533

63 30.49238903 29.18062819 1.31176084

64 29.35413761 29.18062819 0.17350942

96

65 22.15629827 29.18062819 -7.02432992

66 25.99819752 29.18062819 -3.18243067

67 22.08860887 29.18062819 -7.09201932

68 33.89685521 29.18062819 4.71622702

69 27.70005799 29.18062819 -1.48057020

70 21.57444346 29.18062819 -7.60618473

71 36.64719322 29.18062819 7.46656503

72 20.17675948 29.18062819 -9.00386871

73 32.30524730 29.18062819 3.12461912

74 30.33762149 29.18062819 1.15699330

75 38.52771514 29.18062819 9.34708695

76 16.95305075 29.18062819 -12.22757744

77 34.53174503 29.18062819 5.35111684

78 26.56343721 29.18062819 -2.61719098

79 24.18247582 29.18062819 -4.99815236

80 27.85366422 29.18062819 -1.32696397

81 23.81610217 29.18062819 -5.36452602

82 37.10652168 29.18062819 7.92589349

83 37.57940294 29.18062819 8.39877475

84 23.65883979 29.18062819 -5.52178840

85 20.85847596 29.18062819 -8.32215222

86 23.28572252 29.18062819 -5.89490566

87 31.96145650 29.18062819 2.78082831

88 22.46056840 29.18062819 -6.72005978

89 47.66447841 29.18062819 18.48385022

90 33.03900443 29.18062819 3.85837625

91 28.35778804 29.18062819 -0.82284015

92 21.78611108 29.18062819 -7.39451710

93 39.49746867 29.18062819 10.31684049

94 21.50772777 29.18062819 -7.67290042

95 24.82351814 29.18062819 -4.35711005

96 31.23462915 29.18062819 2.05400096

97 33.45555036 29.18062819 4.27492217

97

98 34.89338898 29.18062819 5.71276079

99 37.87009542 29.18062819 8.68946724

100 32.33644049 29.18062819 3.15581231

101 33.29494965 29.18062819 4.11432146

102 26.67582650 29.18062819 -2.50480169

103 26.26130747 29.18062819 -2.91932072

104 37.30285116 29.18062819 8.12222297

105 38.77392502 29.18062819 9.59329683

106 31.20477180 29.18062819 2.02414361

107 23.00342509 29.18062819 -6.17720310

108 30.92847382 29.18062819 1.74784563

109 20.15623900 29.18062819 -9.02438918

110 19.94801283 29.18062819 -9.23261536

111 21.88430203 29.18062819 -7.29632615

112 20.96831118 29.18062819 -8.21231701

113 35.64475047 29.18062819 6.46412229

114 26.85268879 29.18062819 -2.32793940

115 38.23496092 29.18062819 9.05433273

116 23.01723030 29.18062819 -6.16339789

117 21.12124645 29.18062819 -8.05938174

118 37.24813759 29.18062819 8.06750940

119 26.87635915 29.18062819 -2.30426904

120 44.54547715 29.18062819 15.36484896

121 35.49943513 31.43947794 4.05995719

122 20.55525420 31.43947794 -10.88422375

123 51.93850998 31.43947794 20.49903204

124 47.51157407 31.43947794 16.07209613

125 33.31934583 31.43947794 1.87986788

126 31.74423138 31.43947794 0.30475344

127 22.79552391 31.43947794 -8.64395404

128 23.31955670 31.43947794 -8.11992124

129 39.63613777 31.43947794 8.19665983

130 46.35430972 31.43947794 14.91483178

98

131 30.45194366 31.43947794 -0.98753428

132 25.25006693 31.43947794 -6.18941101

133 22.37009937 31.43947794 -9.06937857

134 31.44578313 31.43947794 0.00630519

135 26.62405578 31.43947794 -4.81542216

136 22.06926647 31.43947794 -9.37021147

137 23.21500963 31.43947794 -8.22446831

138 27.79363337 31.43947794 -3.64584457

139 22.58494618 31.43947794 -8.85453177

140 28.29784824 31.43947794 -3.14162970

141 24.54641312 31.43947794 -6.89306482

142 27.21983692 31.43947794 -4.21964103

143 24.87206573 31.43947794 -6.56741222

144 21.75442132 31.43947794 -9.68505662

145 40.26513794 31.43947794 8.82566000

146 34.19059362 31.43947794 2.75111568

147 47.30474114 31.43947794 15.86526319

148 23.79289169 31.43947794 -7.64658626

149 36.68020315 31.43947794 5.24072520

150 35.52437036 31.43947794 4.08489242

151 21.03736195 31.43947794 -10.40211599

152 21.75324675 31.43947794 -9.68623119

153 27.02625602 31.43947794 -4.41322192

154 33.83244514 31.43947794 2.39296720

155 24.76611004 31.43947794 -6.67336791

156 44.25625622 31.43947794 12.81677827

157 28.36994759 31.43947794 -3.06953035

158 24.98708524 31.43947794 -6.45239271

159 27.68933234 31.43947794 -3.75014561

160 35.05419428 31.43947794 3.61471633

161 31.72123593 31.43947794 0.28175799

162 23.52235326 31.43947794 -7.91712468

163 36.19837278 31.43947794 4.75889483

99

164 41.59140212 31.43947794 10.15192418

165 30.00311706 31.43947794 -1.43636088

166 20.05049626 31.43947794 -11.38898169

167 51.20934847 31.43947794 19.76987053

168 49.60042231 31.43947794 18.16094436

169 34.95026143 31.43947794 3.51078349

170 35.42744551 31.43947794 3.98796757

Suma de residuales 0.00000


Suma de residuales cuadrados - SS de error -0.00000

Autocorrelación de primer orden 0.11771


Test de Levene para homogeneidad de la varianza IC




Grupo 2 23440.3 11720.2 2.28 0.1054

Error 167 858139 5138.6

Nivel de --------------IC-------------

Grupo N Media Dev tip

Control 50 31.4394779 8.89223233

10 58 29.1806282 6.99391134

30 62 29.6667834 8.06209501

100


Variable: ric

Momentos

N 170 Sumar pesos 170

Media 0 Observ suma 0


Asimetría 0.45807017 Curtosis -0.6571523


Coef. variación . Media error std 0.6082019




Mediana -1.38166 Varianza 62.88462





T de Student t 0 Pr > |t| 1.0000

Signo M -4 Pr >= |M| 0.5915

Puntuación con signo S -291.5 Pr >= |S| 0.6515

101



Shapiro-Wilk W 0.959261 Pr < W <0.0001

Kolmogorov-Smirnov D 0.090673 Pr > D <0.0100

Cramer-von Mises W-Sq 0.322121 Pr > W-Sq <0.0050

Anderson-Darling A-Sq 1.987159 Pr > A-Sq <0.0050

Procedimiento NPAR1WAY

Análisis de la varianza para la variable IC

Clasificado por la variable Grupo

Grupo N Media

ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

30 62 29.666783

10 58 29.180628

Control 50 31.439478

Suma de Cuadrado de


ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ

Among 2 149.343838 74.671919 1.1734 0.3119

Within 167 10627.501292 63.637732

Test de Kruskal-Wallis

Chi-cuadrado 1.2666

DF 2

Pr > Chi-cuadrado 0.5308

102

3. ANÁLISIS VALORES DE REMODELACIÓN VASCULAR

Grupo 1: Nifedipina 30 mg/Kg en PNHP

Grupo 2: Nifedipina 30 mg/Kg en PHP

Grupo 3: Nifedipina 10 mg/Kg en PNHP

Grupo 4: Nifedipina 10 mg/Kg en PHP

Grupo 5: Control en PNHP

Grupo 6: Control en PHP

Procedimiento GLM



Grupo 6 1 2 3 4 5 6



103

Variable dependiente: IC IC

Suma de Cuadrado de


Modelo 5 126.4939946 25.2987989 15.21 <.0001

Error 42 69.8701648 1.6635754


R-cuadrado Coef Var Raíz MSE IC Media

0.644181 6.817908 1.289797 18.91778

Cuadrado de


Grupo 5 126.4939946 25.2987989 15.21 <.0001

Cuadrado de


Grupo 5 126.4939946 25.2987989 15.21 <.0001

104


1 17.64262614 17.22915057 0.41347558

2 17.40887279 17.22915057 0.17972222

3 18.41234257 17.22915057 1.18319200

4 19.31722446 17.22915057 2.08807390

5 14.28280638 17.22915057 -2.94634419

6 18.76807490 17.22915057 1.53892433

7 16.70423219 17.22915057 -0.52491837

8 15.29702509 17.22915057 -1.93212547

9 20.09769897 19.69588449 0.40181448

10 20.62038898 19.69588449 0.92450450

11 19.10699974 19.69588449 -0.58888475

12 18.80239330 19.69588449 -0.89349119

13 18.93988370 19.69588449 -0.75600079

14 21.95227440 19.69588449 2.25638991

15 18.29563852 19.69588449 -1.40024597

16 19.75179829 19.69588449 0.05591380

17 17.41785038 17.19411736 0.22373302

18 16.23548475 17.19411736 -0.95863261

19 15.70875446 17.19411736 -1.48536290

20 17.43187381 17.19411736 0.23775644

21 17.51588116 17.19411736 0.32176379

22 18.68804527 17.19411736 1.49392791

23 17.08085124 17.19411736 -0.11326612

24 17.47419783 17.19411736 0.28008047

25 21.08121031 19.86188760 1.21932271

26 19.05058130 19.86188760 -0.81130630

27 19.42133395 19.86188760 -0.44055365

28 22.66776867 19.86188760 2.80588107

29 20.43399473 19.86188760 0.57210713

30 19.05753450 19.86188760 -0.80435310

31 17.63155559 19.86188760 -2.23033201

105

32 19.55112176 19.86188760 -0.31076584

33 19.10549631 17.88340263 1.22209367

34 18.54665826 17.88340263 0.66325562

35 18.69872512 17.88340263 0.81532249

36 17.96039644 17.88340263 0.07699381

37 18.62403030 17.88340263 0.74062767

38 16.58105663 17.88340263 -1.30234600

39 17.24224850 17.88340263 -0.64115414

40 16.30860951 17.88340263 -1.57479312

41 23.05501102 21.64221476 1.41279625

42 22.11604720 21.64221476 0.47383243

43 21.91082893 21.64221476 0.26861417

44 20.44210850 21.64221476 -1.20010626

45 20.31340169 21.64221476 -1.32881308

46 21.25289303 21.64221476 -0.38932173

47 23.33981419 21.64221476 1.69759942

48 20.70761356 21.64221476 -0.93460120



Suma de residuales cuadrados - SS de error 0.00000000

Autocorrelación de primer orden -0.12877358


Test de Levene para homogeneidad de la varianza IC




Grupo 5 21.0922 4.2184 1.13 0.3571

Error 42 156.1 3.7175

106

Nivel de --------------IC-------------


1 8 17.2291506 1.73292232

2 8 19.6958845 1.18248666

3 8 17.1941174 0.89908611

4 8 19.8618876 1.52396422

5 8 17.8834026 1.05151498

6 8 21.6422148 1.15915966


Variable: ric

Momentos

N 48 Sumar pesos 48

Media 0 Observ suma 0


Asimetría 0.0055304 Curtosis -0.1501816


Coef. variación . Media error std 0.17598528







107



T de Student t 0 Pr > |t| 1.0000

Signo M 2 Pr >= |M| 0.6655

Puntuación con signo S -5 Pr >= |S| 0.9597




Kolmogorov-Smirnov D 0.059955 Pr > D >0.1500

Cramer-von Mises W-Sq 0.023172 Pr > W-Sq >0.2500

Anderson-Darling A-Sq 0.131792 Pr > A-Sq >0.2500

Medias con la misma letra no son significativamente diferentes.

t Agrupamiento Media N Grupo

A 21.6422 8 6

B 19.8619 8 4

B

B 19.6959 8 2

C 17.8834 8 5

C

C 17.2292 8 1

C

C 17.1941 8 3

108

EXPERIMENTO IN VITRO

Grupo 1: Anillos vasculares de PNHP contraídos con ET-1

Grupo 2: Anillos vasculares de PHP contraídos con ET-1

Grupo 3: Anillos vasculares de PNHP incubados con nifedipina y contraídos con ET-1

Grupo 4: Anillos vasculares de PHP incubados con nifedipina y contraídos con ET-1

Procedimiento GLM



Grupo 4 1 2 3 4



109

Variable dependiente: Contrac Contrac

Suma de Cuadrado de


Modelo 3 2004.143341 668.047780 9.17 0.0001

Error 39 2841.889436 72.868960


R-cuadrado Coef Var Raíz MSE Contrac Media

0.413564 37.21722 8.536332 22.93651

Cuadrado de


Grupo 3 2004.143341 668.047780 9.17 0.0001

Cuadrado de


Grupo 3 2004.143341 668.047780 9.17 0.0001

110


1 26.47000000 23.72466667 2.74533333

2 14.00000000 23.72466667 -9.72466667

3 21.60000000 23.72466667 -2.12466667

4 25.00000000 23.72466667 1.27533333

5 15.00000000 23.72466667 -8.72466667

6 22.20000000 23.72466667 -1.52466667

7 25.80000000 23.72466667 2.07533333

8 15.00000000 23.72466667 -8.72466667

9 29.00000000 23.72466667 5.27533333

10 29.40000000 23.72466667 5.67533333

11 36.70000000 23.72466667 12.97533333

12 27.10000000 23.72466667 3.37533333

13 25.00000000 23.72466667 1.27533333

14 14.00000000 23.72466667 -9.72466667

15 29.60000000 23.72466667 5.87533333

16 32.00000000 32.87555556 -0.87555556

17 34.00000000 32.87555556 1.12444444

18 22.20000000 32.87555556 -10.67555556

19 39.00000000 32.87555556 6.12444444

20 31.80000000 32.87555556 -1.07555556

21 27.00000000 32.87555556 -5.87555556

22 24.50000000 32.87555556 -8.37555556

23 56.10000000 32.87555556 23.22444444

24 29.28000000 32.87555556 -3.59555556

25 17.34000000 11.85333333 5.48666667

26 13.88000000 11.85333333 2.02666667

27 4.34000000 11.85333333 -7.51333333

28 16.30000000 11.85333333 4.44666667

29 20.00000000 11.85333333 8.14666667

30 8.82000000 11.85333333 -3.03333333

31 8.10000000 11.85333333 -3.75333333

111

32 12.90000000 11.85333333 1.04666667

33 5.00000000 11.85333333 -6.85333333

34 13.88000000 22.78400000 -8.90400000

35 35.00000000 22.78400000 12.21600000

36 29.66000000 22.78400000 6.87600000

37 8.33000000 22.78400000 -14.45400000

38 8.33000000 22.78400000 -14.45400000

39 30.76000000 22.78400000 7.97600000

40 35.29000000 22.78400000 12.50600000

41 34.42000000 22.78400000 11.63600000

42 17.77000000 22.78400000 -5.01400000

43 14.40000000 22.78400000 -8.38400000



Suma de residuales cuadrados - SS de error -0.000000

Autocorrelación de primer orden -0.031777


112

Test de Levene para homogeneidad de la varianza Contrac




Grupo 3 50301.8 16767.3 2.07 0.1204

Error 39 316433 8113.7

Nivel de -----------Contrac-----------


1 15 23.7246667 6.7486706

2 9 32.8755556 10.0724812

3 9 11.8533333 5.5694973

4 10 22.7840000 11.2766831

Momentos

N 43 Sumar pesos 43



Asimetría 0.4540968 Curtosis 0.63302812



113





Moda 8.33000 Rango 51.76000


NOTA: La moda mostrada es la menor de 6 modas con un conteo 2.



T de Student t 14.0021 Pr > |t| <.0001

Signo M 21.5 Pr >= |M| <.0001

Puntuación con signo S 473 Pr >= |S| <.0001







114

---------------------------------------------- Grupo=1 -----------------------------------


Variable: Contrac (Contrac)

Momentos

N 15 Sumar pesos 15



Asimetría -0.1049805 Curtosis -0.5344851






Moda 14.00000 Rango 22.70000


NOTA: La moda mostrada es la menor de 3 modas con un conteo 2.



T de Student t 13.61531 Pr > |t| <.0001

Signo M 7.5 Pr >= |M| <.0001

Puntuación con signo S 60 Pr >= |S| <.0001







115

---------------------------------------------- Grupo=2 -----------------------------------



Momentos

N 9 Sumar pesos 9



Asimetría 1.68315963 Curtosis 3.53744623











T de Student t 9.791695 Pr > |t| <.0001

Signo M 4.5 Pr >= |M| 0.0039

Puntuación con signo S 22.5 Pr >= |S| 0.0039







116

---------------------------------------------- Grupo=3 -----------------------------------



Momentos

N 9 Sumar pesos 9














T de Student t 6.384777 Pr > |t| 0.0002

Signo M 4.5 Pr >= |M| 0.0039








117

---------------------------------------------- Grupo=4 -----------------------------------



Momentos

N 10 Sumar pesos 10










Moda 8.33000 Rango 26.96000




T de Student t 6.389231 Pr > |t| 0.0001

Signo M 5 Pr >= |M| 0.0020





Kolmogorov-Smirnov D 0.228988 Pr > D 0.1405



118

Prueba t- student (LSD) para Contrac

NOTA: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 39

Error de cuadrado medio 72.86896

Valor crítico de t 2.02269

Las comparaciones importantes del nivel 0.05 están indicadas por ***.

Diferencia

Grupo entre 95% Límites

Comparación medias de confianza

2 - 1 9.151 1.871 16.431 ***

2 - 4 10.092 2.158 18.025 ***

2 - 3 21.022 12.883 29.162 ***

1 - 2 -9.151 -16.431 -1.871 ***

1 - 4 0.941 -6.108 7.990

1 - 3 11.871 4.591 19.151 ***

4 - 2 -10.092 -18.025 -2.158 ***

4 - 1 -0.941 -7.990 6.108

4 - 3 10.931 2.997 18.864 ***

3 - 2 -21.022 -29.162 -12.883 ***

3 - 1 -11.871 -19.151 -4.591 ***

3 - 4 -10.931 -18.864 -2.997 ***

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Introducción - Universidad Nacional De Colombia · La hipertensión arterial pulmonar (HAP) asociada a la hipoxia crónica de la gran altura, fue clasificada en el tercer grupo de