Kvantinių taškų panaudojimas

nanomedicinoje

Dr. V. Karabanovas

Kaunas, 2012

Vilniaus Universitetas

Proteomikos centras, Biochemijos institutas

Biomedicininės fizikos laboratorija, Onkologijos institutas

2007–2013 m. Žmogiškųjų išteklių plėtros veiksmų programos 3 prioriteto „Tyrėjų gebėjimų

stiprinimas“ VP1-3.1-ŠMM-05-K priemonės „MTTP tematinių tinklų, asociacijų veiklos

stiprinimas“ projektas „Lietuvos Biochemikų draugijos potencialo kurti žinių visuomenę

didinimas“ (Nr. VP1-3.1-ŠMM-05-K-01-022)

SEMINARO PLANAS

• Įvadas į nanomediciną. Nanodalelių įvairovė.

• Kvantiniai taškai. Sintezė ir optinės savybės.

• Kvantinių taškų taikymas in vitro: kaupimasis

ląstelėse, patekimo mechanizmų tyrimas,

viduląstelinis transportas, biologinis efektas.

• Kvantinių taškų taikymas in vivo: KT susikaupimas

odoje, panaudojimas limfmazgių vaizdinime bei

prasiskverbimas per placentos barjerą.

Įvadas. Nanomedicinos vizija

Robert A. Freitas Jr., “Current Status of Nanomedicine and Medical Nanorobotics” J.

Comput. Theor. Nanosci. 2(March 2005):1-25

Trumpiausią nanomedicinos apibrėžimą, matyt, yra

suformulavęs Robertas A. Freitas jaunesnysis:

„Nanomedicina – tai nanotechnologijų

panaudojimas medicinoje“

Ekspertai į nanomedicinos sritį žiūri labai plačiai

ir supranta, kad tai technologijos, kurios

naudoja molekulinius instrumentus ir žinias

apie žmogaus kūno sandarą medicininei

diagnostikai ir gydymui.

Nanotechnologijos pakeitė požiūrį į pacientą

Tikslingas vaistų pristatymas

Vaistų, baltymų ir genų lokalizavimas

kūne, ląstelėje, ląstelės viduje

Vaistų paieška

Didelio pralaidumo patikros (stebėjimo)

technologija. Rodmenys – ląsteliniai ir

biomolekuliniai

Novatoriškieji bioaktyvūs elementai,

aptinkami panaudojant nanotechnologijas

Novatoriškosios vaistų pristatymo

sistemos

Diagnostika

In vitro (sudėtinė detekcija) ir in vivo

Regeneracinė medicina

Medžiagos, skirtos ląstelių siunčiamų

signalų reguliavimui ir diferencijavimui.

Morfogenezės kontrolė, padedanti įvesti

funkcinę integraciją

1906 m. P.Erlichas pateikė koncepciją apie vaistus,

kurie labai tiksliai nukreipiami į pažaidos židinį, ir

pavadino juos magiškomis kulkomis (magic bullet).

Nanodalelių įvairovė

Plati medžiagų klasė. Junginiai, kurių dydis 1-100 nm:

Organinės ND: liposomos, “kietų” lipidų (solid lipid), dendrimerai, polimerinės ND,

hydrogelio ND ir kt...

Neorganinės ND: kvantiniai taškai, aukso, platinos, sidabro, feritinės ND,

nanokiautai

Nanodalelių charakteristikos

Užpildytos ar tuščiavidurės

Modifikuotas paviršius

Temperatūrai jautrus lipidai

Fotoliuminescencija

Šilumos sugėrimas

Magnetinės savybės ir kaitinimas

Vaizdinimo kontrastas

Kvantinis taškas – yra monodispersinė puslaidininkinė nanodalelė, kurios

dydis kinta nuo nuo 2 iki 10 nm. Dėka savo mažo dydžio jų energetinė struktūra

panaši į atomų struktūrą. Galima sutikti įvairios formos KT. Jie sudaryti iš kelių

dešimčių iki tūkstančių atomų.

~5 nm 5 nm 5 nm

Kvantiniai taškai. Sintezė ir optinės savybės.

1975m - Leo Esaki ir kt., krūvininkų judėjimo apribojimas vieną kryptimi kvantinėse

duobėse.

1980m. Teorinis darbas Dr. Ekimov ir Efros (Rusija)

bei Dr. Brus iš Bell lab. (Jav) pirma karta nustatė dydžio

kvantavimo efektus stikle turinčiame PbS.

1982m. Rosetti ir Brus pirmieji kvantinių taškų

liuminescencinių savybių tyrimai. Tyrinėjo CdS

kvantinių taškų koloidus ir pirmieji pasiūlė CdS

dengti ZnS, kadangi pamatė kad ženkliai padidėja fluorescencijos kvantinė išeiga.

1989m. Bell Lab. CdS-ZnS kvantinis taškas vandenyje.

1993m. Pirmoji aukštos kokybės monodispersinių CdS, CdSe ir CdTe

sintezė.

1995m. Dr. Guyot-Sionnest ir jo studentas Peggy Hines išvystė CdSe

padengimo ZnS metodą. Pirmieji pagamino aukštos kokybės CdSe-ZnS

kvantinį tašką.

1996m. Vandenyje tirpių CdTe kvantinių taškų sintezė.

1998m. Pirmieji kvantinių taškų taikymai biologijoje. (mikroskopija)

Istorija

Medžiagų įvairovė iš kurių galima pagaminti

kvantinius taškus

• Puslaidininkiai

– II-VI: CdSe, CdS, ZnSe,

– CdTe, PbS, PbSe

– III-V: GaAs, GaP, InP

– I-VII: CuCl, CuBr, AgBr

– Netiesiajuostis: Si

• Galima pagaminti iki 3.0±0.3 nm (CdTe)

Sintezės metodai

Pirolizė metaloorganinių junginių pvz: Cd(CH3)2 ir

SeTOP, TOPO 250-350oC.

Nusodinimo metodas CdSe KT iš vandeninių tirpalų

pvz: CdCl2 ir Na2Se, ligandai polifosforo ar merkapto

rūgštys.

KT sintezė terminio skaidymo metodu

Tai organometalinių junginių skaidymas

koordinuojančiuose tirpikliuose, esant atinkamam

chalkogenidui, 250 – 350 C temperatūroje. Kadmio

selenido sintezės pradinai junginiai - kadmio oksidas

ir selenas, koordinuojantys tirpikliai: trioktil fosfinas

(TOP), trioktil fosfino oksidas (TOPO) stearino

rūgštis (SA).

Temperatūros ir reakcijos laiko kontrolė !

400 450 500 550 600 6500,0

0,5

1,0

1,5

A

Op

tin

is t

an

kis

(op

t.t.

vn

t)

Bangos ilgis (nm)

CdSe 1 sintezė

CdSe 2 sintezė

CdSe 3 sintezė

CdSe 4 sintezė

CdSe 5 sintezė

CdSe 6 sintezė

Susintetintų CdSe KT optinės savybės

400 450 500 550 600 650 700 7500

100

200

300

400

500

600

700

B

CdSe 1 sintezė

CdSe 2 sintezė

CdSe 3 sintezė

CdSe 4 sintezė

CdSe 5 sintezė

CdSe 6 sintezė

Fo

toliu

min

esce

ncijo

s in

ten

syvu

ma

s(s

.v.)

Bangos ilgis(nm)

Sferinių

(CdSe)ZnS

nanodalelių

sintezė

2-50 nm

II_VI, IV-VI, III-V B gr.:

CdSe, CdS, CdTe,

ZnS, ZnSe, InSe, InS

ZnS, CdS

Pliusai

Puiki dydžio pasiskirstymo kontrolė

Puikus kvantinių taškų stabilumas

FL kvantinis našumas, padengus apvalkalu

padidėja >70%

Minusai

Netirpūs vandenyje

Didžiausia blogybė

Daug sunkiųjų metalų

Metalo organinės pirolizės metodas

Charakteringa KT struktūra

Branduolys/apvalkalas

(CdSe)ZnS KT

Šerdis CdSe KT

Organinis sluoksnis

(TOPO)

Hidrofobinis

Paviršiaus modifikacija

Ligando pakeitimas

TDPA

Oleino r.

TOPO TOP

HS-(CH2)n-COOH1

HS-CH2-CH2-NH22

Oligomeriniai fosfinai6,7

6. J.Am.Chem.Soc., 125 (2003) 14652-14653.

7. Nature Biotechn., 22 (2004) 93-97.

8. J.Am.Chem.Soc., 126 (2004) 6115-6123.

9. Chem. Mater., 15 (2003) 3125-3133.

Sintetiniai peptidai8

Dendrimerai9

1. J.Nanosci.Nanotechnol., 8 (2008) 1-7.

2. Nano Lett., 3 (2003) 503–507.

3. Anal.Biochem., 334 (2004) 257-265.

4. J.Am.Chem. Soc., 123 (2001) 4103–4104.

5. J.Am.Chem. Soc., 122 (2000) 12142-12150.

4

5

3

L-DPPC2

Micelių formavimas per hidrofobinę sąveiką

(fosfolipidai)

DSPE1

Hidrofilinis

Hidrofobinis

Hidrofilinis

1. Science, 298 (2002) 1759–1762.

2. Nano Lett., 5 (2005) 645–648.

Micelių formavimas per hidrofobinę sąveiką

(amfifiliniai polimerai)

1. Nat. Biotechnol., 21 (2003) 41–46.

2. Nano Lett., 4 (2004) 703–707

1, 2

CdSe-GSH sintezė vandeninėje

terpėje1

* glutationas

CdCl2 . 2,5H2O

Na2SeO3

Na3C6H5O7 . 2H2O

GSH*

Sintezė vyksta 20 min. 900C

temperatūroje.

DNR peptidas

baltymas antikūnas

KT apvalkalas

KT biomedicinininiams tyrimams

KT šerdis

Organinis sluoksnis

Modifikacija

KT – idealus fluoroforas nanovaizdinimui

Platus sugerties spektras

Didelis ekstinkcijos koeficientas (103-105M-1cm-1)

FL modifikuojama keičiant dydį

Ilgą sužadintos būsenos gyvavimo trukmė

Didelis fotostabilumas

Lengvai modifikuojamas paviršius hidrofiliniais ligandais

Paviršius lengvai modifikuojamas specifinio atpažinimo molekulėmis

Michalet, X. et al .Science, 2005, 307, 538; Bruchez, M.; et al. Science, 1998, 281, 2013, Chan,

W. C. W.; Nie, S. M. Science, 1998, 281, 2016.

Fluorescencinis vaizdinimas

Vištos embriono kraujagyslių vaizdinimas panaudojus organinį fluoroforą (FITC-

dextraną) – A ir kvantinius taškus – B. (Smith et al. 2007)

Fluorescencinis žmogaus epitelio ląstelių vaizdas. Dažyta 5 tipų (spalvų) KT,

kurie konjuguoti su skirtingais antikūnais (Delehanty et al. 2009).

Klasikinis Alexa-488 dažiklis (žalias), greit išblykšta, o KT (raudoni) – ne.

KT taikymas in vitro. Klausimai?

• Identifikuoti KT savybes kurios yra svarbios sąveikai

su ląstelėmis

• KT patekimo mechanizmai

• Viduląstelinis transportas

• Biologinis efektas

• Kaip KT paviršiaus modifikavimas gali padidinti ar

sumažinti jų patekimą

KT patekimas

500 550 600 650 700 7500

200000

400000

600000

549nm

630nm

QDs DME mediaP

L inte

nsity (

a.u

.)

Wavelength (nm)

Pagrindinis objektas :

CdSe

ZnS

COOH

CdSe/ZnS-COOH KT kaupimasis

NIH3T3 ląstelėse

Endocitozės mechanizmai

0 5 100 200 300 4000

50

100

150

200

250

300

350

PL inte

nsity (

a.u

.)

Incubation time (min)

4 0C Red-QD

37 0C Red-QD

40C

370C

Red-QD

Red-QD

KT susikaupimas energetiškai priklausomas?

Endocitozė ar difuzija? GFP kontrastas; KT mikroinjekcija

Red-QD Red-QD GFP

COOH-KT patekimo dinamika į NIH3T3 ląsteles

30’ 3 h 6 h 24 h

Struktūra

24h

3h

Priklausomai nuo patekimo

mechanizmo susidaro skirtingo

dydžio endosomos klatrino –

(~120 nm), kaveolino – (~60 nm)

ir klatrino –bei kaveolino-

nepriklausomos (~90 nm).

Inhibitorinė

analizė

Kolokalizacija

Kas atsakingas klatrinas ar kaveolinas?

Cav1 QD LacCer QD Clathrin QD

Viduląstelinis vėzikulių transportas

• Rab baltymų šeima: Rab GTPases reguliuoja membranos

transportą, įskaitant vezikulių formavimąsi, vezikulių judėjimą,

membranų susiliejimą.

NIH3T3 ląstelių transfekcija e-GFP vizualizuojant Rab5-wt

Rab5wt

1h

3h

EE

24h

Viduląstelinis vezikulių transportas

• Rab5 baltymas: ankstyvos endosomos, klatrinų dengtos vezikulės,

Viduląstelinis vezikulių transportas

• RQDs and Trf-Alexa susikaupimas NIH3T3 ląstelėse

Trf-FITC konjugatas 1h 2h

Vezikulių susiliejimas ir sortavimas

3h 3h

Vezikulių susiliejimas ir sortavimas

480 500 520 540 560 580 600 620 640 6600

500

1000

1500

2000

2500

RQDs

Trf-Alexa conjugate

FL

in

ten

sit

y (

a.u

.)

Wavelength (nm)

1

2

3

24h su Trf-Alexa 24h su Trf-Alexa

Kodėl KT vėzikulės po susiliejimo su klatrino

vėzikulėmis kaupiamsi MVK

COOH-ND viduląstelinis transportas NIH 3T3 ląstelėse

COOH-KT viduląstelinis transportas NIH 3T3 ląstelėse

Ankstyvosios endosomos Vėlyvosios endosomos Lizosomos

COOH-ND galutinė lokalizacija: multivezikulinės struktūros

(MKV)

QD QD

• KT fotoatsistatymas and fotoblukimas Trf-FITC konjugatų

0min Po 2 min.

0min 10min 25min

Švitinimas 488nm po 24h ND

inkubavimo ląstelėse

Vėlyvoji patekimo fazė: inhibavimo signalo generavimas

Inhibavimas nuo cholesterolio raftu/kaveolino

priklausomos endocitozės

Cav-1 kiekis (žalias) po 24h poveikio su KT

Kas atsakingas už

inhibavimą?

Kaip KT kaupiasi vėžinėse ląstelėse?

MCF-7

HepG2

24h 48h 60h

Vaizdas iš viršaus

Vaizdas iš apačios

Receptoriai ekspresuojami

vėžinių ląstelių membranoje

Adaptuota iš A.H Shim et al., PNAS, 2010

Trombocitų kilmės augimo veiksniu (PDGF)-modifikuoti KT

COOH-KT modifikavimas PDGF-BB

QD

QD-PDGF

PDGF-KT

COOH-KT

30’ 3 h 24 h

PDGF-KT patekimo dinamika

Inhibitorinė analizė

PDGF-KT viduląstelinis transportas NIH 3T3 ląstelėse

Klatrinas Ankstyvosios

endosomos

Vėlyvosios endosomos Lizosomos

Clathrin QD EEA1 QD

Vps4 QD Lysotracker QD

2h 48h COOH-QD

Kaupimasis PDGF-KT HepG2 ląstelėse

PDGF-QD

KT (PDGF-KT) aktyvuoja PDGF receptoriaus autofosforilinimą

Biologinis efektas

24h ND 24h PDGF-ND

ND (PDGF-ND) indukuoja DNR sintezė

COOH-KT poveikis ląstelių migracijai

Apibendrinimas

COOH-KT poveikis proteomai

Atsparumas stresui Ląste

lių g

yvybin

gum

as (

pro

c.)

K K K KT KT

0,075 μg/ml CisPlatina 24 h.

0,5 μg/ml CisPlatina 24 h.

KT taikymas in vivo. Klausimai?

• Pasiskirstymas organizme priklausomai nuo KT

įvedimo būdo

• Farmakokinetika

• KT prasiskverbimas per placentos barjerą

Suleidimas į paodę. KT susikaupimas odoje.

KT neprasiskverbia per bazinę membraną, nepatenka į plauko

folikulus, prakaito liaukas ir kt. – jų migracija iš esmės skiriasi nuo

mažų organinių junginių.

KT yra endocituojami odoje esančių ląstelėje. Tai sąlygoja jų ilgalaikį

susikaupimą odoje, galimą vaisto pristatymą į ląstelę arba priešingai

– toksiškumą.

KT susikaupimas limfmazgyje

Suleidimas į kraujotaką KT

farmakokinetika kraujyje

550 600 650 700 7500

20

40

60

FL

in

ten

syvu

ma

s,

s.v

.

Bangos ilgis, nm

Kontrole

0.5 h

1 h

1.5 h

2 h

2.5 h

3 h

4 h

5 h

6 h

Kraujo plazmos tirpalų fluorescencijos ir sugerties spektrai. FL spektrai

normuoti ties 590 nm, λžad=480nm.

350 400 450 500 550 600 6500.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Optinis

tankis

, o.t

.v.

Bangos ilgis, nm

Kontrole

0.5 h

1 h

1.5 h

2 h

2.5 h

3 h

4 h

5 h

6 h

zad=480nm

KT farmakokinetika kraujyje

0 3 6 9 12 15 18 21 240

20

40

60

FL m

aks,

s.v

.

Laikas, val

0309

0301

1216

1220

0322

Originalios ir normuotos FLmaks kitimo kreivės. Didžiausia KT

koncentracija kraujyje stebima praėjus 2-4 val po suleidimo.

0 3 6 9 12 15 18 21 240.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

FL

in

ten

syvu

ma

s,

s.v

.Laikas, val

0309

0301

1216

1220

0322

KT pasiskirstymas kraujagyslėje.

Histologinis bandinys.

KT kompleksai kraujagyslėje:

Naudojant 457nm lazerį ir x60/1,4 objektyvą, Dteor.~200 nm.

Taigi KT kompleksai yra mažesni už mikroskopo skiriamąją

gebą. Jų dydis gali būti nuo <0,4 μm iki 3 μm.

0 200 400 600 800 1000 12000

50

100

150

200

FL

in

ten

syvu

ma

s,

s.v

.

x, nm

375 nm

KT kraujo plazmoje aplipę eritrocitus

KT pasiskirstymas žiurkės organuose po 3h

550 600 650 700 7500.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

FL

in

ten

syvu

ma

s,

s.v

.

Bangos ilgis, nm

Sirdis

Raumuo let

Plauciai

Kepenys

Ciobrialiauke

Bluznis

Inkstas

balta šviesa UV (atspindys) (fluorescencija)

Gimdos ragai

su embrionais

KT prasiskverbimas per placentos barjera:

550 600 650 700 7500

1

2

3

PL

in

tensity,

a.u

.

Wavelength, nm

Gimda

Gimdos kontrole

KT

550 600 650 700 7500

1

2

3

FL

in

ten

syvu

ma

s,

s.v

.

Wavelength, nm

Placenta

Placenta control

550 600 650 700 7500

1

2

3

PL inte

nsity,

a.u

.

Wavelength, nm

Embrionas

Embrionas kontrole

KT susikaupimas reprodukciniuose organuose:

550 600 650 700 7500

1

2

3

PL inte

nsity,

a.u

.

Wavelength, nm

Trynio maiso placenta

Trynio maiso placenta kontrole

Žiurkės organų FL spektrai, praėjus 3 val po KT injekicjos. Kontroliniam

gyvūnui nebuvo leista KT.

Konfokalinė mikroskopija: KT (raudoni) susikaupimę placentoje,

bet ne embrione.

“Tobula” nanodalelė:

Ateitis

Toksiškumas

Turi būti ištirtas, kadangi yra žinoma,

kad kai kurios nanodalelės yra

sudarytos

iš sunkiųjų metalų junginių, kurie yra

toksiški.Nanodalelių toksiškumą galima

reguliuoti,naudojant skirtingas jų

Paviršiaus padengimus.

Nanodalelių ateitis – biovaizdinimo ir terapijos

agentai. Po injekcijos nanodalelės patenka į

naviką ir yra detektuojami PET/MRI/NIR.

Realiame laike navikas diagnozuojamas

panaudojant konfokalinį kateterių arba imant

biopsiją fluorescencinei analizei. Gydymas

realizuojamas dėka nanodalelių rentgeno arba

infraraudonų spindulių sugerties, kurios metu

generuojami laisvieji radikalai.

Nanotechnologijų klinikinis taikymas

Dabar 2020

Ačiū už dėmesį!