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Kit di estrazione degli acidi nucleiciGuida alla selezione
Gli sviluppi dei metodi di rilevazione e di quantificazione basati sulle Real-Time
PCR hanno contribuito in modo significativo ad aumentare l'efficienza del
controllo qualità nell'industria alimentare. I laboratori di controllo lavorano
quotidianamente con test qPCR per la rilevazione di patogeni, microrganismi
deterioranti, OGM, allergeni o semplicemente per prevenire le frodi.
Storicamente, i fornitori si concentravano sulle prestazioni dei kit di rilevazione,
spesso dimenticando che nelle applicazioni agroalimentari l'estrazione del
DNA ha un'importanza equivalente per la qualità dei risultati.
I metodi basati sul DNA, come la reazione a catena della polimerasi (PCR),
sono altamente specifici, riproducibili, sensibili e caratterizzati da una elevata
capacità discriminatoria, tempi rapidi di analisi e bassi costi, ma fortemente
limitati dalla presenza di inibitori nell'alimentazione. Gli inibitori della PCR,
come i polisaccaridi, gli acidi umici, particolarmente abbondanti nei
campioni di alimenti, non vengono completamente rimossi durante i
protocolli di estrazione classica che rimangono come contaminanti nei
preparati finali del DNA. I composti inibitori possono interferire con la reazione
a diversi livelli, portando a diminuire o a completa inibizione della
amplificazione del DNA.
Pertanto, i metodi basati sul DNA sono fortemente dipendenti dalle tecniche
di estrazione e purificazione del DNA.
In particolare i campioni richiedono:
• una stretta strategia di estrazione e purificazione che garantisce un
efficace recupero dell'acido nucleico e la rimozione dei numerosi
composti che inibiscono il test PCR.
• Metodi di estrazione in grado di recuperare frammenti degradati di
DNA a causa di variazioni di pH o di trattamenti termici subiti dalla
matrice (cottura, sterilizzazione, affumicatura, ecc.) che avvengono
spesso durante il processo di produzione.
• Quando eterogenei, la possibilità di estrarre da grande quantità di
materiale per garantire la rappresentatività. Ciò è particolarmente
utile quando si ricercano contaminanti come gli OGM, gli allergeni e
le specie di carne/vegetali non dichiarate.
I metodi di analisi basati sugli acidi nucleici e la loro standardizzazione sono
l'attività principale del gruppo di ricerca e sviluppo di Generon.
ION è la linea di prodotti per l'estrazione del DNA sviluppata da Generon per
sfruttare al meglio la Real-Time PCR e Digital PCR.
E' composta da 3 kit con diversi profili per offrire la soluzione più conveniente
e più idonea a soddisfare le esigenze tecniche al cliente.
• ION-Liquid FORCE DNA extractor è la soluzione sviluppata specificamente
per l'estrazione rapida del DNA di batteri dopo l'arricchimento in brodo di
cultura.
• ION-Spin DNA Prep One-for-All basato su CTAB per l'estrazione del DNA da
piccoli campioni contenenti composti inibitori PCR.
• ION-Force DNA extractor FAST basato su CTAB per l'estrazione del DNA da
grandi campioni quando la rappresentatività è di fondamentale
importanza. Ion-Force DNA Extractor FAST viene utilizzato presso il
Laboratorio nazionale Italiano di riferimento per gli OGM in quanto
consente estrazioni di DNA riproducibili da matrici che altri kit commerciali
disponibili non sono in grado di eseguire in quanto restituiscono scarti di
DNA poveri e irregolari.
Analisi OGM
AnalisiAllergeni
AnalisiMicrobiologia
Autenticità ingredienti
ION-Liquid Force DNA extractor
ION-Spin DNA PrepOne-for-All
ION-ForceDNA extractor FAST
Tabella 1 – Performance dei diversi kit di estrazione per le varie applicazioni
Velocità Versatilità Quantità estratta Purezza
ION-Liquid Force DNA extractor
ION-Spin DNA PrepOne-for-All
ION-ForceDNA extractor FAST
Tabella 2 – Caratteristiche tecniche dei diversi kit di estrazione
ION-Liquid Force DNA extractor (EXD008)
E' il kit sviluppato da Generon per estrarre il DNA dei microrganismi il più
velocemente possibile. L'estrema facilità d'uso si adatta perfettamente
all'estrazione del DNA da pellet batterica derivata da brodo di arrichimento.
Se l'estratto è molto grezzo, nel caso in cui la matrice alimentare contanga
molti inibitori PCR si consiglia un ulteriore passaggio con ION-Spin DNA Prep
One-for All.
AggiungiION-Liquid
Force
Centrifugaree Drenare
pellet
Raccogliereliquido arricchito
Amplificareil DNA
Centrifugare eriscaldare
Precipitare i detritie diluire 1:10
Diagramma 1 – Flusso di lavoro ION-Liquid Force DNA extractor
La procedura di campionamento determina la rappresentatività di un
risultato, mentre la qualità e la quantità degli analiti possono variare a
seconda della preparazione del campione. Il campionamento e la
preparazione dei campioni sono quindi passi cruciali nel processo di
rilevazione del DNA dei contaminanti.
Il limite di rilevazione del metodo analitico, nel suo complesso, è determinato
non dalla parte più sensibile della procedura ma dalla meno sensibile.
Nella maggior parte dei casi questa è la dimensione del campione. Un
campione deve essere rappresentativo del lotto del prodotto da cui è stato
prelevato ed il piano di campionamento e la dimensione del campione
devono soddisfare i requisiti statistici in relazione all'omogeneità e al limite di
soglia fino al quale il risultato deve essere affidabile.
ION-Force DNA Extractor FAST (EXD001)
E' un kit progettato per massimizzare la resa e la purezza del DNA estratto da
matrici semplici o complesse (ricche di inibitori PCR). E' un sistema che
garantisce dati ripetibili e riproducibili in fase di rilevazione molecolare da
campioni contenenti minimi tracce di DNA contaminanti, grazie ai seguenti
viaggi:
• 1-4-ALL APPROACH permette l'estrazione da matrici vegetali e animali
• PROTOCOLLO SCALABILE consente l'estrazione di unità di
campionamento rappresentative
• RECUPERO DNA FRAMMENTATO permette di estrarre da matrici lavorate
• PURIFICAZIONE PROGRESSIVA consente la rimozione di inibitori PCR
presenti nelle matrici
• CONFORMITA’ alle indicazioni ISO in merito all’estrazione basata sul CTAB
CTABPreparazione
Campione
N-EsanoPulizia dei
Grassi opzionali
Diagramma 2 – Flusso di lavoro estrazione ION-Force DNA
PurificazioneBuffer E
ColonninaPulizia
DNAPer PCR
Farine di cereali e derivati
Semi di soia e derivati di lavorazione
Oli vegetali crudi e raffinati
Amidi e zuccheri
Farina di carne e ossa
Lecitina liquida e polvere
Uova e derivati
Verdure fresche
Verdure secche o in scatola
Caramelle di frutta
Succhi di frutta
Latte liquido e polverizzato
Latte, latticini e gelati
Carne (cruda o cotta)
Bevande
Torte e cioccolato
Toppings
Biscotti e snacks
Alimenti e mangimi estrusi
Cibi congelati
Alimenti a base di soia
Aromi e spezie
Condimenti per insalata
Würstel
Miele
Integratori dietetici
Alimenti per neonati
Tamponi superficiali
Acqua e acque reflue
Preparati per pasta
Salse a base di pomodoro
Tessuti
Tabella 3 – Elenco delle matrici estratte con successo utilizzando ION Force DNA Extractor e
ION-Spin DNA Prep One-for-All direttamente o dopo l'arricchimento dei media per l'analisi
microbiologica a valle
ION-Spin DNA Prep One-for-All (EXD018)
E' una versione miniaturizzata del kit ION-Force e condivide lo stesso flusso di
lavoro mostrato nel diagramma 2. Questo kit consente l'estrazione solo da
piccole quantità di materiale (fino a 1 grammo), ma necessita di pochissime
attrezzature di laboratorio (un piccolo blocco di riscaldamento e una
microcentrifuga).
ION-Spin DNA Prep One-for-All è il kit ideale per estrarre campioni
microbiologici da matrici "difficili" e offre diversi vantaggi:
• 1-4-ALL APPROACH permette l'estrazione di matrici vegetali e animali
• PROTOCOLLO SCALABILE permette l'estrazione di unità di
campionamento rappresentative
• RECUPERO DI DNA FRAMMENTATO consente l'estrazione da matrici
lavorate
• PURIFICAZIONE PROGRESSIVA consente la rimozione degli inibitori PCR
presenti nelle matrici
• CONFORMITA’ alle indicazioni ISO in merito all’estrazione basata sul CTAB
Il successo complessivo dei test in metodi molecolari dipende dall'isolamento
del DNA. Per molte ragioni diverse matrici e anche diversi campioni
producono diverse quantità di estratto di DNA per grammo.
La quantità di DNA definisce la rappresentazione e il contributo all'errore di
campionamento.
E' quindi conveniente per la misurazione del DNA ottenuto dopo l'estrazione,
normalizzare la quantità di DNA caricata in una reazione molecolare in
quanto la normalizzandolo:
• Si fornisce uniformità del test
• Si rispetta lo schema di campionamento
• Ci si conforma ai processi / test verificati
Migliora la robustezza dei test e il tasso di successo più elevato, quindi, a
lungo termine, riduce i costi e, in media, migliora il tempo di rotazione.
Infatti, anche se qPCR consente la normalizzazione in-assay, l'estrazione
normalizzata consente l'analisi semi-quantitativa .
Promega Quantus ™ (ACC2037) e il relativo
kit Quantifluor ™ dsDNA (ACC2038) sono il
metodo di scelta presso Generon per la
quantitazione del DNA.
