Laboratorní průkaz kmene viru HSV1 rezistentního k acicloviru u

pacientky s CLLLabská K., Plodková H., Pumannová

M. – SZÚ, NRL HVBenešová K., Špaček M. – 1. Interní

klinika VFN

Rezistence HSV k ACV

• Přirozená0,3%-0,7% Collins, P., and M. N. Ellis. 1993. J. Med. Virol. Suppl. 1:58–66.• Získaná – na terapii

– HSV1 keratitida 6,4%Duan R et al. 2008 JID; 198: 659–663.– HSV2 herpes genitalis 5%

K. Bohn-Wippert et al. 2015. International Journal of Medical Microbiology 305 (2015) 644–651

– HIV pozitivní 3 – 7%– Pacienti po SOT 2,5%-10– Pacienti po HSCT 4-11%

• Piret J. et al. 2011 Antimicrobial Agents and Chemotherapy, p. 459–472

Laboratorní metody k určení rezistence HSV k ACV

Genotypové• Sekvenace genů pro

thymidinkinázu a DNA polymerázu• Rychlejší• Význam všech mutací není jasný

Fenotypové• Založené na kultivaci viru v

různých koncentracích ACV• Nejasná hranice – 2ug/ml EC50• Výstup:

– počet plaků– enzymatické assaye– vzestup nálože DNA

• Závislé na:– použité buněčné linii– testovaných koncentracích ACV– velikosti inokula (nutno titrovat-

nejlépe PFU)• Plaque Redukční Assay- zlatý

standard

Metody v NRL HVSekvenace

• Sekvenace dle Sangera• Thymidinkináza

– Rozdělená na 2 překrývajícíse úseky, zvlášť primery HSV1 a HSV2

– Aspoň 10exp3 cp/ml• DNA polymeráza

– 9 úseků HSV1– 8 úseků HSV 2– Aspoň 10exp4 cp/ml– Referenční kmen– 17 (HSV1)

– -HG52 (HSV2)

Izolace DNA

kontrolní real-time PCR amplifikace úsekůKontrolní elektroforéza

Přečištění, kontrola koncentrace DNA

Sekvenační reakce

Přesrážení etanolem rozpouštění ve formamidu přes noc

Sekvenace

analýza= 3 dny minimálně

Metody NRL HV-plaque redukční assay I.

• Kultivace na LEP• Testujeme 5 koncentrací

ACV/4 opakování• Rezistentní- roste v 2

ug/ml• Barvení plaků neutral red• Nutná kontrola CPEStranska R. et al., 2004 Antimicrob

Agents Chemother. Jun;48(6):2331-3.

Metody NRL HV-plaque redukční assay II.

Kultivace na LEP

2-3 dny

Titrace viru na PFU kultivací

3- 5 dní

Příprava desky s LEP na titraci

Příprava desek s LEP na kultivaci s ACV Kultivace titrovaného

viru s ACV

3-5 dní

1 den barvení= 14 dní

kazuistika• Žena 71 let• OA: Polyvalentní alergie na ATB, divertikulóza sigmatu, st.p.CHCE• CLL od 1/2009, Rai low risk•• 13 q13 q--, ZAP , ZAP --70+, IgVH 6%(VH370+, IgVH 6%(VH3--49*05)49*05)• p53 norm., CD38neg, CD49dneg,B2mikroglob. norm.• 2/2016 progrese nemoci – splenomegalie, B symptomy, CIRS 7• 3/2016 přetrvává výsev herpes labialis, sledována dermatologem,

intermitentně ACV, val ACV, doxycyklin• Indikována k terapii bendamustin +rituximab• 1.cyklus 11.5.16 + G-CSF• 26.5. pleuropneumonie – th. Moxifloxacin, přetrvávající febrilie, • 14.-17.6. nitrofurantoin pro asymptomatickou bakteriurii• Vysloveno podezření na rezistenci HSV k ACV

Kazuistika – vyšetření v NRL HV

• Provedeny stěry ze 4 míst + odběr krve PCR• Silně HSV1 pozitivní, krev 273 cp/ml• Kultivačně HSV1 ze všech stěrů + masivně kvasinky• Virus roste v 5ug/ml ACV (4/4 jamek)• Mutace v genu pro thymidinkinázu (kodon 125, Gln/His)• Známá, rezistence k ACV• Stejná mutace i ve vykultivovaném viru

Kazuistika - pokračování

• ACV i.v., substituce IVIG• Po informaci o rezistenci ACV ex• 2.cyklus bendamustin rituximab 30.6.• 3.cyklus 28.7.• 8/2016 dochází ke spontánní regresi

nálezu

Závěr

• Testování rezistence HSV k ACV v NRL HV ve zkušebním režimu

• Probíhá validace (genotyp + fenotyp)• Vhodný materiál k vyšetření –

kultivovatelný stěr (např. Dakron + virolog. médium)

• NRL má zájem o izoláty HSV