1

KỸ THUẬT PHÂN TÍCH CẤU TRÚC PROTEIN

PHẦN 1: CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

1. Khái Niệm1.1 Protein

1.1.1 Protein là gì?

Tất cả các tế bào sống đều chứa Protein, điều đó có nghĩa là protein là chất cần cho sự

sống. Vì người ta cho rằng Protein là thành phần quan trọng nhất trong các vật chất của sự

sống, cho nên trong tiếng anh, protein bắt nguồn từ chữ Hy Lạp có nghĩa là “thứ nhất”. Về

định nghĩa chính xác Protein là gì, có nhiều cách nói khác nhau, nhưng tự chung lại, đều

thống nhất cho rằng: Protein là hợp chất cao phân tử giữ nhiều vai trò nòng cốt trong cơ

thể. Hầu hết chúng làm việc trong tế bào đáp ứng yêu cầu của các bào quan và mô trong cơ

thể về cấu trúc, chức năng và điều hòa. Protein được chứa trong tất cả các phần của cơ thể

của bạn, làn da, cơ bắp, tóc, máu, bộ phận cơ thể, đôi mắt, ngay cả móng tay và xương

.

1.1.2 Cấu trúc – chức năng của Protein

Theo công trình nghiên cứu :” What is protein” của Georgia C. Lauritzen thuộc đại học

Utah State: “Protein được cấu tạo từ các đơn vị nhỏ hơn được gọi là các axit amin. Hiên nay

đã phát hiện ra hơn 20 loại axit amin khác nhau. Mỗi phân tử protein bao gồm rất nhiều các

axit amin, được sắp xếp theo một trình tự ngẫu nhiên, từ đó tạo ra hàng trăm, hàng nghìn

các phân tử protein có cấu trúc khác nhau. Hầu hết các protein là các phân tử lớn có thể

chứa hàng trăm axit amin được sắp xếp trong các ngành và các chuỗi”. Trình tự axit amin

xác định cấu trúc không gian 3 chiều của protein và chức năng chuyên biệt của chúng. Có 5

loại cấu trúc không gian, ứng với 5 chức năng của Protein như sau:

1

2

Kháng thể (antibody)

Đây là các protein có khả

năng bám vào các phân tử

ngoại lai như vi khuẩn, vi

rút, sau đó vô hiệu hóa

chúng để bảo vệ cơ thể.

Trong hình bên là cấu trúc

không gian của protein

kháng thể:

Immunoglobulin G (lg G).

Enzyme

Enzyme xúc tác cho

hầu hết các phản ứng

hóa học xảy ra trong tế

bào. Chúng cũng giúp

đỡ hình thành những

phân tử mới bằng cách

đọc thông tin di truyền

lưu trữ trong DNA.

Vídụ hình bên:

Phenylalanine

hydroxylase.

2

3

Thông tin - Messenger

protein thông tin, như một số loại hormone, truyền tải tín hiệu để phối hợp các quá trình

sinh học giữa các tế bào, mô, cơ quan khác nhau. Ví dụ: hormone tăng trưởng (Growth

hormone)

3

4

Thành phần cấu

trúc

Những protein này

cung cấp cấu trúc và

nuôi dưỡng tế bào.

Trong một phạm vi

lớn hơn, chúng còn

cho phép tế bào di

chuyển. Ví dụ: Actin

Vận chuyển-dự trữ

các protein này bám vào

những nguyên tử và phân

tử nhỏ bên trong tế bào và

lưu thông trong cơ thể. Ví

dụ: Ferritin

4

5

1.2 Vai trò Protein trong sinh học

Như đã nói ở trên, Protein có vai trò cực kỳ quan trọng trong đời sống sinh học nói

chung cũng như con người nói riêng.

1.2.1 Vai trò

Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là

axit amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide (gọi là

chuỗi polypeptide). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo

thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein.

Protein hình thành, duy trì và thay thế các tế bào trong cơ thể. Protein chiếm tới

trên 50% khối lượng khô của tế bào và là vật liệu cấu trúc của tế bào. Thiếu

protein dẫn đến suy dinh dưỡng, chậm lớn, suy giảm miễn dịch, ảnh hưởng xấu

đến chức năng của các cơ quan trong cơ thể.

Protein là tham gia vào thành phần cơ bắp, máu, bạch huyết, hocmôn, men,

kháng thể, các tuyến bài tiết và nội tiết. Vì vậy, protein có liên quan đến mọi

chức năng sống của cơ thể (tuần hoàn, hô hấp, sinh dục, tiêu hóa, bài tiết hoạt

động thần kinh và tinh thần...).

Protein cần thiết cho chuyển hóa bình thường các chất dinh dưỡng khác, đặc biệt

là các vitamin và chất khoáng. Khi thiếu protein, nhiều vitamin không phát huy

đầy đủ chức năng của chúng mặc dù không thiếu về số lượng.

5

6

Protein còn là nguồn năng lượng cho cơ thể, thường cung cấp 10%-15% năng

lượng của khẩu phần, 1g protein đốt cháy trong cơ thể cho 4 Kcal (trong khi đó

Gluxit là 4 Kcal, Lipit là 9kcal và rượu là 7kcal)

Protein kích thích sự thèm ăn và vì thế nó giữ vai trò chính tiếp nhận các chế độ

ăn khác nhau. Thiếu protein gây ra các rối loạn quan trọng trong cơ thể như

ngừng lớn hoặc chậm phát triển, mỡ hóa gan, rối loạn hoạt động nhiều tuyến nội

tiết (giáp trạng, sinh dục), thay đổi thành phần protein máu, giảm khả năng miễn

dịch sinh học của cơ thể và tăng tính cảm thụ của cơ thể với các bệnh nhiễm

khuẩn.

1.2.2 Bổ sung protein cho cơ thể

Sau khi được nạp vào cơ thể, trong quá trình tiêu hoá thức ăn, protein được phân huỷ

tại dạ dày bởi các enzyme. Nó  chuyển thành các polypeptides, cung cấp các axit amin

cần thiết cho sự sống. Thành phần axit amin của cơ thể người không thay đổi và cơ thể

chỉ tiếp thu một lượng các axit amin hằng định vào mục đích xây dựng và tái tạo tổ

chức. Có 8 axit amin cơ thể không thể tổng hợp được hoặc chỉ tổng hợp một lượng rất

ít. Đó là Lyzin, tryptophan, phenynalaninin, lơ - xin, izolơxin, valin, treonin, metionin.

Người ta gọi chúng là các axit amin cần thiết.

Các axit amin cần thiết này được lấy thông qua protein của thức ăn từ bên ngoài. Tuy

nhiên, trong tự nhiên không có loại protein thức ăn nào có thành phần hoàn toàn giống

với thành phần axit amin của cơ thể. Do đó để đáp ứng nhu cầu cơ thể cần phối hợp

các loại protein thức ăn để có thành phần axit amin cân đối nhất.

Giá trị dinh dưỡng một loại protein cao khi thành phần axit amin cần thiết trong đó cân

đối và ngược lại. Hầu hết thức ăn có nguồn gốc động vật và thực vất chứa đầy đủ và

6

7

cân đối các thành phần của các axit amin cần thiết . Tuy nhiên, không có một loại thức

ăn nào có đủ tất cả mà cần phải sử dụng một chế độ hỗn hợp nhiều loại thức ăn.

Thực phẩm nguồn gốc động vật (thịt, cá, trứng, sữa) là nguồn protein quý, nhiều về số

lượng, và cân đối hơn về thành phần và đậm độ axit amin cần thiết cao. Hàm lượng

các axit amin cần thiết  trong thực phẩm nguồn gốc thực vật (đậu tương, gạo, mì, ngô,

các loại đậu khác...) không cao (trừ đậu nành); nhưng cơ thể vẫn phải bổ sung cân đối

đấy đủ các loại này. Vì vậy, biết phối hợp các nguồn protein thức ăn hợp lý sẽ tạo nên

giá trị dinh dưỡng cao của khẩu phần. Ví dụ gạo, ngô, mì nghèo lizin còn đậu tương,

lạc, vừng hàm lượng lyzin cao, khi phối hợp gạo hoặc mì hoặc ngô với đậu tương,

vừng , lạc sẽ tạo nên protein khẩu phần có giá trị dinh dưỡng cao hơn các protein đơn

lẻ

2. Phân tích cấu trúc Protein

2.1 Phân tích cấu trúc Protein là gì?

Như đã trình bày, mỗi một loại protein với chức năng khác nhau sẽ có một thành phần và

trình tự axit amin khác nhau, cũng như cấu trúc không gian khác nhau. Chính vì vậy, việc

nghiên cứu tìm ra những thông tin này là vô cùng cần thiết trong sinh học. Từ các thông tin

đó, chúng ta có thể biết được chính xác protein nào, có chức năng gì, để từ tìm cách tổng

hợp nhân tạo protein, hay bố sung protein cần hoặc loại bỏ các protein có hại. Phân tích cấu

trúc Protein chính là nhằm mục đích này.

Hiện nay, trên thế giới, công tác nghiên cứu về phân tích cấu trúc protein đang rất được đẩy

mạnh. Hàng loạt các công trình nghiên cứu, các bài báo khoa học được công bố cho phép

con người có cái nhìn sâu và rộng hơn về thế giới sinh học phân tử protein. Và chúng cũng

được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực: y tế, nông nghiệp,…7

8

2.2 Các phương pháp phân tích

Protein, tuy được gọi là một “đại” phân tử của thế giới vi mô, tuy nhiên mắt thường của

chúng ta sẽ không thể nhìn thấy chúng được. Chính vì vậy, để nghiên cứu những đối tượng

này, cần sử dung những phương pháp đặc hiệu với sự trợ giúp của các phương tiện khoa

học kỹ thuật hiện đại, đó cũng chính là lý do việc phân tích cấu trúc protein chỉ thực sự

khởi sắc trong vài năm trở lại đây, theo sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật.

Hiện nay, có nhiều phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu protein, sau đây xin giới

thiệu sơ lược 2 phương pháp hữu hiệu nhất

2.2.1 Tinh thể học tia X (X-ray crystallography)

William Henry Bragg (1862-1942) là người đi tiên phong trong việc phát triển phương

pháp X-ray. Bragg có vô số hứng thú nghiên cứu, nhưng công trình mang lại tên tuổi cho

ông là một nhà khoa học hàng đầu là tiến bộ mang tính lịch sử của ông trong tinh thể học

tia X. Làm việc với người con trai, William Lawrence Bragg, ông đã phát triển một phương

pháp bắn phá các tinh thể với tia X năng lượng cao phát ra bởi những ống chân không được

cấu trúc đặc biệt. Khi tia X đi qua đơn tinh thể, chúng bị nhiễu xạ theo một điều kiện do

cha con Bragg khám phá ra và do đó suy luận định lượng ra đường đi của chúng. Hình ảnh

tia X nhiễu xạ có thể được chụp trên kính ảnh, vì tia X làm phơi sáng các hạt bạc bromide

khi chúng va vào. Bằng cách khảo sát hình ảnh tia X nhiễu xạ bởi những tinh thể khác

nhau, Bragg và con trai của ông đã có thể thiết lập một số mối liên hệ toán học cơ bản giữa

một cấu trúc tinh thể nguyên tử và hình ảnh nhiễu xạ của nó. Với thành tựu này, , William

Henry Bragg và William Lawrence Bragg được tặng Giải Nobel Vật lí năm 1915.

2.2.1.1 Sơ lược phương pháp

Cách thông thường để xác định hình dáng một vật là nhìn trực tiếp vào nó. Với các vật rất

nhỏ, như các phân tử, để xác định cấu trúc liên kết giữa các nguyên tử tạo nên phân tử đó, 8

9

ta cần dùng kính hiển vi để phóng đại chúng lên hàng ngàn tỉ lần. Với khả năng hiện có,

kính hiển vị điện tử (electron microscopes) cũng chỉ có thể phóng đại lên cỡ vài tỉ lần. Lí

do là do giới hạn nhiễu xạ (diffraction limit): để có thể nhìn thấy một vật hoặc phân biệt

được 2 vật điểm thì kích thước tối thiểu của vật hoặc khoảng cách tối thiểu giữa hai vật

điểm lớn hơn 1/2 lần bước sóng đang sử dụng.

Bước sóng của ánh sáng nhìn được vào khoảng vài trăm nanometers còn các nguyên tử thì

có khoảng cách chỉ ở đơn vị hay bước sóng cần thiết để nhìn thấy các nguyên tử là bước

sóng của tia X. Nhưng ta không thể tạo ra kính hiển vi tia X. Vì thế đòi hỏi ta phải dùng các

kĩ thuật mang tính gián tiếp khác. Tia X khi chiếu vào tinh thể sẽ tương tác với các electron

hóa tri (valence electron) của các nguyên tử thành phần được phân bố trong không gian.

Các electron này sẽ tán xạ (scatter) tia X ra các hướng, tùy vào sự sắp xếp trong không gian

của nguyên tử. [Cái này cũng giống như dùng một đèn pin lớn chiếu vào một cây đèn chùm

(chandelier) mà ta không được phép nhìn thấy. Dù không biết cây đèn chùm hình dáng thể

nào, nhưng dựa vào bóng phản chiếu (các pattern) ta cũng có thể dự đoán sự sắp xếp của

các mảnh thủy tinh trên cây đèn chùm] Một màn hình sẽ ở phía sau để lưu lại ví trí tán xạ và

cường độ của tia X bị tán xạ. Sau khi có các dữ liệu này rồi, người ta sẽ dùng các công thức

tính toán phức tạp để xác định vị trí các electron bao quanh các nguyên tử và từ đó suy ra vị

trí các nguyên tử. Các mẫu nhiễu xạ thu được sẽ có mối quan hệ với vật phát tán các sóng

chiếu tới nó thông qua một phép toán biển đổi gọi là biến đổi Fourier (Fourier transform).

Nếu mật độ các electron (electron density) bao quanh mỗi nguyên tử là một hàm toán học,

thì mẫu nhiễu xạ tia X thu được tương ứng là biến đối Fourier của hàm đó. Với tính chất có

thể biến đổi ngược của phép biến đổi Fourier, ta có thể dùng máy tính để xây dựng lại hình

ảnh mật độ electron dựa vào ảnh mẫu nhiễu xạ. PDB (Protein Data Bank) lưu trữ cấu trúc

protein và các phân tử sinh học khác miễn phí sử dụng. Để hiển thị cấu trúc 3D của chúng,

ta dùng phần mềm RasMol hay Pymol.

9

10

Tuy nhiên, một khó khăn gặp phải là nhiễu xạ tia X từ một phân tử thì sẽ cho cường độ thu

được trên ảnh rất yếu và khó phân biệt với nhiễu. Do đó, người ta sử dụng tinh thể. Tinh thể

sắp xếp một lượng lớn các phân tử theo một trật tự và hướng giống nhau, nhờ thế các sóng

nhiễu xạ sẽ cộng hưởng pha (ở một số hướng) làm tăng cường độ hiển thị lên máy đo. Hiển

nhiên, ở một số hướng khác, các nhiễu xạ này cũng triệt từ nhau. Đó là lí do mà mẫu nhiễu

xạ chỉ là mảng các điểm. Vì thế, việc tạo ra một tinh thể tốt đóng vai trò cực kì quan trọng

để thu được hình ảnh có giá trị. Đó là khởi nguồn của kĩ thuật tinh thể học tia X.

2.2.1.2 Ưu – nhược điểm phương pháp

Trước khi có phương pháp tinh thể học tia X: Việc tìm hiểu tinh thể là dựa vào đặc tính

hình học của tinh thể. Để biết được cấu trúc 3D, người ta đo các góc của bề mặt tinh thể so

với các trục tham chiếu tưởng tượng (crystallographic axes) và từ đó cho ra hình ảnh hình

học có tính đối xứng của tinh thể. Hình ảnh 3D này được chiếu lên mặt phẳng dùng phép

chiếu lập thể (stereographic projection) để chiếu mặt cầu lên mặt phẳng. Phép chiếu này bảo

toàn góc nhưng không bảo toàn diện tích.

Phương pháp tinh thể học tia X thì dựa vào máy đo góc (goniometer): Việc xác định trật tự

của các nguyên tử dựa vào sự phân tích các mẫu nhiễu xạ (diffraction patterns) thu được sau

khi chiếu tia X vào tinh thể các chất/phân tử cần phân tích ở dạng rắn tinh thể. Ngoài tia X,

người ta còn dùng electron (electron diffraction) hoặc neutron (neutron diffraction) cho một

số mục đích đặc biệt.

Tinh thể học tia X (X-ray crystallography) được ứng dụng nhiều trong sinh học để xác định

cấu trúc của các đại phân tử như protein, DNA hay RNA. Và các phân tử này phải được

chuyển về dạng tinh thể. Lí do sử dụng tia X là vì ta không thể nhìn thấy chi tiết một vật

nhỏ hơn nửa bước sóng đang sử dụng. Mà kích thước nguyên tử quá nhỏ, nên phải dùng tia

X vì có bước sóng đủ ngắn để thấy được chi tiết nguyên tử. Tuy nhiên, năng lượng sóng thì

tỉ lệ nghịch với bước sóng, nghĩa là bước sóng càng ngắn thì năng lượng càng cao, càng dễ

phá hỏng mẫu phân tử sinh học. Đó là lí do mà phải chuyển về dạng tinh thể để giảm sự phá 10

11

hoại của tia X. Tuy nhiên việc phá hoại của tia X là vẫn không thể tránh khỏi, kết quả thu

được cần được xem xét kỹ.

2.2.2 Cộng hưởng từ hạt nhân ( NMR )

Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân được tìm ra và phát triển qua nhiều giai đoạn,

đặc biệt nhờ các đóng góp của Richard R. Ernst. Năm 1966, khi làm việc chung với một

đồng nghiệp người Mỹ, Ernst đã phát hiện ra rằng độ nhạy của kỹ thuật cộng hưởng từ hạt

nhân (cho đến nay chỉ giới hạn trong việc phân tích số ít hạt nhân) có thể được tăng lên

đáng kể bằng cách thay thế các sóng vô tuyến quét chậm thường được dùng trong quang

phổ cộng hưởng từ hạt nhân thời đó bằng các xung ngắn cường độ cao. Khám phá của ông

đã cho phép phân tích nhiều loại hạt nhân hơn và các số vật liệu nhỏ hơn.

Đóng góp quan trọng thứ nhì của ông vào lãnh vực "phổ học cộng hưởng từ hạt nhân" là

một kỹ thuật cho phép một độ phân giải cao, nghiên cứu "hai chiều" các phân tử lớn hơn so

với trước đây mà quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân đã đạt được. Với các cải tiến của

Ernst, các nhà khoa học đã có thể xác định cấu trúc 3 chiều của các hợp chất hữu cơ và vô

cơ và các đại phân tử sinh học như các protein; để nghiên cứu sự tương tác giữa các phân tử

sinh học và các chất khác như các ion kim loại, nước, và thuốc; để xác định các loại hóa

chất, và để nghiên cứu tỷ lệ của các phản ứng hóa học. Ông được trao Giải Nobel Hóa học

cho công trình đóng góp của ông vào việc phát triển phổ học cộng hưởng từ hạt nhân biến

đổi Fourier và sau đó việc phát triển kỹ thuật “cộng hưởng từ hạt nhân” đa chiều. Các ứng

dụng nền tảng của cộng hưởng từ hạt nhân cả trong hóa học (phổ học cộng hưởng từ hạt

nhân) và y học.(chụp cộng hưởng từ).

2.2.2.1 Phương pháp thực hiện

Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân sẽ được trình bày chi tiết ở phần 2.

2.2.2.2 Ưu nhược điểm phương pháp

11

12

Với các kỹ thuật phổ NMR, người ta có thể biết được mối liên hệ giữa các proton và carbon

trong phân tử. Kết hợp với phổ khối và các thông tin khác người ta có thể xây dựng được

cấu trúc phân tử của hợp chất. Trong khá nhiều trường hợp, chỉ bằng NMR người ta cũng

có thể xác định được cấu trúc và cấu hình lập thể của chất cần phân tích. Do có rất nhiều

thông tin đặc trưng về cấu trúc phân tử, việc sô sánh phổ proton hay carbon một chiều của

một chất với một chất đã biết cho phép xác định một chất một cách tin cậy. Ngày nay, chỉ

cần lượng mẫu ở mức /mg /hay thấp hơn đã có thể xác định cấu trúc của một chất. Khả năng

này giúp ích rất nhiều trong nghiên cức các tự nhiên, khi mà cá chất rất khó phân lập và

thường chỉ thu được với một lượng nhỏ. Ngoài việc xác định cấu trúc, phổ cộng hưởng từ

hạt nhân còn được dùng trong định lượng các chất trong phân tích định lượng như các

phương pháp phổ khác. Tuy nhiên, do thiết bị đắt tiền nên cách thức này ít được sử dụng.

Việc kết nối cộng hưởng từ hạt hân với các thiết bị sắc ký lỏng có nhiều khó khăn. Tuy vậy,

hiện đã có những hệ thống ghép nối HPLC-NMR để phân tích và xác định các chất chiết từ

dược liệu. Ngoài các phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân dùng trong phân tích cấu trúc, kỹ thuật

xác định hình ảnh cộng hưởng từ hạt nhân cũng được sử dụng trong chẩn đoán y khoa.

Công nghệ mới này không những cung cấp thông tin về cấu trúc không gian ba chiều của

các phân tử sinh học mà còn cho biết đặc điểm nhiệt động học và từ tính của nó. Điều nay

cho thấy đây là một công cụ quan trọng cho phép đi sâu tìm hiểu chức năng của các phân tử

sinh học ở mức độ phân giải cỡ các nguyên tử trong tương lai.

PHẦN 2. Xác định cấu trúc protein bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân ( RMN-

RÉSONANCE MAGNÉTIQUE NUCLÉAIRE )

I. Tổng quan về phương pháp RMN :

2.1.1. Lịch sử nghiên cứu cấu trúc Protein :

Các nghiên cứu về cấu trúc Protein bắt đầu vào năm 1936 khi Mirsky và Pauling đề xuất rằng

các chức năng của một protein có liên quan đến cấu tạo của nó (sự sắp xếp của các nguyên tử

12

13

trong không gian ba chiều) (Anfinsen , 1973). Những lời này đã có một ảnh hưởng lớn đến sự

hiểu biết về sinh học cũng như việc nghiên cứu và phát triển các loại thuốc mới (Russell và

Eggleston, 2000). Kể từ đó, việc nghiên cứu cấu trúc ba chiều của tất cả các protein trong một

hệ protein cho phép ta có một cách suy nghĩ mới trong lĩnh vực Sinh học cấu trúc (Hol,

2000). Nghiên cứu thực nghiệm về cấu trúc của các protein là một quá trình lâu dài và tốn

kém, đòi hỏi phải có thiết bị chuyên dụng và trình độ chuyên môn cao. Hai phương pháp chính

được sử dụng là phương pháp tinh thể và phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và

được trình bày trong phần sau. 

2.1.2 Lịch sử phương pháp NMR :

Cho đến năm 1985, phương pháp duy nhất để xác định cấu trúc ba chiều của một đại phân tử

là tinh thể học tia X nhiễu xạ. Kỹ thuật này đòi hỏi phải có các tinh thể protein ngăn nắp.Mặc

dù có những bước tiến lớn trong nghiên cứu nhưng phương pháp vẫn gặp phải rất nhiều khó

khăn và đôi khi kết quả lại là những tinh thể protein không đạt yêu cầu. Trong những năm gần

đây, nhờ những tiến bộ trong lĩnh vực quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), mà chúng ta

đã có thể xác định được cấu trúc ba chiều của các protein nhỏ, đặc biệt là protein ít hơn 200

axit amin (Cavanagh et al. , 1996). Điều này có được là nhờ việc chúng ta đã sản xuất được

các quang phổ kế trường cao, sự phát triển của kỹ thuật NMR đa chiều và những tiến bộ trong

công nghệ máy tính. NMR cho phép chúng ta ước tính khoảng cách giữa các proton và một số

góc nhị diện. Từ kiến thức của một số lượng lớn các dữ liệu NMR, có thể xác định cấu trúc

của một protein với độ phân giải của trật tự thu được bởi tia X.

Việc một số dự án giải mã gen được hoàn thành gần đây đã cung cấp cho các nhà khoa học các

thông tin về trình tự của một số bộ gen. Vì mỗi protein trong một sinh vật có một tầm quan

trọng sinh hóa nhất định nên xác định cấu trúc ba chiều của tất cả các protein của một hệ

protein sẽ cho phép chúng ta hiểu sâu hơn về cấu trúc cũng như chức năng của các protein

trong cơ thể sống. Vì vậy gần đây, một số dự án phân tích cấu trúc protein đã được bắt đầu ở

một vài nơi trên thế giớ như Nhật Bản, châu Âu và Bắc Mỹ (Heinemann, 2000; Terwilliger,

2000; Yokoyama và cộng sự, 2000).

13

14

Xác định cấu trúc ba chiều của protein mất một thời gian. Nó có thể mất vài tháng tùy thuộc

vào độ dài của protein. Để tăng tốc độ của sự khám phá của các cấu trúc, các nhà nghiên cứu

phối hợp với các phòng thí nghiệm khác để áp dụng phương pháp NMR để phân tích mẫu

protein. Kết quả cho thấy, 16 cấu trúc đã được giải quyết trong sáu phòng thí nghiệm tinh thể

khác nhau và 17 cấu trúc đã được giải quyết trong bảy phòng thí nghiệm NMR khác nhau (Yee

et al, 2003). Số lượng các cấu trúc gần như giống hệt nhau được xác định với tinh thể và NMR

cho thấy NMR quang phổ có thể đóng góp đáng kể cho lĩnh vực nghiên cứu cấu trúc protein

(Yee et al, 2003).

Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một kỹ thuật quang phổ được sử dụng rộng rãi. Sự đa dạng

tuyệt vời của quang phổ cho phép xác định cấu trúc ba chiều của các protein. Phần dưới sẽ

cung cấp một cái nhìn tổng quan về các khái niệm lý thuyết trong phương pháp NMR cũng

như giới thiệu các bước xác định cấu trúc của một protein bằng phương pháp này.

II. Các khái niệm lý thuyết cơ bản trong phương pháp NMR :

2.2.1 Những nguyên tắc cơ bản của NMR

NMR phân tích dựa trên các tính chất từ của hạt nhân nguyên tử. Các hạt nhân của các nguyên

tử tạo ra sự tồn tại của một momen quay riêng cụ thể được gọi là spin I  . Spin có giá trị là 0,

1/2, 1, 3/2, và như vậy ( I = 0 có nghĩa là không có quay). Trong thực tế, có một hạt có

moment quay khác không sẽ cung cấp cho hạt nhân nguyên tử các thuộc tính của một lưỡng

cực từ. Một hạt có spin 1/2 sẽ chịu ảnh hưởng của một từ trường có hai moment từ theo hai

hướng khác nhau, trong cùng một phương.Ví dụ như proton 1 H, hạt nhân 13 C, 19 F hoặc 31 P có

spin là 1/2 và hai trạng thái spin: 1/2 -1/2. Cho một spin bằng một, chẳng hạn như

deuterium2 H hoặc lithium 6 Li, có ba sự định hướng sẽ xảy ra: -1, 0 và +1 (Evans, 1995). Nói

chung, có (2I+1) hướng cho một spin I.

Khi mẫu đặt trong một từ trường, mỗi sự định hướng sẽ tương ứng với một mức năng

lượng. Đối với các proton có spin là 1/2, có hai mức năng lượng nhất (phân phối Boltzmann)

( Hình 2-3 ). Đây là quá trình chuyển đổi giữa các mức và sẽ hình thức hóa hiện tượng cộng

hưởng từ hạt nhân (Sanders và Hunter, 1987).

14

15

Hình 2-3: Mức năng lượng và trạng thái spin hạt nhân của proton khi không có từ trường. Sự

khác biệt hai mức năng lượng là yếu hơn nhiều so với những gì được hiển thị trong hình

này. (Hình từ www.rmn.uhp-nancy.fr/Mutzenhardt/RMNSV2CM1.pdf)

Để quan sát một tín hiệu, chúng ta phải phá vỡ sự cân bằng giữa hai mức năng lượng.  Mẫu

phải chịu một từ trường thứ hai được sản xuất bởi một nguồn bức xạ điện từ có xung vuông

góc với trường đầu tiên và được tạo ra bởi nam châm.  Do hiện tượng cảm ứng điện từ nên một

dòng điện cảm ứng sẽ xuất hiện trong máy thu cuộn dây (Cavanagh et al, 1996.) ( Hình 2-4 ) .

Hình 2-4: Ảnh hưởng của từ trường bên ngoài của một mẫu NMR chuyển từ hóa dọc theo x và

trục y và sự quay do cảm ứng điẹn từ xung quanh trục z. (Sanders, 1987).

Như thể hiện trong Hình 2-5 , M dần dần sẽ trở về vị trí ban đầu của nó và song song với

B o . ( Cavanagh et al, 1996).

15

16

Hình 2-5: Sự cân bằng trở lại moment từ hóa theo định hướng song song với

B 0 (www.med.univ-rennes1.fr/cerf/edicerf/BASES/BA004_cv_rb_9.html).

Trong thời gian quay trở lại trạng thái cân bằng, các dữ liệu sẽ được ghi lại bằng máy quang

phổ NMR. Hạt nhân của protein sẽ cộng hưởng ở tần số khác nhau tùy thuộc vào môi trường

khác. Các tín hiệu được ghi nhận là một FID (cảm ứng phân rã tự do).  Hình 2-6 là một ví dụ

về một FID.

16

17

Hình 2-6: Tín hiệu NMR ở dạng tín hiệu tắt dần theo thời gian có tên là FID (cảm ứng phân rã

tự do).

Những tín hiệu này có chứa tất cả các thông tin cần thiết nhưng rất khó để giải mã chúng. Biến

đổi Fourier giúp chúng ta có thể nhìn thấy tín hiệu này có đồ thị dạng hình sin và là một hàm

theo thời gian (y = f (t)) bằng cách thay đổi nó thành một quang phổ NMR mang chức năng

của tần số (y = f (?)) ( Hình 2-7 ). Các tần số cộng hưởng sau đó sẽ được phục hồi

lại(Cavanagh et al, 1996).

Hình 2-7: Tín hiệu FID qua phép biến đổi Fourier. (Hình từ

www.rmn.uhp-nancy.fr/Mutzenhardt/RMNSV2CM1.pdf)

2.2.2 Các bước xác định cấu trúc của protein bằng NMR:

Trong phần này, chúng ta sẽ thảo luận về các bước cần thiết để xác định cấu trúc của một

protein. Các bước này được trình bày ở phần ngay sau đây.

2.2.2.1 Biểu diễn, đánh dấu các đồng vị và tinh chế protein:

NMR phân tích yêu cầu số lượng lớn các protein tinh khiết. Bằng cách sử dụng các kỹ thuật

tiêu chuẩn , gen quan tâm được nhân bản vô tính trong một plasmid DNA và được đưa vào các

vi khuẩn với số lượng rất lớn.

Một số hạt nhân không quan sát được bằng NMR do thiếu spin hạt nhân (I = 0). Nhưng trong

nghiên cứu các thành phần cơ bản cốt lõi của hóa học hữu cơ, chẳng hạn như  12 C và 16 O,

chúng ta có thể quan sát được hiện tượng NMR. Đó là do các nguyên tử này luôn xuất hiện các

đồng vị với spin hạt nhân khác không. 13 C quay 1/2 được tìm thấy ở mức 1,11% trong tự

nhiên. Ngoài ra, đồng vị này có một tỷ lệ gyromagnetic thấp hơn bốn lần của proton. Vì vậy, 17

18

hai yếu tố này gây ra độ nhạy rất thấp cho 13 C khi phân tích NMR quang phổ. 17 O có spin 5/2

tồn tại ít hơn nhiều so với13 C trong tự nhiên, dẫn đến sự quan sát của các vạch phổ rất rộng và

gần như không thể sử dụng phương pháp phân tích NMR.

Hạt nhân 14 N có spin 1, có thể phân tích bằng NMR Đánh dấu làm giảm số lượng các mức

năng lượng. 15 N quay 1/2 là có ít hơn 13 C trong tự nhiên, được tìm thấy ở 0,37% (Cavanagh et

al, 1996; VOET và VOET, 1995). Nó cung cấp tín hiệu NMR tốt. Tỷ lệ “gyromagnetic” của

nó nhỏ hơn 10 lần so với proton.

Để khắc phục những khó khăn, có thể thống nhất đánh dấu các nguyên tử cacbon và nitơ

là 13 C và 15 N. Đánh dấu amoni clorua ( 15 NH 4 Cl) và glucose ( 13 C-glucose) cách biểu diễn

duy nhất của nitơ và carbon trong môi trường nuôi cấy. Đánh dấu đồng vị của các protein này

là điều cần thiết để phân tích vô số các thí nghiệm NMR đa chiều.

Đôi khi người ta thay thế các proton bởi các deuterium để giảm bớt quang phổ của protein

lớn. Để sản xuất một protein deuterated, sự tăng trưởng của vi khuẩn được thực hiện trong

D 2 O thay vì H 2 O.

Các protein tái tổ hợp sau đó được tinh chế và cấu trúc của chúng sẽ được đặc trưng bởi NMR.

2.2.2.2. Chuẩn bị mẫu

Các protein có cấu trúc ba chiều được phân tích bởi NMR phải có nồng độ và môi trường thích

hợp. Nồng độ của protein tinh khiết trong một mẫu cần phải khác nhau từ 0,5 đến 2.0 mM. 

Các mẫu có thể chứa tạp chất, nhưng không được chứa các proton tạp chất vì sẽ gây ảnh

hưởng tới các proton của protein. Muối và ion có thể được tìm thấy trong dung dịch. Một nồng

độ tối thiểu của các muối sẽ cung cấp cho protein một môi trường tương tự như môi trường tự

nhiên của nó, nhưng nồng độ quá cao sẽ làm tổn thương nó, vì muối là những yếu tố dẫn điện

và có thể làm nóng mẫu.

Protein có thể ở dạng monomer hoặc polymer và phải được ổn định để có thể duy trì hoạt động

và giữ vững cấu trúc của nó cho một vài tuần trong điều kiện nhiệt độ cao. Độ pH của mẫu là

18

19

rất quan trọng để quan sát tất cả các proton của protein. pH thường dao động từ 5 đến 7. pH

cao giúp tăng tốc độ trao đổi proton với dung môi.

Dung môi được sử dụng thường là nước. 10% D 2 O được thêm vào mẫu để giữ cho phổ kế chỉ

một giá trị tần số duy nhất (Cavanagh et al 1996). Thật vậy, mặc cho từ trường thay đổi liên

tục từ một giá trị nhỏ, xung được đưa ra liên tục trên D 2 O để điều chỉnh tần số tham chiếu của

các hạt nhân của protein. Tần số cộng hưởng được tham chiếu bởi một lượng nhỏ (0,5 mM)

DSS (natri 2,2-dimetyl 2 silapentane-5-sulfonate) được thêm vào mẫu.

2.2.2.3. Lấy NMR

Việc có được một số quang phổ NMR tạo điều kiện cho việc xác định tần số cộng hưởng của

tất cả các hạt nhân của một hợp chất. Tuy nhiên, tần số cộng hưởng của một hạt nhân lại tỉ lệ

thuận với từ trường. Việc xác định tần số chuyển hóa chất không phải dễ dàng và các thiết bị

cũng biện pháp được sử dụng phải có độ chính xác đến ppm (phần triệu) (Cavanagh et al,

1996). Như một ví dụ đơn giản, một proton trong một từ trường 14 Tesla (T) ở 600MHz trong

khi trong một từ trường mười lần nhỏ hơn (1,4092 T), ở 60 MHz. Tính toán có thể được thực

hiện từ các phương trình 1 .

Phương trình 1: Phương trình của NMR cơ bản. ᵞ đại diện cho Lamor tuế sai tần số (MHz),

B z là từ trường. 

Các hạt nhân của hợp chất không cộng hưởng ở cùng một tần số. Proton cộng hưởng thông

thường từ 1 đến 12 ppm ( Hình 2-9 ), các nguyên tử cacbon béo thường cộng hưởng giữa 17

và 75 ppm và nitơ amit thường giữa 100 và 132 ppm. Tính chất hóa học bị ảnh hưởng bởi môi

trường xung quang, chính xác hơn nữa là bởi các hạt nhân và các electron ở gần đó. 

19

20

Hình 2-9: Sự thay đổi hóa tính đối với các loại proton khác nhau. Phổ 1D đã được ghi lại trong

nước. FID được biến đổi bởi biến đổi Fourier (Cavanagh et al, 1996).

Trong quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân nhiều hơn một chiều, các cực đại được hình thành

trong sự chuyển đổi hóa học của sự tương quan giữa hai hạt nhân. Mối tương quan được ghi

nhận giữa các hạt nhân của protein có thể chỉ là sự khác nhau của một quang phổ. Họ có thể

tạo liên kết giữa một amino acid riêng lẻ hoặc thông qua không gian. Một số NMR giúp phân

tích cấu trúc mạch, tức là xác định những thay đổi hóa học của các hạt nhân trên chuỗi chính,

và các loại quang phổ khác ước tính sẽ cần nhiều hơn để xác định sự thay đổi hóa tính của các

chuỗi bên.

20

21

Thí nghiệm NMR Homonuclear được dựa trên một loại hạt duy nhất của nguyên tử:

proton. Hai loại thí nghiệm được sử dụng đó là COSY và TOCSY (Braunschweiler và Ernst

1983) (Cavanagh et al, 1996).

Một số axit amin có một spin của riêng mình. Lấy ví dụ cặn alanine. Dư lượng này được đặc trưng bởi nhóm methyl nằm ở Hβ. Trong thực tế, cao điểm này có cường độ lớn hơn gấp ba lần so với Hα. Do đó, có thể kết hợp một vài nhóm dịch chuyển hóa học cho một loại axit amin, sau đó nó sẽ liên kết các axit amin với nhau. Phổ NOESY cũng là một thử nghiệm NMR homonuclear. Công cụ để chỉ định một chuỗi là các NOEs và sẽ được trình bày chi tiết hơn ở phần sau nữa.

Trong quá trình phân tích các protein lớn hơn, nơi nó là cần thiết để đánh dấu dư lượng, một số

thí nghiệm NMR heteronuclear có quang phổ có thể lên đến bốn lần kích thước mà ta có thể

lúc trước.

Như đã đề cập ở trên, để xác định cấu trúc của một protein thì ta phải giải mã được tất cả các

hệ thống spin của các axit amin. Tương tác Noe là những tương tác lưỡng cực giữa các proton

gần đó trong không gian (Cavanagh et al, 1996). Khoảng cách giữa hai nguyên tử hơn kém

nhau về cường độ trong tương tác NOE là thấp và thường không vượt quá 5A. Mối quan hệ

này là tỷ lệ nghịch và đề cập đến mối quan hệ sau đây.

Phương trình 2: Mối quan hệ giữa tương tác Noe và khoảng cách giữa hai proton

2.2.2.4. Chuyển đổi quang phổ để phân tích

Tín hiệu MNR phát ra phải trải qua một số biến đổi trước khi được phân tích. 

Việc trích xuất dung môi là cách để loại bỏ các tín hiệu từ các dung môi. Nhân tín hiệu fid

bằng một phép toán rất nhiều lợi ích phổ. Dự đoán tuyến tính làm tăng thêm các điểm được dự

đoán từ các điểm thí nghiệm. Ngoài các phương pháp đã nêu, bạn có thể thêm số không vào

cuối của tín hiệu để cải thiện độ phân giải của quang phổ.

21

22

Biến đổi Fourier chuyển đổi các tín hiệu fid trong phổ tần số ( Hình 2-7 ). Chức năng này được

thực hiện trên toàn kích thước của một quang phổ. Ưu điểm của phương pháp này là các tín

hiệu được thêm vào không gây nhiễu loạn.

Ngoài ra còn nhiều phương pháp khác được sử dụng để nâng cao phổ NMR. 

2.2.2.5. Kết cấu giới hạn :

Các giới hạn khác nhau về cấu trúc như NOE và góc nhị diện rất cần để xác định cấu trúc của

protein bằng NMR. Các giới hạn của liên kết hydro và các giới hạn khác không được trình bày

trong bài viết này cũng có thể được sử dụng để xác định cấu trúc của protein.

a.  Giới hạn khoảng cách

NOE hạn chế cung cấp thông tin về khoảng cách giữa các nguyên tử lân cận. Các khoảng cách

này ít hơn 5A có thể là dư lượng trong nội bộ hoặc liên dư lượng (tuần tự, tầm trung, tầm

xa). Thí nghiệm cho 15 N-HSQC-NOESY đã tạo điều kiện để tìm hiểu tương tác giữa proton và

amit gần đó trong không gian. Thí nghiệm 13 C-NOESY-HSQC lại làm rõ những tương tác

giữa tất cả các proton thuộc carbon. Mỗi proton liên kết với carbon của mỗi lượng dư đều có

tương tác với tất cả các proton gắn liền với các nguyên tử carbon gần đó trong không

gian. Quang phổ này thường không được quy hoàn toàn bởi vì vài đỉnh thường chồng chéo lên

nhau.

Sự tương tác giữa hai nguyên tử, đo được cường độ tương tác giúp ta có thể đánh giá được

khoảng cách của các liên kết trước đó đã đề cập từ phần trước( phương trình 2 ). Việc hiệu

chuẩn NOE là cần thiết cho việc tính toán kết cấu.

b.  Giới hạn của góc nhị diện

Trong một protein, các liên kết tiếp giáp với các peptit CN có khả năng xoay xung quanh trục

của chúng. Như vậy, quỹ đạo của một protein trong không gian được xác định bởi một tập hợp

mặt phẳng khớp nối với nhau tại cacbon α( Hình 2-16 ).

22

23

Hình 2-16: Đại diện của một chuỗi polypeptide. Các góc quay về N-Cα là góc Φ và liên kết

xung quanh 'Ca-C là Ψ

Định hướng của hai mặt phẳng này được xác định bởi Φ và các góc Ψ. Cũng như khoảng cách

Noe, những góc độ này có thể được sử dụng như các giới hạn cấu trúc.Hai phương pháp

thường được sử dụng trong NMR để xác định các góc nhị diện. Sử dụng mối quan hệ giữa sự

thay đổi hóa học và các cấu trúc thứ cấp (ví dụ như cách tiếp cận Talos) được hiển thị

trong hình 2-17 và cùng với những hằng số khớp nối.

23

24

Hình 2-17: Mối quan hệ giữa sự thay đổi hóa học Cα Cβ và cấu trúc thứ cấp. Con số này được

lấy từ http://spin.niddk.nih.gov/bax/software/TALOS/

Talos (Torsion Angle Likelihood Obtained from Shift and sequence similarity)

Talos là một hệ thống cung cấp các cơ sở dữ liệu để đánh giá các góc Ψ, Φ từ sự chuyển đổi

hóa học của năm nguyên tử: Hα, Cα, Cβ, CO, N (Cornilescu et al, 1999.). Talos sử dụng một

chuỗi ba axit amin trong một protein và so sánh các biến thể của sự dịch chuyển hóa học (tuần

tự gấp mẫu) của năm nguyên tử cuối cùng với các biến thể của các tripeptit tương tự như một

cơ sở dữ liệu. Cơ sở dữ liệu này hiện chứa thông tin khoảng 20 protein của các cấu trúc nổi

tiếng đại diện cho khoảng 3000 bộ ba. 

Talos là một phương pháp thực nghiệm, các giá trị góc là giá trị không chính xác và không

chắc chắn đối với các đại lượng quan trọng. Talos cho kết quả tốt hơn khi được sử dụng kết

hợp với các giá trị hằng số khớp nối.

c.  Khớp nối các hằng số

Hằng số khớp nối là sự tách các đỉnh proton kép ra bằng hertz . Để phân tích protein theo ba

chiều không gian, việc khớp nối các hằng số được sử dụng thường xuyên nhất là trong liên kết

giữa HN và Hα. Thí nghiệm NMR HNHA (Geerten W. Vuister, 1993) được sử dụng để xác

định các hằng số khớp nối ( 3 J HNHa ). HNHA quang phổ gồm có ba chiều (F 1 ( 15 N), F 2 ( 1 H),

F 3 ( 1 HN) (Cavanagh et al, 1996). Trên quang phổ này, tỷ lệ các tương tác giữa các đỉnh

đường hoành và các đỉnh đường chéo cho một lượng dư nhất định và tỷ lệ thuận với 3 J HNHa .

Ta xác định giá trị của 3 J HNHa bằng phương trình dưới đây :

Phương trình 3: Phương trình cho ta biết được khớp nối liên tục 3 J HNHa 

24

25

Một khi các hằng số khớp nối thu được cho tất cả các axit amin của protein mà ta đang nghiên

cứu, thì nhờ có mối quan hệ Karplus (Harbison, 1993) thể hiện trong Hình 2-18 , chúng ta có

thể chuyển các hằng số khớp nối vào trong các giới hạn của góc nhị diện Φ.

Hình 2-18: Biểu đồ Karplus mô tả sự biến đổi của các khớp nối liên tục 3 J HNHa F với góc nhị

diện của chuỗi mạnh.

Khi các khớp nối liên nhỏ hơn 6 Hz, góc Φ được tìm thấy là khoảng 60 độ trong một chuỗi

xoắn cấu trúc thứ cấp. Khi lớn hơn 8 Hz, góc Φ là khoảng 120 độ (ß-sheet). Khi nó là hằng số

từ 6 đến 8 Hz thì khớp nối không được sử dụng như là một ràng buộc cấu trúc bởi (Cavanagh

et al, 1996).

Những ràng buộc nhị diện Φ giúp ích cho việc tính toán các cấu trúc protein. Tùy thuộc vào

góc, một khu vực sẽ tạo thành một cấu trúc thứ cấp trong tấm β hoặc xoắn α. Sơ đồ

Ramachandran cho thấy các khu vực và Φ mà tại đó thuận lợi cho việc tạo thành xoắn và các

tấm β

25

26

Hình 2-19: Biểu đồ Ramachandran biểu diễn những vùng giá trị góc nhị diện Φ và Ψ.  

(Branden và Tooze, 1991).

d.  Giới hạn liên kết hydro :

Liên kết hydro là tương tác tĩnh điện giữa một nguyên tử hydro gắn liền với một nguyên tử có

độ âm điện cao và một cặp electron tự do nằm trên một nguyên tử (O, S hoặc N) của một

nhóm khác. Khoảng cách của các liên kết hydro thay đổi từ 2,7 đến 3,1 Å (Văn Holde và

Mathews, 1990). Khó khăn của các liên kết hydro có thể được biết đến trong việc đo vận tốc

trao đổi của amit khi protein được hòa tan trong deuterium. Deuterium không hiển thị trong

NMR quang phổ 1 H do đó cần nhiều thời gian hơn trước khi sự biến mất của đỉnh, proton trao

đổi dễ dàng hơn với các dung môi nên liên kết hydro cũng dễ hình thành hơn.

26

27

Có nhiều loại ràng buộc cấu trúc khác có thể được sử dụng để xác định cấu trúc ba chiều của

protein, nhưng chúng không được sử dụng trong nghiên cứu này.

2.2.2.6. Protein động lực

Trạng thái nghỉ là quá trình mà các spin của các hạt nhân trong mẫu trở lại trạng thái cân bằng

sau khi được kích thích. Trạng thái cân bằng là trạng thái mà mức năng lượng tương ứng với

một phân bố Boltzmann. Tỷ lệ nghỉ chịu ảnh hưởng bởi tính chất vật lý và tính năng động của

phân tử đó. Do đó, một nghiên cứu của quá trình nghỉ sẽ cho ta biết các thuộc tính năng động

của các phân tử. Để mô tả các đặc tính này, ta cần đo một số thông số

Thứ nhất, thời gian nghỉ T1 (đôi khi được gọi là theo chiều dọc hoặc spin mạng) đặc trưng cho

sự cân bằng năng lượng hạt nhân sau khi kích thích. Trạng thái nghỉ này là do tương tác với

môi trường. Thời gian nghỉ ngang T 2 (còn gọi là spin-spin) cũng cho phép quay trở lại trạng

thái cân bằng, nhưng dọc theo trục x và y (Levitt, năm 2001). Thông

thường, 15 NT 1 và 15 NT 2 được phân tích cho sự năng động của mạch. 

2.2.2.7. Tính toán của các cấu trúc ba chiều

Sự mô phỏng cấu trúc ba chiều được thực hiện bằng cách sử dụng tất cả các thông tin được

biết cho đến nay trên protein. Trình tự protein và các ràng buộc cấu trúc đề cập ở trên là những

thành phần thiết yếu được sử dụng trong các phần mềm tính toán. Mục đích là để tạo ra một

tập hợp của các cấu trúc phù hợp với các giới hạn thử nghiệm, trong khi vẫn giữ được cấu trúc

hình học của các axit amin và các peptit.

ARIA là một chương trình được phát triển trong những năm gần đây như chương trình tự động

phân tích các dữ liệu NMR. Nó làm tăng tốc viêc phân tích các dữ liệu thực nghiệm khác bằng

cách quy về NOESY quang phổ. ARIA cũng là một hệ thống hiệu chuẩn của Noe (Linge et al,

2001).

Sự mô phỏng các cấu trúc ở nhiệt độ cao cho phép nghiên cứu các cấu trúc đó mà không cần

đưa cả hệ đến nhiệt độ yêu cầu. Phương pháp này cho phép tạo ra cấu trúc để ổn định trước

27

28

mọi sự thay đổi nhiệt độ. Các cấu trúc ứng với năng lượng thấp nhất được lưu giữ cho phiên

bản kế tiếp.

Hình 2-20: Sơ đồ đại diện cho tính toán động học phân tử của các cấu trúc mô phỏng luyện

kim (MDSA) Hình từ www.bip.bham.ac.uk/osmart/bcm311_pef/slide27.html.

Trong một tính toán của cấu trúc ba chiều NMR, các cấu trúc được tạo ra được chồng lên để

xác định chất lượng và độ chính xác. Cấu trúc khác cũng tương tự, cộng với giá trị của

RMSD. RMSD có thể được tính trên mạch, các nguyên tử nặng (C, O, N, S) hoặc các phần

khác nhau của chuỗi protein. RMSD được tính toán bằng cách sử dụng phương trình sau đây.

28

29

Phương trình 4: Phương trình của RMSD .N là số lượng mẫu. r i và r i ‘ đại diện cho cấu trúc.

Các vùng N-cuối và C-cuối của protein thường có cấu cho RMSD cao hơn. Loops (vùng giữa

hai cấu trúc thứ cấp) thường có một khu vực cao hơn RMSD và có cấu trúc như xoắn α và các

tấm beta. 

29

30

Tài liệu tham khảo :

http://archimede.bibl.ulaval.ca/archimede/fichiers/21738/

http://fr.wikipedia.org/wiki/R%C3%A9sonance_magn%C3%A9tique_nucl%C3%A9aire

http://glycobase.univ-lille1.fr/documents/livreRMN.PDF

http://www.cours-medecine.info/biochimie/structure-proteines.html

Công cụ hỗ trợ:

https://www.google.com.vn/

http://translate.google.com.vn/

30