UJI KEMAMPUAN METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

UJI KEMAMPUAN METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS- DENSITOMETRI UNTUK MEMISAHKAN ASAM SALISILAT DAN EUGENOL

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh : Rosita Secoadi

NIM : 08 8114 166

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2012

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

UJI KEMAMPUAN METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS- DENSITOMETRI UNTUK MEMISAHKAN ASAM SALISILAT DAN EUGENOL

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh : Rosita Secoadi

NIM : 08 8114 166

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2012

i


Persetuj uan Pembim bing

UJI KEMAMPUAN METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPI$

DDNSITOMETRI UNTUK MEMISAHKAI\I

ASAM SALISILAT DAN EUGENOL

Skripsi yang diajukan oleh:

Rosita Secoadi

NIM: 08 81141,66

telah disetujui oleh:

Pembimbing

Jeffiy Julianus S

Tanggal 22Mei20l2


Pengesahan Skripsi Berjudul

UJI KEMAMPUAN METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPI$DENSITOMETRI UNTT'K MEMISAIIKAI\{

ASAM SALISILAT DAI\[ EUGENOL

Oleh:Rosita Secoadi

NIM : 08 8114 166

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji SkripsiFakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharmapada tanggal : 2A Jufi 2012

Mengetahui,Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Panitia Penguji:

l. Jeffry Julianus S.Farm., M.Si.

2. Lucia Wiwid Wijayanti, M. Si.

3. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt.

\\ ^ -=-\\\eA-4 p>......)..;.._.....;1r-

i l l

Djunarko S.Si., Apt.

Pembimbing,

' _-\

Jeffiry Julianus S.Farm., M.Si.


Halaman Persembahan

iv

Kupersembahkan Karya ini untuk:

Papi - Mami - Saudara-saudaraku Almamaterku Dunia Kesehatan Indonesia


PERI{YATAAI\ KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Apabila di kemudian hari diternukan indikasi plagiarisme dalam naskah

ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-

undangan yang berlaku.

Yogyakarta, 22 Mei 2012

Penulis

,.\ Q" C/,{'*Yl

1- /Rosita Secoadi


LEMBAR PERNYATAAI\ PERSETUJUAIY PTTBLIKASI KARYA ILMIAH

I]NTUK KEPENTINGAI\ AKADEMIS

Yang bertanda tangan dibawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :

Nama :Rosita Secoadi

Nomor Mahasiwa : 08 8114 166

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :

UJI KEMAMPUAN METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS-

DENSITOMETRI UNTUK MEMISAHKAN ASAM SALISILAT DAN

EUGENOL

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,

mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan

data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau

media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta izin dari saya

maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan rurma saya

sebagai penulis,

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada Tang gal : 22 Mei 2012

YngMenaatakan

vi

<-)

Rosita Secoadi


UJI KEMAMPUAN METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS-

DENSITOMETRI UNTUK MEMISAHKAN

ASAM SALISILAT DAN EUGENOL

INTISARI

Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Densitometri merupakan metode yang dikembangkan untuk penetapan kadar asam salisilat dan eugenol dalam sediaan krim topikal. Untuk memberikan hasil yang dapat dipercaya, maka metode ini perlu diuji kemampuannya dalam memisahkan kedua senyawa tersebut.

Penelitian ini merupakan penelitian non eksperimental-deskriptif. Asam salisilat dan eugenol dipisahkan dengan metode KLT dengan fase diam silika gel 60 F254 dan fase gerak toluena : etil asetat : metanol (65,2 : 2,4 : 32,4), serta dengan jarak pengembangan sejauh 15 cm. Setelah pemisahan senyawa dengan metode KLT, kemudian dilakukan analisis kuantitatif dengan densitometer pada panjang gelombang 288 nm. Parameter uji kemampuan metode yang diteliti adalah selektivitas, linearitas, perolehan kembali, presisi, dan range.

Hasil penelitian menunjukkan metode ini memiliki selektivitas dengan nilai α 5,825 dan nilai resolusi 5,125, dengan range pengukuran 1020 - 1224 ppm untuk asam salisilat dan 680 – 800 ppm untuk eugenol dan linearitas yang baik untuk asam salisilat dengan nilai r2 0,9972 dan untuk eugenol dengan nilai r2 0,9973, nilai rata-rata % recovery dan CV untuk level kadar rendah, sedang, dan tinggi berturut-turut adalah 98,4173% dan 2,3360%; 98,9914% dan 0,9778%; 98,9664% dan 0,8958% untuk asam salisilat, 100,5497% dan 1,0065%; 99,8064% dan 1,2278%; 99,7653% dan 0,8365% untuk eugenol. Berdasarkan hasil tersebut, maka metode KLT-densitometri ini memiliki kemampuan yang baik untuk memisahkan asam salisilat dan eugenol.

Kata kunci : KLT–Densitometri, asam salisilat, eugenol, uji kemampuan metode.

vii


viii

THE CAPABILITY TEST OF THIN LAYER CHROMATOGRAPHY -

DENSITOMETRY METHOD IN ORDER TO SEPARATE

SALICILIC ACID AND EUGENOL

ABSTRACT

Thin layer chromatography (TLC) densitometry method has been developed to separate a combination of salicylic acid and eugenol. To guarantees the method used provide reliable results, it is necessary to give a capability test to this methode.

In this non-experimental descriptive research, salicylic acid and eugenol were spotted on TLC silica gel F254 plates, which were developed with a mixture of toluene, ethyl acetate and methanol 65,2 : 2,4 : 32,4 (v/v). Quantitative spots at 288 nm.

The result showed α value 5,825, resolution value 5,125, linearity which is showed on coefficient of determination 0,9972 for salicylic acid and 0,9973 for eugenol. The mean recovery and CV value for low, medium and high level concentration respectively are 98,4173% and 2,3360%; 98,9914% and 0,9778%; 98,9664% and 0,8958% for salicylic acid, 100,5497% and 1,0065%; 99,8064% and 1,2278%; 99,7653% and 0,8365% for eugenol.

The densitometry method is selective, linear, precise, and have a good recovery. The quantitative testing shows that concentration of salicylic acid and eugenol range from 1020 ppm – 1224 ppm for salicylic acid and 680 ppm – 800 ppm for eugenol.

Keyword : TLC Densitometry, salicylic acid, eugenol, capability test.


PRAKATA

Puji Syukur dan terima kasih penulis haturkan kepada Tuhan Yang Maha

Esa atas segala berkat, rahmat, karunia dan penyertaan-Nya selama penelitian dan

penyusunan skripsi ini sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan

baik. Skripsi dengan judul: “Uji Kemampuan Metode Kromatografi Lapis Tipis-

Densitometri Untuk Memisahkan Asam Salisilat Dan Eugenol” ini disusun untuk

memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Program

Studi Ilmu Farmasi (S.Farm.) di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Dalam menyelesaikan skripsi ini, banyak dihadapi kesulitan. Namun, dengan

adanya bantuan dari berbagai pihak, baik berupa dukungan moril maupun

spirituil, maka pada akhirnya skripsi ini dapat diselesaikan dengan sebaik

mungkin. Dengan penuh kerendahan hati, maka penulis ingin mengucapkan rasa

terima kasih kepada :

1. Tuhan Yesus Kristus dan Bunda Maria yang selalu menyertai penulis.

2. Papi, Mami, Nana dan Dessy atas doa, dukungan, dan cinta kasihnya.

3. Ipang Djunarko M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

4. Jeffry Julianus S.Farm., M.Si., selaku dosen pembimbing yang dengan

sabar dan bijaksana selalu memberikan bimbingan dan pengarahan kepada

penulis, yang selalu ceria dengan canda tawanya ketika bimbingan.

5. Lucia Wiwid Wijayanti, M. Si., selaku dosen penguji atas kesediaannya

meluangkan waktu untuk menjadi penguji.

ix


6. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt., atas pengarahannya serta kesediaannya

meluangkan waktu untuk menjadi penguji.

7. Christine Patramurti S.Si., M.Si., Apt., atas pengarahannya serta

kesediaannya meluangkan waktu untuk memberikan masukan dan

semangat pada saya.

8. Seluruh dosen Fakultas Farmasi USD, atas ilmu yang diberikan dan

kebersamaan selama kuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma.

9. Seluruh staf laboratorium, staf kebersihan, dan staf keamanan Fakultas

Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Terutama Mas Bimo,

Pak Parlan, Mas Kunto, Mas Otok, dan Pak Ketul yang telah membantu

kelancaran penulis dalam menyelesaikan penelitian.

10. Edward Wijaya Setiawan, atas doa, dorongan, semangat, dan

perhatiannya.

11. Vica, Uchan, Satya, dan Sisca sahabat saya yang telah memberikan doa,

dukungan, bantuan, dan semangat serta pengalaman tak terlupakan selama

penelitian dan penyusunan skripsi. Terima kasih atas saran dan masukkan

yang diberikan.

12. Keluarga ‘DJUminten’, Sisca, Cici, Brian, Dimbex, Uchan, Vica, Aga dan

Satya, atas semangat, canda, tawa, semangat dan pengalaman yang tak

terlupakan selama di universitas ini.

13. Teman seperjuangan saya, Vica, dan Dhimas yang selalu setia menemani,

membantu, dan mendorong saya dalam menyelesaikan skripsi.

x


xi

14. Teman-teman Grup Antistres Paul, Hepi, Adi (Kimpul), Velly, Vica,

Dhimas, Uchan, Sasa, Satya, Yuni, Elisa, Novie, dan Ike sebagai teman

seperjuangan mengerjakan skripsi di Laboratorium Analisis Instrumental.

Terima kasih atas diskusi, semangat, cerita, canda-tawa, masukan, dan

kebersamaan selama kita bekerja bersama.

15. Teman-teman kelompok praktikum C2: Uchan, Sasa, Satya, Asti, Dian,

Tika, Yuni, atas kekompakkan, kebersamaan, dan kerja sama selama

kuliah, praktikum, dan di luar itu.

16. Sahabat-sahabatku dan teman-temanku yang lain atas segala doa dan

dukungannya.

17. Teman-Teman angkatan 2008, khususnya teman-teman FST atas suka

duka dan kebersamaannya.

18. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah

membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan dan penyelesaian skripsi ini

masih banyak terdapat kesalahan dan kekurangan mengingat keterbatasan

kemampuan dan pengetahuan penulis. Oleh karena itu, penulis mengharapkan

kritik dan saran yang membangun dari semua pihak. Akhir kata, semoga laporan

ini dapat berguna bagi pembaca.

Penulis


DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN .............................................................................. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................................... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................... v

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ................................................. vi

INTISARI ............................................................................................................. vii

ABSTRACT ............................................................................................................ viii

PRAKATA ............................................................................................................ ix

DAFTAR ISI ......................................................................................................... xii

DAFTAR TABEL ................................................................................................. xvi

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ xvii

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... xix

BAB I : PENDAHULUAN ................................................................................... 1

A. Latar Belakang .......................................................................................... 1

1. Rumusan Permasalahan ...................................................................... 3

2. Keaslian Penelitian .............................................................................. 3

3. Manfaat Penelitian .............................................................................. 4

B. Tujuan Penelitian ...................................................................................... 5

xii


BAB II : PENELAAHAN PUSTAKA ................................................................. 6

A. Asam Salisilat ........................................................................................... 6

B. Eugenol ..................................................................................................... 7

C. Kromatografi Lapis Tipis .......................................................................... 8

1. Fase Diam ........................................................................................... 10

2. Fase Gerak .......................................................................................... 12

3. Aplikasi (penotolan) ............................................................................ 14

4. Pengembangan .................................................................................... 15

5. Deteksi ................................................................................................ 15

D. Densitometri .............................................................................................. 16

E. Selektivitas (selectivity) ............................................................................ 18

F. Perolehan Kembali (recovery) .................................................................. 19

G. Ketelitian (precision) ................................................................................ 20

H. Linearitas (linearity) ................................................................................. 21

I. Rentang (range) ........................................................................................ 24

J. Landasan Teori .......................................................................................... 24

K. Hipotesis ................................................................................................... 25

BAB III : METODE PENELITIAN ..................................................................... 26

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ................................................................ 26

B. Variabel Penelitian .................................................................................... 26

C. Definisi Operasional ................................................................................. 27

xiii


D. Bahan Penelitian ....................................................................................... 27

E. Alat Penelitian ........................................................................................... 27

F. Tata Cara Penelitian .................................................................................. 28

1. Pembuat fase gerak ............................................................................. 28

2. Penjenuhan chamber ........................................................................... 28

3. Pengaktifan fase diam ......................................................................... 28

4. Pembuatan larutan baku asam salisilat ................................................ 29

5. Pembuatan larutan baku eugenol ........................................................ 29

6. Pembuatan larutan baku tunggal asam salisilat dan eugenol .............. 30

7. Pembuatan larutan baku campuran asam salisilat dan eugenol .......... 30

8. Penetapan panjang gelombang pengamatan ....................................... 30

9. Penetapan kurva baku asam salisilat dan eugenol dan pengamatan

nilai Retardation Factor (Rf) asam salisilat dan eugenol ................... 31

10. Penentuan selektivitas, uji perolehan kembali, presisi, linearitas, dan

rentang ................................................................................................. 31

G. Analisis Hasil ............................................................................................ 32

1. Selektivitas .......................................................................................... 32

2. Linearitas ............................................................................................. 32

3. Uji Perolehan Kembali ........................................................................ 32

4. Presisi .................................................................................................. 33

5. Rentang ............................................................................................... 33

xiv


xv

DA

BI

BAB IV : HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 34

A. Sistem Kromatografi ................................................................................. 34

B. Pembuatan Larutan Baku Asam Salisilat dan Eugenol ............................. 35

C. Penetapan Panjang Gelombang Pengamatan ............................................ 37

D. Analisis Kualitatif ..................................................................................... 40

E. Penetapan Kurva Baku .............................................................................. 45

F. Kemampuan Pemisahan ............................................................................ 49

1. Selektivitas .......................................................................................... 49

2. Uji Perolehan Kembali ........................................................................ 49

3. Presisi .................................................................................................. 52

4. Linearitas ............................................................................................. 54

5. Rentang ............................................................................................... 55

BAB V : KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................. 57

A. Kesimpulan ............................................................................................... 57

B. Saran ......................................................................................................... 57

FTAR PUSTAKA ........................................................................................... 58

LAMPIRAN .......................................................................................................... 62

OGRAFI PENULIS .......................................................................................... 101


DAFTAR TABEL

Tabel I. Adsorben yang Sering Digunakan pada KLT Berdasarkan Urutan

Kepolarannya ........................................................................................... 10

Tabel II. Nilai Indeks Polaritas Pelarut ................................................................. 13

Tabel III. Kriteria Penerimaan Persen Perolehan Kembali pada Konsentrasi

Analit yang Berbeda ............................................................................... 20

Tabel IV. Kriteria Penerimaan Presisi pada Konsentrasi Analit yang Berbeda..... 21

Tabel V. Hubungan dan Arah Koefisien Korelasi ................................................. 22

Tabel VI. Kekuatan Hubungan Berdasarkan Nilai Koefisien Korelasi ................. 23

Tabel VII. Perbandingan Nilai α dan Nilai Resolusi dan Rf pada Baku Asam

Salisilat dan Eugenol ............................................................................... 42

Tabel VIII. Data Replikasi Kurva Baku Asam Salisilat ....................................... 46

Tabel IX. Data Replikasi Kurva Baku Eugenol ..................................................... 46

Tabel X. Data % Recovery Asam Salisilat Tunggal .............................................. 51

Tabel XI. Data % Recovery Eugenol Tunggal ....................................................... 51

Tabel XII. Data % Recovery Campuran Asam Salisilat-Eugenol .......................... 52

Tabel XIII. Data % CV Asam Salisilat Tunggal .................................................... 53

Tabel XIV. Data % CV Eugenol Tunggal .............................................................. 53

Tabel XV. Data % CV Campuran Asam Salisilat-Eugenol ................................... 53

xvi


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Certificate of Analysis Baku Asam Salisilat ..................................... 63

Lampiran 2. Certificate of Analysis Baku Eugenol ............................................... 64

Lampiran 3. Data Pengambilan Bahan dan Perhitungan Konsentrasi Sebenarnya 64

Lampiran 4. Perhitungan Indeks Polaritas Fase Gerak ......................................... 68

Lampiran 5. Spektra Panjang Gelombang Asam Salisilat dan Eugenol dengan

Perbandingan 1,5 : 1 pada Tiga Tingkat Konsentrasi Rendah,

Sedang, dan Tinggi ......................................................................... 69

Lampiran 6. Standar Operasional Prosedur (SOP) Analisis Kuantitatif ............... 70

Lampiran 7. Densitogram Seri Kurva Baku Asam Salisilat Replikasi 1 .............. 71



Lampiran 10. Data Penentuan Kurva Baku Asam Salisilat .................................. 77

Lampiran 11. Persamaan Regresi Linear dan Gambar Grafik Seri Kurva Baku

Asam Salisilat ............................................................................... 78

Lampiran 12. Densitogram Seri Kurva Baku Eugenol Replikasi 1 ...................... 79



Lampiran 15. Data Penentuan Kurva Baku Eugenol ............................................ 85

xix


xx

Lampiran 16. Persamaan Regresi Linear dan Gambar Grafik Seri Kurva Baku

Eugenol ......................................................................................... 85

Lampiran 17. Densitogram Baku Tunggal Asam Salisilat (Uji kemampuan

metode) ......................................................................................... 87

Lampiran 18. Densitogram Baku Tunggal Eugenol (Uji kemampuan metode) .... 91

Lampiran 19. Densitogram Baku Campuran Asam Salisilat dan Eugnol (Uji

kemampuan metode) ..................................................................... 95

Lampiran 20. Perhitungan % Recovery dan CV Baku Tunggal dan Campuran

dari Asam Salisilat dan Eugenol ................................................... 99

Lampiran 21. Perhitungan Nilai α dan Resolusi Baku Tunggal dan Campuran ... 100


BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Asam salisilat dan eugenol merupakan bahan alam yang saat ini

penggunaannya semakin meningkat. Hal ini dapat dilihat dari maraknya produk-

produk farmasi yang mengandung komponen utama asam salisilat dan eugenol,

seperti krim-krim perawatan kulit dan masker wajah. Kedua senyawa ini akan

memberikan efek kulit yang makin halus dan bebas dari mikrobakteri.

Kedua senyawa ini merupakan kombinasi yang dapat memberikan efek

kulit yang makin halus dan bebas dari mikrobakteri, namun dalam dosis yang

tidak tepat asam salisilat dan eugenol dapat menyebabkan iritasi pada jaringan,

dan pada orang yang sangat sensitif dapat menyebabkan dermatitis (Duke, 1987).

Asam salisilat merupakan senyawa bahan alam golongan fenol yang telah

diproduksi secara sintetik dan memiliki aktifitas sebagai keratolitik, antiinflamasi

dan analgesik (Viswanatha, Kharat, Shylaja, and Lakshman, 2010). Senyawa ini

berbentuk serbuk berwarna putih dan tak berbau (Direktorat Jenderal Pengawasan

Obat dan Makanan RI, 1995).

Eugenol merupakan salah satu senyawa golongan fenol yang berasal dari

alam, yang merupakan komponen utama dari minyak cengkeh. Selain memiliki

harum yang khas, eugenol juga memiliki aktifitas sebagai analgesik (Thompson,

Norbeck, Olsson, Constantin-Teodosiu, Van der Zee, and Moldous, 1988).

Senyawa ini merupakan senyawa berwarna kuning pucat, berupa cairan jernih

yang akan berubah menjadi gelap apabila terpapar oleh cahaya, dan praktis tidak

1


2

larut air (European Pharmacopoeia Convention, 2005). Selain itu, eugenol juga

memiliki peran penting sebagai dasar pembuatan produk farmasi dan dapat

diproses menjadi isoeugenol, eugenol asetat dan vanilin (Harnani, 2010).

Dalam penelitian ini akan diteliti kemampuan dari Kromatografi Lapis

Tipis-Densitometri dalam memisahkan campuran asam salisilat dan eugenol.

Asam salisilat merupakan golongan fenol yang dapat memberikan efek

antiinflamsi, keratolitik dan analgesik. Eugenol merupakan senyawa golongan

fenol yang memberikan efek analgesik, bersifat antimikroba dan berbau harum.

Berdasarkan penjelasan di atas, dibutuhkan adanya metode untuk

memisahkan asam salisilat dan eugenol sehingga dapat diteliti kadarnya masing-

masing agar mutu dan keamanan dari produk tetap terjaga. Penjaminan mutu

berguna untuk menjamin khasiat dan keamanan produk. Dalam menganalisis

suatu campuran senyawa, dibutuhkan metode yang mampu memisahkan

campuran senyawa tersebut untuk dapat dilihat kadar dari masing-masing

senyawa dalam sampel.

Salah satu metode analisis yang dapat digunakan untuk memisahkan

asam salisilat dan eugenol adalah Kromatografi Lapis Tipis (KLT)-Densitometri.

KLT-Densitometri merupakan teknik pemisahan yang sederhana dimana

pelaksaannya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan kromatografi kolom

(Rohman, 2009). Kelebihan dari metode KLT-Densitometri adalah lebih fleksibel

dalam pemilihan fase gerak, memiliki berbagai macam teknik optimasi, dapat

diikuti dan dengan mudah dapat dihentikan kapan saja, serta dalam satu fase diam

dapat digunakan untuk mengamati pergerakan beberapa senyawa secara


3

bersamaan (Rohman, 2009). Disamping itu, KLT-Densitometri memiliki

ketepatan penentuan kadar yang lebih baik daripada Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi (KCKT) atau Kromatografi Gas Cair (KGC) karena komponen yang

ditentukan merupakan noda yang tak bergerak (Mulya dan Suharman, 1995).

Sebelum digunakan untuk diaplikasikan, metode ini perlu diuji

kemampuannya dalam memisahakan asam salisilat dan eugenol. Uji kemampuan

pemisahan kedua campuran senyawa dengan metode ini didasarkan pada

parameter selektivitas, akurasi, presisi, linearitas, dan rentang. Hal ini perlu

dilakukan untuk member gambaran tentang kemampuan pemisahan dari

Kromatografi Lapis Tipis – Densitometri dalam menganalisi campuran asam

salisilat dan eugenol.

1. Rumusan Permasalahan

Berdasarkan latar belakang di atas, maka dapat disusun permasalahan

sebagai berikut: apakah metode KLT-Densitometri dengan fase diam silika gel

60 F254 dan fase gerak toluena : etil asetat : metanol (65,2 : 2,4 : 32,4)

memiliki kemampuan pemisahan yang baik untuk memisahkan campuran

asam salisilat dan eugenol yang didasarkan pada parameter selektivitas,

perolehan kembali, presisi, linearitas, dan rentang?

2. Keaslian Penelitian

Beberapa penelitian analisis metil salisilat dan eugenol yang telah

dilakukan, yaitu Quantification of eugenol in Cinnamomum tamala nees and


4

eberm. Leaf powder by high-performance thin-layer chromatography oleh

Vidya V. Dighe, Atish A. Gursale, Ramesh T. Sane, Sasikumar Menon, and

Shvetali C. Raje (2005) dengan fase diam silika gel 60 F254 dan fase gerak

toluena : etil asetat : asam format (90 : 10 : 01), dideteksi dengan densitometri

pada λ=280nm dan Quantitative analysis of eugenol in clove extract by a

validated HPLC method oleh So-Mi Yun, Myoung-Heon Lee, Kwang-Jick

Lee, Hyun-Ok Ku, Seong-Wan Son, and Yi-Seok Joo (2010) dengan fase

diam XTerra RP18 column (250 x 4.6 mm id, 5 microm) dan fase gerak

isokratik metanol 60%, dideteksi pada λ=280nm.

Berdasarkan penelusuran pustaka yang telah dilakukan penulis,

penelitian tentang pemisahan asam salisilat dan eugenol dengan metode KLT-

Densitometri belum pernah dilakukan sebelumnya.

3. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan mempunyai manfaat sebagai berikut:

a. Manfaat Teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat membuktikan bahwa metode Kromatografi

Lapis Tipis-Densitometri mampu memisahkan asam salisilat dan eugenol.

b. Manfaat Metodologis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi bahwa metode

KLT-Densitometri dapat digunakan untuk memisahkan asam salisilat dan

eugenol dengan kemampuan pemisahan yang memenuhi persyaratan.


5

c. Manfaat Praktis

Penelitian ini diharapakan dapat digunakan untuk memisahkan campuran

asam salisilat dan eugenol.

B. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk memberikan gambaran tentang

kemampuan metode KLT-Densitometri dengan fase diam silika gel 60 F254 dan

fase gerak toluen : etil asetat : metanol (65,2 : 2,4 : 32,4) yang digunakan untuk

memisahkan campuran asam salisilat dan eugenol memiliki kemampuan

pemisahan yang baik yang didasarkan pada parameter selektivitas, uji perolehan

kembali, presisi, linearitas, dan rentang.


BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Asam Salisilat

Gambar 1. Struktur Asam Salisilat

Asam salisilat yang disebut juga 2-Hydroxybenzoic acid dapat ditemukan

pada buah-buahan seperti peach, berry dan strawberry, namun saat ini sudah

dapat dibuat secara sintesis (Rhodia, 2011). Senyawa ini berbentuk padat tak

berbau, berwarna putih dengan nilai pH pada saturated condition 2,4. Asam

salisilat memiliki nilai LD 50 melalui kulit sesuai dengan nilai LD50 tikus yaitu

1250 - 1580 mg/kg, memiliki massa molar 138,12 g/mol, nilai kelarutan dalam air

sekitar 2 g/L, nilai kerapatan 1.443 g/cm3 pada suhu 20 °C, dan memiliki nilai

titik didih 2110C dengan nilai tekanan uap sebesar 27 hPa pada suhu 2110C

(Merck, 2006). Selain itu, asam salisilat juga memiliki nilai konstanta Henry

sebesar 1,52 x 10-9 atm-m3/mol pada suhu 250C (RSC, 2012), dengan nilai Kow

2,26 (Vijon, 2008). Biasanya asam salisilat digunakan sebagai analgesik, obat

jerawat, produk perawatan wajah, dan pestisida (Environmental Protection Agency,

2005).

Nilai dari asam salisilat dalam 0,5 N natrium hidroksida (NaOH)

sebesar 260 pada λmaks 300 nm (Clarke, 1971). Asam salisilat merupakan serbuk

%

6


7

kristal putih atau berwarna, kristal asirkular, sedikit larut dalam air, mudah larut

dalam kloroform, eter dan etanol (96%), sedikit larut dalam metilen klorida

(European Pharmacopoeia Convention, 2005).

B. Eugenol

O

OH

Gambar 2. Struktur Eugenol

Komponen utama dari minyak cengkeh yaitu eugenol, merupakan senyawa

berbentuk cairan tidak berwarna atau kuning pucat dengan bobot molekul 164,20

g/mol. Senyawa ini memiliki bau cengkeh kuat, menusuk, dan rasa pedas. Bila

terpapar udara warna eugenol menjadi lebih gelap dan mengental. Kelarutan eugenol

baik dalam etanol, kloroform, eter, dan minyak lemak, namun sukar larut dalam air.

Nilai kelarutannya sebesar 1,85 mg/L pada air disuhu 200C dan lebih dari 25000

mg/L pada alkohol, etil asetat dan pelarut organik lain pada suhu 200C (BPDB,

2011). Bobot jenis eugenol antara 1,064 g/mL - 1,070 g/mL (Budavari, 2001). Nilai

Kow 2,7 dengan titik didih 2480C, serta memiliki nilai tekanan uap sebesar 1mmHg

pada suhu 78,40C (TCI America, 2008). Selain itu, eugenol juga memiliki nilai

konstanta Henry sebesar 0,24 Pa.m3/mol pada suhu 250C dan termasuk dalam

katagori cukup volatil (BPDP, 2011). Nilai dari eugenol dalam etanol

sebesar 406 dengan λmaks 231,5 nm dan 193 pada λmaks 282 nm (Clarke, 1971).

%

Eugenol merupakan fenol atau senyawa aromatis hidroksi (Tarigan, 2009).

Senyawa ini selain memiliki harum yang khas juga memiliki aktifitas sebagai


8

analgesik (Thompson et al., 1988). Disamping digunakan sebagai bahan penambah

aroma, eugenol juga mempunyai sifat stimulant, anestetik lokal, karminatif,

antiemetik, antiseptik dan antispasmodik yang digunakan dalam sabun, detergen,

pasta gigi, parfum dan produk farmasi. Penggunaan eugenol dalam produk

farmasi diantaranya balsam untuk mengurangi rasa nyeri, obat sakit gigi, dan

bahan campuran untuk menambal gigi (Nurdjannah, 2011).

Allylguaiacol atau yang lebih dikenal dengan eugenol merupakan

senyawa golongan fenol yang tak larut air, namun akan berubah menjadi bentuk

garam fenolik yang larut air oleh penambahan basa seperti NaOH dan kalium

hidroksida (KOH). Untuk menjamin kesempurnaan reaksi diperlukan pemanasan

dan atau pengadukan (Gearien and Grabowski, 1969).

C. Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh

suatu proses migrasi diferensial oleh sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih,

salah satu diantaranya bergerak secara kontinyu dalam arah tertentu dan zat-zat di

dalamnya menunjukkan perbedaan mobilitas karena adanya perbedan adsorpsi,

partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion. Dengan

pemisahan tersebut maka masing-masing zat dapat diidentifikasi atau ditetapkan

kadarnya dengan metode analitik (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan

Makanan RI, 1995). Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode pemisahan

komponen-komponen berdasar perbedaan adsorpsi dan partisi oleh fase diam


9

dibawah gerakan pelarut pengembang atau pelarut pengembang campur (Mulya

dan Suharman, 1995).

Kromatografi lapis tipis dapat digunakan untuk menguji kemurnian dari

campuran suatu senyawa. Hal ini berkaitan untuk pembuktian ada atau tidaknya

komponen yang dicari dan apakah komponen tersebut murni atau tidak.

Penggunaan secara khusus KLT adalah untuk mengetahui kemurnian senyawa

selama proses pemurnian. Hal ini dilakukan dengan cara membandingkan

senyawa hasil pemurnian dengan senyawa standarnya. Senyawa yang murni akan

memberikan bercak tunggal pada berbagai fase gerak dengan berbagai tingkat

kepolaran dan mempunyai harga Rf yang sama dengan senyawa standarnya

(Gasparic and Churacek, 1978).

Pada KLT, hasil yang diperoleh ditunjukkan dengan nilai Rf yang

menggambarkan migrasi relatif komponen senyawa terhadap pelarut dan

berhubungan dengan koefisien distribusi komponen. Beberapa variabel dapat

mempengaruhi nilai Rf, seperti komposisi pelarut, suhu, ukuran chamber, dan

lapisan sorbent (Braithwaite and Smith, 1999). Dalam analisis kuantitaif dengan

metode KLT, nilai Rf diharapkan berada antara 0,2 dan 0,8 (Kowalska, 2003).

R

(1)

Dalam pelaksanaannya, KLT lebih murah, lebih mudah, dan peralatannya

lebih sederhana dibandingkan dengan kromatografi kolom. Keuntungan lainnya

menurut Gandjar dan Rohman (2007) adalah sebagai berikut

a. Pemisahan analit dapat diidentifikasi dengan menggunakan pereaksi warna,

fluoresensi, atau radiasi menggunakan sinar UV


10

b. Elusi dapat dilakukan dengan cara menaik, menurun atau elusi 2 dimensi

1. Fase Diam

Dalam KLT, fase diam terdiri atas lapisan tipis adsorben yang

dipadatkan diatas lempengan solid sebagai lapiasan tipis dengan ketebalan

kurang lebih 0.25 mm kemudian sampel akan diaplikasikan di dekat salah

satu ujung fase diam dalam rupa spot/totolan kecil (Drenthe College The

Netherlands, 2011).

Lempeng fase diam ini sebaiknya disimpan dalam lingkungan yang

tidak lembab atau bebas dari uap laboratorium (Stahl, 1985). Sebelum

digunakan, lempeng adsorben perlu diaktifkan terlebih dahulu di dalam oven

dengan suhu 120o-150oC untuk menghilangkan air yang ada pada permukaan

adsorben. Jika temperatur yang digunakan terlalu tinggi dapat menonaktifkan

adsorben secara permanen (Braithwaite and Smith, 1999).

Tabel I. Adsorben yang Sering Digunakan pada KLT

Berdasarkan Urutan Kepolarannya (Gandjar dan Rohman, 2007)

Adsorben Tingkatan Kepolaran Alumina Paling polar

Paling non polar

Silika gel Magnesium silikat Selulosa Resin-resin polimerik

Makin meningkat

Fase diam yang umum ialah silika gel, aluminium oksida, kieselgur,

selulosa dan turunannya, dan lain-lain (Stahl, 1985). Silika gel adalah fase

diam yang paling banyak digunakan (Stahl, 1985). Silika gel GF254 artinya

silika tersebut mengandung gypsum (CaSO4½H2O) yang merupakan pengikat,

dengan cara meningkatkan gaya adhesi antara partikel senyawa dengan silika


11

dan juga meningkatkan gaya adhesi antar partikel silika. F254 adalah indikator

fosforesensi pada panjang gelombang 254 nm yang berarti silika tersebut

dapat berfosforesensi pada panjang gelombang 254 nm (Jork, 1990).

Semua silika gel adalah silikon dioksida dari sudut pandang kimia.

Masing-masing atom silikon dikelilingi oleh empat atom oksigen dengan

bentuk tetrahedron. Pada permukaan silika gel, elektron valensi dari oksigen

terhubungkan dengan hidrogen (Si-OH, gugus silanol) atau dengan atom

silikon lainnya (Si-O-Si, gugus siloksan). Gugus silanol mewakili pusat

permukaan adosorpsi-aktif yang mampu berinteraksi dengan molekul sampel.

Oleh karena itu, silika gel cocok sebagai fase diam di dalam kromatografi.

Kemampuan gugus silanol untuk bereaksi secara kimia dengan reagen yang

sesuai dapat digunakan untuk memodifikasi permukaan silika gel (Kowalska,

2003).

Gambar 3. Stuktur Silika Gel (Hauck and Mack, 1996)

Partikel silika gel mengandung gugus hidroksi pada permukaannya

yang akan membentuk interaksi hidrogen dengan molekul yang polar. Adanya

air yang teradsorbsi akan mencegah molekul polar untuk membentuk interaksi

hidrogen, sehingga silika gel harus diaktifkan dengan pemanasan untuk


12

menghilangkan air yang teradsorbsi (Christian, 2004). Kandungan air yang

ideal dalam silika adalah antara 11-12 % b/b (Rohman, 2009).

2. Fase Gerak

Proses KLT dapat diubah-ubah dengan memodifikasi fase diam atau

dengan mengubah kepolaran fase gerak yang digunakan, dimana mengubah

kepolaran fase gerak lebih mudah dilakukan. Polaritas fase gerak diubah

dengan cara menambahkan fase gerak lain sehingga diperoleh kepolaran yang

tepat untuk memisahkan campuran senyawa. Kepolaran fase gerak yang

digunakan untuk mengelusi harus disesuaikan berdasarkan kemampuannya

bersaing dengan permukaan fase diam untuk berinteraksi dengan molekul

yang terlarut (Gritter, Bobbit, and Scharting, 1991). Semakin besar indeks

polaritas yang dimiliki pelarut maka pelarut semakin polar dan semakin besar

eluotropic values dari pelarut menunjukkan semakin mudah untuk mengelusi

sampel (Snyder, Kirkland, and Glajch, 1997).

Polaritas fase gerak dapat mempengaruhi separasi/pemisahan. Untuk

itu perlu dicari suatu komposisi fase gerak yang mampu memberikan pemisahan

yang baik (Anonim, 2011a). Biasanya pemilihan pelarut yang digunakan untuk

analisis dengan metode KLT, harus dapat melarutkan analit dengan sempurna,

mudah menguap, viskositas rendah, serta dapat membasahi lapisan penyerap

(Sherma and Fried, 1996).

Dalam penentuan fase gerak melalui proses trial and error ini, perlu

memperhatikan sifat polaritas solut. Semakin polar solut maka semakin

tertahan kuat ke dalam adsorben polar. Solut-solut non polar tidak mempunyai


13

afinitas atau mempunyai sedikit afinitas yang kecil terhadap adsorben polar,

sementara solut-solut yang terpolarisasi memiliki afinitas yang kecil terhadap

adsorben polar disebabkan adanya interaksi dipol atau interaksi-interaksi yang

diinduksi oleh dipol. Solut-solut polar, terutama yang mampu membentuk

ikatan hidrogen, akan terikat kuat pada adsorben karenanya butuh fase gerak

yang relatif polar untuk mengelusinya (Gandjar dan Rohman, 2007).

Tabel II. Nilai Indeks Polaritas Pelarut Menurut Snyder, et al. (1997)

Pelarut Indeks Polarits

Nilai Eluotopik UV cut off (nm) Alumina C18 Silika Gel

Heksana 0,1 0,01 - 0,00 195 Sikloheksana 0,2 0,004 - - 200

Toluena 2,4 0,29 - 0,22 284 Tetrahidrofuran 4,0 0,45 3,7 0,53 212

Etil Asetat 4,4 0,58 - 0,48 256 Aseton 5,1 0,56 8,8 0,53 330 Metanol 5,1 0,95 1,0 0,7 205

Asetonitril 5,8 0,65 3,1 0,52 190 Dimetilformamida 6,4 - 7,6 - 268 Dimetilsulfoksida 7,2 0,62 - - 268

Air 10,2 - - - 190 .

Fase gerak yang telah dibuat kemudian dimasukkan ke dalam

chamber. Dalam rangka menjaga reprodusibilitas dari hasil pengelusian, udara

yang ada di dalam chamber harus terjenuhkan oleh fase gerak. Hal ini dapat

dilakukan dengan menyiramkan fase gerak di sekeliling chamber sebelum

memasukkan plate kemudian dijaga kejenuhannya dengan kertas saring dan

menjaga agar chamber tetap tertutup sepanjang waktu pengelusian sampai

plate akan diambil (Anonim, 2011b). Bila ada ruang tak jenuh di balik

lempeng, kecepatan penguapan pelarut pada bagian tepi lempeng akan lebih


14

besar daripada bagian tengah lempeng, yang berarti angka Rf di tepi akan lebih

besar dan memberi pengaruh batas (batas elusi akan tampak melengkung ke

bawah di bagian tengah lempeng). Hal ini menyebabkan penurunan harga Rf

di bagian tengah lempeng, efeknya dapat ditekan dengan menjenuhkan

chamber dengan bantuan kertas saring (Munson, 1984).

3. Aplikasi (penotolan)

Campuran yang akan dipisahkan, biasanya dibuat menjadi bentuk

larutan, ditotolkan dalam bentuk bercak atau pita. Setelah itu, plat diletakkan

di dalam bejana tertutup rapat yang berisi fase gerak yang cocok, pemisahan

terjadi selama pengembangan (Stahl, 1985). Pelarut cuplikan harus sedapat

mungkin merupakan pelarut yang mudah menguap dan juga sedapat mungkin

memiliki poleritas yang rendah (Sastrohamidjojo, 2005).

Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh

hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil mungkin dan

sesempit mungkin. Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain, jika

sampel yang digunakan terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi. Hasil

penelitian menunjukkan bahwa penotolan sampel secara otomatis lebih dipilih

daripada penotolan secara manual terutama jika sampel yang akan ditotolkan

lebih dari 15 μL. Penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak

yang menyebar dan puncak ganda (Gandjar dan Rohman, 2007).

Untuk memperoleh reprodusibilitas, volum sampel yang ditotolkan

paling sedikit 0,5 μL. Jika volum sampel yang akan ditotolkan lebih besar dari

2-10 μL maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan


15

pengeringan antar totolan (Rohman, 2009). Penempatan spot di atas plat kira-

kira 1 cm dari salah satu ujung di mana ujung ini nanti dicelupkan dalam

pelarut pengembang dan spot masing-masing diaplikasikan pada jarak kira-

kira 1cm dari masing-masing pusat spot (Sastrohamidjojo, 2005).

4. Pengembangan

Ada beberapa teknik pengembangan dalam KLT, seperti

pengembangan ascending, pengembangan descending, dan pengembangan

dua dimensi. Teknik pengembangan yang sering dipakai adalah teknik

pengembangan ascending dimana ujung bawah lempeng yang terdapat spot-

spot analit dicelupkan dalam pelarut pengembang (Rohman, 2009).

Jarak pengembangan fase gerak biasanya kurang lebih 10-15 cm,

akan tetapi beberapa ahli kromatografi memilih mengembangkan lempeng

pada jarak 15-20 cm (Rohman, 2009). Untuk plat ukuran 20 x 20 cm, jarak

pengembangan maksimal yang dapat dilakukan adalah 0,5 cm dari ujung atas

plat (19,5 cm) (Sastrohamidjojo, 2005).

5. Deteksi

Biasanya untuk visualisasi cukup mudah, karena ada beberapa

senyawa organik yang bewarna, jika beruntung senyawa yang dipisahkan

adalah senyawa organik bewarna seperti dyes dan tinta, sehingga tidak

membutuhkan bantuan visualisasi khusus. Namun, kebanyakan senyawa

organik tidak berwarana sehingga metode visualisasi diatas tidak berlaku.

Sehingga digunakan lampu UV untuk melihat bercak yang muncul pada plat

dengan menggunakan indikator fluoresensi yang akan membuat plat KLT


16

menjadi berpenjar kehijauan dibawah lampu UV 254 nm (Anonim, 2011a).

Pengukuran kromatogram KLT kebanyakan dilakukan pada kisaran panjang

gelombang UV rendah (190 nm-300 nm). Pada alat yang lebih modern seperti

densitometri dapat dilakukan scanning pada permukaan lempeng (Rohman,

2009).

D. Densitometri

Densitometri merupakan metode analisis instrumental yang mendasarkan

pada interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak pada

plat KLT. Metode ini lebih dititikberatkan untuk analisis kuantitatif analit-analit

dengan kadar kecil, yang mana diperlukan pemisahan terlebih dahulu dengan

KLT (Rohman, 2009). Metode densitometri mempunyai cara kerja yang

sederhana dan cepat (Gritter et al., 1991).

Pada metode densitometri diperlukan adsorben dan fase gerak yang

murni. Untuk memperoleh hasil yang baik, umumnya digunakan adsorben siap

pakai yang telah mengalami pra pencucian (Gritter et al., 1991). Teknik

pengukuran pada densitometri dapat didasarkan atas pengukuran intensitas sinar

yang diserap (absorbansi), intensitas sinar yang dipantulkan (reflectance) atau

intensitas sinar yang dipendarkan (fluorescence) (Gandjar dan Rohman, 2007).

Pada densitometri absorbsi, bercak pada lempeng KLT dipindai oleh

seberkas sinar monokromatik dalam bentuk slit dengan panjang slit yang dapat

diatur panjang dan lebarnya (Rohman, 2009) disesuaikan dengan diameter dari

bercak yang paling luas (Pradyot, 2004). Sumber sinar dari densitometer akan


17

bergerak di atas bercak pemisahan pada lempeng kromatografi. Lempeng akan

digerakkan menyusuri berkas sinar yang berasal dari sumber sinar tersebut

(Sudjadi, 1988).

Beberapa TLC scanner sudah dilengkapi dengan alat pemroses data,

sehingga integrasi luas puncak atau tinggi puncak dapat langsung direkam atau

tercatat sebagai data sekaligus dengan densitogramnya dan dapat pula dicatat

langsung sebagai kadarnya, dengan teknik pemrograman tertentu (Mintarsih, 1990).

Penetapan kadar suatu senyawa dengan metode KLT-densitometri

dilakukan dengan mengukur kerapatan bercak senyawa yang dipisahkan dengan

cara KLT. Pada umumnya pengukuran kerapatan bercak tersebut dibandingkan

dengan kerapatan bercak senyawa standar yang dielusi bersama (Hardjono, 1985).

Ada dua cara penetapan kadar dengan alat densitometer. Pertama, setiap

kali penetapan ditotolkan sediaan baku dari senyawa yang bersangkutan dan

dielusi bersama dalam suatu lempeng, lalu AUC (Area Under Curve) sampel

dibandingkan dengan harga AUC zat baku. Yang kedua, dengan membuat kurva

baku hubungan antara jumlah zat baku dengan AUC. Kurva baku dibuat dengan

menotolkan zat baku pada plat KLT dengan berbagai macam konsentrasi. AUC

yang diperoleh dibuat persamaan garis lurus y=bx+a, dimana x adalah konsentrasi

yang diperoleh sedangkan y adalah besarnya AUC (Sudjadi, 1988).

Penelusuran bercak dapat dilakukan secara horisontal maupun vertikal

(scanning horizontal atau scanning vertical). Penelusuran bercak secara horisontal

dapat dilakukan satu persatu, atau apabila satu plat bercak yang diperoleh segaris

semua maka dapat dilakukan penelusuran untuk semua bercak sekaligus.


18

Sedangkan cara penelusuran vertikal, hanya dapat dilakukan satu per satu. Pada

penelusuran bercak horisontal dengan penelusuran beberapa bercak sekaligus

hanya dapat dilakukan apabila bercak-bercak tesrsebut benar-benar berada dalam

satu baris. Cara ini akan mengalami kesulitan jika bercak yang sangat dekat

dengan bercak yang akan ditetapkan, karena ada kemungkinan bercak yang tidak

diinginkan ikut tertetapkan (Mintarsih, 1990). Semakin kecil dan intensif suatu

bercak, akan dihasilkan suatu puncak kurva absorbsi yang sempit dan tajam,

sebaliknya bercak yang lebar akan menghasilkan puncak kurva absorbsi yang

lebar dan tumpul (Sudjadi, 1988).

E. Selektivitas (selectivity)

Selektivitas suatu metode analisis adalah kemampuan untuk

mengukur analit secara cermat dan seksama dengan adanya komponen yang

mungkin ada dalam matrik sampel (Yuwono dan Indrayanto, 2005).

Selektivitas sering dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan metode

terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran,

produk degradasi, senyawa sejenis, dan senyawa asing lain (Harmita, 2004).

Gambar 4. Simulasi Pemisahan Antara Dua Puncak


19

Gambar 4 merupakan suatu simulasi pemisahan puncak kromatografi

antara dua kurva Gaussian identik, yang terpisah secara perlahan-lahan. Dapat

dilihat bahwa nilai resolution factor (R) akan sesuai dengan diagram. Dimana

nilai R = 0,75 kedua puncak masih berhimpit sekitar 65%, pada R = 1, kedua

puncak masih berhimpit sekitar 27%, dan pada R=1,5 kedua puncak dapat

dianggap telah akan mencapai baseline dimana kedua puncak hanya berhimpit

sekitar 2% (Rouessac and Rouessac, 2007).

Selektivitas pada metode kromatografi dapat ditunjukkan melalui

nilai α (separation factor) dan nilai resolusi (daya pisah) antara analit yang

dituju dengan pengganggu lainya harus > 1,5 (Gandjar dan Rohman, 2007).

Harga R > I,5 disebut baseline resolution, yaitu pemisahan sempurna dari dua

puncak dengan ukuran yang sama (Pecsok, Shield, Cairns and McWilliam,

1976). Sedangkan α merupakan kemampuan fase diam dalam memisahkan

dua komponen A dan B, dimana komponen B adalah komponen yang labih

kuat teretensi. Nilai α dinyatakan sebagai rasio relatif dari kedua komponen

yang terpartisi atau terdistribusi. Separation factor (α) merupakan fungsi dari

retensi relatif dari masing-masing komponen terhadap fase diamnya

(Braithwait and Smith, 1999).

F. Perolehan Kembali

Perolehan kembali (recovery) dapat digunakan untuk menyatakan

ketepatan dari metode. Ketepatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat

kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. (Harmita,

2004). Disarankan penggunaan minimal 3 replikasi pada setiap 3 konsentrasi


20

yang diambil dari rentang uji (The British Pharmacopoeia Commission, 2011).

Kriteria penerimaan persen (%) perolehan kembali tertera pada tabel III:

Tabel III. Kriteria Penerimaan Akurasi pada Konsentrasi Analit yang Berbeda (Huber, 2003)

Kadar Analit (%) Analyte Ratio Unit Mean Recovery (%) 100 1 100 % 98 - 102 ≥ 10 101 10 % 98 - 102 ≥ 1 102 1 % 97 - 103 ≥ 0,1 103 0,1 % 95 - 105 0,01 104 100 ppm 90 - 107 0,001 105 10 ppm 80 - 110 0,0001 106 1 ppm 80 - 110 0,00001 107 100 ppb 80 - 110 0,000001 108 10 ppb 60 - 115 0,0000001 109 1 ppb 40 -120

G. Ketelitian (precision)

Pesisi atau keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat

kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil

individual dari rata-rata jika prosedur ditetapkan secara berulang pada sampel-

sampel yang diambil dari campuran yang homogen (Harmita, 2004).

Presisi biasanya dinyatakan dalam koefisien variasi (KV). Suatu

metode dapat dinyatakan memiliki presisi yang baik apabila memiliki KV < 2

% tetapi kriteria ini fleksibel tergantung dari kondisi analit yang diperiksa,

jumlah sampel dan kondisi laboratorium (Harmita, 2004).

Ketelitian adalah derajat kesesuaian antara hasil uji individual yang

diperoleh dari pengambilan sampel yang berulang suatu sampel yang

homogen dengan menggunakan suatu metode analisis. Presisi umumnya

dinyatakan dengan coefficient of variation (CV) atau standar deviasi relatif


21

(RSD), seperti yang tertera pada tabel IV (United States Pharmacopeial

Convention, 2005):

Tabel IV. Kriteria Penerimaan Presisi pada Konsentrasi Analit yang Berbeda (Huber, 2003)

Kadar Analit (%) Analyte Ratio Unit CV (%) 100 1 100 % 1,3 10 101 10 % 1,8 1 102 1 % 2,7 0,1 103 0,1 % 3,7 0,01 104 100 ppm 5,3 0,001 105 10 ppm 7,3 0,0001 106 1 ppm 11 0,00001 107 100 ppb 15 0,000001 108 10 ppb 21 0,0000001 109 1 ppb 30

H. Linearitas (Linearity)

Linearitas adalah kemampuan metode untuk memberikan respon

yang proporsional terhadap konsentrasi analit di dalam sampel (Snyder et al.,

1997). Parameter ini biasanya dinyatakan dalam istilah variansi sekitar arah

garis regresi yang dihitung berdasarkan persamaan matematik data yang

diperoleh dari hasil uji analit dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit

(Harmita, 2004). Pada penentuan linearitas digunakan tiga sampai enam

replikasi dari lima atau lebih standar dengan konsentrasi yang terdapat dalam

rentang 80-120% dari expected concentration range (Hurber, 2003).

Penggambaran linearitas secara visual biasanya dilakukan dengan

memplotkan signal yang muncul sebagai fungsi dari konsentrasi analit.

Apabila terdapat hubungan yang linier, hasil uji harus dievaluasi dengan


22

bantuan metode statistik, misalnya dengan perhitungan garis regresi (The British

Pharmacopoeia Commission, 2011).

Koefisien korelasi, y-intercept, dan kemiringan garis regresi (slope)

harus dihitung. Sebagai tambahan, plot data harus digambarkan. Analisis

penyimpangan titik data aktual dari garis regresi juga dapat membantu untuk

mengevaluasi linearitas (The British Pharmacopoeia Commission, 2011).

Korelasi tidak membutuhkan variabel bebas. Dengan korelasi, dua

atau lebih variable dapat dibandingkan dan ditentukan apakah memiliki

hubungan, serta dapat diukur kekuatan dari hubungan tersebut. Korelasi hanya

menggambarkan hubungan kekuatan antara 2 variabel x dan y. Koefisien

korelasi (r) merupakan indeks matematika yang mendifinisikan dengan tepat

ukuran kekuatan dari hubungan tersebut. Secara umum, y merupakan nilai

variabel tergantung yang di plotkan pada aksis vertical grafik, disebut ordinat

dan x merupakan nilai variabel bebas yang diplotkan pada aksis horisontal

grafik, disebut absis (De Muth, 1999).

Tabel V. Hubungan dan Arah Koefisien Korelasi Koefisien Korelasi Korelasi

+ 0,1 Perfect Positive Correlation 0,0 No Correlation

- 0,1 Perfect Negative Correlation

Apabila terdapat perfect correlation (nilai koefisien korelasi +1,0

atau -1,0), maka semua titik data akan terdapat dalam suatu garis lurus. Makin

besar interval perubahan y pada interval tetap x, maka makin curam

kemiringan garis. Pada hubungan korelasi yang kurang sempurna antara 2


23

variabel (nilai koefisien korelasi mendekati 1), titik-titik data akan berada di

dekat garis. Semakin nilai koefisien korelasi mendekati 0, deviasi titik data

akan semakin jauh dari garis (De Muth, 1999).

Tabel VI. Kekuatan Hubungan Berdasarkan Nilai Koefisien Korelasi Koefisien Korelasi

Kekuatan Hubungan Menurut Guilford (1956) Menurut Roundtree (1981)

< 0,20 Sedikit, hampir tidak ada hubungan Sangat lemah, dapat diabaikan 0,20 – 0,40 Rendah, definite but small Lemah, rendah 0,40 – 0,70 Cukup, subtansial Moderate, cukup 0,70 – 0,90 Tinggi, marked Kuat, tinggi, marked

> 0,90 Sangat tinggi, Sangat kuat, sangat tinggi

Regresi liner merupakan suatu metode statistik untuk mengevaluasi

bagaimana pengaruh satu atau lebih variabel bebas (predictor) pada satu

continuous dependent variable (respon) melalui suatu hubungan linear.

Regresi linier melibatkan suatu garis lurus atau fungsi linier. Garis ini

merupakan estimasi dari data sampel. Analisis dengan regresi linier dilakukan

dengan menggambarkan garis yang tepat diantara titik-titik data. Dari sini

kemudian akan diketahui kemiringan garis dan nilai dari y-interceptnya yang

kemudian dapat digunakan untuk perhitungan, dirumuskan dengan y=Bx+A.

Dimana y adalah variabel tergantung, B adalah nilai slope (kemiringan) garis,

x adalah variabel bebas dan A adalah y-intercept (De Muth, 1999).

Hubungan antara titik-titik data dengan garis linier dari regresi linier

disebut dengan koefisien determinasi (r2). Koefisien determinasi dapat

didefinisikan sebagai kedekatan tiap titik data pada garis linier. Semakin dekat

titik-titik data dengan garis linier, semakin kuat hubungan korelasinya.

Artinya semakin nilai r2 mendekati 1, maka semakin linier data tersebut (titik-


24

titik data berhimpit dengan garis). Faktanya, akar dari koefisien determinasi

adalah koefisien korelasi (r = √r2) (De Muth, 1999). Suatu metode memiliki

linearitas yang baik jika nilai koefisien determinasi (r2) ≥ 0,997 (Chan, 2004).

I. Rentang (range)

Rentang dalam suatu metode analisis merupakan interval antara

konsentrasi analit tertinggi dan konsentrasi analit terendah yang memenuhi

persyaratan linearitas, % perolehan kembali, dan presisi. Dalam suatu assay

biasanya menggunakan rentang tidak kurang dari 80%-120% dari konsentrasi

sampel dan untuk penetapan keseragaman kadar biasanya digunakan rentang

tidak kurang dari 70%-130% (The British Pharmacopoeia Commission, 2011).

J. Landasan Teori

Metode KLT densitometri dapat digunakan untuk memisahkan

beberapa campuran asam salisilat dan eugenol karena adanya perbedaan

interaksi dan partisi antara senyawa-senyawa tersebut dengan fase diam dan

fase gerak yang digunakan. Metode ini memberikan fleksibilitas yang tinggi

dalam pemilihan fase gerak.

Hasil optimasi metode pemisahan asam salisilat dan eugenol dengan

metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)-Densitometri dengan fase diam silika

gel 60 F254 dan fase gerak toluen : etil asetat : metanol (65,2 : 2,4 : 32,4) yang

sebelumnya telah dilakukan menghasilkan pemisahan peak yang optimum dan

dapat memisahkan kedua senyawa (Ediningtyas, 2012). Senyawa yang benar-


25

benar terpisah akan memudahkan pengukuran kuantitatif dari respon yang

dihasilkan tetapi hasil optimasi ini tidaklah cukup menjamin metode ini baik

bila diaplikasikan pada penetapan kadar. Oleh karena itu perlu dilakukan uji

kemampuan pemisahan pada metode ini.

Parameter uji kemampuan pemisahan didasarkan antara lain pada

selektivitas, ulangan standart, presisi,dan linearitas. Dalam hal ini, selektivitas

akan dianalisis berdasarkan perbandingan nilai Rf kedua campuran, yang

ditunjukkan dengan nilai α > 1 dan nilai resolusi > 1,5, linearitas dianalisis

berdasarkan koefisien determinasi (r2) ≥ 0,997, untuk asam salisilat perolehan

kembali dianalisis berdasarkan mean % recovery antara 98 - 102% dan presisi

dianalisis berdasarkan CV (Coefficient of Variation) ≤ 1,8%, sedangkan untuk

eugenol ulangan standart dianalisis berdasarkan mean % recovery antara 97-

103% dan presisi dianalisis berdasarkan CV ≤ 2,7%.

K. Hipotesis

Berdasarkan landasan teori di atas, dapat disusun hipotesis bahwa

metode analisis Kromatografi Lapis Tipis (KLT)–Densitometri yang

dikembangkan untuk analisis pemisahan asam salisilat dan eugenol dengan

fase diam silika gel 60 F254 dan fase gerak toluen : etil asetat : metanol (65,2 :

2,4 : 32,4) memiliki kemampuan pemisahan yang baik berdasarkan parameter

selektivitas, uji perolehan kembali, presisi, linearitas, dan rentang.


BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian non-eksperimental dengan

rancangan penelitian deskriptif, karena dalam penelitian ini tidak dilakukakn

manipulasi terhadap subyek uji, penelitian hanya mendeskripsikan keadaan yang

ada.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah metode yang digunakan untuk

melakukan analisis yaitu sistem KLT yang telah dioptimasi, dengan fase diam

silika gel 60 F254 dan fase gerak toluena : etil asetat : metanol (65,2 : 2,4 : 32,4).

2. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah parameter uji kemampuan

metode yaitu selektivitas, uji perolehan kembali, presisi, linearitas, dan

rentang.

3. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah

a. Pelarut, untuk mengatasinya digunakan pelarut pro analysis (p.a) yang

memiliki kemurnian tinggi.

b. Senyawa baku yang digunakan, untuk mengatasinya digunakan senyawa

baku yang memiliki Certificate of Analysis (CoA).

26


27

c. Paparan cahaya terkait dengan sifat eugenol yang sedikit fotosensitif,

untuk mengatasinya pada saat preparasi semua peralatan gelas yang akan

digunakan dilapisi dengan aluminium foil.

C. Definisi Operasional

1. Sistem KLT yang digunakan dalam penelitian adalah fase diam silika gel 60

F254 dan fase gerak toluena : etil asetat : metanol (65,2 : 2,4 : 32,4).

2. Kadar asam salisilat dan eugenol dinyatakan dalam part per million (ppm).

3. Parameter uji kemampuan metode yang digunakan yaitu selektivitas, uji

perolehan kembali, presisi, linearitas, dan rentang.

D. Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah asam slisilat for

synthesis (E. Merck, kemurnian 99,8%), eugenol for R&D (Sigma-Aldrich,

kemurnian 99%), metanol pro analysis (E. Merck), etanol pro analysis (E.

Merck), toluen pro analysis (E. Merck), etil asetat pro analysis (E. Merck), plat

KLT silika gel 60 F254 (E. Merck).

E. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat

komputer merek HP xw4600 Workstation s/n : SGH75203QM, p/n : RV724AV,

OS : GH544AV Linux, printer Canon BJC-255SSP Color bubble Jet Printer,

seperangkat alat densitometer (CAMAG TLC Scanner 3 CAT. No. 027.6485 SER.

No.160602), autosampler (CAMAG Linomat 5 CAT. No. 027.7808. SER. No.


28

170610), Syringe (CAMAG Linomat Syringe 695.0014), UV lamp cabinet

(CAMAG), perangkat lunak WinCats (V.1.4.4), chamber (DESAGA, Germany

dimensi 23x23x10 cm), Oven (Marius Instrumenten, postbus 7018-3502 Utrecht,

Hollantlaan 18-3526 Am utrech), mikropipet 100-1000 µL (Socorex ACURA

825), neraca analitik (Ohaus SN 8331120093; PAJ 1003; N13123;MC 173467;

max 1050 ct; readability 0,001 ct), dan seperangkat alat-alat gelas (Pyrex Iwaki

dan Herma).

F. Tata Cara Penelitian

1. Pembuatan Fase Gerak

Fase gerak yang dibuat adalah fase gerak yang telah didapat dari hasil optimasi

pada penelitian sebelumnya yaitu toluena : etil aseat : metanol (65,2 : 2,4 :

32,4). Fase gerak ini dibuat sebanyak 25 mL menggunakan prinsip volume

portion dengan teknik doubling (Shimadzu corporation, 2012).

2. Penjenuhan Chamber

Chamber dimensi 23x23x10 cm diisi dengan fase gerak yang telah dibuat

kemudian dijenuhkan dengan bantuan kertas saring (Munson, 1984). Kondisi

chamber dikatakan telah terjenuhkan apabila kertas saring telah terbasahi

seluruhnya oleh fase gerak.

3. Pengaktifan Fase diam

Fase diam berupa plat KLT silika gel 60 F254 dipanaskan dalam oven selama

30 menit dengan suhu optimal 1200C (Braithwait and Smith, 1999).


29

4. Pembuatan larutan baku asam salisilat

a. Pembuatan larutan stok asam salisilat 20000 ppm

Serbuk baku asam salisilat ditimbang sebanyak 0,2004 gram kemudian

dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL. Serbuk tersebut kemudian

dilarutkan dengan etanol p.a hingga tanda dan digojog agar homogen.

b. Pembuatan seri larutan baku asam salisilat 816; 884, 952, 1020; 1088,

1156 dan 1224 ppm

Larutan stok asam salisilat 20000 ppm diambil sebanyak 204, 221, 238,

255, 272, 289 dan 306 μL menggunakan mikropipet kemudian masing-

masing dimasukkan ke dalam labu takar 5 mL. Larutan tersebut

diencerkan dengan etanol p.a hingga tanda dan digojog agar homogen.

Seri larutan baku dibuat sebanyak tiga replikasi.

5. Pembuatan larutan baku eugenol

a. Pembuatan larutan stok eugenol 20000 ppm

Larutan baku eugenol diambil sebanyak 189 μL menggunakan mikropipet

kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL dan dilarutkan dengan

etanol p.a hingga tanda dan digojog agar homogen.

b. Pembuatan seri larutan baku eugenol 560, 600, 640, 680, 720, 760 dan

800 ppm

Larutan stok eugenol 20000 ppm diambil sebanyak 140, 150, 160, 170,

180, 190 dan 200 μL menggunakan mikropipet kemudian masing-masing

dimasukkan ke dalam labu takar 5 mL. Larutan tersebut diencerkan


30

dengan etanol p.a hingga tanda dan digojog agar homogen. Seri larutan

baku dibuat sebanyak tiga replikasi.

6. Pembuatan larutan baku tunggal asam salisilat dan eugenol

a. Pembuatan larutan baku tunggal asam salisilat

Larutan stok baku asam salisilat diambil sebanyak 204, 255 dan 306 μL

menggunakan mikropipet kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 5

mL. Larutan tersebut diencerkan dengan etanol p.a hingga tanda dan

digojog agar homogen. Seri larutan baku dibuat sebanyak lima replikasi.

b. Pembuatan larutan baku tunggal eugenol

Larutan stok baku eugenol diambil sebanyak 140, 170 dan 200 μL

menggunakan mikropipet kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 5 mL.

Larutan tersebut diencerkan dengan etanol p.a hingga tanda dan digojog

agar homogen. Larutan baku tungal dibuat sebanyak lima replikasi.

7. Pembuatan larutan baku campuran asam salisilat dan eugenol

Larutan stok baku asam salisilat diambil sebanyak 204, 255 dan 306 μL dan

larutan stok baku eugenol diambil sebanyak 140, 170 dan 200 μL

menggunakan mikropipet kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 5 mL.

Campuran larutan lalu diencerkan dengan etanol p.a hingga tanda dan digojog

agar homogen. Pembuatan larutan campuran baku eugenol dan asam salisilat

dilakukan sebanyak lima kali replikasi.

8. Penetapan panjang gelombang pengamatan

Larutan baku campuran ditotolkan dengan volume penotolan 2 µL pada plat

KLT dengan fase diam silika gel 60 F254 yang telah diaktifkan dan setelah


31

kering dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi dengan

fase gerak dengan jarak pengembangan 15 cm. Setelah mencapai jarak rambat

15 cm, plat dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Plat hasil

pengembangan secepatnya discanning pada panjang gelombang pengamatan

250-330 nm menggunakan alat TLC scanner.

9. Penetapan kurva baku asam salisilat dan eugenol dan pengamatan nilai

Retardation Factor (Rf) asam salisilat dan eugenol

Seri larutan baku masing-masing ditotolkan dengan volume penotolan 2 µL

pada plat KLT dengan fase diam silika gel 60 F254 yang telah diaktifkan dan

setelah kering dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi

dengan fase gerak dengan jarak pengembangan 15 cm. Setelah mencapai

jarak rambat 15 cm, plat dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Plat hasil

pengembangan diukur Area Under Curve (AUC) dan tinggi puncaknya

dengan alat TLC scanner pada panjang gelombang pengamatan (288 nm).

Replikasi dilakukan sebanyak tiga kali. Selanjutnya dihitung persamaan

kurva baku, nilai koefisien determinasi dan nilai koefisien korelasinya,

kemudian diplotkan dalam grafik kadar vs AUC.

10. Penentuan selektivitas, uji perolehan kembali, presisi, linearitas, dan

rentang

Larutan baku tunggal dan campuran masing-masing ditotolkan dengan

volume penotolan 2 µL pada plat KLT dengan fase diam silika gel 60 F254

yang telah diaktifkan dan setelah kering dikembangkan dalam bejana

kromatografi yang telah dijenuhi dengan fase gerak dengan jarak


32

pengembangan 15 cm. Setelah mencapai jarak rambat 15 cm, plat dikeluarkan

dari bejana dan dikeringkan. Plat hasil pengembangan diukur Area Under

Curve (AUC) dan tinggi puncaknya dengan alat TLC scanner pada panjang

gelombang pengamatan (288 nm). Replikasi dilakukan sebanyak lima kali.

Kadar terukur dihitung dengan menggunakan persamaan kurva baku yang

telah didapat.

G. Analisis Hasil

Uji Kemampuan yang dilakukan dalam pemisahan asam salisilat dan

eugenol pada penelitian ini dapat ditentukan berdasarkan parameter berikut:

1. Selektivitas

Selektivitas ditentukan dengan membandingkan nilai Rf dari kedua senyawa.

Selektivitas ditunjukkan dengan nilai α dan resolusi (R) > 1,5 (Gandjar dan

Rohman, 2007). Resolusi dapat dihitung dengan cara berikut:

α = (2) (Braithwait and Smith, 1999).

Resolusi = R RW W

(3) (Watson, 1999).

2. Linearitas

Linearitas dilihat dari harga r2 (koefisien determinasi) hasil pengukuran seri

baku eugenol dan asam salisilat. Suatu metode memiliki linearitas yang baik

jika nilai koefisien determinasi (r2) ≥ 0,997 (Chan, 2004).

3. Uji Perolehan Kembali

Uji Perolehan kembali metode analisis dinyatakan dengan recovery yang dapat

dihitung dengan cara berikut:


33

x 100%Recovery =

(4) (Harmita, 2004).

4. Presisi

Presisi metode analisis dinyatakan dengan KV (koefisien variasi) yang dapat

dihitung dengan cara berikut :

KV = S H

x 100% (5) (Harmita, 2004).

5. Rentang

Rentang merupakan interval konsentrasi analit yang memenuhi persyaratan

linearitas, % perolehan kembali, dan presisi.


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Sistem Kromatografi

Sistem kromatogafi yang digunakan dalam penelitian ini adalah sistem

kromatografi adsorbs-partisi fase normal, di mana fase gerak yang digunakan

memiliki sifat yang lebih non polar dibandingkan dengan sifat fase diam yang

digunakan.

Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan fase gerak

yang didapat dari penelitan oleh Ediningtyas (2012), yaitu toluena : etil asetat :

metanol (65,2 : 2,4 : 32,4). Campuran fase gerak ini bersifat lebih non polar

apabila dibandingkan dengan fase diamnya, memiliki nilai indeks polaritas

sebesar 3,3228 dan merupakan fase gerak yang dapat memisahkan asam salisilat

dan eugenol secara optimal. Campuran fase gerak ini disebut non-polar karena

memiliki nilai indeks polaritas yang rendah, dimana semakin rendah nilai indeks

polaritas suatu fase gerak, maka semakin non-polar sifatnya.

Prinsip pembuatan dan pencampuran ketiga larutan fase gerak tersebut

menggunakan prinsip volume portion dengan teknik doubling dimulai dari fase

gerak yang memiliki volum terkecil lalu ditambah larutan fase gerak selanjutnya

sebanyak volum di dalam wadah, begitu seterusnya. Prinsip volume portion

dengan teknik doubling dilakukan untuk mempermudah pencampuran ketiga jenis

larutan fase gerak yang digunakan sehingga ketiganya dapat tercampur dengan

sempurna.

34


35

Fase diam yang digunakan adalah silika gel 60 F254. Fase diam yang

berupa silika ini menempel pada plat aluminium, memiliki ukuran pori sebesar 60

μm dan dapat berfluoresensi pada panjang gelombang 254 nm. Plat silika ini

memiliki sifat yang lebih polar dibandingkan dengan fase gerak yang digunakan.

Fase gerak dan fase diam yang digunakan dalam penelitian akan

memiliki afinitas tertentu terhadap senyawa analit. Afinitas ini timbul akibat

terbentuknya interaksi antara senyawa analit dengan fase diam dan fase gerak

yang digunakan. Interaksi yang terbentuk akan berbeda antara senyawa analit

dengan fase diam dan fase gerak yang digunakan. Adanya perbedaan afinitas

antara senyawa analit dengan fase gerak dan fase diam inilah yang dapat

mengakibatkan perbedaan migrasi solut atau bercak yang ditotolkan sehingga

mampu memisahkan komponen senyawa dalam bercak. Interaksi antara senyawa

analit dengan fase diam dan fase gerak yang digunakan akan dibahas pada sub-

bahasan E.

B. Pembuatan Larutan Baku Asam Salisilat dan Eugenol

Larutan baku yang dibuat adalah larutan baku tunggal asam salisilat dan

larutan baku tunggal eugenol, serta larutan baku campuran asam salisilat-eugenol.

Larutan stok baku asam salisilat dan eugenol dibuat dengan melarutkan baku

asam salisilat dan baku eugenol dengan menggunakan etanol sehingga didapatkan

konsentrasi 20.000 ppm untuk masing masing larutan stok baku asam salisilat dan

eugenol. Etanol dipilih sebagai pelarut karena baik asam salisilat maupun eugenol

memiliki kelarutan yang baik dalam etanol.


36

Penelitian ini menggunakan perbandingan kadar asam salisilat dan

eugenol 1,5:1 dimana peak yang dihasilkan memiliki bentuk yang cukup simetris

dan runcing dengan nilai Rf antara 0,2-0,8 (Ediningtyas, 2012), dimana nilai Rf

asam salisilat adalah 0,25 dan nilai Rf eugenol adalah 0,66. Selain itu, dengan

perbandingan kadar 1,5:1 didapatkan respon detektor terhadap sinyal yang cukup

besar sehingga signal yang terbentuk tidak terganggu oleh noise yang dihasilkan

oleh alat sehingga tidak mengganggu pengamatan kadar analit.

Dari larutan stok baku, kemudian dibuat seri konsentrasi larutan baku.

Seri konsentrasi larutan baku dibuat dalam tujuh tingkat konsentrasi dengan

perbandingan konsentrasi asam salisilat-eugenol 1,5:1. Seri konsentrasi larutan

baku yang digunakan berturut-turut untuk asam salisilat adalah 816 ppm, 884

ppm, 952 ppm, 1020 ppm, 1088 ppm, 1156 ppm dan 1224 ppm, sedangkan untuk

eugenol adalah 560 ppm, 600 ppm, 640 ppm, 680 ppm, 720 ppm, 760 ppm dan

800 ppm. Ketujuh seri konsentrasi larutan baku ini digunakan sebagai kurva baku.

Larutan baku tunggal baik asam salisilat maupun eugenol dibuat dalam

tiga tingkat kosentrasi, yaitu konsentrasi rendah (low) dengan konsentrasi asam

salisilat 816 ppm dan konsentrasi eugenol 560 ppm, konsentrasi tengah (medium)

dengan konsentrasi asam salisilat 1020 ppm dan konsentrasi eugenol 680 ppm,

dan konsentrasi tinggi (high) dengan konsentrasi asam salisilat 1224 ppm dan

konsentrasi eugenol 800 ppm. Ketiga tingkat konsentrasi ini dibuat dalam lima

replikasi dan akan digunakan untuk data presisi dan akurasi larutan baku tunggal.

Larutan baku campuran asam salisilat-eugenol dibuat dalam tiga tingkat

kosentrasi, yaitu konsentrasi rendah (low) dengan konsentrasi asam salisilat 816


37

ppm - eugenol 560 ppm, konsentrasi tengah (medium) dengan konsentrasi asam

salisilat 1020 ppm - eugenol 680 ppm, dan konsentrasi tinggi (high) dengan

konsentrasi asam salisilat 1224 ppm - eugenol 800 ppm. Ketiga tingkat

konsentrasi ini dibuat dalam lima replikasi dan akan digunakan untuk data presisi

dan akurasi larutan baku campuran.

C. Penetapan Panjang Gelombang Pengamatan

Penentuan panjang gelombang pengamatan bertujuan untuk mengetahui

panjang gelombang yang menghasilkan serapan optimal terhadap asam salisilat

dan eugenol ketika dilakukan pemindaian secara bersamaan sehingga sensitivitas

pengukuran kadar meningkat dan meminimalkan kesalahan pengukuran. Larutan

yang digunakan untuk menentukan panjang gelombang pengamatan adalah

larutan baku campuran asam salisilat-eugenol konsentrasi rendah (816:560),

tengah (1020:680) dan tinggi (1224:800). Ketiga tingkat konsentrasi larutan baku

campuran yang telah dibuat ditotolkan dalam satu lempeng plat silika sehingga

mendapatkan kondisi kromatografi yang sama. Penggunaan konsentrasi rendah,

tengah, dan tinggi diasumsikan dapat mewakili seri konsentrasi larutan baku yang

digunakan.

Panjang gelombang maksimum adalah panjang gelombang ketika analit

memberikan respon yang maksimum, adanya perubahan konsentrasi zat sedikit

saja akan memberikan pengaruh yang cukup signifikan pada respon, sehingga

kepekaan analisis maksimal dan dapat meminimalkan kesalahan sewaktu

pengukuran. Panjang gelombang maksimum dari asam salisilat dalam etanol 95%


38

adalah 300 nm (Ahlneck and Alderborn, 1988), sedangkan panjang gelombang

maksimum eugenol adalah 282 nm (Clarke, 1971), oleh karena itu pembacaan

serapan dilakukan pada rentang panjang gelombang 250-330 nm dengan

menggunakan detektor UV pada densitometer, karena rentang panjang gelombang

maksimum asam salisilat dan eugenol terletak pada rentang panjang gelombang

daerah UV (200-400 nm).

Detektor pada densitometer adalah lampu D2 yang menghasilkan sinar

UV. Suatu senyawa dapat diukur serapannya pada daerah UV jika memiliki gugus

kromofor yang dapat menyerap radiasi sinar pada daerah UV. Pada gugus

kromofor terdapat ikatan rangkap terkonjugasi yang mengandung elektron π yang

jika diberi radiasi elektromagnetik mudah tereksitasi ke tingkat energi lebih

tinggi.

Asam salisilat dan eugenol memiliki gugus kromofor sehingga dapat

menyerap radiasi sinar pada daerah UV. Berikut gambar struktur kromofor dan

auksokrom pada asam salisilat dan eugenol.

b a = auksokrom = kromofor

Gambar 5. Kromofor dan auksokrom dari asam salisilat (a) dan eugenol (b)

Asam salisilat memiliki dua gugus auksokrom yang terikat langsung

dengan kromofor, adanya gugus auksokrom ini dapat meningkatkan intensitas

serapan dari asam salisilat dan panjang gelombangnya jadi semakin panjang


39

(pergeseran batokromik). Eugenol memiliki kromofor yang lebih pendek

dibandingkan dengan asam salisilat dan memiliki dua gugus auksokrom yang

berikatan langsung pada kromofor sehingga panjang gelombang yang dimilikinya

lebih rendah daripada asam salisilat.

Hasil pengukuran panjang gelombang pengamatan menunjukkan panjang

gelombang maksimum asam salisilat pada 298 nm sedangkan eugenol pada 282

nm. Hasil tersebut bila dibandingkan dengan panjang gelombang teoritis mengalami

sedikit perbedaan sekitar 2 nm. Pergeseran ini masih memenuhi ketentuan yang

ditetapkan dalam Farmakope Indonesia edisi IV (1995) penyimpangan hingga

batas ± 2 nm dari panjang gelombang maksimum teoritis masih dapat diterima.

Untuk analisis multikomponen cara yang biasa digunakan dalam

menentukan panjang gelombang pengamatan adalah dengan menumpang

tindihkan spektra masing-masing senyawa dan memilih panjang gelombang

perpotongan kedua spektra (λ overlapping). Panjang gelombang pengamatan

untuk asam salisilat dan eugenol adalah sebesar 288 nm. Selanjutnya, panjang

gelombang tersebutlah yang digunakan selama penelitian untuk mendapatkan

serapan yang optimal dari asam salisilat dan eugenol ketika dilakukan pemindaian

secara bersamaan menggunakan densitometer.


40

λλ mmaakkss aassaamm ssaalliissllllaatt 229988 nnmm

λλ mmaakkss eeuuggeennooll 228822 nnmm

Gambar 6. Spektra baku campuran asam salisilat-eugenol (816:560) ppm

D. Analisis Kualitatif

Retardation factor (Rf) suatu senyawa pada kondisi tertentu bersifat

spesifik sehingga dapat digunakan untuk analisis kualitatif. Pengamatan nilai Rf

dalam penelitian ini berfungsi sebagai parameter analisis kualitatif untuk

mengetahui sesuai tidaknya jenis analit yang didapat dari sampel dengan senyawa

target yang akan diteliti, dengan cara membandingkan nilai Rf sampel dengan

nilai Rf baku. Larutan yang digunakan adalah larutan baku tunggal asam salisilat

1020 ppm dan larutan baku tunggal eugenol 680 ppm serta larutan sampel yang

masing-masing ditotolkan sebanyak 2 μL.

Pada sistem KLT-densitometri ini asam salisilat baku memiliki Rf 0,25

lebih rendah dibandingkan dengan eugenol baku yang memiliki Rf 0,66, seperti

λλ oovveerrllaappppiinngg 228888 nnmm


41

pada gambar 7 dan 8. Nilai Rf asam salisilat larutan baku campuran adalah 0,25

dan nilai Rf eugenol larutan baku campuran adalah 0,66, seperti pada gambar 9.

Gambar 7. Densitogram asam salisilat baku 1020 ppm Rf 0,25

Gambar 8. Densitogram eugenol baku 680 ppm Rf 0,66

Gambar 9. Densitogram asam salisilat-eugenol baku (1020:680) ppm

Rf asam salisilat 0,25 Rf eugenol 0,66

Dari gambar 9 dapat dipastikan bahwa asam salisilat dan eugenol

terpisah sempurna dengan nilai resolusi (R) sekitar 5,125 dan nilai α sekitar 5,825.

Nilai resolusi ini memenuhi persyaratan Gandjar dan Rohman (2007) R > 1,5.


42

Tabel VII. Perbandingan Nilai α dan Nilai Resolusi dan Rf pada Baku Asam Salisilat dan Eugenol

Rf Asam Salisilat Rf Eugenol Resolusi α ( ka/ke) Baku Tunggal 0,25 0,66 - - Baku Campuran 0,25 0,66 5,125 5,825

Pada penelitian ini digunakan KLT fase normal dimana fase geraknya

bersifat lebih non-polar dibandingkan dengan fase diamnya. Karenanya senyawa

yang bersifat lebih non-polar akan terelusi lebih dahulu karena terbawa oleh fase

geraknya. Kepolaran eugenol lebih kecil apabila dibandingkan dengan asam

salisilat, sehingga eugenol akan terelusi lebih dahulu.

= bagian non-polar

Gambar 10. Bagian non-polar dari asam salisilat (a) dan eugenol (b) b a

Berikut gambar interaksi asam salisilat dan eugenol terhadap fase diam

dan fase geraknya:

Si O Si O Si

O

Si

O

O Si O Si

O O

HH H

O O OH H H

Si O Si O

Si O Si O

O O

HH

O OH H

O

O OHH

Interaksi Hidrogen

Gambar 11. Interaksi Antara Asam Salisilat Dangan Fase Diam


43

CH3

O

OH3C

H3C

O

O

O

CH3

H

H

H

O

H3C

CH3

O

O

H3CCH3

CH3

H3C

O

O

OH3C H

H3C

H

O

CH3

H

O

H3C

H3C

H3C

H3C

O

H

Gambar 12. Interaksi Antara Asam Salisilat Dangan Fase Gerak

= interaksi van der waals = interaksi hidrogen

= interaksi dipole-dipole

Si

O

Si

OSi O

O

Si O

H

H

O

O

H

H

Si

O

Si

O

Si

O

Si

O

O

O

H

H

O

O

H

H

O

H

O

CH3

Interaksi Hidrogen

Gambar 13. Interaksi Antara Eugenol Dangan Fase Diam


44

O

O

O

OH

H

OCH3

O

O

HO

CH3

CH3

OH

HO

H3C

CH3

OH

O

O

HO

H3C

H3C O

H = interaksi dipole-dipole

Gambar 14. Interaksi Antara Eugenol Dangan Fase Gerak

= interaksi van der waals = interaksi hidrogen

Pada gambar 11 dan 13 interaksi yang terjadi antara asam salisilat dan

eugenol dengan fase diam berupa interaksi hidrogen. Jumlah interaksi yang terjadi

antara asam salisilat dengan fase diam lebih banyak daripada eugenol dengan fase

diam oleh sebab itu asam salisilat akan lebih tertambat kuat pada fase diamnya

sehingga akan terelusi lebih lama dibandingkan eugenol.

Pada gambar 12 dan 14 terlihat bahwa interaksi Van der waals antara

eugenol dengan toluena dan etil asetat lebih banyak daripada asam salisilat

dengan toluena dan etil asetat, hal ini dipengaruhi oleh gugus non-polar eugenol

yang lebih panjang daripada gugus non-polar asam salisilat. Sedangkan gugus-

gugus polar dari kedua senyawa akan membentuk interaksi hidrogen dengan

metanol.

Interaksi yang terjadi antara fase gerak dengan analit merupakan interaksi

hidrogen, interaksi dipol-dipol dan interaksi Van der Waals. Jumlah interaksi yang

terjadi antara fase gerak dengan asam salisilat jauh lebih sedikit dibandingkan


45

dengan jumlah interaksi fase gerak dengan eugenol. Oleh karena itu, eugenol

lebih mudah terbawa oleh fase geraknya daripada asam salisilat sehingga nilai Rf

eugenol lebih besar daripada nilai Rf asam salisilat. Keseluruhan interaksi asam

salisilat-eugenol dengan fase diam dan fase gerak di atas menjelaskan hasil

densitogram pemisahan sampel.

Mekanisme partisi yang terjadi berdasarkan proses pemisahan like

dissolve like dimana apabila ditilik dari data nilai log Ko/w dari masing-masing

senyawa, asam salisilat memiliki nilai 2,26, yang artinya dia lebih mudah larut

dalam air, sedangkan nilai log Ko/w dari eugenol adalah 2,7, yang artinya dia

lebih mudah larut dalam pelarut organik. Dari sini dapat disimpulkan bahwa

eugenol akan lebih terbawa oleh fase geraknya sehingga akan memiliki nilai Rf

yang lebih besar daripada asam salisilat. Hal ini dapat dilihat pada tabel VII.

E. Penetapan Kurva Baku

Pembuatan kurva baku asam salisilat dan eugenol dilakukan masing-

masing sebanyak tiga kali replikasi untuk mendapatkan persamaan garis regresi

linier sehingga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif. Regresi linier

menggambarkan hubungan proporsional antara konsentrasi dengan respon

pengukuran yang berupa AUC (Area Under Curve) atau tinggi peak. Kekuatan

hubungan antara konsentrasi dan respon pengukuran dinyatakan dengan koefisien

korelasi (r), sedangkan hubungan antara garis linier dengan respon dinyatakan

dengan koefisien determinasi (r2). Semakin dekat nilai respon dengan garis linier,

semakin linier data tersebut dan semakin kuat hubungan korelasinya (De Muth,


46

1999). Oleh karena itu syarat pemilihan kurva baku didasarkan pada nilai r2 ≥

0,997 (Chan, 2004). Data persamaan kurva baku asam salisilat dan eugenol dapat

dilihat pada tabel VIII dan IX.

Tabel VIII. Data Replikasi Kurva Baku Asam Salisilat Replikasi

1 2 3 Kadar (ppm)

AUC/12 Kadar (ppm)

AUC/12 Kadar (ppm) AUC/12

815,9967 1418,9500 815,9967 1531,4750 814,3680 1491,0000883,9965 1498,3667 883,9965 1604,1167 882,2320 1565,0917951,9962 1592,6833 951,9962 1682,3417 950,0960 1675,2167

1019,9959 1682,2750 1019,9959 1744,3667 1017,9600 1775,45831087,9956 1728,1167 1087,9956 1832,7000 1085,8240 1825,14171155,9954 1805,1667 1155,9954 1927,1000 1153,6880 1922,39171223,9951 1928,4500 1223,9951 2004,5083 1221,5520 2038,6083

A 444,7512 A 574,1094 A 412,9066B 1,1962 B 1,1636 B 1,3195r2 0,9913 r2 0,9972 r2 0,9939r 0,9957 r 0,9986 r 0,9969α 50,1050 α 49,3240 α 52, 8430

Tabel IX. Data Replikasi Kurva Baku Eugenol Replikasi

1 2 3 Kadar (ppm)

AUC/5 Kadar (ppm)


559,01 1254,18 559,01 1219,94 559,01 1158,16598,94 1292,78 598,94 1274,34 598,94 1216,36638,87 1326,28 638,87 1337,52 638,87 1255,04678,8 1369,42 678,8 1367,72 678,8 1292,40

718,73 1416,46 718,73 1434,24 718,73 1329,18758,65 1461,42 758,65 1468,26 758,65 1365,44798,59 1492,20 798,59 1526,88 798,59 1403,52

A 680,1831 A 522,2886 A 615,6397B 1,0210 B 1,2570 B 0,9914r2 0,9973 r2 0,9948 r2 0,9942r 0,9986 r 0,9974 r 0,9971α 45,5950 α 51,4960 α 44,7530


47

Dari tabel VIII dan IX dapat dilihat bahwa koefisien korelasi yang

dihasilkan oleh ketiga replikasi seri konsentrasi larutan baku antara konsentarsi

dengan AUC menunjukkan hubungan yang sangat kuat, > 0,90, hal ini

menunjukan bahwa dengan penambahan konsentrasi tetap akan didapatkan

penambahan respon yang tetap. Hubungan yang proporsional antara seri

konsetrasi larutan baku asam salisilat dan eugenol dengan AUC ditunjukkan

dalam gambar 24 dan 25. Dari gambar tersebut dapat dilihat bahwa AUC asam

salisilat maupun eugenol meningkat seiring dengan peningkatan konsentrasi.

Pada tabel VIII, persamaan kurva baku yang digunakan untuk asam salisilat

adalah replikasi 2. Hal ini dikarenakan hanya replikasi 2 saja yang mendapatkan nilai

koefisien determinasi yang didapatkan > 0,997 dan memenuhi persyaratan Chan

(2004). Hal ini menunjukkan respon (AUC) yang muncul memiliki kedekatan

dengan garis linier dari regresi linier, sehingga persamaan regresi linier yang

didapat mampu digunakan untuk mengukur respon analit dengan lebih akurat.

Pada tabel IX nilai koefisien determinasi ketiga replikasi yang didapatkan

> 0,997 dan memenuhi persyaratan Chan (2004). Hal ini menunjukkan respon

(AUC) yang muncul memiliki kedekatan dengan garis linier dari regresi linier,

sehingga persamaan regresi linier yang didapat mampu digunakan untuk

mengukur respon analit dengan lebih akurat. Persamaan kurva baku yang

digunakan untuk eugenol adalah replikasi 1, dikarenakan koefisien determinasinya

paling mendekati 1 dibanding replikasi 2 dan 3. Semakin mendekati nilai 1, respon

hasil uji yang didapatkan semakin dekat dengan garis linier, semakin linier data yang

didapat, semakin proporsional respon yang didapat dengan konsentrasi dalam baku.


48

P

salisilat ad

kuantitatif

salisilat m

slope yang

sehingga p

Persamaan r

dalah y=1,1

f eugenol ad

aupun eugen

g terbentuk t

penampilan g

regresi linie

1636x + 57

dalah y=1,0

nol dilakuka

tidak terlalu

grafik kurva

er yang digu

4,1094 dan

0201x + 68

an modifika

u curam dan

a baku asam

unakan untu

n persamaan

80,1831. Ba

asi agar sudu

tidak terlalu

salisilat dan

uk analisis

n kurva bak

aik kurva b

ut α mendek

u landai (nil

n eugenol m

kuantitatif

ku untuk an

baku untuk

kati 45°, seh

lai slope = t

menjadi lebih

asam

nalisis

asam

hingga

tan α)

h baik.

Ga

Ga

ambar 15.

ambar 16.

12501270129013101330135013701390141014301450147014901510

520

AUC x 5

‐1

ser

Grafik HuAsam

Grafik HuEu

0 560 600

Gri konsent

bungan Sem Salisilat vs

bungan Seugenol vs A

y =

640 680 72

Konsentras

Grafik hubtrasi larut

vs AUC

ri Konsents AUCx 12

ri KonsentAUCx 5-1

= 00.001x + 00R² = 00.001

20 760 800

si (ppm)

bungan tan baku x5-1

trasi Laruta-1

trasi Laruta

0.6801

840 880

Eugenol

an Baku

an Baku


49

F. Kemampuan Pemisahan

1. Selektivitas

Selektivitas digunakan untuk melihat kemampuan metode

memisahkan dan membedakan senyawa yang satu dengan senyawa yang lain

ketika berada dalam suatu campuran. Penentuan selektivitas metode dapat

diamati dari pemisahan peak asam salisilat dan eugenol. Pemisahan kedua

senyawa ini dipengaruhi oleh nilai separtion factor (α) dan dinyatakan dalam

nilai resolusi (R).

Nilai α merupakan nilai dari retensi relatif antara masing-masing

komponen yang dipisahkan, didapat dari perbandingan nilai antara Rf senyawa

yang tertambat kuat di fase diam dengan Rf senyawa yang lainnya. Semakin

kecil nilai α, maka pemisahan antara dua komponen akan semakin jauh.

Pada tabel VII dapat terlihat bahwa Rf baku dan Rf analit dalam

sampel menunjukkan nilai yang hampir sama dengan nilai α adalah 5,825

yang artinya kedua komponen terpisah relatif cukup jauh dan nilai resolusi

sebesar 5,125 dihitung berdasarkan jarak peak asam salisilat dan eugenol.

Nilai resolusi ini telah memenuhi persyaratan yang ditetapkan oleh Gandjar

dan Rohman (2007) yaitu R > 1,5. Maka dapat disimpulkan bahwa metode

KLT densitometri ini memenuhi parameter selektivitas dalam menetapkan

kadar asam salisilat dan eugenol.

2. Uji perolehan kembali

Pengujian perolehan kembali dilakukan dengan metode simulasi

dengan menggunakan larutan baku. Uji perolehan kembali dilakukan untuk


50

melihat apakah metode yang digunakan memiliki kemampuan memberikan

hasil pembacaan kadar yang sama dengan perhitungan secara teoritis,

dinyatakan dengan kedekatan nilai terukur dengan nilai sebenarnya yang

dinyatakan dengan nilai % recovery. Recovery merupakan persen perolehan

kembali kadar terukur terhadap kadar sebenarnya.

Pada uji perolehan kembali dilakukan dengan larutan baku tunggal

dan campuran. Baku tunggal digunakan untuk mengetahui kemampuan dari

instrumen yang digunakan apakah memberikan hasil yang sama dengan

teoritis pada baku tunggal. Sedangkan untuk baku campuran untuk

mengetahui kemampuan dari metode apabila nantinya diaplikasikan pada

penetapan kadar campuran. Pada baku campuran dilakukan untuk melihat

apakah pada campuran senyawa dapat memberikan hasil yangsesuai dengan

teoritisnya.

Pada larutan baku tunggal konsentrasi senyawa dalam matrik yaitu

100%, sehingga persyaratan yang diperbolehkan menurut Hurber (2003)

adalah nilai rata-rata % recovery antara 98-102%. Berikut data recovery

masing-masing senyawa tunggal. Dari data pada tabel X dan XI dapat dilihat

bahwa yang memenuhi persyaratan recovery hanya pada konsentrasi tengah

dan tinggi untuk asam salisilat (1020-1224 ppm) dan ketiga tingkat

konsentrasi untuk eugenol (560-800 ppm).


51

Tabel X. Data % Recovery Asam Salisilat Tunggal

% Recovery Kadar asam salisilat (ppm)

Low (816) Med (1020) High (1224) Replikasi 1 101,3233 98,8995 98,4387 Replikasi 2 102,3248 97,7003 99,3105 Replikasi 3 106,3700 99,1319 100,1613 Replikasi 4 103,0752 96,7580 98,9934 Replikasi 5 99,1361 99,1685 100,3076

Mean % Recovery

102,4459 98,3316 99,4423

Tabel XI. Data % Recovery Eugenol Tunggal

% Recovery Kadar eugenol (ppm)


Mean % Recovery

101,0957 100,2767 99,5092

Pada larutan baku campuran konsetrasi 100-999 ppm ulangan

standart yang baik harus memenuhi persyaratan pada rentang rata-rata

recovery antara 90-107%, sedangkan pada konsentrasi di atas 1000-9999 ppm

harus memenuhi persyaratan pada rentang rata-rata recovery antara 95-105%

(Huber, 2003). Namun karena uji perolehan kembali ini menggunakan baku,

maka sebaiknya memiliki nilai yang semakin mendekati kadar sebenarnya

dalam rentang 98 – 102%. Berikut data recovery campuran asam salisilat-

eugenol. Dari data pada tabel XII dapat dilihat bahwa semua memenuhi

persyaratan recovery baik untuk ketiga tingkat konsentrasi asam salisilat (816-


52

1224 ppm) maupun ketiga tingkat konsentrasi eugenol (560-800 ppm). Hasil

rentang asam salisilat dan eugenol memenuhi persyaratan 98-102%.

Tabel XII. Data % Recovery Campuran Asam Salisilat-Eugenol

% Recovery Kadar asam salisilat (ppm) Kadar eugenol (ppm) Low (816)

Med (1020)

High (1224)

Low (560)

Med (680)

High (800)

Replikasi 1 100,7239 97,6020 98,5429 99,4880 98,1199 99,3257Replikasi 2 96,0616 100,1121 98,1760 101,3101 99,5340 98,7689Replikasi 3 98,2778 99,3082 98,6657 99,6036 99,3666 100,6748Replikasi 4 96,2494 98,4881 98,9811 101,7727 101,1009 100,5914Replikasi 5 100,7739 99,4465 100,4662 100,5743 100,9104 99,4656

Mean % Recovery

98,4173 98,9914 98,9664 100,5497 99,8064 99,7653

Metode ini memiliki perolehan kembali yang baik pada konsentrasi

tengah dan konsentrasi tinggi untuk asam salisilat dan semua range

konsentrasi untuk eugenol sehingga dapat digunakan untuk menetapkan kadar

asam salisilat dan eugenol pada level tersebut.

3. Presisi

Pengujian presisi dilakukan dengan metode simulasi dengan

menggunakan larutan baku tunggal dan campuran. Baku tunggal digunakan

untuk mengetahui presisi dari instrumen yang digunakan. Sedangkan untuk

baku campuran untuk mengetahui presisi dari metode penetapan kadar. Presisi

merupakan gambaran kedekatan hasil pengukuran satu dengan lainnya dalam

kondisi analisis yang sama. Presisi suatu metode diukur dengan parameter %

koefisien variasi (KV) atau dalam istilah asing Coefficient of Variation (CV).

Pada larutan baku tunggal konsentrasi senyawa dalam matrik yaitu

100%, sehingga persyaratan % CV harus memenuhi persyaratan %CV ≤ 1,3%


53

(Huber, 2003). Dari tabel XIII dan XIV dapat dilihat bahwa yang memenuhi

persyaratan % CV hanya pada konsentrasi tengah dan tinggi untuk asam

salisilat (1020-1224 ppm) dan eugenol (680-800 ppm).

Tabel XIII. Data % CV Asam Salisilat Tunggal

Kadar asam salisilat (ppm)

Low (816) Med (1020) High (1224) Rata-rata 835,9551 1002,9787 1217,1690

SD 21,5985 10,8646 9,6606 % CV 2,5837 1,0832 0,7937

Tabel XIV. Data % CV Eugenol Tunggal

Kadar eugenol (ppm)


SD 10,5828 7,1406 6,5145 % CV 1,8726 1,0490 0,8198

Pada senyawa campuran % CV yang dapat diterima untuk

konsentrasi analit 100-999 ppm % CV ≤ 5,3% sedangkan untuk konsentrasi di

atas 1000-9999 ppm % CV ≤ 3,7% (Hurber,2003). Dari tabel XV dapat dilihat

bahwa semua memenuhi persyaratan % CV, baik untuk ketiga tingkat

konsentrasi asam salisilat (816-1224 ppm) maupun ketiga tingkat konsentrasi

eugenol (560-800 ppm). Hasil rentang asam salisilat memenuhi persyaratan ≤

3,7% sedangkan eugenol memenuhi persyaratan ≤ 5,3%.

Tabel XV. Data % CV Campuran Asam Salisilat-Eugenol

Kadar asam salisilat (ppm) Kadar eugenol (ppm) Low (816)

Med (1020)

High (1224)

Low (560)

Med (680)

High (800)

Rata-rata 803,0820 1009,7080 1211,3435 562,0831 677,4856 796,7156SD 18,7600 9,8727 10,8516 5,6573 8,3180 6,6641

% CV 2,3360 0,9778 0,8958 1,0065 1,2278 0,8365


54

Dari hasil tersebut dapat disimpulkan metode KLT-densitometri ini

memiliki presisi yang baik, sehingga penetapan kadar asam salisilat dan

eugenol pada konsentrasi tengah dan tinggi untuk asam salisilat (1020-1224

ppm) dan eugenol (680-800 ppm).

4. Linearitas

Linearitas suatu metode menunjukkan hubungan yang proporsional

antara konsentrasi analit dan respon yang dihasilkan. Menurut De Muth

(1999) linearitas ditunjukkan dengan nilai koefisien determinasi (r2) dan

koefisien korelasi (r) yang didapat dari perhitungan regresi linear. Dimana

koefisien determinasi (r2) menunjukkan hubungan antara garis linear dengan

respon dan koefisien korelasi (r) menunjukkan hubungan antara konsentrasi

dan respon pengukuran. Semakin dekat nilai respon dengan garis linear,

semakin linear data tersebut dan semakin kuat hubungan korelasinya. Suatu

metode dikatakan memiliki linearitas yang baik apabila memiliki nilai r2 ≥

0,997 (Chan, 2004).

Berdasarkan data yang diperoleh diketahui bahwa nilai koefisien

determinasi untuk asam salisilat dan eugenol berturut-turut adalah 0,9972 dan

0,9973. Hal ini menunjukkan bahwa metode KLT-densitometri ini telah

memenuhi parameter linearitas dan dapat digunakan dalam menetapkan kadar

campuran asam salisilat dan eugenol.


55

5. Renta

campu

yang

merup

dalam

dan p

peneta

yang m

dan pr

ang

Penetapa

uran karena

merupakan

pakan interv

suatu samp

presisi. Jika

apan kadar,

memenuhi

resisi yang b

an rentang

a pada saat

n campuran

val antara k

pel, yang m

a rentang

jumlah an

rentang, seh

baik.

menggunak

t penetapan

n dari as

konsentrasi a

masih meme

dapat dite

nalit yang d

hingga dap

kan data da

n kadar me

am salisila

analit pada

enuhi param

entukan ma

dituju dapa

pat member

ari presisi d

enggunakan

at dan eu

level bawa

meter lineari

aka pada

at diarahkan

ikan hasil d

dan akursi

n larutan sa

ugenol. Ren

ah dan leve

itas, % reco

saat melak

n ke level

dengan rec

baku

ampel

ntang

l atas

overy,

kukan

analit

overy

= recovery Gamb

baku bar 17. Ren

= pntang Kons

resisisentrasi As

= lin

nearitas am Salisilaat


56

D

metode ya

dan 680

parameter

= recovery Ga

Dari gamba

ang baik dig

– 800 ppm

r linearitas, %

baku ambar 18. R

ar 17 dan

gunakan ad

m untuk eu

% recovery

= pRentang K

18 mempe

dalah pada

ugenol kare

y, dan presis

resisiKonsentrasi

erlihatkan b

1020 – 122

ena pada r

si.

= lin

nearitas Eugenol

bahwa rent

24 ppm untu

rentang ters

tang konsen

uk asam sa

sebut mem

ntrasi

lisilat

enuhi


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Metode KLT-densitometri dengan fase diam silika gel 60 F254, fase gerak

toluena : etil asetat : metanol (65,2 : 2,4 : 32,4), volum penotolan 2,0 μl dan jarak

pengembangan 15 cm mempunyai pengulangan standart dan presisi yang baik

pada rentang konsentrasi asam salisilat 1020-1224 ppm dan eugenol 680-800 ppm

dengan nilai rata-rata % recovery dan CV untuk level kadar rendah, sedang, dan

tinggi berturut-turut adalah 98,4173% dan 2,3360%; 98,9914% dan 0,9778%;

98,9664% dan 0,8958% untuk asam salisilat, 100,5497% dan 1,0065%; 99,8064%

dan 1,2278%; 99,7653% dan 0,8365% untuk eugenol. Metode ini juga memenuhi

parameter linearitas dengan nilai r2 > 0,997 dan selektivitas dengan nilai α= 5,825

dan nilai resolusi 5,125. Berdasarkan hasil tersebut maka metode KLT-

densitometri ini mempunyai kemampuan pemisahan yang baik untuk menetapkan

pemisahan campuran asam salisilat dan eugenol dengan perbandingan 1,5 : 1.

B. Saran

Hasil penelitian ini dapat dikembangkan untuk penetapan kadar

campuran asam salisilat dan eugenol dalam sediaan.

57


DAFTAR PUSTAKA

Adamovics, J.A., 1997, Chromatographic Analysis of Pharmaceuticals, 2nd edition, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 57-60

Ahlneck, C., and Alderborn, G., 1988, Solid-state stability of acetylsalicylic-acid in binarymixtures with microcrystalline and microfine cellulose, Acta Pharm Suec 25(1): 41-52, cit., Mihranyan, A., Strømme, M., and Ek, R., 2006, Influence of cellulose powder structure on moisture-induced degradation of acetylsalicylic acid, Eur.J.Pharm.Sci., 2006 Feb;27(2-3):220-5.

Anonim, 2011a, Thin Layer Chromatography, http://courses.chem.psu.edu/chem36/Experiments/PDF's_for_techniques/TLC.pdf, diakses tanggal 28 Oktober 2011.

Anonim, 2011b, Thin Layer Chromatography, http://www.chem.wisc.edu/courses/342/Fall2004/TLC.pdf, diakses tanggal 28 Oktober 2011.

Braithwaite, A and F.J. Smith, 1999, Chromatographic Methods 5th Edition, Kluwer Academic Publishers, Netherlands, pp.17-117.

Budavari, S., 2001, Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biological, 13th ed., Merck & Co., Inc., USA, pp.239, 612.

Chan, C.C., 2004, Potency Method Validation, in Chan, C.C., Lam, H., Lee, Y.C., and Zhang, X., (Ed.), Analytical Method Validation and Instrument Performance Verification, John Wiley & Sons, Inc., USA, pp.11-24.

Christian, G.D., 2004, Analytical Chemistry, 6th edition, John Wiley and Sons Inc., USA, pp. 126-131, 627-630.

Clarke, E.G.C, 1971, Isolation and Identification of Drugs, The Pharmaceutical Press, London, pp. 42, 343, 539.

De Muth, J.E., 1999, Basic Statistic and Pharmaceutical Statistical Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, USA, pp.295-364.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope Indonesia, jilid IV, Departeman Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, hal.735-737.

Drenthe College The Netherlands, 2011, STANDARD BASE techniques: Thin Layer Chromatography, http://www.standardbase.com/tech/Thin%20 Layer%20Chromatography.pdf, diakses tanggal 29 Oktober 2011.

Duke, J.A, 1987, CRC Handbook of medical herb, CRC Press. Inc, Florida, pp.468-469 in Syzygium aromaticum (L.) Merr & Perry_cengkeh pp. 174-180. Gunawan D., Sudarsono, Wahyuono S, Donatus IA, Purnomo, 2001, Tumbuhan obat 2 : Hasil Penelitian, sifat-sifat, dan penggunaan, PPOT UGM, Yogyakarta

Ediningtyas, V.V.D., 2012, Optimasi Metode KLT-Densitometri Pada Penetapan Kadar Metil Salisilat dan Eugenol dalam Sediaan Merek “X” , Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Environmental Protection Agency, 2005, Biopesticide Registration Action Document : Salicylic Acid, US Environmental Protection Agency Office of Pesticide Programs, pp.2.

58


59

European Pharmacopoeia Convention, 2005, The European Pharmacopoeia, 5th edition, European Pharmacopoeia Convention Inc., pp.3007.

Fessenden, R. J. dan Fessenden, J. S., 1986, Organic Chemistry, diterjemahkan oleh Pudjaatmaka, A.H., Edisi ketiga, Jilid I, Penerbit Erlangga, Jakarta, hal.315.

Gandjar, I.G., dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, hal.323-324, 353-354, 359-360.

Gasparic, J., and Churacek, J., 1978, Laboratory Handbook of Paper and Thin-Layer Chromatography, Ellis Horwood Limited, England, pp.63.

Gearien, J.E. and Grabowski, B. F., 1969, Methods of Drug Analysis, Lea & Febiger, Philadelphia, USA, pp. 32,33, 72-77.

Gritter, J.R., Bobbit, J.M., and Scharting, A.E., 1991, Introduction of Chromatography, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., Edisi II, Penerbit ITB, Bandung, hal.109-112.

Guilford, J.P., 1956, Fundamental Statistics in Psycology and Education, cit., De Muth, J. E., 1999, Basic Statistic and Pharmaceutical Statistical Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, USA, pp.295-364.

Hardjono, 1985, Kromatografi, Laboratorium Analisa Kimia Fisika Pusat, UGM, Yogyakarta, hal.32-34.

Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya, Majalah Ilmu Kefarmasian, 1(3), hal.117-134.

Harnani, E.D., 2010, Perbandingan Kadar Eugenol Minyak Atsiri Bunga Cengkeh (Szygium aromaticum (L.) Merr. & Perry) dari Maluku, Sumatera, Sulawesi, dan Jawa dengan Metode GC-MS, Skripsi, Univesitas Sumatera Utara, Sumatera.

Hauck, H. E., and Mack, M., 1996, Handbook of Thin Layer Chromatography:Sorbents and Precoated Layers in Thin-Layer Chromatography , 2nd Edition, Marcel Dekker, Inc., pp. 102.

Huber, L., 2003, Validation of Analytical Methods and Processes, in Nash, R.A., and Wachter, A.H., Pharmaceutical Process Validation, an International Third Edition, Revised and Expanded, Marcell Dekker, Inc., USA, pp.518- 520.

Jork, H., 1990, Thin-Layer Chromatography Reagents and Detection Methods, VCH, New York, pp. 12.

Kowalska, T., 2003, Encyclopedia of Chromatography, Marcell Dekker Inc, New York, pp.1524.

Mintarsih, 1990, Penetapan Kadar Alkaloid Kininda dalam Akar, Batang, dan Daun Chinchona Succirubra Pavon et Klotzsch dari Daerah Kaliurang Secara Spektrodensitometri (TLC-Scanner), Skripsi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Mulja, H.M., dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press, Surabaya, hal. 225, 231, 232.

Munson, J.W., 1984, Kromatografi Lapis Tipis, in Munson, J.W., 1991 Pharmaceutical Analysis Modern Methods, diterjemahkan oleh Harjana, Parwa B., Universitas Airlangga Press, Surabaya, hal.125-144.


60

Nurdjannah, N., 2011, Difersifikasi Penggunaan Cengkeh, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pasca Panen Pertanian, Bogor, Perspektif, Volume 3 Nomor 2, Desember 2004 : 61-70.

Pecsok, R.L., Shield, L.D., Cairns, T., and McWilliam, I.G., 1976, Modern Methods of Chemical Analysis, 2nd Edition, John Wiley & Sons, Inc., Canada, pp. 51.

Pradyot, P., 2004, Dean’s Analytical Chemistry Handbook, 2nd edition, Mc Graw-Hill Inc., USA, pp.5.1-5.106.

Purushothamrao K., Khaliq K., Sagare P., Patil S.K., Kharat S.S., Alpana K., 2010, Formulation and evaluation of vanishing cream for scalp psoriasis, Int J Pharma Sci Tech, Vol-4,Issue-1, Jan-June 2010, ISSN: 0975-0525, pp.32-41.

Rhodia, 2011, Salicilic Acid, GPS Safety Summary, Rhodia Global product Strategy, pp.1-7.

Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, Graha Ilmu, Yogyakarta, hal.17-45.

Rouessac, F. and Rouessac, A., 2007, Chemical Analysis : Modern Instrumentation Methods and Techniques, 2nd Edition, John Wiley & Sons Ltd., England, pp.17.

Roundtree, D., 1981, Statistics Without Tears: A Primer for Non-Mathematicians, cit., De Muth, J. E., 1999, Basic Statistic and Pharmaceutical Statistical Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, USA, pp.295-364.

RSC, 2012, Salicilic Acid, http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.331.html, diakses tanggal 5 Juni 2012

Sastrohamidjojo, H., 2005, Kromatografi, cetakan pertama, penerbit Liberty, Yogyakarta, hal. 1-40.

Sherma, J., and, Fried B., 1996, Handbook of Thin Layer Chromatography, 2nd Edition, Marcel Dekker, Inc.,pp.20.

Shimadzu corporation, 2012, How to Prepare Mobile Phases - Solvent Mixture Ratios, http://www.shimadzu.com/an/hplc/support/lib/lctalk/28/28intro.html, diakses tanggal 12 Februari 2012.

Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method Development, 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, pp.67, 161, 687- 691.

So-Mi Yun, Myoung-Heon Lee, Kwang-Jick Lee, Hyun-Ok Ku, Seong-Wan Son, and Yi-Seok Joo, 2010, Quantitative analysis of eugenol in clove extract by a validated HPLC method

Stahl, E., 1985, Drug Analysis by Chromatography and Microscopy, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Penerbit Institut Teknologi Bandung, Bandung, hal.3-18.

Sudjadi, 1988, Metode Pemisahan, cetakan pertama, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, hal.167-175.

Supardjan, A.M., Meiyanto, E., 2002, Efek Antiproliferatif Pentagamavunon-0 Terhadap Beberapa Sel Kanker, Laporan Penelitian, Lembaga Penelitian Universitas Gajah Mada, Yogyakarta.


61

Tarigan, H.Y.S., 2009, Sintesis 4-Alil-2-Metoksi Fenil Laurat melalui Reaksi Transesterifikasi antara 4-Alil-2-Metoksi Fenil Asetat dengan Metil Laurat, Skripsi, Universitas Sumatra Utara, Medan, hal.9-13.

TCI America, 2008, Material Safety Data Sheet A0232, https://www.spectrumchemical.com/MSDS/TCI-A0232.pdf, diakses tanggal 5 Juni 2012

The British Pharmacopoeia Commission, 2011, British Pharmacopoeia 2011, Volume 3, The Department of Health, London, pp.A608-A610, A182-A185, 2376.

Thompson, D., Norbeck, K., Olsson, L., Constantin-Teodosiu D., Van der Zee J., and Moldous P., 1988, Peroxidase-catalyzed Oxidation of Eugenol: Formation of a Cytotoxic Metabolite(s), The journal of biological chemistry, Vol. 264, No. 2, Issue of January 15, pp.1016-1021,1989.

United States Pharmacopeial Convention, 2005, The United States Pharmacopeia, 28th edition, United States Pharmacopeial Convention Inc., Rockville, pp.2748-2751.

Vidya V. Dighe, Atish A. Gursale, Ramesh T. Sane, Sasikumar Menon, and Shvetali C. Raje, 2005, Quantification of eugenol in Cinnamomum tamala nees and eberm. Leaf powder by high-performance thin-layer

chromatography Vijon, 2008, Material Safety Data Sheet,

http://www.vijon.com/data/resources/219.pdf, diakses tanggal 5 Juni 2012

Viswanatha G.L., Kharat N., H. Shylaja , Lakshman K, 2010, Anti-Inflammatory And Analgesic Activity Of Topical Preparation Of Root Extracts Of Ichnocarpus Frutescens (L.) R.Br, International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology, ISSN 0976-4550, pp.1101.

Walker, R., 2007, Mass, Weight, Density or Specific Gravity of Liquids, http://www.simetric.co.uk/si_liquids.htm, diakses tanggal 9 Januari 2012.

Walker, R., 2011, Summary:- Mass, Weight, Density or Specific Gravity of water at various temperatures C and thermal coefficient of expansion of water, http://www.simetric.co.uk/si_water.htm, diakses tanggal 9 Januari 2012.

Watson, D.G., 1999, Pharmaceutical Analysis, Churchill Livingstone, London, pp. 202.

Wilks Enterprise, Inc., 2012, Emulsion Breaking Techniques for Oil in Water Solvent Extractions, Wilks sampel analytical solutions, http://wilksir.com/pdf/Breaking_Emulsions_Oil_Grease_Extractions.pdf, diakses tanggal 18 April 2012.

Wulandari, L., dan Indrayanto, G., 2000, Densitometric Determination of Betamethasone Dipripionate and Salicilic Acid in Lotion, and Validation of the Methode, http://www.akademiai.com/content/8111142372361604.html, diakses tanggal 1 Mei 2012

Yuwono, M., and Indrayanto, G., 2005, Validation of Chromatographic Methods of Analysis, Profile of Drug Substances, Excipients, and Related Methodology, Elseiver Inc., pp 32, 243-259.


LAMPIRAN

62


63

Lampiran 1. Certificate of Analysis Baku Asam Salisilat


64

Lampiran 2. Certificate of Analysis Baku Eugenol

Lampiran 3. Data Pengambilan Bahan dan Perhitungan Konsentrasi Sebenarnya 1. Penimbangan Asam Salisilat (serbuk)

Kemurnian 99,8% a. Perhitungan pengambilan asam salisilat

Dibuat 20.000 ppm asam salisilat stok sebanyak 10 mL Maka asam 0 mg = 0,2 g salisilat yang diambil 20.00

ang setara 0,2 g asam salisilat

,

Menimb : x 0,2 g 01 g 0,2004008

0, 2004 g

b. Penimbangan stok kurva baku asam salisislat

Asam Salisilat (g) Kurva Baku R 1 R 2 R 3

Berat Kertas 0,2046 0,1966 0,2038 Berat Kertas + Zat 0,4050 0,3974 0,4047 Berat Kertas + Sisa 0,2046 0,1970 0,2047 Berat Zat 0,2004 0,2004 0,2000 Berat Zat Murni (Berat Zat x 99,8%) 0,1999992 0,1999992 0,1996

Konsentrasi dalam 10 mL (ppm) 19999,9200 19999,9200 19960,0000


65

c. Penimbangan stok asam salisilat untuk uji kemampuan metode baku tunggal dan campuran Asam Salisilat (g) Validasi Metode Analisis

R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 Berat Kertas 0,1988 0,1940 0,1918 0,2020 0,2044 Berat Kertas + Zat 0,3995 0,3944 0,3922 0,4024 0,4048 Berat Kertas + Sisa 0,1991 0,1942 0,1919 0,2020 0,2046 Berat Zat 0,2004 0,2007 0,2007 0,2004 0,2003 Berat Zat Murni (Berat Zat x 99,8%) 0,1999992 0,2002986 0,2002986 0,1999992 0,1998994

Konsentrasi dalam 10 mL (ppm) 19999,9200 20029,8600 20029,8600 19999,9200 19989,9400

2. Pengambilan eugenol (cair) Kemurnian 99% Berat jenis (ρ) = 1,067

L

a. Perhitungan pengambilan eugenol Dibuat 20.000 ppm eugenol stok dalam 10 mL Maka eugenol ia g yang d mbil 20.000 mg = 0,2Setara dengan ,

, L0, 187441424 mL

0, 187 mL 187 µL Men L : gambil setara dengan 0,187 μ x 187 µL µL 188,889 189 µL

b. Perhitungan konsentrasi eugenol Volume z 89 mL at yang diambil 189 μL = 0,1

e zat murni (volume zat yang d=

Volum iambil x kemurnian) x 0,189 mL 0,18 11 mL

zat murni (volume za murni x ρ) = 0,18711 mL x 1,067 0,19964637 g

7Berat t

Konsentrasi dalam 10 mL = 19964,6370 ppm

3. Pembuatan seri konsentrasi a. Asam salisilat

i. Perhitungan volume pengambilan pembuatan seri konsentrasi kurva baku C1 x V1 = C2 x V2

Konsentrasi teoritis (C2)

(ppm)

Konsentrasi Larutan Stok

(C1) (ppm)

Volume Akhir (V2) (mL)

Volume Pengambilan

(V1) (mL)

Volume Pengambilan

(V1) (μL) 816

20.000 5

0,204 204 884 0,221 221 952 0,238 238 1020 0,255 255 1088 0,272 272 1156 0,289 289 1224 0,306 306

ii. Perhitungan volume pengambilan pembuatan seri konsentrasi baku tunggal dan campuran (uji kemampuan metode) C1 x V1 = C2 x V2


66


(ppm)


(C1) (ppm)


Volume Pengambilan

(V1) (mL)

Volume Pengambilan

(V1) (μL) 816

20.000 5 0,204 204

1020 0,255 255 1224 0,306 306

b. Eugenol i. Perhitungan volume pengambilan pembuatan seri konsentrasi kurva baku

C1 x V1 = C2 x V2


(ppm)


(C1) (ppm)


Volume Pengambilan

(V1) (mL)

Volume Pengambilan

(V1) (μL) 560

20.000 5

0,140 140 600 0,150 150 640 0,160 160 680 0,170 170 720 0,180 180 760 0,190 190 800 0,200 200

ii. Perhitungan volume pengambilan pembuatan seri konsentrasi baku tunggal

dan campuran (uji kemampuan metode) C1 x V1 = C2 x V2


(ppm)


(C1) (ppm)


Volume Pengambilan

(V1) (mL)

Volume Pengambilan

(V1) (μL) 560

20.000 5 0,140 140

680 0,170 170 800 0,200 200

4. Perhitungan konsentrasi yang sebenarnya a. Asam salisilat

i. Konsentrasi kurva baku Replikasi 1 dan 2 C1 x V1 = C2 x V2

Konsentrasi terhitung (C2)

(ppm)


(C1) (ppm)


Volume Pengambilan

(V1) (mL)

Volume Pengambilan

(V1) (μL) 815,9967

19999,9200 5

0,204 204 883,9965 0,221 221 951,9962 0,238 238 1019,9959 0,255 255 1087,9956 0,272 272 1155,9954 0,289 289 1223,9951 0,306 306


67

ii. Konsentrasi kurva baku Replikasi 3 C1 x V1 = C2 x V2


(ppm)


(C1) (ppm)


Volume Pengambilan

(V1) (mL)

Volume Pengambilan

(V1) (μL) 814,3680

19960 5

0,204 204 882,2320 0,221 221 950,0960 0,238 238 1017,9600 0,255 255 1085,8240 0,272 272 1153,6880 0,289 289 1221,5520 0,306 306

iii. Konsentrasi baku tunggal dan campuran (uji kemampuan metode)

Replikasi 1 dan 4 C1 x V1 = C2 x V2


(ppm)


(C1) (ppm)


Volume Pengambilan

(V1) (mL)

Volume Pengambilan

(V1) (μL) 815,9967

19999,9200 5 0,204 204

1019,9959 0,255 255 1223,9951 0,306 306

iv. Konsentrasi baku tunggal dan campuran (uji kemampuan metode) Replikasi 2 dan 3 C1 x V1 = C2 x V2


(ppm)


(C1) (ppm)


Volume Pengambilan

(V1) (mL)

Volume Pengambilan

(V1) (μL) 817,2183

20029,8600 5 0,204 204

1021,5229 0,255 255 1225,8274 0,306 306

v. Konsentrasi baku tunggal dan campuran (uji kemampuan metode) Replikasi 5 C1 x V1 = C2 x V2


(ppm)


(C1) (ppm)


Volume Pengambilan

(V1) (mL)

Volume Pengambilan

(V1) (μL) 815,5896

19989,9400 5 0,204 204

1019,4869 0,255 255 1223,3843 0,306 306


68

b. Eugenol i. Konsentrasi kurva baku Replikasi 1, 2, dan 3

C1 x V1 = C2 x V2


(ppm)


(C1) (ppm)


Volume Pengambilan

(V1) (mL)

Volume Pengambilan

(V1) (μL) 559,0098

19964,6370 5

0,140 140 598,9391 0,150 150 638,8684 0,160 160 678,7977 0,170 170 718,7269 0,180 180 758,6562 0,190 190 798,5855 0,200 200

ii. Konsentrasi baku tunggal dan campuran (validasi) Replikasi 1, 2, 3, 4, dan 5

C1 x V1 = C2 x V2


(ppm)


(C1) (ppm)


Volume Pengambilan

(V1) (mL)

Volume Pengambilan

(V1) (μL) 559,0098

19964,6370 5 0,140 140

678,7977 0,170 170 798,5855 0,200 200

Lampiran 4. Perhitungan Indeks Polaritas Fase Gerak

Komposisi fase gerak Toluena : Etil Asetat : Metanol (65,2 : 2,4 : 32,4)

Nilai Indeks Polaritas Toluena = 2,4 Etil Aseat = 4,4 Metanol = 5,1

Perhitungan Indeks Polaritas P K P

T P K x nilai indeks polaritas pelarut

Pelarut P n erhitunga Nilai Polaritas Pelarut dalam komposisi

Toluena 65,2100 x 2,4 1,5648

Etil Asetat 2,4100 x 4,4 0,1056

Metanol 32,4100 x 5,1 1,6524

TOTAL 3,3228


69

Lampiran 5. Spektra Panjang Gelombang Asam Salisilat dan Eugenol dengan Perbandingan 1,5 : 1 pada Tiga Tingkat Konsentrasi Rendah, Sedang, dan Tinggi


70

Lampiran 6. Standar Operasional Prosedur (SOP) Analisis Kuantitatif


71

Lampiran 7. Densitogram Seri Kurva Baku Asam Salisilat Replikasi 1


72 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

73




75




77

Lampiran 10. Data Penentuan Kurva Baku Asam Salisilat

Replikasi 1 2 3

Kadar (ppm)

AUC/12 Kadar (ppm)


815,9967 1418,9500 815,9967 1531,4750 814,3680 1491,0000883,9965 1498,3667 883,9965 1604,1167 882,2320 1565,0917951,9962 1592,6833 951,9962 1682,3417 950,0960 1675,2167

1019,9959 1682,2750 1019,9959 1744,3667 1017,9600 1775,45831087,9956 1728,1167 1087,9956 1832,7000 1085,8240 1825,14171155,9954 1805,1667 1155,9954 1927,1000 1153,6880 1922,39171223,9951 1928,4500 1223,9951 2004,5083 1221,5520 2038,6083

A 444,7512 A 574,1094 A 412,9066B 1,1962 B 1,1636 B 1,3195r2 0,9913 r2 0,9972 r2 0,9939r 0,9957 r 0,9986 r 0,9969α 50,1050 α 49,3240 α 52, 8430


78

Lampiran 11. Persamaan Regresi Linear dan Gambar Grafik Seri Kurva Baku Asam Salisilat

1. Replikasi 1 y = 1,1962 x + 444,7512

2. Replikasi 2 (yang digunakan) y = 1,1636 x + 574,1094

3. Replikasi 3 y = 1,3195 x + 412,9066


79

Lampiran 12. Densitogram Seri Kurva Baku Eugenol Replikasi 1


80


81



82


83



84


85

Lampiran 15. Data Penentuan Kurva Baku Eugenol

Replikasi 1 2 3

Kadar (ppm)

AUC/5 Kadar (ppm)


559,01 1254,18 559,01 1219,94 559,01 1158,16598,94 1292,78 598,94 1274,34 598,94 1216,36638,87 1326,28 638,87 1337,52 638,87 1255,04678,8 1369,42 678,8 1367,72 678,8 1292,40

718,73 1416,46 718,73 1434,24 718,73 1329,18758,65 1461,42 758,65 1468,26 758,65 1365,44798,59 1492,20 798,59 1526,88 798,59 1403,52

A 680,1831 A 522,2886 A 615,6397B 1,0210 B 1,2570 B 0,9914r2 0,9973 r2 0,9948 r2 0,9942r 0,9986 r 0,9974 r 0,9971α 45,5950 α 51,4960 α 44,7530

Lampiran 16. Persamaan Regresi Linear dan Gambar Grafik Seri Kurva Baku Eugenol

1. Replikasi 1(yang digunakan) y = 1,0210 x + 680,1831


86

2. Replikasi 2 y = 1,2570 x + 522,2886

3. Replikasi 3 y = 0,9914 x + 615,6397


87

Lampiran 17. Densitogram Baku Tunggal Asam Salisilat bnjhnyuj (Uji kemampuan metode)




90


91

Lampiran 18. Densitogram Baku Tunggal Eugenol (Uji kemampuan metode)




94


95

Lampiran 19. Densitogram Baku Campuran Asam Salisilat dan Eugnol (Uji kemampuan metode)




98


99

Lampiran 20. Perhitungan % dan CV Baku Tunggal dan Campuran dari Asam Salisilat

Recovery dan Eugenol

% Recovery = K TK T

x 100 % CV = S BR R

x 100 % a. Asam Salisilat

i. Recovery

% Recovery Kadar asam salisilat (ppm)


Mean % Recovery

102,4459 98,3316 99,4423

ii. CV

Kadar asam salisilat (ppm)


SD 21,5985 10,8646 9,6606 % CV 2,5837 1,0832 0,7937

b. Eugenol

i. Recovery

% Recovery Kadar eugenol (ppm)


Mean % Recovery

101,0957 100,2767 99,5092

ii. CV

Kadar eugenol (ppm)


SD 10,5828 7,1406 6,5145 % CV 1,8726 1,0490 0,8198


100

c. Campuran i. Recovery

% Recovery Kadar asam salisilat (ppm) Kadar eugenol (ppm) Low (816)

Med (1020)

High (1224)

Low (560)

Med (680)

High (800)

Replikasi 1 100,7239 97,6020 98,5429 99,4880 98,1199 99,3257Replikasi 2 96,0616 100,1121 98,1760 101,3101 99,5340 98,7689Replikasi 3 98,2778 99,3082 98,6657 99,6036 99,3666 100,6748Replikasi 4 96,2494 98,4881 98,9811 101,7727 101,1009 100,5914Replikasi 5 100,7739 99,4465 100,4662 100,5743 100,9104 99,4656

Mean % Recovery

98,4173 98,9914 98,9664 100,5497 99,8064 99,7653

ii. CV

Kadar asam salisilat (ppm) Kadar eugenol (ppm) Low (816)

Med (1020)

High (1224)

Low (560)

Med (680)

High (800)

Rata-rata 803,0820 1009,7080 1211,3435 562,0831 677,4856 796,7156SD 18,7600 9,8727 10,8516 5,6573 8,3180 6,6641

% CV 2,3360 0,9778 0,8958 1,0065 1,2278 0,8365

Lampiran 21. Perhitungan Nilai α dan Resolusi Baku Tunggal dan Campuran

Rf = α = Resolusi = R RW W

Nilai α dan Nilai Resolusi asam salisilat dan eugenol Rf Asam Salisilat (1) Rf Eugenol (2) Resolusi α ( ka/ke) Baku Tunggal 0,25 0,66 - - Baku Campuran 0,25 0,66 5,125 5,825


BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “Uji Kemampuan Metode Kromatografi Lapis Tipis- Densitometri Untuk Memisahkan Asam Salisilat Dan Eugenol” ini memiliki nama lengkap Rosita Secoadi. Penulis lahir di Yogyakarta pada tanggal 5 Maret 1990 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara. Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulis adalah TK Tarakanita Bumijo (1994-1996), SD Tarakanita Bumijo (1996-2002), SMP Stella Duce 1 (2002-2005), SMA Pangudi Luhur Van Lith Muntilan (2005-2008), kemudian tahun 2008 penulis melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah penulis aktif dalam beberapa kegiatan dan

organisasi antara lain sebagai anggota kesekretariatan seminar nasional POKJANAS TOI XXXVI (2009), dan Penyuluh dalam kegiatan Pengabdian Masyarakat bersama dosen (2010). Selain itu penulis juga pernah menjadi asisten dosen Praktikum Kimia Analisis (2010), Praktikum Farmakognosi Fitokimia II (2012), Praktikum Analisis Kosmetik (2012) dan Praktikum Bioanalisis (2012).

101


DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur Asam Salisilat ....................................................................... 6

Gambar 2. Struktur Eugenol ................................................................................. 7

Gambar 3. Stuktur Silika Gel ................................................................................ 11

Gambar 4. Simulasi Pemisahan Antara Dua Puncak ............................................ 18

Gambar 5. Kromofor dan auksokrom dari asam salisilat dan eugenol ................. 38

Gambar 6. Spektra baku campuran asam salisilat-eugenol (816:560) ppm .............. 40

Gambar 7. Densitogram asam salisilat baku 1020 ppm Rf 0,25 ........................... 41

Gambar 8. Densitogram eugenol baku 680 ppm Rf 0,66 ...................................... 41

Gambar 9. Densitogram asam salisilat-eugenol baku (1020:680) ppm Rf asam

salisilat 0,25 Rf eugenol 0,66 ........................................................... 41

Gambar 10. Bagian non-polar dari asam salisilat dan eugenol ............................. 42

Gambar 11. Interaksi Antara Asam Salisilat Dangan Fase Diam ......................... 42

Gambar 12. Interaksi Antara Asam Salisilat Dangan Fase Gerak ........................ 43

Gambar 13. Interaksi Antara Eugenol Dangan Fase Diam ................................... 43

Gambar 14. Interaksi Antara Eugenol Dangan Fase Gerak .................................. 44

Gambar 15. Grafik Hubungan Seri Konsentrasi Larutan Baku Asam Salisilat vs

AUCx 12-1 ........................................................................................ 48

Gambar 16. Grafik Hubungan Seri Konsentrasi Larutan Baku Eugenol vs

AUCx 5-1 .......................................................................................... 48

xvii


xviii

Gambar 17. Rentang Konsentrasi Asam Salisilat ................................................. 55

Gambar 18. Rentang Konsentrasi Eugenol ........................................................... 56


Documents

UJI KEMAMPUAN METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS